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标题: 跑标品的时候，竟然没有峰出来会是什么原因呀？ [打印本页]

作者: 哦买噶 时间: 2015-4-13 22:19 标题: 跑标品的时候，竟然没有峰出来会是什么原因呀？

跑标品的时候，竟然没有峰出来会是什么原因呀，隐黄素（一种脂溶性、弱极性的色素），C18柱，PDA检测器，用的流动相：乙腈：水=9：1，会不会是流动相的问题？还是其他的问题呢？

作者: 集贤阁 时间: 2015-4-13 22:19

丙酮是第一步溶解的时候用了，后来用了乙腈稀释的，不会影响很大。波长你用245吧，400多都超了UV范围了。基线不平稳的因素有很多，可能与仪器是否平衡好也有关。

作者: 哈达 时间: 2015-4-13 22:23

1、反相色谱，极性越小越难洗脱。
2、但就极性而言，水>乙腈。90%乙腈极性小于50%极性，90%乙腈的洗脱力大于50%。
3、反相色谱中不建议加入EA。
4、可以考虑，在流动相中加入一定比例的四氢呋喃或者异丙醇，增加洗脱力。

作者: 化小样 时间: 2015-4-13 22:26

丙酮在400附近已经没有吸收了，不会影响出峰。

作者: 明灰灰 时间: 2015-4-13 22:29

你需要检查一下DAD光源的设置。通常测200～300nm吸收时用于长波的钨丝灯是不开的，而你测420左右吸收时钨丝灯是必需的。

作者: 誓言@谎言 时间: 2015-4-13 22:31

90%乙腈？pda可以看全波长范围内的吸收，你挪动波长看看有没有峰。也可以用紫外看看有没有吸收和最大吸收波长。

作者: 兜兜 时间: 2015-4-13 22:33

用紫外分光光度计200-800nm扫描，有两个吸收峰其中一个在453nm吸光度1.6几和目标物差不多，还有一个245 而且吸光度9.999，且基线不是很平稳。PS：标品用丙酮溶解，吸取200μl用乙腈定溶至10ml，20μl的上样量。不知分光光度计基线不平是否与溶解用的丙酮有关，开始以为HPLC上样量少就没管了，会影响HPLC么谢谢

作者: mr.henry 时间: 2015-4-13 22:34

隐黄素的极性很小啊！
还有一种可能，在柱子上保留太强，90%的乙腈洗脱力不够。
楼主有条件的话，可以考虑用C8柱试试。

作者: 娜爷~ 时间: 2015-4-13 22:35

可我的目标物的最适波长是450nm，不清楚波长扫描还出了另外一个大峰是怎么回事

作者: 小书虫 时间: 2015-4-13 22:35

是呀，隐黄素极性很小，应该是很容易洗脱出来的，目前只能用18柱的。在反相柱里面90%乙腈应该是极性应该较大了，反相柱中90%乙腈极性大于50%极性，不知这样理解是否正确？另外，看到有流动相A乙腈：水 9：1,B乙酸乙酯，这样是不是又增大了流动相的极性？谢谢

作者: outeer 时间: 2015-4-13 22:37

有次吸收峰的，正常。8楼的建议很好，你可以试试。反相，极性越大越容易随着流动相一起早出来。

作者: 冰@舟 时间: 2015-4-13 22:38

可以试试用100%的有机相。祝你好运！！！

作者: XXXX111 时间: 2015-4-13 22:38

紫外可见分光光度计的检测波长单位是185~1100nm，一般硅光电池是190~1100，光电倍增管是185~900。450正好在仪器最稳定的中间波长区！240是不能采用的，因为乙腈在200nm左右有末端吸收！！

作者: 差不多先生 时间: 2015-4-13 22:39

想请教下，不建议流动相加乙酸乙酯是因为流动相中有水么？可能会造成哪些后果呢，因为我看到分离类胡萝卜素有几篇报道用的是这个流动相，但也听说用EA不好，有点迷糊

作者: 孤独的渔夫 时间: 2015-4-13 22:40

乙酸乙酯和水不能互溶，会损伤柱子。
反相柱在设计时，是用水、乙腈、甲醇做流动相的，用乙酸乙酯的话会损伤柱子。
尽量避免用乙酸乙酯或者二氯甲烷之类的，用四氢呋喃代替。

作者: 敬候佳音 时间: 2015-4-13 22:41

那如果不加水呢？是说上次用的时候跑完标品，跑样品的时候就出现柱压过高

作者: 倾轻地 时间: 2015-4-13 22:41

我没做过不加水的反相。不过色谱柱的说明书上有说，别用乙酸乙酯之类的。
走样品柱压高，很可能是样品里杂质太多。建议在色谱柱前加一个预柱，或者进样前过一下SPE小柱。

作者: 雨儿 时间: 2015-4-13 22:42

常见液相UV的检测波长范围是多少？pda检测器也只是到800啊。最后是要用液相做的，你自己看清楚。

作者: 落叶无声 时间: 2015-4-13 22:43

可见光波长范围400-760nm，说450nm不在紫外区没错。至于哪种紫外灯能有效覆盖那些波段，做了20年有机化学的人也未必明白，不妨给大家科普一下?

作者: 我是夜猫子 时间: 2015-4-13 22:43

乙腈cutoff波长权威数据不清楚，常见说法190nm。在200nm有吸收对基线有影响-不水平，有所倾斜。在多数情况下还是可以积分的。稍微增加点波长影响就迅速减弱。个人常用205或者210nm。
这些都和240nm没关系。

作者: 倾尽温柔 时间: 2015-4-13 22:43

450可以的，液相配的是紫外可见分光光度计，有两个光源，氘灯和钨灯，450的时候是钨灯在工作。二极管阵列检测器工作原理是复合光过样品池，再分光再到检测器。紫外可见检测器是先分光再过样品池，再到检测器。

作者: 舞疯 时间: 2015-4-13 22:44

方法本身的话，将240作为次吸收波长来测，也能行。毕竟和乙腈的截止吸收波长相差大于20nm以上了，240nm的话，根据平时做的乙腈影响的没那么大。PDA检测器是配氘灯和钨灯来匹配200-800的波长范围，考虑方法的后续可转移性，用240nm还可以用在UV检测器的液相上。

作者: 翔少爷 时间: 2015-4-13 22:44

我纳闷他有PDA干嘛不看看三维图谱，再选最佳波长，为什么要在这两个波长纠结

作者: 小米粒 时间: 2015-4-13 22:44

我不怎么建议用边缘波长，仪器稳定性的问题，还有方法的稳定性

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