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标题: 【求助】细胞大面积的出现未知小黑碎片 [打印本页]

作者: 箭头儿 时间: 2015-4-7 14:44 标题: 【求助】细胞大面积的出现未知小黑碎片

各位大侠！请教一下细胞大面积的出现未知小黑碎片！，洗是洗不掉的，并且传代后也会出现同样的情况，不过贴壁的时间和数量都和以前差不多，这种小碎片感觉是贴壁的，镜下观察这些小黑点绝大多数是不动的（用极小数会小里面飘动）。请问这是什么神奇的现象！！
后续：首先非常感谢给位朋友的帮助，问题基本已经解决，再者会将前后两次的图片上传，希望能对大家在试验中遇到的相似问题提供一点帮助！！还请其他朋友分享你们宝贵的经验，为大家以后的实验工作提供更多的方便！谢谢大家！

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作者: 箭头儿 时间: 2015-4-7 14:44

各位大侠！请教一下细胞大面积的出现未知小黑碎片！，洗是洗不掉的，并且传代后也会出现同样的情况，不过贴壁的时间和数量都和以前差不多，这种小碎片感觉是贴壁的，镜下观察这些小黑点绝大多数是不动的（用极小数会小里面飘动）。请问这是什么神奇的现象！！
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作者: 箭头儿 时间: 2015-4-7 14:45

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作者: 箭头儿 时间: 2015-4-7 14:46

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作者: 箭头儿 时间: 2015-4-7 14:47

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作者: 箭头儿 时间: 2015-4-7 14:48

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作者: 箭头儿 时间: 2015-4-7 14:49

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作者: HOT兔 时间: 2015-4-7 14:50

据说是黑胶虫，你可以搜索一下相关资料，也可能是你养的细胞老了，重新复苏原代细胞

作者: dior 时间: 2015-4-7 14:50

是否是酒精灯上的小黑块通过一些途径（比如你你盖上瓶子前，把瓶口放到火焰附近烧）飘到瓶子里去了

作者: fox_79 时间: 2015-4-7 14:51

有图最好……曾经我的培养瓶瓶盖内的黑色胶因为被酸缸浸泡腐蚀碎裂，视野里就有小黑点……

作者: feiya 时间: 2015-4-7 14:51

应该问题不大，离心，用培养基洗涤一下，效果不错，我试过
极可能是你细胞生长分泌的东西

作者: xevin 时间: 2015-4-7 14:52

消化过了也可能会出现黑点，或者使用的细胞瓶洗的不干净也有可能造成黑点吧

作者: 箭头儿 时间: 2015-4-7 14:52

应该问题不大，离心，用培养基洗涤一下，效果不错，我试过
极可能是你细胞生长分泌的东西

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先谢谢您的解答！请问减速离心该怎么做？是先消化下来再直接用低速（不大于1000）离心呢？还是从较高转速（1300）往下降的梯度离心？？

作者: NBA 时间: 2015-4-7 14:53

QUOTE:

原帖由 xevin 于 2015-4-7 14:52 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

消化过了也可能会出现黑点，或者使用的细胞瓶洗的不干净也有可能造成黑点吧

应该不会是消化过了或瓶子的问题，因为我铺的板子也由这样的情况~消化的时候都会采用两步法消化，轻轻拍打细胞瓶待胰酶变的比较浑浊时就马上终止。

作者: 箭头儿 时间: 2015-4-7 14:53

是否是酒精灯上的小黑块通过一些途径（比如你你盖上瓶子前，把瓶口放到火焰附近烧）飘到瓶子里去了

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先行谢过！应该不会是那样，以前遇到过你说的那种情况，不过换液时多洗几次就好的多，但是这次却洗不掉！

作者: vcve 时间: 2015-4-7 14:53

问题不大，你这个问题我在培养细胞的时候也出现过，细胞仍可以生长的很好，确切的原因还不知道，，但估计是不是你的血清反复冻融过。

作者: ns5fan 时间: 2015-4-7 14:54

你的血清用之前是不是灭活过？

作者: ns5fan 时间: 2015-4-7 14:54

查资料发现血清用之前灭活对细胞的作用不大，反而会在一定程度上影响细胞生长，37℃放置一段时间会有你说的这种情况。

作者: 箭头儿 时间: 2015-4-7 14:54

QUOTE:

原帖由 ns5fan 于 2015-4-7 14:54 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

你的血清用之前是不是灭活过？

这个就不知道了！这是老板买回来的！这样影响会很大吗？？

作者: 箭头儿 时间: 2015-4-7 14:55

应该不是黑胶虫！！黑胶虫是会动的啊！！

作者: ukonptp 时间: 2015-4-7 14:55

实验显示，经过正确处理的热灭活血清，对大多数的细胞而言是不需要的。经此处理过的血清对细胞的生长只有微小的促进，或完全没有任何作用，甚至通常因为高温处理影响了血清的质量，而造成细胞生长速率的降低。而经过热处理的血清，沉淀物的形成会显著的增多，这些沉淀物在倒立显微镜下观察，像是 "小黑点"，常常会让研究者误以为是血清遭受污染，而把血清放在37C环境中，又会使此沉淀物更增多，使研究者误认为是微生物的分裂扩增。
　　因此建议您，若非必须，您可以不需要做热处理这一步。如此一来，不但节省您宝贵的时间，更确保您血清的质量!另外，购买已灭活成品也不失一个捷径，请在购买的时候注意询问厂家是否是已灭活血清。

作者: purrr 时间: 2015-4-7 14:55

消化下来再直接用低速（不大于1000）离心
我做的是瘤细胞，半贴壁

作者: purrr 时间: 2015-4-7 14:56

贴壁的时间和数量都和以前差不多，说明你的细胞本质上没什么变化
是不是传代次数多了？

作者: dior 时间: 2015-4-7 14:56

可能是黑胶虫，我的细胞也这样。光加培养基在培养箱里面养养试试。我的培养基里面就有这样的黑点，少的时候对细胞影响不大，多了就漂了。有很多人在讨论这种情况，好像比较难除去。

作者: newway 时间: 2015-4-7 14:56

楼主上图片吧，最好是Phase contrast 和 DIC的图片

作者: 箭头儿 时间: 2015-4-7 14:57

图片已上传

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作者: 箭头儿 时间: 2015-4-7 14:57

再补两张

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作者: 箭头儿 时间: 2015-4-7 14:57

最后一张

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作者: caihong 时间: 2015-4-7 14:58

先行谢过！应该不会是那样，以前遇到过你说的那种情况，不过换液时多洗几次就好的多，但是这次却洗不掉！ ...

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或是烧枪头时枪头不小心擦到酒精灯，自己又没留意。我弄的培养瓶有一阵子在镜下观察有很多大小不一的小黑块，而且有稍微增长的趋势，洗也洗不掉，我就消化，弃掉部分培养基，再培养，再消化弃掉部分培养基，几次后，小黑块就基本没有了，呵呵

作者: caihong 时间: 2015-4-7 14:58

我的是洗不掉，都和细胞贴在壁上的

作者: caihong 时间: 2015-4-7 14:59

问题不大，你这个问题我在培养细胞的时候也出现过，细胞仍可以生长的很好，确切的原因还不知道，，但估计是 ...

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是的，细胞照样可以长得很好，但是测试时会对吸光值有影响，结果数据会波动的，所以，如果出现这种情况，最好能把小黑点去掉，再做实验，否则，建议不要这细胞瓶做实验。

作者: 箭头儿 时间: 2015-4-7 14:59

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原帖由 caihong 于 2015-4-7 14:59 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
问题不大，你这个问题我在培养细胞的时候也出现过，细胞仍可以生长的很好，确切的原因还不知道，，但估计是 ...

...

hehe !谢谢你哈！我试一试传一下！在多洗几遍！

作者: junhun 时间: 2015-4-7 15:00

我养的细胞近来也出现了这种情况，但是小黑点没楼主的多，我的感觉是，如果细胞没有污染，几乎可以确定为细胞碎片，而且传代还是有，是因为细胞状态不好的缘故，建议消化时间不要过长，因为碎片比较容易消化下来，一定时间后，直接将胰酶吸去，此时碎片大多数被吸走了，而后用新鲜配液将细胞吹下，直接种板，可不离心了（因为离心本来就是为了除去胰酶和一些死细胞），我试过，效果不错！

作者: 箭头儿 时间: 2015-4-7 15:00

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原帖由 junhun 于 2015-4-7 15:00 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
我养的细胞近来也出现了这种情况，但是小黑点没楼主的多，我的感觉是，如果细胞没有污染，几乎可以确定为细胞碎片，而且传代还是有，是因为细胞状态不好的缘故，建议消化时间不要过长，因为碎片比较容易消化下来，一定时间后，直接将胰酶 ...

xiexie ，昨天传了一下！采用朋友们建议的低速离心，并且传代后12小时再洗了一次！现在好多了哈！应该不是污染哈！呵呵！以后还请多多交流！

作者: summerxx 时间: 2015-4-7 15:01

应该问题不大，离心，用培养基洗涤一下，效果不错，我试过
极可能是你细胞生长分泌的东西

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应该没什么问题，对细胞生长没有哦太大影响

作者: woshi 时间: 2015-4-7 15:01

我在培养细胞时也出现过类似的情况！估计是胰酶消化细胞不充分造成的！你可以在细胞重新分板时，先用胰酶消化，之后用PBS洗涤细胞1-2次，再用培养基培养！

作者: bring 时间: 2015-4-7 15:02

虽然楼主问题解决，但我还是冒点杂音，希望对以后的童鞋有帮助。

第一，不是黑胶虫，黑胶虫会动，镜下形态是规则圆点或逗号形状。黑胶虫会影响细胞形态，形状大致不变但细胞大小比正常偏小，因为黑胶虫是血清里带来的，是竞争血清营养的东西。
第二，你这个是细胞由于传代次数过多或者胰酶消化时间过长造成的细胞代谢不良，细胞的分泌物。解决这个问题，把细胞保种冻到-80°C冰箱一个礼拜，或者放液氮里。然后复苏，问题就可解决。
P.S.我做细胞方面的实验已经4年多了，你的这个问题以前也多次遇到，后来发现，细胞也需要呵护，才长的好，哈哈。

作者: 箭头儿 时间: 2015-4-7 15:02

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虽然楼主问题解决，但我还是冒点杂音，希望对以后的童鞋有帮助。

第一，不是黑胶虫，黑胶虫会动，镜下形态是规则圆点或逗号形状。黑胶虫会影响细胞形态，形状大致不变但细胞大小比正常偏小，因为黑胶虫是血清里带来的，是竞争血清 ...

非常感谢您的解答！这个问题目前来看也没有完全解决，这几天观察依然有类似情况出现，只是没有那么厉害就是了！今天测量了一下培养基的PH值，发现居然是8.2几，吓了一跳，个人觉得PH值才是产生这个问题的根本原因，同时也认为细胞到目前为止还没有挂，确实是有点不容易~今天已经调整过来了，再等等看结果吧！希望它平安健康！最后请问一下，培养基过滤后的PH值会升高吗？？

作者: abc816 时间: 2015-4-7 15:02

我的细胞也遇到了同样的情况，换液时用PBS洗了，但还是会有，求解

作者: remenb 时间: 2015-4-7 15:03

得，肯定是污染了。

作者: 箭头儿 时间: 2015-4-7 15:03

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得，肯定是污染了。

污染的不是啊！这因为培养基变碱了！导致细胞状态很差，最后破裂成的碎片照成的！！！

作者: HOT兔 时间: 2015-4-7 15:03

培养基里有血清就是正常的。

作者: veiwu 时间: 2015-4-7 15:04

细胞碎片吧，贴壁啦，所以遮光度大就黑

作者: dior 时间: 2015-4-7 15:05

看了这么多层的讨论，结果还是没有一个号点的方法啊！楼主，你的情况和我现在遇到的问题是一样的，开始复苏的时候，细胞背景很干净，可是传代3次以上，就是满视野的杂质。很多人说是消化时间过长了，我就后面严格把握时间，可是在进行药物处理细胞的时候，那些东东就开始出来了。
请问楼主，你的问题解决了没？给点好的意见啊！

作者: 箭头儿 时间: 2015-4-7 15:05

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看了这么多层的讨论，结果还是没有一个号点的方法啊！楼主，你的情况和我现在遇到的问题是一样的，开始复苏的时候，细胞背景很干净，可是传代3次以上，就是满视野的杂质。很多人说是消化时间过长了，我就后面严格把握时间，可是在进行 ...

传代是时候采用低速离心吧，离心完了后再加PBS洗一至二次在传，这样背景会少很多，不过带细胞长的比较密的时候这种黑点还是会出现。我个人更倾向于这是细胞状态不好所照成的，最好重新复苏吧，消化的要掌握好，还有就是培养基的PH。大概就这么多了！希望对你有帮助。祝你好运！

作者: ending 时间: 2015-4-7 15:05

以前我养细胞的时候也出现过，是在转染之后出现的，应该不是菌，菌没这么大，是不是细胞分泌物？

作者: ending 时间: 2015-4-7 15:06

以下是论坛里我找来的相关帖子内容　　“黑胶虫”是近十几年才发现的一种细胞污染物，“黑胶虫”的分类目前尚无鉴定确认。　　“黑胶虫”可寄生于动物细胞，也可以生存于培养基中，依靠细胞和培养基中的营养为生，并随细胞传代而传代。“黑胶虫”与细胞竞争性生长，开始时对细胞并没有什么影响，但当黑胶虫的数量多到一定程度的时候，细胞生长就会受到影响直至死亡，严重影响了科研活动的开展和进行。所以“黑胶虫”的污染常在培养条件改变、细胞接种密度降低、细胞状态不佳时显现并使实验中断，尤其在冻存细胞复苏时可造成大量细胞死亡。　　目前比较公认的观点认为“黑胶虫”是一种微生物，增殖缓慢但对细胞有损害，数量达到一定程度可引起细胞死亡，其来源可能是细胞本身的污染或从动物取材时污染造成的。该污染在全世界细胞实验室中普遍存在，解决该问题是一个世界性难题　　关于是什么的问题的讨论　　A. 玻璃培养瓶中的类似氧化硅的东西（曾经有文献报道过）　　B. 据说这是黑胶虫，又有人说是原生动物，好象也没个统一的说法　　C. 据病毒所和军科院鉴定是一种寄生于牛血清内的一种原虫，似乎和草履虫和变形虫有类似之处，然而由于课题经费不够而不能继续进行下去。　　D. 有人说是纳米级的细菌　　其他的特点　　（1）形态上有些像细菌，直径约在0.5~1微米，　　（2）在400X倒置显微镜小，有典型的布朗运动（不规则的原地小距离抖动）。　　（3）细胞内好像也有存在，　　（4）但并不引起培养液混浊　　（5）时间稍长，细胞状态明显恶化，并最后死亡　　大家的处理　　1.换好一点的血清（我觉着和血清的关系不大）。　　2.如果是贴壁细胞的话，可用无菌的PBS洗几次，可一定程度上缓解。若是悬浮的话，就不太好处理拉，可以向其中少加一点滋养细胞（从小鼠腹腔内取的巨噬细胞，这种细胞不分裂，过一阵就死掉了，做抗体杂交瘤融合的同志肯定知道）。加滋养细胞对有黑胶虫的刚复苏的细胞很有效！还有就是实验环境要注意好，保持细胞间整个环境的洁净度。　　3.换用进口的一次性塑料培养瓶。　　4.建议清理无菌室所有物品，重新灭菌，用KMnO4熏蒸，按首次使用无菌室做，细胞重新复苏，。　　5. 在换液前先加入生理盐水并轻轻拍打，冲洗干净后再加入培养液，坚持天天洗，传代时加生理盐水再离心一次，接种密度稍大一些，一段时间后，虫子就会大大减少，对细胞的生长也不会有大的影响。　　6.有材料称minocycline具有一定的作用，可以和换液结合起来使用。　　7.可以用专门的杀黑胶虫培养基。

作者: 箭头儿 时间: 2015-4-7 15:06

还请其他朋友分享你们宝贵的经验，为大家以后的实验工作提供更多的方便！谢谢大家！

作者: cwcwcww 时间: 2015-4-7 15:06

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还请其他朋友分享你们宝贵的经验，为大家以后的实验工作提供更多的方便！谢谢大家！

调过Ph之后怎么样了？

作者: 箭头儿 时间: 2015-4-7 15:07

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原帖由 cwcwcww 于 2015-4-7 15:06 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

调过Ph之后怎么样了？

调过之后继续培养原来的细胞也还是会有小黑点（不过没有之前那么多），重新复苏一批养的还挺顺利！！

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