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标题: 【求助】用过transwell或养过Caco-2细胞的请进 [打印本页]

作者: NBA 时间: 2015-5-11 15:52 标题: 【求助】用过transwell或养过Caco-2细胞的请进

我养Caco-2细胞,现在已经接种到6孔培养板的插入式小室(即在6孔培养板的每个孔中再加单独的小室,transwell,让Caco-2细胞长在小室的膜上),目前存在的问题是:1.细胞接种不均匀,我已在园内搜索了一些接种技巧,按照那些方法不是很有效,细胞全部集中在中间;2.细胞换液后,原来贴壁的细胞都脱落了,连在一起,用肉眼可见细胞培养液中有白色漂浮物,估计是死细胞,我以为是换液动作太粗鲁了,再换液时又加倍小心,可是那些漂浮物依然存在,不能通过换液除去;3.文献说Caco-2细胞在膜上长5-7天就可以长满,可是7天了,镜下观察,依然是中间有细胞,周围很少,怎么回事呢?有明白的高手请指点一下吧,不胜感激!

作者: 箭头儿 时间: 2015-5-11 15:52

目前我也在做这个试验，对你的问题进行讨论，共同学习。
问题一的解决：提高细胞密度，5次方以上，用移液枪均匀滴加植入millicell中即可。
问题二三：Caco-2细胞生长一定密度和时间，细胞间形成紧密连接以及细胞表面分化出微绒毛，换液不小心会导致块状脱落或被吸出，可以在每次换液时，只换部分培养液解决。对于你提到白色漂浮物，我想这可能是细胞分泌或分化过程有关。
另外，我观察了24孔培养板中培养1～30天的Caco-2，1～3天细胞间无边界、块状生长，4天后，视接种细胞密度情况，基本可以形成紧密连接。
备注：如在南京，可以面谈。细胞生长照片等整理好可以上传。

作者: NBA 时间: 2015-5-11 15:54

呵呵，我在北京，离你太远了。问一下，你是用密里博的插入式小室，即millicell么？我怀疑他们的膜不利于细胞贴壁。我的细胞接种到膜上已经一周了，但在倒置显微镜下，我只能看到中间有零星的细胞，观察不到成片的形态（不象培养瓶中形态）。如果说细胞密度少（3*105也不少了），但每隔一天换液时，培养液明显变黄，而且我还测电阻了，电阻值一直在增加，这是怎么回事呢？难道我一直没找到细胞？每次移动培养板时，可以看到有很多细胞在动，似乎细胞没有贴壁，如果是死细胞换液后就应该没有了，但换液后这些东西还在，难道是分化的微绒毛？真痛苦啊！你有没有长在膜上的Caco-2细胞形态啊！如能指点一二，万分感谢！

作者: 考拉乌拉拉 时间: 2015-5-11 15:54

膜上的细胞是观察不到的

作者: NBA 时间: 2015-5-11 15:54

啊，是么?在倒置显微镜下观察不到细胞单层么？但是有的文献说21天后可以观察到膜上细胞的形态，怎么回事呢？是不是我养的时间短所以观察不到细胞啊！问另外一个问题，你测电阻么？我的细胞在接种后的第8天电阻为（241-143）*4.2=411.6，计算公式：（有细胞电阻值-无细胞空白电阻值）*六孔板膜面积，文献上说电阻大于250表明细胞即可使用，那岂不是我现在就可以开始吸收试验了？但不是21天才能形成单层么？能帮我解释以下么？谢谢！

作者: yizhi 时间: 2015-5-11 15:55

在倒置显微镜下是不是能观察到细胞，要看你使用的transwell是什么材料的，如果买的是聚碳酯的只能染色后观察，如果买的是透明聚酯膜就可以直接观察了
纹鹿你在北京哪个单位，我也正在做Caco－2相关试验，可以交流一下吗？

作者: bring 时间: 2015-5-11 15:55

我也正在做这个实验，我在往膜上种细胞后，与你的现象正相反，中间有一个缺口，边上的细胞到练成一片。不知道是不是细胞种的不匀。还是没有长融合，或者是被细菌破坏了，在显微镜下是看不到细胞的，所以各种因素都不能确定，我种的密度是5次方，也不行，很郁闷。我在天津

作者: any333 时间: 2015-5-11 15:56

我做过的，不过也不是什么高手，应该是要测膜电位来确定是否单层完全融合吧，换液的时候一定要轻，不能够碰到下面的，说时候transwell也实在说太贵了，一个那么小的孔就是30快钱，还是一次性的。

作者: iii_ii 时间: 2015-5-11 15:56

大家好！
高兴看到这个帖子。请问：药物也要做倍比稀释吗？
有没有统一的阳性对照？结果怎么分析呢?
还有，我现在培养瓶里的细胞3天就可以基本长满，
为什么millicell要21天呢？
非常感谢，！！

作者: DCS 时间: 2015-5-11 15:56

相关疾病：
结肠癌
您好，我是北京的，现急切需要CACO－2或HT29结肠癌细胞株从事毒理学实验，不知你可以赞助赞助我或卖给我，或者交换吗，谢谢！

作者: mickeylin 时间: 2015-5-11 15:56

我也正在养CACO-2 细胞，培养了快18天，细胞在TRANSWELL 上漂着一层膜，我不确认除了这膜紧贴着TRANSELL上是否也又一层膜

作者: yychen 时间: 2015-5-11 15:57

看到这个标题时真是激动了一会，因为我也要开始养Caco-2细胞了，请大家指教啊。买那millicell是不是就是他们说的插入式培养皿啊？造这个模型是要什么样的装置？是millicell好还是transwell好？

作者: dior 时间: 2015-5-11 15:57

我这有一包millipore的millicell插入式培养皿，买了有两个月，但是现在做实验发现和我们的染毒装置不配套，所以现在想转卖掉，型号PICM03050,可以和六孔板配套，只是和我们另外一套染毒装置不配，想要的同志可以联系我啊，价格绝对优惠。谢谢！

作者: gmjghh 时间: 2015-5-11 15:58

大家好！
我也正在用millicell养caco-2细胞，我用0.4um的多聚碳脂膜，所以接种细胞后在显微镜下是看不到细胞的，只能看到密布的小孔。
但是等到十几天后，细胞开始分化（我观察认为是分化了）时，可以在镜下看到一些聚集的小亮泡，轻摇六孔板，它们还会随之摆动，但是无论换液还是pbs冲洗都是不会被冲洗下来的，随着越接近20d，它们会越多，所以我觉得这些可能就是分化后的微绒毛吧。
还有，楼主所说，8d电阻值已经到达>200的要求，这只是评价此模型完整性的一项指标吧，电阻值符合要求但是如果未到21d以上，模型没有分化完成，也是不能进行下步试验的。
以上只是我试验中无数碰壁后的一些经验，希望大家多交流~~

作者: youyou99 时间: 2015-5-11 15:58

我用的是0.4um的多聚碳脂膜，养的是bend。3细胞（小鼠脑微血管内皮细胞），不知道怎么回事，今天是种进细胞的第四天，细胞的电阻没有明显变化，我接种的密度是2.5×10的5次方，难道是细胞没有贴壁？同瓶细胞种24孔板，第2天就基本长满了。因为膜是半透明，看不到细胞的情况。我的transwell里面的培基一直都满红的。

作者: feiya 时间: 2015-5-11 15:59

大家好！大家讨论的很激烈啊！我最近也要开始养Cao-2细胞了，正在准备transwell培养板，不知道大家都是在哪个公司买的，价格如何？最小包装是多少？急需得到大家的帮助，也希望能多学习！谢谢！

作者: feiya 时间: 2015-5-11 15:59

你们使用的0.4um的多聚碳脂膜都是在哪买的啊？要用来养caco-2，刚开始准备，好多不懂，跟你们学学，谢谢！

作者: shkudo 时间: 2015-5-11 15:59

我的是millicell公司出的

作者: feiya 时间: 2015-5-11 16:00

请问小室都要铺胶吗？从哪买胶啊？听说胶的保质期很短，只有3个月，还有具体怎么操作啊？好多问题不懂，谢谢！

作者: feiya 时间: 2015-5-11 16:00

我刚定了Corning公司的，通过华粤行仪器公司，说是40-50天到，货号3401，12孔板，聚碳酸酯膜，膜孔径0.4um。有需要买胶的同志吗？可否合买？我在郑州，谢谢！

作者: dog002 时间: 2015-5-11 16:01

顶,学习,请问大家有没什么资料可以共享啊,我也要养caco-2细胞了.什么都不懂啊

作者: gmjghh 时间: 2015-5-11 16:01

看到这个帖子太激动了，遇到这么多有经验的同行，多多指教啊，我养这个细胞半年多了，一直是在25平方厘米的培养瓶里面养，但是非常糟糕，刚开始长的很好，1：3传代都差不多第三天就长满了，可是传过几代后就越来越不好了，贴壁活的越来越少，而且瓶子中间部分扎堆，边缘却越来越少，并且生长缓慢，而中间越挤越密会出现很多空泡，慢慢就都死掉了。并且培养期间培养液很脏，很多黑色物质，但是培养基颜色没有变黄也不浑浊。请问有人知道这是怎么回事吗？
PS：纹路和serchina分别是北京和南京什么单位啊？还在养这个细胞吗？我是石家庄，可以好好交流下吗？

作者: caihong 时间: 2015-5-11 16:02

跟HT29的情况差不多

作者: 箭头儿 时间: 2015-5-11 16:02

原因可能是细胞消化不彻底，只消化到了块状的细胞团，就简单吹散就传代了，块状的细胞团换液时就丢失了，这种情况下细胞越传代数量就越少。这个细胞在局部融合后就会形成紧密连接，光学显微镜下观察像网格样结构，很难消化分散。
解决办法：
（1）PBS洗1~2次后，37度的胰酶消化5~20min，镜下观察直到用手轻拍就有大量单个细胞脱落，
（2）对于传代后的细胞，每次传代的细胞不要培养太长时间，<5~7d，按照这样两点基本可以解决培养问题了。
另外培养过程中，有些细胞分泌物分泌到培养基中，镜下可以见到絮状颗粒，PBS冲洗2~3次就可以去除了。

作者: 笑弯了腰 时间: 2015-5-11 16:03

我的情况正好与你相反，用的是玻璃瓶，总是中间少，边缘多，周围好多同学也都出现了这种情况，不知道是什么原因？

作者: 笑弯了腰 时间: 2015-5-11 16:03

不知道什么情况我的HT-29长着长着就出问题，不怎么贴壁，并且细胞间很多颗粒物，难道是培养基有点偏碱的原因吗？谢谢！

作者: JK.jon 时间: 2015-5-11 16:04

请教：我的Caco-2一般都是1：3或1：2的传代，不知道怎么回事，昨天传的有点稀，今天一看细胞几乎都不贴壁，也不知道是密度小的问题还是培养基有点偏碱的问题，请问大家遇见过这样的情况吗？需要怎么补救啊？

作者: bs4665 时间: 2015-5-11 16:04

（1）insert 内一般不用铺胶，适量的细胞在膜上分散均匀就行了，
（2）在配制DMEM培养基时，用pH计测量，试纸比较粗糙，主观因素大，另外每次传代时都进行细胞计数，做好记录。至于细胞不贴壁，我不好说，培养基偏碱可能性比较大，，一般这个细胞传代后2~4h就大部分贴壁了，11/11到现在时间比较长了，如果有1/3贴壁就更换新鲜培养基培养，贴壁的细胞太少就没有好的补救措施了，重新配制培养基，复苏细胞，传代3次后可以实验了，估计10~20天吧。

作者: shkudo 时间: 2015-5-11 16:05

非常感谢！虽然细胞密度很小我还是决定明天消化下，看看情况有没有改善。另外我11号复苏了一管效果非常不好，没有离心，也没有几个贴壁的，好郁闷啊！

作者: vvmmoy 时间: 2015-5-11 16:05

请问你的膜上铺胶了吗？是哪个公司的啊？铺时都需要注意哪些？谢谢！

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你好！我之前询问过前辈，他们都说transwell可以不用铺胶的，因为铺胶的目的是增强细胞贴壁，caco-2在transwelll膜上本身贴壁就很牢固，不知道你试过没有，在膜上生长20多天的caco-2，是没法消化下来的，清洗膜时就是用棉球擦拭，也需要反复几次才能干净。
我没有铺胶，长着的细胞也很好。

作者: milkdog 时间: 2015-5-11 16:06

相关疾病：
楼上的，我是新手，能否传几张长的比较好的caco-2细胞的图片看看，怎么感觉这个细胞长的有点怪，（可能看惯肿瘤细胞了），呵呵

作者: feiya 时间: 2015-5-11 16:06

我的细胞都快长没了，不知道什么原因，传代后一层一层的细胞死亡，真崩溃！

作者: popo520 时间: 2015-5-11 16:07

对于改善 caco-2细胞生长状态，有以下几点：
1、提高血清浓度
2、勤传代，勤换液，防止细胞老化
3、传代时，细胞密度不宜过低
4、消化时间3-5min，我用Hyclone的胰酶，吹打时注意力度
5、离心2次，第一次800转，3 min，倒上清，用PBS混悬，1000转，3 min
我也在millipore的膜上养细胞，细胞消化后直接种板，10^5cells/ml，21天TEER300-400,换液过程中动作一定要轻，防止把细胞膜吹起，至于细胞形态，我是用透明的膜，但镜下观察不明显

作者: dior 时间: 2015-5-11 16:07

请教各位：我正在养的Caco-2细胞出现问题，电镜视野下有貌似絮状的大团漂浮物，观察培养瓶底部有白色凸出的小点，因为transwell太贵，所以试着在普通24孔板上接了一些，结果漂着的东西越长越多。肉眼就能看见大团的白色雾状漂浮物。拍了照片，可是图太大，传不上论坛上来~请教各位，是什么污染么？还是细胞死太多？（培养瓶中的细胞除了有上述漂浮物外，生长状态挺好的，3天就必须要传代了）
多谢各位指教！！

作者: dior 时间: 2015-5-11 16:07

因为目前做实验的细胞房进出风口都是仓库，所以污染很大~~养Caco-2两个月来，一直都不顺利~~
现在急觅在做Caco-2的实验室，请问各位的实验室是否接受外来同学，可以以合作的形式进行，我导师可以支付费用~~烦请大家咨询下导师或老板，多谢！！祝大家细胞养得顺利~~

作者: dior 时间: 2015-5-11 16:08

cuturl('www.bufotanine.com/html/0714/3b3c.html')
这个网址上有Caco-2的图片

作者: dior 时间: 2015-5-11 16:09

你提到的“培养过程中，有些细胞分泌物分泌到培养基中，镜下可以见到絮状颗粒，PBS冲洗2~3次就可以去除了。”请问，这些絮状颗粒到底是什么样子？我的Caco-2中有一团一团疑似死细胞的漂浮物，而且随着培养传代的进行，会逐渐增多，能观察到培养瓶中有白色颗粒状凸起，请教：这是污染还是你所指的分泌物？谢谢！！要是方便，可否告知一下邮箱，我把图片发给你，图太大，没法传到论坛上来~~多谢！！

作者: feiya 时间: 2015-5-11 16:09

大家好！我用的是12孔Transwell板，不知道每孔种多少细胞合适，想听听大家的建议！谢谢！

作者: gmt 时间: 2015-5-11 16:10

transwell细胞小室实验中upper chamber细胞数和均匀度很重要，一般在制备单细胞悬液时要求吹打均匀，100次左右，这样种的细胞就不会出现集中性或四周密集型生长的特性。而且在进行细胞计数时我们一般计数一块计数板的8个大方格细胞数/8 *10000.

作者: bring 时间: 2015-5-11 16:10

我在用transwell 做的是表皮细胞,没有涂胶,感觉长的很不好. 是不是细胞密度低的原因呢? 还是在这膜上就是不容易长?

作者: feiya 时间: 2015-5-11 16:11

你好！请问你用的是哪个型号的板啊？细胞密度有多大？谢谢！

作者: feiya 时间: 2015-5-11 16:11

我得只在中间有点细胞，种前也计数了，按2*10的5次方种的，但只有稀稀拉拉的几个细胞，很崩溃啊！

作者: zhy平平 时间: 2015-5-11 16:12

我是广州的，正在养caco2，目前长得不错，感觉还是要进口血清。只是在消化时发现这种细胞真的很容易成块掉下来，吹打也很难完全吹散，所以种板时容易成团。大家继续交流啊，受益匪浅！

作者: 阿敏 时间: 2015-5-11 16:12

问个小问题，就是种在24孔板的millicell，miliicell的直径是12毫米，那膜的面积应该是3.14*0.6*0.6=1.1平方厘米吧，但是我怎麽查到的文献是0.6平方厘米呢？
另外就是空白电阻的测定，是将一个不种细胞的millicell加培养基后测吗，然后一直培养，每次测电阻时，以它为空白，还是总共测一次空白电阻就可以，谢谢

作者: tudou85 时间: 2015-5-11 16:12

我也要开始养Caco-2细胞了，说是需要测电阻值，不知道在测得时候怎么样能够保证无菌状态呀！

作者: any333 时间: 2015-5-11 16:13

请教各位，我是新手，能否介绍几个测TEER的细胞电位仪的厂家及报价吗，一般用那个品牌的性价比高，我们实验室刚开始做Caco2实验，老板不可能买太贵的仪器。我查过evom resistance voltohm meter，上海有，报价2万多，太贵了。谢谢。

作者: vvmmoy 时间: 2015-5-11 16:13

我的细胞养着养着现在都不见了不知道怎么回事在膜上和瓶里都是这样的不知道怎么回事刚开始接种到膜上和瓶里都蛮好的结果现在只见膜上中央有一层镜下观察到的不清楚的蒙蒙一团东西疑似细胞分泌物怎么除去它呢？我的细胞怎么了？急！！！希望高手指教不甚感激！！

作者: woshi 时间: 2015-5-11 16:14

很可能是你接种的时候细胞没有弄均匀，都集中在中间，还有transwell膜是半透明的，在显微镜下你无法看到细胞及细胞形态

作者: www.1 时间: 2015-5-11 16:14

transwell细胞小室实验中upper chamber细胞数和均匀度很重要，一般在制备单细胞悬液时要求吹打均匀，100次左右，这样种的细胞就不会出现集中性或四周密集型生长的特性。而且在进行细胞计数时我们一般计数一块计数板的8个大方格细胞数/8 *10000.

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吹打100次？？？这么多次不会影响细胞的活力吗？毕竟机械损伤也是有影响的。我做的transwell也感觉少中间部分扎堆，边缘细胞比较少，分布不是很均匀。这好像是跟液体张力之类的物理学原理有关吧。我种的24孔板也是中间密度很高，周围很低，接种前已经吹打很多次之后才加样的啊。不知道各位站友有什么好办法？

作者: jude 时间: 2015-5-11 16:14

请问一般铺胶的浓度是多少？？？

作者: #甜# 时间: 2015-5-11 16:15

请问CACO-2做转运实验用的TRANSWELL的规格我们一般用多少的啊，我准备买CORING的，膜直径和膜孔径，几孔合适啊？

作者: qianqin1977 时间: 2015-5-11 16:19

我想请教
在包被transwell过程中遇到问题。
想在transwell上包被matrigel，培养caco-2细胞，按照caco-2培养手册中的方法应该把I型胶原稀释成0.9mg/ml，但是matrigel说明书中除了做3d基质有浓度和量的限制以外，对于包被的说明很笼统，说按需要稀释，园子里说法很多，没有找到令我满意的答案，能不能告诉我一下，应该什么浓度，多少ug胶原/cm2，

作者: qianqin1977 时间: 2015-5-11 16:20

我给BD工程师打过电话了，他说只能在3倍稀释以内，包括包被也不能稀释太多，谢谢各位

作者: whitesheep 时间: 2015-5-11 16:21

看到这个帖子太激动了，遇到这么多有经验的同行，多多指教啊，我养这个细胞半年多了，一直是在25平方厘米的培养瓶里面养，但是非常糟糕，刚开始长的很好，1：3传代都差不多第三天就长满了，可是传过几代后就越来越不好了，贴壁活的越来越少，而且瓶子中间部分扎堆，边缘却越来越少，并且生长缓慢，而中间越挤越密会出现很多空泡，慢慢就都死掉了。并且培养期间培养液很脏，很多黑色物质，但是培养基颜色没有变黄也不浑浊。请问有人知道这是怎么回事吗？
PS：纹路和serchina分别是北京和南京什么单位啊？还在养这个细胞吗？我是石家庄，可以好好交流下吗？
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我是广西的，不知道你用的培养瓶是哪个厂家的，我之前用了一种，也是这种情况，后面改用康宁的细胞培养瓶，现在细胞长得很好呀~~

作者: whitesheep 时间: 2015-5-11 16:21

我用caco-2细胞做转运试验，可是培养21天后测定电阻，扣除空白后电阻值大概就在600左右，可是做出来的结果重现性很差，不知道为什么，请高手帮帮忙，小女子万分感激！

作者: xue258 时间: 2015-5-11 16:21

各位战友好！
我也正在用transwell培养板养Caco-2细胞做药物运输实验。刚开始做前期的准备工作。有些问题想请教大家。
1.今天有用鼠尾胶原包被通透膜，按说明书上所说室温开盖在超净台上晾干1小时后，仍为凝固成胶。如果我今天铺胶不成功，我可以在此基础上重新铺胶吗？还是该清洗后再用呢？我该怎样清洗通透膜同时防止它染菌呢？
2.如何接种细胞使其能均匀生长？
3.如何用PBS清洗细胞？
4.如何加入、吸弃培养基不破坏细胞层？
敬请各位高手不吝赐教！

作者: yizhi 时间: 2015-5-11 16:22

养Transwell几天后下层总会出现一些很小的东西，时间越久越多，在镜下还可以看到在动，请高手指导一下那是什么东西啊？染菌了吗？很困惑

作者: ns5fan 时间: 2015-5-11 16:23

污染了

作者: panda王 时间: 2015-5-11 16:23

我给BD工程师打过电话了，他说只能在3倍稀释以内，包括包被也不能稀释太多，谢谢各位

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貌似咨询有些晚了，还是想问，书上说1:8稀释呢
真的用基底胶基质取代鼠尾胶原可以吗？求具体操作，多谢！

作者: panda王 时间: 2015-5-11 16:24

（1）insert 内一般不用铺胶，适量的细胞在膜上分散均匀就行了，
（2）在配制DMEM培养基时，用pH计测量，试纸比较粗糙，主观因素大，另外每次传代时都进行细胞计数，做好记录。至于细胞不贴壁，我不好说，培养基偏碱可能性比较大，，一般这个细胞传代后2~4h就大部分贴壁了，11/11到现在时间比较长了，如果有1/3贴壁就更换新鲜培养基培养，贴壁的细胞太少就没有好的补救措施了，重新配制培养基，复苏细胞，传代3次后可以实验了，估计10~20天吧。
......

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隔了好久，但从回复言语，直觉告诉我您应该做的比较成功，求指教
1、CACO-2在培养瓶中不到3天就快长满，在小室内，21天不早飘起来吗？真只用隔天换液体？
2、真不用铺鼠尾胶原，看到后面有战友7天就飘起来，求您的操作除了半换培养基之外，其他注意事项！
3、我要做的是药物干预细胞，测电阻值，小室内在电阻稳定后加含药物培养基，外层培养基加需要血清吗，具体培养及是？
拜托了

作者: ldh 时间: 2015-5-11 16:25

我最近也在做这个，请教楼主在一般显微镜下看不清细胞的生长状况，有什么办法可以判断是否染菌啊？

作者: langlang 时间: 2015-5-11 16:25

放那两三天不换液看看黄不黄臭不臭，或者吸出来部分液体显微镜观察看看

作者: dadada 时间: 2021-12-10 11:14 标题: 回复 #60 panda王的帖子

您好，请问您做成功了吗，想知道您是否遇到过细胞悬液中的细胞聚集在膜中间的情况？您建造的模型会脱落吗？我的总是八天、最晚十六天就开始出现脱落情况，现在不知道会不会是没铺鼠尾胶原的缘故，能指点一下吗，马上就要毕业了，一直做不出来，求指教

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