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标题: 【讨论帖】心肌细胞的密度，跳动频率，跳动幅度和... [打印本页]

作者: NBA 时间: 2015-5-11 16:27 标题: 【讨论帖】心肌细胞的密度，跳动频率，跳动幅度和...

相关疾病：
盲
各位老师好：
我养心肌细胞也快两年了，开始自己在学校养的就是原代心肌细胞（Primary Cardiomyocytes, PCM），说句实话，开始养的时候，没人教的，自己以前也没养过细胞，看着丁香园和文献资料，自己总结瞎摸索，竟然也养出来了，细胞洁净度还可以，基本没污染过；现在嘛，在一家外企里，主要也是种植PCM，有仪器可以观察PCM的Beating rate 和Amplitude，现在稳定时的一般细胞Beating rate是90-100次/min，Amplitude是0.07（根据细胞跳动对电极阻值的变化计算得出），但在这有前辈稳定时做过Beating rate是120次/min左右，Amplitude是0.15（其人现已出国）。自己也希望能进一步改进，故在此有几个问题和大家商量一下：
1.96孔板细胞密度为多少时，细胞跳动的Beating rate和Amplitude会达到最好状态？（在实验水平稳定情况下，我自己的PCM密度是15K/well，而我们这前辈却是10K/well）
2.细胞计数时，什么样的细胞为心肌细胞，标准是什么，大小、形状？若是大小，若是以大小评价多大算是可以？
3.细胞密度是不是尽可能的越大就越好，这样细胞搏动一致性好，还是保持在一个合适的密度较好？
4.细胞老化问题，PCM消化不完全会起跳早，老化也早；消化稍过，会起跳晚，但成纤维细胞也长起来，造成干扰；我做过较早的有12h时就能跳，晚的有3-4d才跳。所以，细胞消化成什么状态才能算比较好，细胞跳动时间不早也不晚，持续跳动时间也很长？我们这有前辈24h开始跳，可持续跳动7d，细胞频率为90次/min以上，Amplitude是0.1以上。这其中关键的问题在于消化，怎样把握消化水平？

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作者: vvmmoy 时间: 2015-5-11 16:28

楼主能否把你具体分离心肌细胞的过程帖出来，让我们这些初学者学习一下。我也是自己一个人按着丁香园上的帖子做的。培养的细胞洁净度很差，有很多死细胞帖子心肌细胞上，很难把它们洗下来。不知楼主如何处理这个问题？
不好意思楼主的问题，我都还没有经验:
第2个问题：细胞计数时我计得是那些大一点的，稍圆，看着饱满一些的。那种小小的应该不是心肌细胞，不知对不对
第4个问题：我觉得用胰酶联合胶原酶不管细胞数量还是活力都较单用好，第二天换液之后，细胞跳动频率和力量都较好.
把这个帖子顶起来，急需要这方面的经验
这是我的图片：

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作者: NBA 时间: 2015-5-11 16:30

下面的是我们这的前辈写出来的protocol，我们一直也用的是这个，仅供参考！
Preparation:
0.1% gelatin: 0.1g gelatin in 100ml PBS. After high pressure sterilization, gelatin dissolve and solution will be clear. Store at 4 ℃.
Digest solution: 0.07% Trypsin with 0.05% Collagenase TypeⅡin HBSS.
Coating methods: Add 50ul 0.1% gelatin to every well. Move the 96-well plate in 4°C. Overnight. Then get rid of gelatin solution. Move the plate to normal incubator.
Methods:
All experiments were performed in accordance with the Guide for the Care and Use of Laboratory Animals published by the US National Institutes of Health (NIH Publication No.85-23, revised 1996).
Cardiac ventricular myocytes were prepared from 1- to 2-day-old Sprague-Dawley rats and rats would be kept in warm temperature.
Cutting and isolation of hearts:
Rats are sterilized by 75% alcohol. Cut chest wall and isolate heart by scissors. Hearts from neonatal rats should be rapidly excised, rinsed in ice cold DMEM, washed to remove blood and debris. Remove atriums from isolated hearts. Ventricles are left and moved in a bottle which with HBSS. Then ventricles are shredded into tissue fragments (1mm3). Get rid of HBSS. Add digest solution, move into normal incubator to begin digestion.
Myocytes digestion:
Tissue fragments are digested by stepwise trypsin and collagenaseⅡ. Each step needs 8 min, shake bottle every 4 min. Use glass pipette to blow the fragments. Aspirate supernatant and move into another tube with 10% FBS DMEM to stop digestion. Repeat the steps (4-5 step) until the fragments disappear. Centrifuge cell suspension with 800 rpm for 5min. And get rid of the suspension. Now the cells are in the bottom of tube. Add DMEM (10%FBS) and re-suspend the cells. Filter cells with filter (200 mesh).
Myocytes enrichment:
The dissociated cells are preplated to 25cm2 culture flask and back to incubator. Use 60 min differential adhesion to enrich the culture with myocytes. The nonadherent myocytes suspension is moved to a tube. The cells are counted and adjusted to a desirable concentration by adding DMEM with 10%FBS.
Myocytes plating:
Add 100ul cell suspension to each well. Cells are cultured in 96-well plates and are maintained at 37°C in a humidified incubator with 5% CO2.Change the medium at 48 hour. And put the plate in the station and record the impedance signaling. After 12h, cells would be used for experiments.

作者: NBA 时间: 2015-5-11 16:30

QUOTE:

原帖由 vvmmoy 于 2015-5-11 16:28 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

楼主能否把你具体分离心肌细胞的过程帖出来，让我们这些初学者学习一下。我也是自己一个人按着丁香园上的帖子做的。培养的细胞洁净度很差，有很多死细胞帖子心肌细胞上，很难把它们洗下来。不知楼主如何处理这个问题？
不好 ...

细胞洁净度的处理，我在DXY上看到过一位前辈曾说过，换液时可以可用PBS洗几遍，好像会少一些；我个人认为，死细胞是无法避免的，所以我们只能去尽可能的优化条件去减少死细胞的数量，而贴壁的死细胞可能与我们的培养条件有关，因为细胞是已经贴壁然后再死的（时间长了也会死的这个不算在内）。而整个心肌细胞培养的过程我觉得最关键的可能在于消化的控制，心脏剪碎和取心脏，因为这一方面决定了细胞的生长的状态和细胞活力，另一方面关乎细胞培养的结果可重复性，而在消化和取心脏过程中，我们应该尽可能的去注意条件和操作手法的控制（如消化时间，细胞冰浴，心脏取的大小等）。
对于台盼蓝细胞计数，我一般也是数的是大的圆的，但有一些也是大的，形状不规则的，有时数量还比较多，不知各位老师也是否计算在内，我一般是计算的。从我使用的protocol来看，我用的也是混合酶消化，但同样的操作条件下，优秀结果的重复性太差，每次细胞的频率和幅度也不完全一致，可能因为仪器是通过检测，所以能够较精确的比较每一次的结果差异性，跳动的频率有时60多次，有时90多次；同时间细胞的跳动幅度也不一致；且细胞起跳时间也不一致，有时24小时就跳的非常好，而有时48小时才跳的勉强接受。
不知各位老师对于心肌细胞原代培养有什么独特的好的想法，欢迎您提出来，我们大家共同讨论，三个臭皮匠顶一个诸葛亮嘛，祝每一次都能做出比较完美的结果，谢谢您！

作者: 如影随形 时间: 2015-5-11 16:31

楼主的照片很好看啊，我现在也在养心肌细胞。想请教楼主几个问题：
1：楼主养的是什么的心肌细胞，我养的是SD乳大鼠（3天内）的原代心肌细胞和成纤维细胞，两种细胞我都要养，就分离纯化很麻烦，现在也没有纯化的很好，想向你请教下。
2：楼主是怎么纯化的啊？差速贴壁？多久的差速，还有您用的消化酶的类别和浓度，以及消化的时间。
3：我的心肌细胞跳动的也有一周的时间了，但是就是这些活性好的心肌细胞在我养的cfs瓶中跳的很欢快，并且这片的整个视野都在同频率搏动，太郁闷了。
4:楼主有没有在用5溴脱氧尿苷，你调的加入心肌细胞的瓶中的终浓度是多少的啊？？
十分期待楼主能够回帖。谢谢~

作者: NBA 时间: 2015-5-11 16:31

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原帖由 如影随形 于 2015-5-11 16:31 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

楼主的照片很好看啊，我现在也在养心肌细胞。想请教楼主几个问题：
1：楼主养的是什么的心肌细胞，我养的是SD乳大鼠（3天内）的原代心肌细胞和成纤维细胞，两种细胞我都要养，就分离纯化很麻烦，现在也没有纯化的很好，想向你请教下。
...

谢谢这位战友，谢谢您的夸奖，图片虽好看但并不能解决我所遇到的问题。
关于您的问题，我使用的Protocol中有的，您可以再看看；你所遇到的问题，就我知道的回答如下：
1. SD乳鼠心肌细胞，分离纯化多用差速贴壁法分离，这样得到的纯度不是非常高，一般是够用的，看你实验而定；若需要高纯度心肌细胞的话，有条件可用hESCM细胞（胚胎细胞诱导分化的心肌细胞，国外多用），而高纯度成纤维细胞，不好意思，我也不是很了解；
2.差速贴壁法60min即可，若希望心肌细胞纯度高，可以延长至90min. 消化酶：0.07% Trypsin with 0.05% Collagenase TypeⅡin HBSS，Each step needs 8 min, shake bottle every 4 min.
3.心肌细胞的特点之一就是同步性，这是正确的，为什么会郁闷？
4.我没有使用5-Brdu，若用的话，也可以的，前三天加入0.1 mmol/L，这园子里都有很多的，有时间你可以搜搜看看。
谢谢您的参与！

作者: iii_ii 时间: 2015-5-11 16:32

楼主，我也是养心肌细胞的，上年做了很久，都没有问题，后来就停了，今年又要做但怎么做也做不出来了，完全按以前的方法，细胞就是不活，老板催了很久再不活估计要怒了，真不知道问题出在哪里了，楼主分享下经验啊

作者: NBA 时间: 2015-5-11 16:32

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原帖由 iii_ii 于 2015-5-11 16:32 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

楼主，我也是养心肌细胞的，上年做了很久，都没有问题，后来就停了，今年又要做但怎么做也做不出来了，完全按以前的方法，细胞就是不活，老板催了很久再不活估计要怒了，真不知道问题出在哪里了，楼主分享下经验啊 ...

你先把你的实验方法和步骤写出来，我们才能知道可能的问题在那些方面.
我的经验和方法都在论坛里写出来了，还有可以参考一下论坛里的专题总结，有很多优秀的内容，我相信你的问题肯定有人遇到过，肯定可以解决好的

作者: iii_ii 时间: 2015-5-11 16:33

谢谢楼主的回答，想再咨询几个问题。
1、从您的Protocol中看，您是先离心再进行细胞筛过滤，这样做和先过滤再离心有什么差别？我们一般是先过滤再离心，并且是1000rpm、8min，是不是对心肌细胞会有较大的影响？
2、还有对于消化过程中的过多的胶原，你是怎么处理的？我们用的也是复合消化，胶原酶Ⅱ的浓度都加到1g/L了，可是在消化过程中还是有很多的胶原，上清不是很好吸取，想请教楼主有什么更好的办法没有？有很多文献中讲到在心肌细胞中的胶原主要是Ⅰ型和Ⅲ型，那用Ⅱ型的胶原酶效果又体现在哪里呢？
谢谢~~

作者: NBA 时间: 2015-5-11 16:33

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原帖由 iii_ii 于 2015-5-11 16:33 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

谢谢楼主的回答，想再咨询几个问题。
1、从您的Protocol中看，您是先离心再进行细胞筛过滤，这样做和先过滤再离心有什么差别？我们一般是先过滤再离心，并且是1000rpm、8min，是不是对心肌细胞会有较大的影响？
2、还有对于消化过 ...

我知道的可能原因如下，如有不妥之处，请各位老师指点：
1. 先过滤再离心和先离心再过滤我个人觉得在本质上是没有什么差别的，我们先离心再过滤的可能是我们习惯的问题吧，我觉得消化下来的细胞在消化液中停留的时间越短损伤就会越小.
2. 我们使用的胶原酶浓度为0.05%，你说的“胶原”我猜测可能是细胞破碎释放的DNA，若条件可以，可加一些DNA酶，就没有难吸的粘稠物了。我没有用DNA酶，我的办法是消化静置以后，轻吸上清，不进行吹打，消化10多次后，再用含血清培养基进行吹打。另我好像记得sigma的Ⅱ型胶原酶更适合消化心肌组织，但具体原因没有深入了解过，抱歉！

作者: xevin 时间: 2015-5-11 16:33

谢谢楼主，我昨天第一次养心肌细胞，但今天看状态很不好，贴壁松，不舒展，未见伪足，更加没有搏动，我把步骤大概写一下，希望楼主指点一二：
一共用了6只乳鼠，整个过程中，除了洗心脏和剪心脏用PBS+glucose外，中和用的培养基是含钙镁的，配胰酶用的溶液是PBS+glucose，即不含钙镁的：
1. 75%消毒小鼠，消毒后小鼠是活的；
2.开胸，迅速取出心脏，置PBS+glucose溶液；同样的方法处理其余5只乳鼠；
3.修剪6只乳鼠心脏，之后剪碎（剪不成1 mm的，大约1-3 mm不等吧；我是全部心脏取出来之后，统一修剪再统一剪碎，这样会不会不好？）；
4.胰酶（Gibico，买来就是配好的，0.25%，含EDTA，稀释成0.8%，用PBS+glucose稀释，胰酶事先已温育）消化，6只乳鼠同在一支50 ml离心管，放7 ml胰酶，37度水浴，10 min，边浴边轻摇（整个过程都在轻摇，基本没怎么间断，是不是不好？）；
5.取上清（没有静置）置于另一支50 ml离心管，该管置于冰中，预先放置预冷的20% FBS+M199（含钙镁）；
6.继续加入7 ml胰酶，37度水浴消化，消了6次，分别是10 min，10 min，6 min，10 min，6 min，6 min，取上清和中方法同上；最后三次消化可见胶冻状物质，我用枪头较用力吹打，可打散；
7.3支离心管离心收集细胞（未过滤），以68 g，5 min离，见不到沉淀，换用200 g 5 min，沉淀还是不明显，将看到的沉淀吹散后以300 g 10 min离心，可看到少许沉淀；
8.每支离心管以2 ml培养基重悬，种6孔板中的3个孔（1支管的东西种一个孔），镜下观察只有第3支管（即最后两次消化得到的上清）细胞才多，前两个支管收集的细胞加起来都没有第三支管一半多，而且有支管的细胞不透亮，稍有皱缩（今天看这个也的细胞基本死光）；
9.差速1 h。

作者: NBA 时间: 2015-5-11 16:34

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原帖由 xevin 于 2015-5-11 16:33 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

谢谢楼主，我昨天第一次养心肌细胞，但今天看状态很不好，贴壁松，不舒展，未见伪足，更加没有搏动，我把步骤大概写一下，希望楼主指点一二：
一共用了6只乳鼠，整个过程中，除了洗心脏和剪心脏用PBS+glucose外，中和用的培养基是含钙镁的，配 ...

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先天性卵巢发育不全综合征

第一次养能注意到这么多细节并且做到这一步，已经很不容易了，没关系，不要担心，肯定很快能做好的！
1-2 步：我觉得你的做法应该是可行的
3：心脏取出后，可以稍微挤压几次，尽可能减少心脏内的残留血液，我觉得不要担心弄裂心脏，因为后来还要剪碎的，还有血小板等细胞可能在消化过程中会破碎和残留，无论哪种情况对后来的心肌细胞都不好的；心脏集中起来一起剪碎是可行的, 至少我一直都是这样做的,没发现有明显的问题的.
4-6 : Trypsin浓度是可行的，只是我觉得单独使用可能会使细胞的损伤较大，需要的时间和酶量也较多，若有条件可以尝试使用两种酶（即trpsin+collagen 2），这样消化会快一些，损伤相对也小一些，不过trypsin单独使用也是可以的，消化液的量可以适当降低看看，摇晃动作不要太剧烈，摇晃轻柔一些，其实静置也行，中间时摇几下即可，我们是10只乳鼠约4-5mL，8 min/time，消化约10-12次。
7：离心速度一般在800-1000 转/分钟，其实细胞在800时即可离心沉淀，低于800肯定是不行的，细胞沉淀不了；高于1000细胞会死亡率较高，一般中和后因为血清和消化液较多，整个细胞悬液浓稠度较高，可以用1000 转/分钟离心，转速较低时细胞可能难以沉淀，得率较低。
8：细胞密度要在合适的范围，可以尝试一下不同浓度，因为每个人每一次得到的细胞活力和状态都有差异性的，除非技术非常稳定，次与次之间的差异性才会会减小，但每个人得到的细胞也会有差异的，而且一般来说差异会比较大；所以你可以接种几个密度，在细胞长开后能连成一片，一起跳动的，否则细胞较稀，一般只有自律细胞才会跳动，其它细胞基本不跳的，当然，如果不需要观察跳动，那就没必要了。
9：差速贴壁1hr基本是够的，如果想要更纯一点的细胞，可以差速贴壁两次，45min/time，我一般第二次贴壁后还是能发现有相当一部分的成纤维细胞等细胞贴在瓶里（已经长出一些类似伪足的触角），这是从形态上观察的，而心肌细胞贴的也有一部分贴壁了，不过这肯定是要损失的，这样细胞的纯度也相对较高了。
祝实验顺利！

作者: NBA 时间: 2015-5-11 16:35

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先天性卵巢发育不全综合征
补充一下：
首先声明这不是和大家炫耀，而是想说明现在的实验方法和技术可能是相对较稳定的，可以算是阶段性的结果给大家汇报一下，以下的结果是仪器检测的结果，现在我们的细胞Beating rate一般在35hr时就能非常稳定了，Beating rate一般为120- 140 time/min，跳动幅度在0.04-0.08，大约持续到45hr左右，Beating rate开始逐渐下降，持续到100 hr左右，Beating rate约为60-80次/min，而幅度增加到约0.1以上，基地材料为玻璃，Gelatin包被。

作者: mickeylin 时间: 2015-5-11 16:35

真是高手！非常感激你的点拨！
我想大家都不会认为炫耀，更多的是仰慕，betaing rate能有120，了不起！
我今天重新做了一批，试了三种消化方式，0.05%胰酶+0.05%胶原酶，0.025胰酶+0.05%胶原酶，0.1%胶原酶，刚刚差速完毕，从目前来看，0.1%胶原酶得率高，从这一个小时贴壁情况来看，也是0.1%胶原酶贴壁得更好一些。使用了胰酶，在消化到第4-5次时就会出现胶冻状（或者称为鼻涕状更形象），一直消化到第7次，还是有，我到第8次消化前吹散，吹散了就基本看不见了，过滤时也不会堵孔（200目，70 um孔径），使用胰酶消化4-6 min，胶原酶消化有3次到了10 min，消化过程有轻晃，最后两次消化用巴氏管间断轻柔吹打，第一次消化液弃去。
今天我把液体分成两管离心，收集细胞没有问题。看看明天的情况再来汇报，向您请教。
再次感谢您细致的帮助，同时非常钦佩您在这方面的造诣。

作者: mickeylin 时间: 2015-5-11 16:35

首先再次感谢！
刚才看了昨晚养的细胞，胶原酶消化和0.025%+胶原酶的细胞均可见伸出伪足的不规则形状的贴壁较紧的细胞，虽然没有搏动，但这些应该是心肌细胞。
这些不规则形状的细胞在差速前的孔（即差速后吸走，剩下的）较多见，而在差速后的孔（即差速后吸出来的部分种到的新孔）贴壁很少，即使贴上，也显然没有差速前的孔贴的紧，分析原因可能主要有两点：
（1）差速后吸出来的部分可能本来就有很多是死细胞、细胞碎片，这些理所当然不会贴壁（而且会妨碍正常细胞贴壁），所以显得有很多细胞没贴上；
（2）吸出来的部分细胞很多，种的太密，瓶皿底部没有足够的空间让细胞伸展。
于是，我刚才把这两孔差速后的细胞稀释后种到别的板上（胶原酶消化的一分三；胰酶+胶原酶消化的一分二），不知道结果如何，但镜下看细胞状态似乎不太好，台盼蓝染，有较多死细胞。
接种密度好解决，计数后种稀点就行了；但是这死细胞、细胞碎片、可能还夹着部分血小板，怎么去除呢？请问您差速后是单纯把液体吸出来直接种到另外的板上，还是再离心一次（如果低速离心，也许可以除去血小板，我们从全血血中分离单个核细胞就是用这种方法，去除血小板效果不错，但这心肌细胞，除了血小板，可能更多的是被破坏了的细胞碎片，其密度可能与细胞更接近，离心效果如何？）？
再次感谢您的指点，祝工作顺利！

作者: NBA 时间: 2015-5-11 16:36

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原帖由 mickeylin 于 2015-5-11 16:35 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
首先再次感谢！
刚才看了昨晚养的细胞，胶原酶消化和0.025%+胶原酶的细胞均可见伸出伪足的不规则形状的贴壁较紧的细胞，虽然没有搏动，但这些应该是心肌细胞。
这些不规则形状的细胞在差速前的孔（即差速后吸走，剩下的）较多见，而 ...

不用那么客气，我也是从丁香园的前辈和实验室的前辈们学习才逐渐了解的，其实也没什么的，从你的实验态度可以看出你以后也一定会做的很好的，我只不过比你早点接触而已，谈不上什么造诣，其实实验做的再好，也只是一项技术而已，有思考和有思想才是更重要的。
从您的提供的信息来看，我了解的告知到如下：
1. 血小板的去除：在前面的环节很重要，如果在取心脏和消化这两个环节能降下来，那么后面就不用很担心血小板的影响力，在心脏取出后可以立即多清洗几次（保持低温），在心脏剪碎后可以再清洗一次，消化得到的细胞悬液我一般是废弃的，因为这样得到的细胞一方面部分细胞会容易消化过度，细胞活力较低，另一方面细胞含有较多的血小板等，且细胞数量也较少，这我们做过比较的。我现在使用的是在消化10-12次后剩下的心脏组织，在10%FBS的培养基中吹打得到的细胞，这种方法得到的细胞活力高，且数量也多，质量较稳定。
2. 消化条件的控制：在酶浓度控制的条件下（我们使用的浓度为0.07% trypsin+0.05% collagenase）消化时尽量控制力度和温度，动作轻柔一些可能会更好，室温不要太高，否则即使是吹打下来的细胞也会死亡率较高的。
3. 差速贴壁：能贴下的部分为心肌细胞，部分为成纤维细胞等，但成纤维细胞会贴壁较快，所以在上悬液中残留的较少。差速贴壁后，取上清液进行计数，计数时一般只数大个的细胞，小的细胞就不计在内了，死亡率一般不要超过70%，否则细胞的状态一般大都不会好，正常在50%-60%之间，如果各方面条件都能控制很好，在30%以内也是很有可能的，再低的死亡率就不太容易得到了。
以上的方法仅作为参考，建议你再想想哪些可能会适合你，这样再去做自己可能会更清晰一些，因为只有寻求到适合你自己的方法才是好的方法！

作者: woshi 时间: 2015-5-11 16:36

首先非常感谢楼主这么详尽的介绍，我有点不太明白的是“我现在使用的是在消化10-12次后剩下的心脏组织，在10%FBS的培养基中吹打得到的细胞，这种方法得到的细胞活力高，且数量也多，质量较稳定。”你的意思是说10-12次消化的都弃掉，之后消化的上清保留下来，是吗，我想这是不是消化太多了呢，最多的细胞是不是在这10-12次中啊，之后的会不会不好？还有我差速贴壁后离心得到的沉淀怎么还是红色的，看来血细胞还是没有完全去除干净，你们离心后看到的沉淀是什么样的呢？还有一个问题，消化后的细胞用含血清的培养基中和后保存在哪，是四度或冰上还是室温就可以了，小说明下，我的做法是收集好了几管中和过的细胞一起离心，嘻嘻，不知道我有没有说明白？
最后感谢楼主及各位同道提供的宝贵经验！

作者: bring 时间: 2015-5-11 16:37

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原帖由 woshi 于 2015-5-11 16:36 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

首先非常感谢楼主这么详尽的介绍，我有点不太明白的是“我现在使用的是在消化10-12次后剩下的心脏组织，在10%FBS的培养基中吹打得到的细胞，这种方法得到的细胞活力高，且数量也多，质量较稳定。”你的意思是说10-12次消化的 ...

头一个问题我也想问，意思是把前面10-12次消化所得的上清全部弃去，只留下最后的组织块吹打，然后收集细胞？
离心后红色是沉淀是红细胞，我没遇到过，但有两点可供参考：
1.没洗干净；
2.尝试弃去前几次上清。
4度和室温我也想问，我上次是放室温。

作者: bring 时间: 2015-5-11 16:37

我刚才换液，有部分细胞在搏动了，如我前面一个贴子所述，差速前的那个孔细胞较多，铺开符合心肌细胞形状特点，细胞贴壁紧；差速后的贴壁不紧，但也有些在搏动。
继续请教：
1. 心肌细胞贴壁不紧，圆圆的在搏动的，这不会不正常吧？
2. 和上面朋友的问题一样，您的意思是前面10-12次消化液全部弃去，留最后的组织块吹打，然后只收集这次的细胞？如果是这样的话，和组织剪碎的程度有较大关系吧，如果组织剪得较碎，消化到10-12次均弃上清，会不会损失的细胞有点多？
3. 也和上面的朋友一样，中和后放4度？如果是放4度，中和液会先在冰上预冷吗？先预冷的话会不会因为温度变化大（消化液37度，中和液4度）而影响细胞活力？我昨天是中和后放室温，消化过程共持续约100 min，最后统一离心。
我刚才把换下的培养基用台盼染，确实大部分是死细胞，如您所言，细胞死亡是很严重的。

作者: NBA 时间: 2015-5-11 16:37

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大家一起共同讨论，这样才会共同提高啊！
1. “10-12次消化的都弃掉，之后消化的上清保留下来，是吗”，是的，我消化过程中得到的细胞，一方面细胞质量不均一，有的会消化过度，有的会状态很好，这容易导致每次实验的差异性较大，另一方面消化得到的细胞数量也较少，大约只有后期吹打下来到1/3左右，这当中还有部分细胞后来会死亡的，且大量细胞死亡时释放的各类物质也在一定程度上影响了其它活细胞的活力，从而可能导致整体细胞状态都不是很好。
2. “还有我差速贴壁后离心得到的沉淀怎么还是红色的”，这种现象也是比较常见的，如果将消化得到的细胞一起离心就比较容易看到这种情况，若只用吹打后得到的细胞也有时会有种情况，我个人觉得血细胞基本是不可能去除干净的，只有可能减少，减少的方法我前面也提到过，若你有空可以看看。
3. 消化后的中和液最好放低温放置，因为血清是可以中和酶的消化，但并不保证所有的酶都会被中和，所以需要低温来降低酶的活性，使中和后的细胞不被消化过度，另一方面细胞在低温下代谢也降低了，细胞也不易因为代谢过度而致使活力下降，处理方式主要有冰浴和4度放置等，这两种较为常见的处理方式都是可以的，我个人以前使用的一般都是冰浴，然后可以一起再离心。

作者: NBA 时间: 2015-5-11 16:38

QUOTE:

原帖由 bring 于 2015-5-11 16:37 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
我刚才换液，有部分细胞在搏动了，如我前面一个贴子所述，差速前的那个孔细胞较多，铺开符合心肌细胞形状特点，细胞贴壁紧；差速后的贴壁不紧，但也有些在搏动。
继续请教：
1. 心肌细胞贴壁不紧，圆圆的在搏动的，这不会不正常吧？
2. 和 ...

1. 心肌细胞贴壁不紧，圆圆的在搏动的，这是正常还是不正常，其实这并不好说，因为细胞之间的形态和状态也是差异较大的，且能搏动的心肌细胞也有多种，这其中也有差异的；不过我觉得若能搏动，至少说明有两点：一：这是心肌细胞的一种，二：这种细胞活力也较好，贴壁状态也较好，如果贴壁不好，那么估计是很难跳动的，我们可以观察到的跳动幅度，这个幅度相对于单个细胞（或细胞团）来说，运动量已经是非常大的了。
2. 您的问题问到点上了，组织剪碎的程度是会影响消化的次数，一般比1mm稍大一点点也就可以了，这是肉眼估测的，并没有实际测量过，就算是1mm左右，也没关系，消化次数稍微减少一两次就可以了（或者酶减少一些也可以），但至少消化8次以上（组织量大约为原来的1/3左右），这样组织才会疏松，后面细胞才能在组织上吹打下来（可以换液吹打多次），否则细胞吹下来会比较少，最后还有可能会剩一些组织的，不过可以弃掉的。
3. 温差的变化较大确实会对细胞有一定的不好影响，但比起消化一直产生的损伤，温差的影响可能也算小的了，所以只能舍车保帅了。

作者: qhyu 时间: 2015-5-11 16:38

前辈您好：
看到您在论坛里发的关于细胞培养的帖子受益匪浅，我刚开始养乳鼠心肌细胞一个月，由于没有人指导，自己在论坛看到前辈们写的自己摸索，效果不是很好，在操作中有许多问题请前辈解答。
1，关于胰酶，我们用的是百分之0.25的胰酶，每次基本都做八只SD大鼠乳鼠，每次大约放4-5ml胰酶，第一次消化十分钟，第二次八分钟第三次六分钟。用磁力恒温加热不超过三十七度，用磁力搅拌慢慢搅动。一般离心四次以后就剩下很少的很难溶解的组织，一般我都会不去消化了，是不是不好。
2，每次取上清液的时候有很多粘稠的上清不容易取，取出上清以后大约每五毫升加一滴血清终止消化。
3，离心每次离心十分钟，离心两次，有时候沉淀不是很明显。
4，离心以后过滤，加半分之十五的胎牛血清和DMEM配置的培养基培养，要是十只鼠的话每次的培养基大约配置多少呢？是不是第二次换液的时候就得把血清浓度降低到百分之四啊？
5，十只鼠要是用三十毫升培养瓶的话需要几个？前几批细胞换液之前还活着，换液之后就全部死掉了，其中只有一次细胞贴壁，其他的没有贴壁情况，我是用差速贴壁的方法来纯化心肌细胞的。然后获得的纤维细胞也是换液之后就死掉了，很少贴壁的。
6，细胞的密度多少才适合呢？每次往瓶里种细胞的时候细胞数还是很多的，我一般是往培养瓶里加五毫升的细胞混悬液。
谢谢

作者: 箭头儿 时间: 2015-5-11 16:39

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原帖由 qhyu 于 2015-5-11 16:38 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
前辈您好：
看到您在论坛里发的关于细胞培养的帖子受益匪浅，我刚开始养乳鼠心肌细胞一个月，由于没有人指导，自己在论坛看到前辈们写的自己摸索，效果不是很好，在操作中有许多问题请前辈解答。
1，关于胰酶，我们用的是百分之0.25 ...

我来尝试回答一下。自己摸索也应该是可行的，我也是没有人指导，但在贴主前辈的耐心、精心指导下，我第二次已经比第一次好很多了，我们继续努力下去，在前辈的指导下，应该可以养出来的！
1.关于胰酶的问题，这个问题是很苦恼，而且似乎不同品牌，甚至不同批次的胰酶会有差别，这种差别可能是极大的！据我所知，胰酶浓度从0.25%一直到0.05%都有人用，我自己的第一次也是用0.075%的（含EDTA，比例未知），消出来的细胞基本不贴壁，所以胰酶的浓度可能自己试几个梯度会好一些。我上次也试过酶的梯度（见上贴）。
2.如果消化每次都很难吸出上清，我考虑是不是有点消过度，起码前面几次是消过度，我用0.025%胰酶+0.05%胶原酶，消化到第5次左右才会出现粘稠难吸上清的情况；一滴血清中和？一滴是多少？有点悬吧，能否严谨一点，比如用5% FBS完全培养基或10%完全培养基1:2中和（完全培养基2，消化液1）？
3.离心两次？为什么呢？液体内受到的离心力与液面的高度有关，如果液面高度太高，能否分两支离？离久了应该不是好事。
4.种板密度我也在搜索，细胞计数应该可行，但我发现很多死细胞的时候，计数不计入死细胞，但死细胞会影响活细胞贴壁的，可能我们在前面的过程混入了太多的死细胞。
5.不贴壁说明活性差，最可能的原因可能是消化酶过度，活性好的细胞刚消完细胞透亮，差速的时候就可见挺多贴壁；活性差的细胞透光性差，甚至皱缩，不贴壁；
6.细胞密度的问题，如果是活细胞，应该很好界定；关键问题在于死细胞很多，如果种板时把死细胞计算进去，那么换液两次后剩下的活细胞就不够铺满；如果不计算进去，死细胞可能会影响活细胞贴壁。可能正如版主所言，减少死细胞是关键。

作者: NBA 时间: 2015-5-11 16:39

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原帖由 箭头儿 于 2015-5-11 16:39 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

我来尝试回答一下。自己摸索也应该是可行的，我也是没有人指导，但在贴主前辈的耐心、精心指导下，我第二次已经比第一次好很多了，我们继续努力下去，在前辈的指导下，应该可以养出来的！
1.关于胰酶的问题，这个问题是很苦恼，而且似 ...

1. 做实验开始是需要摸索的，一方面是熟悉流程与操作的，另一方面是积累经验的，做的多了或者有一定的基础也就熟能生巧了，“百分之0.25的胰酶”，胰酶作用的效果本身就很强，且你的浓度可能有点高，降到0.07%-0.1%看看（或者加一些胶原酶），浓度低一点细胞的损伤可能就小一点，但消化的次数可能也多一些；宁愿时间长一点也不要太着急，因为做不好实验你可能需要花更多的时间来重复实验；每次消化的时间是差不多的，磁力搅拌器可用可不用，若用的话40转/min以下，可能会好一些，尽量去控制好每一个条件，积累起来细胞也就会好很多了。
2-3. 血清直接中和胰酶的话，溶液中还含有一些组织碎片和释放的DNA，以及胰酶和血清等在一起确实会使中和液比较粘稠，离心时细胞不容易沉淀，如果有可能，可以试试10%的FBS培养基1.5:1中和消化液，这样粘稠度可能会比较低一些，离心时细胞相对容易沉淀；消化液上清的粘稠可能主要是DNA起的影响，若有条件可以加点DNA酶就可以了，如果没有，按我使用的方法试试看，没有DNA酶这肯定很难根除的，所以只好从方法上稍调整一下了。
4-6. FBS的浓度我从开始到接种细胞都是10%的浓度，浓度我也比较过（5%，10%，20%），发现10%左右可能是一个相对较好的浓度范围，低于10%细胞长不起来，浓度较高的话细胞会比较容易老化，而且换液周期也较短，10%基本上是可以满足细胞的生长需要了；细胞的密度需要根据个人得到的细胞质量和状态来确定的，我一般在96孔板中，仪器可以测到的细胞密度是17000-20000/well ，但观察发现细胞也不是比较密，但最好不要超过30000/孔，超过30000/孔时细胞可能就会过密，这是差速贴壁后计的大细胞数目，其实每次计数的差异性还是有的，具体接入瓶中的浓度还需要麻烦你自己换算一下。
谢谢，祝实验顺利！

作者: qhyu 时间: 2015-5-11 16:40

前辈您好：
看到您对好多帖子的回复，学到了好多知识，在这里也想请教您几个问题，希望您也能帮忙知道分析一下。我也是个初学者，做心肌细胞原代的培养，做了几次都是很失败。
我做的步骤如下：无菌条件下，取六只SD乳鼠心脏，剪碎1mm3小块，磁力搅拌器37度水浴消化，用的是0.08%的胰蛋白酶，第一次消化8分钟，第二次6分钟，第三次6分钟，转速100次/min，第一次去掉上清，第二次和第三次收集放入离心管，用一点血清终止消化，离心两次，1000转/min，10min，第一次弃掉上清，再加上ＤＭＥＭ第二次离心，弃掉上清收集细胞，放入培养瓶含１５％小牛血清和７５％ＤＭＥＭ培养。
　　 1．第一次消化后就出现絮状物质，不易吸出。
2. 后来就直接加到离心管离心，絮状物质直接漂在上层，不沉淀。
3.离心完用吸管吹打道尽量散开，直接用200目滤网过滤，放入培养瓶中。

三张图片分别刚接种的，48小时的，72小时拍下来的，请您给于指导，很是纠结不知道问题出在哪里？谢谢您！

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作者: zzzz 时间: 2015-5-11 16:40

第一次就絮状了，消化过度了吧，另外，转速100次/min是不是有点高了？
很好奇，水浴又磁力棒，如何做到的？

作者: NBA 时间: 2015-5-11 16:41

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原帖由 qhyu 于 2015-5-11 16:40 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

前辈您好：
看到您对好多帖子的回复，学到了好多知识，在这里也想请教您几个问题，希望您也能帮忙知道分析一下。我也是个初学者，做心肌细胞原代的培养，做了几次都是很失败。
我做的步骤如下：无菌条件下，取六只SD乳鼠心脏，剪碎1mm ...

这位战友您好，通过您的描述和拍摄的图片发现可能正如楼上所说，细胞可能是消化过度了，或者也可能是其它步骤没有控制好，导致你得到的细胞活力较低，两者并存也有可能，不过没关系，开始就是一个熟悉的过程，原代的步骤也确实比较多比较繁琐，多做几次就会好的。
可能出现问题的地方建议如下：
1. 磁力搅拌器若无必要，可以不用，因为你用水浴，在这样的温度下胰酶的活力会保持在一种较高的状态，胰酶单消化的损伤本身就会较大，若再加上较高速度的搅拌，细胞活力在第一环节就会立即下降很多或者部分趋于死亡，还有后来的离心和吹打重悬等多个步骤，会使大部分细胞发生皱缩和死亡，在计数时，胎盘蓝染色可以留意一下，看看细胞是否呈现圆圆的，透亮的，细胞透亮表示细胞的活力会相对比较高；或者放在水浴中，中间时间摇动几下即可，消化完成时，不吹打直接去除上清，再加入胰酶摇动几下，放入水浴中。
2. 可以尝试用10%FBS+DMEM中和看看，离心一般5min差不多了，不用超过8min，时间越长细胞的损伤可能越大，一般5min大部分细胞都会沉淀的，若觉得还有剩余，可以再离心5min，两次离心后，上清中的细胞基本不会剩下很多了。
3. “第一次弃掉上清，再加上ＤＭＥＭ第二次离心，弃掉上清收集细胞，放入培养瓶含１５％小牛血清和７５％ＤＭＥＭ培养”这句话我没有理解你的意思，第一次弃掉上清，为什么还需要加入DMEM进行第二次离心啊，若觉得有剩余，可以把上清再离心一次，然后收集两次离心得到的沉淀，重悬细胞；１５％小牛血清和７５％ＤＭＥＭ培养这一共是90%，不知道是手误了还是加入了其它的培养成分。
谢谢！

作者: 月牙牙 时间: 2015-5-11 16:41

应该是85%DMEM不小心打错了，谢谢您的指点，吸取教训，在摸索一次试试！关于水浴加搅拌，外边放上大烧杯加上水，将含有心肌组织块的三角烧瓶放在大烧杯中就行啦！

作者: qhyu 时间: 2015-5-11 16:42

今天是第4天，细胞仍在搏动，但似乎不聚成一片（见下图，显微镜效果不好，有点发黄，大家将就看一下），细胞也不展开，未见明显伪足，查了一下，心肌细胞似乎是有层叠生长特性，表现为聚堆现象，堆与堆之间是空白或成纤维细胞。请帮忙分析一下，如果我种密些，会不会好一点？
10倍物镜（成团的细胞很多都会跳，应该是心肌细胞）：

图片附件: 14487882.snap.jpg (2015-5-11 16:42, 101.95 KB) / 该附件被下载次数 11
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作者: NBA 时间: 2015-5-11 16:42

QUOTE:

原帖由 qhyu 于 2015-5-11 16:42 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

今天是第4天，细胞仍在搏动，但似乎不聚成一片（见下图，显微镜效果不好，有点发黄，大家将就看一下），细胞也不展开，未见明显伪足，查了一下，心肌细胞似乎是有层叠生长特性，表现为聚堆现象，堆与堆之间是空白或成纤维细胞。请帮忙分析一下 ...

一般心肌细胞种在塑料基底的培养皿或培养瓶中，合适的细胞密度下心肌细胞可以从第2-3天开始跳动，大约持续到第4-7天的，或许更长的时间，而在玻璃基底上（明胶包被）种的细胞有时也能坚持到7天，一般都坚持不了，记得的那次第7天时频率约为60-80次/min，可能每一次的细胞状态也不是很一致的。
细胞不聚成一片，细胞纯度可能不够，成纤维细胞等较多，细胞难以连接；心肌细胞密度较低；细胞的生长状态不好，受到支原体或环境条件的抑制；培养基和血清是否合适（我们常用Gibco 10% FBS+Hyclone DMEM），或者这两者存在一些问题，这都是有可能的。
第4天时，一般情况下，心肌细胞已经长出伪足，明显展开了，我看你的图片觉得还挺好的，细胞基本长的比较大了，下面的图片显示的和心肌细胞形态非常接近的，如果跳动，那肯定就是心肌细胞了。
细胞的密度的调整主要还是看你的实验目的，如果是观察，可以密一些的，细胞连成一片，跳动起来场面是非常壮观的，如果是实验需要，再根据你的实验选取一个较为合适的密度，我们一般使用来做药物毒性检测的，所以密度在15-20K/well就可以了，但观察却并不是一个较好的密度范围。

作者: NBA 时间: 2015-5-11 16:43

上图~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~

图片附件: 59656315.jpg (2015-5-11 16:43, 9.61 KB) / 该附件被下载次数 18
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=32070

作者: milkdog 时间: 2015-5-11 16:43

各位前辈:
关于消化我还是有些不懂，请教，每次消化的时候都会出现胶冻状的。八只鼠第一次消化加三毫升的百分之0.8的胰酶，第二次加一点五毫升，第三次加一点五毫升，有很多胶冻状的。上清液不好吸取。我是要分别养心肌细胞和成纤维细胞。采用的是差时贴壁的方法，一般是60-90分钟。一般八只乳鼠加多少的胰酶合适呢？谢谢

作者: qhyu 时间: 2015-5-11 16:43

我用胰酶，哪怕浓度0.025，不含EDTA，消到第6次左右也会有胶冻状。我做的是小鼠，减低浓度，减少时间或者换用胶原酶吧，不同胰酶有差异，很难说的，要自己稍微调整一下，不过我现在养的还不好，一起加油！

作者: NBA 时间: 2015-5-11 16:44

各位前辈:
关于消化我还是有些不懂，请教，每次消化的时候都会出现胶冻状的。八只鼠第一次消化加三毫升的百分之0.8的胰酶，第二次加一点五毫升，第三次加一点五毫升，有很多胶冻状的。上清液不好吸取。我是要分别养心肌细胞和成纤维细胞。采用的是差时贴壁的方法，一般是60-90分钟。一般八只乳鼠加多少的胰酶合适呢？谢谢

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8只SD乳鼠（24h）的约2/3左右的心脏组织，消化液的量建议为3-5mL（0.08%trpsin+0.05%collagenase），最低不要低于3mL，不然很难吸掉上清，有较多的细胞DNA释放导致粘稠，多于5mL会比较容易引起消化过度；可以试试多次消化，每次培养箱静置消化8min，中途4min轻轻摇动几下，消化约10-12次，上清丢弃，剩下的心脏组织用含血清的培养基吹打多次，吹打三遍左右，得到的上清收集起来离心，差速贴壁接种细胞，差速贴壁的方法都差异不大，我一般是用60min两次，会稍好于90min一次的，心肌细胞纯度会较高。

作者: qhyu 时间: 2015-5-11 16:44

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原帖由 NBA 于 2015-5-11 16:44 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
各位前辈:
关于消化我还是有些不懂，请教，每次消化的时候都会出现胶冻状的。八只鼠第一次消化加三毫升的百分之0.8的胰酶，第二次加一点五毫升，第三次加一点五毫升，有很多胶冻状的。上清液不好吸取。我是要分别养心肌细胞和 ...

明天按照这个量养一批试试，希望能成功

作者: qhyu 时间: 2015-5-11 16:44

想就心肌细胞纯度再问教于版主：
心肌细胞鉴定标记物文献报导主要有3种：a-sarcomeric actin，MHC及Troponin I（或T），有些文献把a-SA和Troponin联用（没说明是计算双阳性还是单阳性）。单用的话，以a-SA和MHC较为多见，其中以a-SA最多见，请问这几种抗体的阳性率或者假阳性率有何区别？
谢谢呵，我初养心肌细胞，问题多，真的非常感谢你的耐心指导。

作者: bhka 时间: 2015-5-11 16:45

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我是用的百分之0.08的胰酶，上次写错了。今天上午做了四只2天得SD乳鼠，取心脏大约2/3第一次加胰酶约2.5ml。然后消化效果仍然不好。请问是你所说的每次消化8分钟都加胰酶3ml么？还是第一次加三毫升，以后每次按照消化的量再加。我还要养心肌纤维细胞，所以上清液每次都保留，然后用血清中和，等最后一起离心，再差速贴壁。谢谢您的耐心指导。

作者: NBA 时间: 2015-5-11 16:45

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想就心肌细胞纯度再问教于版主：
心肌细胞鉴定标记物文献报导主要有3种：a-sarcomeric actin，MHC及Troponin I（或T），有些文献把a-SA和Troponin联用（没说明是计算双阳性还是单阳性）。单用的话，以a-SA和MHC较为多见，其中以a-SA最多 ...

标记物的假阳性率是由多个方面的因素决定的，如：抗体的纯度和来源（单抗或者多抗），生产抗体的质量，实验条件的可靠性，实验的稳定性等；单就几种标记物的差异性来说，我觉得都有一定的合理性与可靠性的，关键看你用于什么样的细胞（细胞来源），其次实验技术和实验条件也是影响较大的，所以可能需要依靠你们实验室的条件和实验技术水平来选择一个或几个较为合适的方法。
一般多用Alpha-sarcomeric actin staining(α-横纹肌肌动蛋白染色)，多是因为这种方法相对较为方便与便宜，一般能够做Western Blot的实验室基本都可以做出阳性结果的，但假阳性也是存在的，可能与实验条件关联更大，其它两种方法我并没有做过；心肌细胞标记物的鉴定目的是检测细胞性质与纯度，不管哪种方法都会有假阳性的，考虑更多的可能是方法与目的。

作者: qhyu 时间: 2015-5-11 16:46

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原帖由 bhka 于 2015-5-11 16:45 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

我是用的百分之0.08的胰酶，上次写错了。今天上午做了四只2天得SD乳鼠，取心脏大约2/3第一次加胰酶约2.5ml。然后消化效果仍然不好。请问是你所说的每次消化8分钟都加胰酶3ml么？还是第一次加三毫升，以后每次按照消化的量再 ...

上清每次都保留应该不是一个明智的选择。我今天做了一个试验，我把前4次，每次的消化得到的上清都放到皿中观察，发现第一次消下来的基本是红细胞，第2-4次消下来的大多是死细胞或细胞碎片，因此，前几次消化的上清液估计意义不大。我用的是0.05%胶原酶。我现在养的还不好，一起进步！
心肌成纤维细胞最后产量并不会少，我用C57的小鼠，3只都够种6孔板中的1-2个孔，SD大鼠更不用说了。BTW，今天我才发现SD乳鼠的体积有C57的4-5倍大。

作者: qhyu 时间: 2015-5-11 16:46

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原帖由 NBA 于 2015-5-11 16:45 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

标记物的假阳性率是由多个方面的因素决定的，如：抗体的纯度和来源（单抗或者多抗），生产抗体的质量，实验条件的可靠性，实验的稳定性等；单就几种标记物的差异性来说，我觉得都有一定的合理性与可靠性的，关键看你用于什么样的细胞（细 ...

谢谢！我原来也是想买a-SA，但这个抗体竟然只有小鼠来源的。。。。。。

作者: 大虾米 时间: 2015-5-11 16:46

各位前辈：
看了你们培养心肌细胞的经验，受益很多。我样的细胞起初不贴壁，后来贴壁的都是成纤维细胞，当然一直都没有见过搏动的，我一直都找不到原因，我把我的步骤陈述如下，希望各位前辈能指点一二：
1.乙醚麻醉乳鼠，酒精棉擦拭，
2.开胸取心，
3.0.08%的胰酶，37°水浴，消化10分钟，轻轻摇晃，弃上清后再重复一次
4.加0.08%胰酶+0.04%胶原酶37°水浴消化8分钟，取上清，1000转/分，离心8分钟，
5.加15%FBS的培养液0.5ml终止消化
6.重复上述步骤，直至沉淀完全消化，
7.差速贴壁1.5小时。

作者: NBA 时间: 2015-5-11 16:47

我是用的百分之0.08的胰酶，上次写错了。今天上午做了四只2天得SD乳鼠，取心脏大约2/3第一次加胰酶约2.5ml。然后消化效果仍然不好。请问是你所说的每次消化8分钟都加胰酶3ml么？还是第一次加三毫升，以后每次按照消化的量再加。我还要养心肌纤维细胞，所以上清液每次都保留，然后用血清中和，等最后一起离心，再差速贴壁。谢谢您的耐心指导。

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这位战友您好，回复比较晚，抱歉！
4只2d的SD乳鼠，心脏2/3左右，胰酶量可以适当的增加一些，一方面2d的SD乳鼠心脏可能会比24hr之内的大一些，个人觉得2-4mL都是可以的，原来摸索条件时一般用3只的，加入有2-3mL的酶液（SD乳鼠，24hr内新生）；但我有一个不太明白的地方，就是您所说的消化效果不好，是怎么得出结论的，是消化液在显微镜下观察，还是细胞跳不起来，然后感觉是消化结果不好导致的？其实我消化时并不是每一次的胰酶量都一致的，开始8次大约多一些，到后面4次时，一般缩减为原来的一半酶液量左右。
原代细胞培养目前我们使用的方法可能更多的需要依赖个人的操作（在有能够做出较好结果的客观条件前提下），如果个人操作不好，那么细胞状态大都不会好，或者是不稳定（次与次差异性较大），所以在实验过程中，可能需要多留心，多注意，多体会，认真的思考一些，哪些地方需要轻柔，哪些地方需要注意无菌（我们一般多用于加药，所以是无抗生素的），哪些地方需要慢一些，自己感悟出来的可能比别人说的会感受和体会更深也可能更有用，这就可能在更大程度上会使我们的结果会更好一些，更稳定一些！

作者: NBA 时间: 2015-5-11 16:47

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原帖由 大虾米 于 2015-5-11 16:46 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

各位前辈：
看了你们培养心肌细胞的经验，受益很多。我样的细胞起初不贴壁，后来贴壁的都是成纤维细胞，当然一直都没有见过搏动的，我一直都找不到原因，我把我的步骤陈述如下，希望各位前辈能指点一二：
1.乙醚麻醉乳鼠，酒精棉擦拭，
...

原代心肌细胞培养每个人的操作差异性还是比较大的，这可能和平时的行为和习惯关联非常大，同样的材料和protocol情况下，两个人同时做出的结果会具有极明显的差异，这也是很正常的。
我也不是什么前辈，正好看到你的帖子，我就说一下我觉得可能的有问题的地方在哪儿，但希望你自己多想想和思考，我说的说不定也有可能会误导你，这也是很正常的事。
1. 你的protocol 估计是没什么大问题的，但是在各种溶液配制正确的前提下；水浴消化时不知还摇晃么，可否改为培养箱消化试试，因为水浴有可能会使酶的活力较高，容易使细胞消化过度，我也做过水浴消化，发现消化速度会快很多，或者缩短消化时间试试看。
2. 我不知道你的整个消化时间，但消化整个过程时间不要太长，不要超过3hr，尤其在收集消化上清的时候，消化过程也不要吹打，直接吸上清，加入酶液后，轻轻摇动多次，再进行消化，在酶液中吹打，细胞很容易死亡；后来的吹打最好在液面下吹打，且要轻柔，不要产生气泡，气泡的破裂对细胞的损伤也是很大的。
3. 心脏组织的量与加入酶液量的比例大约为1：5差不多，中和时1：1中和，中和后放入4度或者冰浴，以降低酶的活性，减少细胞损伤。

作者: qhyu 时间: 2015-5-11 16:47

NBA版主讲了很多细节和原理啊，非常感谢！
昨天养第三批，今天看有个别跳，但细胞密度整体稀，我是做小鼠的，感觉细胞产量是个绝对的大问题，我6只心脏，只种2个孔，都这样，还得继续加把劲努力！

作者: qhyu 时间: 2015-5-11 16:48

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请教一下，不吹打沉淀能完全消化吗？我昨天消了10次，不吹打的话似乎看不到消化完的希望？看到的是白白的边缘模糊的组织里似乎包着一颗致密的心肌组织，我用力甩几下，似乎能把致密的甩到更靠近边缘，显得更容易消，但似乎还是不完全的。
另外，有没有人做过C57小鼠乳鼠的呢，产量如何？

作者: flower@@ 时间: 2015-5-11 16:48

楼上这位朋友，您好，我先来回答您的问题作为一个抛砖引玉吧！
在消化时候的胶状物质，上面也有人提到是DNA，可以加入DNA酶，不过我没有这样做过，我的方法是静置片刻再取上清，在用混合酶消化的第三次-第六次这段过程中胶状物质比较明显！静置后比较好吸取。
在这我想请教大家，混合酶必须是现用现配吗，为什么呢？一周配的混合酶保存在四度还可以用吗？胰酶呢，两周以上配的保存在四度可以用吗？谢谢大家！

作者: bhka 时间: 2015-5-11 16:49

这是刚种上的细胞感觉是没消化开八只乳鼠加了百分之0.8的胰酶，消化了七次。高手们看看这是什么情况啊

图片附件: 57093543.snap.jpg (2015-5-11 16:49, 128.62 KB) / 该附件被下载次数 15
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=32071

作者: 雪原 时间: 2015-5-11 16:49

请问楼主：
Digest solution: 0.07% Trypsin with 0.05% Collagenase TypeⅡin HBSS.
这个是什么意思？是分别用两种酶，0.07%的胰蛋白酶和0.05%胶原酶II，都是用Hanks液配的吗？不知道我理解对否？
另外，请问你消化时候分别用胰酶和胶原酶，第一次消化松散组织时，也就是第一次弃掉上清液时候，用的是什么酶呢？正式消化时候，也是分别用着两个酶吗？分别的顺序是什么呢？
烦劳能不能详细介绍一下酶消化那一段的过程。非常感谢啦！！

作者: NBA 时间: 2015-5-11 16:49

楼上这位朋友，您好，我先来回答您的问题作为一个抛砖引玉吧！
在消化时候的胶状物质，上面也有人提到是DNA，可以加入DNA酶，不过我没有这样做过，我的方法是静置片刻再取上清，在用混合酶消化的第三次-第六次这段过程中胶状物质比较明显！静置后比较好吸取。
在这我想请教大家，混合酶必须是现用现配吗，为什么呢？一周配的混合酶保存在四度还可以用吗？胰酶呢，两周以上配的保存在四度可以用吗？谢谢大家！
......

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大家都问楼主的，为了缓解楼主的压力，我来帮忙回答一些力所能及的问题。
胰酶放置没有问题，胶原酶必须现配。
我的感觉是，胶冻状物质很明显的话，细胞活力一般不会太好，也许可能真的是DNA（我同学有说用胰酶可以把这东西消化完，这样的话，就可能不是DNA，不过我没试过，个人倾向于认为这是DNA，因为我经常提DNA，DNA确实很粘稠）

作者: NBA 时间: 2015-5-11 16:50

QUOTE:

原帖由雪原于 2015-5-11 16:49 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

请问楼主：
Digest solution: 0.07% Trypsin with 0.05% Collagenase TypeⅡin HBSS.
这个是什么意思？是分别用两种酶，0.07%的胰蛋白酶和0.05%胶原酶II，都是用Hanks液配的吗？不知道我理解对否？
另外，请问你消化时候分别用胰 ...

可以用Hank或PBS配。
第一次消用什么酶影响不大，正式消化的时候是混用的，不是分别用。你做一次就知道了。

作者: NBA 时间: 2015-5-11 16:51

QUOTE:

原帖由 bhka 于 2015-5-11 16:49 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
这是刚种上的细胞感觉是没消化开八只乳鼠加了百分之0.8的胰酶，消化了七次。高手们看看这是什么情况啊

图片看不清，看样子是细胞，是组织块还是细胞你自己应该能分清？

作者: NBA 时间: 2015-5-11 16:51

回答了几个问题后，我自己也提出一个问题，希望楼主及同道解答。
我做的是小鼠乳鼠的心肌细胞，品系是C57。经过几次，昨晚我的细胞大部分都能跳，得率还算勉强过得去，但有一个问题始终困扰。
我的细胞起初种下去的时候是一粒一粒的，差速结束后也是一粒一粒的，但第二天一早去看，就会呈现抱团，聚堆，堆与堆之间散在一些细胞，贴壁不紧，由于细胞聚堆，看不到贴在器皿上的细胞是否展开（也就是说，不知道是贴在器皿上的那个细胞驮着上面的细胞团在跳动，还是整个细胞团在跳动），聚堆的细胞能跳。也能看到个别摊开了能跳的。
同学看了，说是我消化不足（我用胶原酶消，消化到最后基本看不见东西），原因是我的细胞边缘不是十分光滑，他说那是纤维条索（图片照不清，所以这里没附图）。
请问，依你分析，我的细胞抱团的可能问题有哪些：如果我的同学说的是正确的，那么就是细胞种下去之后，细胞之间相互碰撞，纤维条索把细胞与细胞粘在一起，使得上层的细胞无法贴在瓶皿上？这样的话，跳动的应该就是紧贴着瓶皿的细胞驮着上面粘着的细胞在跳？
我应该如何解决这个问题呢？延长消化时间？
谢谢楼主了，这个贴子给你添了不少麻烦，望谅！

(细胞团块)

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http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=32072

作者: whitesheep 时间: 2015-5-11 16:51

谢谢各位指点，我今天打算在试试。都养了两个月了，还不在波动，焦心呀！

作者: whitesheep 时间: 2015-5-11 16:52

原代心肌细胞培养每个人的操作差异性还是比较大的，这可能和平时的行为和习惯关联非常大，同样的材料和protocol情况下，两个人同时做出的结果会具有极明显的差异，这也是很正常的。
我也不是什么前辈，正好看到你的帖子，我就说一下我觉得可能的有问题的地方在哪儿，但希望你自己多想想和思考，我说的说不定也有可能会误导你，这也是很正常的事。
1. 你的protocol 估计是没什么大问题的，但是在各种溶液配制正确的前提下；水浴消化时不知还摇晃么，可否改为培养箱消化试试，因为水浴有可能会使酶的活力较高，容易使细胞消化过度，我也做过水浴消化，发现消化速度会快很多，或者缩短消化时间试试看。
2. 我不知道你的整个消化时间，但消化整个过程时间不要太长，不要超过3hr，尤其在收集消化上清的时候，消化过程也不要吹打，直接吸上清，加入酶液后，轻轻摇动多次，再进行消化，在酶液中吹打，细胞很容易死亡；后来的吹打最好在液面下吹打，且要轻柔，不要产生气泡，气泡的破裂对细胞的损伤也是很大的。
3. 心脏组织的量与加入酶液量的比例大约为1：5差不多，中和时1：1中和，中和后放入4度或者冰浴，以降低酶的活性，减少细胞损伤。
......

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不知道5Br的浓度是不是有问题，我的是0.0015%，细胞贴壁了，但不见波动，数目也很少，一天后就基本死光光了。

作者: 雪原 时间: 2015-5-11 16:52

QUOTE:

原帖由 whitesheep 于 2015-5-11 16:52 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
原代心肌细胞培养每个人的操作差异性还是比较大的，这可能和平时的行为和习惯关联非常大，同样的材料和protocol情况下，两个人同时做出的结果会具有极明显的差异，这也是很正常的。
我也不是什么前辈，正好看到你的帖子，我就说 ...

贴壁后死光，说明成纤维也死了，这种情况一般是消化过度。成纤维很顽强，如果成纤维都活不下来，心肌基本是死定了。

作者: zhy平平 时间: 2015-5-11 16:52

我用的0.06%的胰酶，一边水浴37度一边低速磁力搅拌（机器不好不知道转速），每次8分钟的消化都有很多鼻涕状的东西。。吹散后离心也有絮状物，结果细胞数量很少。都3天了，还是没多少细胞，不过都是清亮的，所以还想养看看。细胞周围会有大片大片的透明的膜状物，那是什么啊？？

作者: qhyu 时间: 2015-5-11 16:53

我用的0.06%的胰酶，一边水浴37度一边低速磁力搅拌（机器不好不知道转速），每次8分钟的消化都有很多鼻涕状的东西。。吹散后离心也有絮状物，结果细胞数量很少。都3天了，还是没多少细胞，不过都是清亮的，所以还想养看看。细胞周围会有大片大片的透明的膜状物，那是什么啊？？

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我认为这种是消化过度。大部分人认为那是细胞碎裂后释放出来的DNA。如果是大片大片的，消化应该是出问题了。

作者: NBA 时间: 2015-5-11 16:53

请问楼主：
Digest solution: 0.07% Trypsin with 0.05% Collagenase TypeⅡin HBSS.
这个是什么意思？是分别用两种酶，0.07%的胰蛋白酶和0.05%胶原酶II，都是用Hanks液配的吗？不知道我理解对否？
另外，请问你消化时候分别用胰酶和胶原酶，第一次消化松散组织时，也就是第一次弃掉上清液时候，用的是什么酶呢？正式消化时候，也是分别用着两个酶吗？分别的顺序是什么呢？
烦劳能不能详细介绍一下酶消化那一段的过程。非常感谢啦！！
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各位，非常抱歉，最近比较忙，回复比较晚，谅解，谢谢！
“是分别用两种酶，0.07%的胰蛋白酶和0.05%胶原酶II，都是用Hanks液配的吗？”是的，是现配现用，直接粉末配制，分别在称好所需的质量，同时溶于HBSS中，微孔过滤待用。
整个消化过程用的都是都是这个消化液，即0.07%的胰蛋白酶和0.05%胶原酶II溶于HBSS中配制而成。
实验前，称量所需的胰蛋白酶和胶原酶II，分别称量好后，放在一起，溶于HBSS中，用注射器接上0.22um的微孔过滤器，过滤消化液，放入超净台中备用；在组织剪碎后，加入大约5倍体积的消化液，每次消化的上清都弃掉（即所得的细胞都不要），重新加入新鲜消化液，消化约10-12次，完成后，剩余组织在10%FBS培养基中吹打多次，收集上清，离心获取细胞，此时的细胞差速贴壁，计数并接种。

作者: NBA 时间: 2015-5-11 16:53

回答了几个问题后，我自己也提出一个问题，希望楼主及同道解答。
我做的是小鼠乳鼠的心肌细胞，品系是C57。经过几次，昨晚我的细胞大部分都能跳，得率还算勉强过得去，但有一个问题始终困扰。
我的细胞起初种下去的时候是一粒一粒的，差速结束后也是一粒一粒的，但第二天一早去看，就会呈现抱团，聚堆，堆与堆之间散在一些细胞，贴壁不紧，由于细胞聚堆，看不到贴在器皿上的细胞是否展开（也就是说，不知道是贴在器皿上的那个细胞驮着上面的细胞团在跳动，还是整个细胞团在跳动），聚堆的细胞能跳。也能看到个别摊开了能跳的。
同学看了，说是我消化不足（我用胶原酶消，消化到最后基本看不见东西），原因是我的细胞边缘不是十分光滑，他说那是纤维条索（图片照不清，所以这里没附图）。
请问，依你分析，我的细胞抱团的可能问题有哪些：如果我的同学说的是正确的，那么就是细胞种下去之后，细胞之间相互碰撞，纤维条索把细胞与细胞粘在一起，使得上层的细胞无法贴在瓶皿上？这样的话，跳动的应该就是紧贴着瓶皿的细胞驮着上面粘着的细胞在跳？
我应该如何解决这个问题呢？延长消化时间？
谢谢楼主了，这个贴子给你添了不少麻烦，望谅！
(细胞团块)
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您说的这种情况，我也遇到过，但很抱歉，无法给你比较合理的解释。
一种现象，被后的原因可能会有多种，因此可能需要具体情况具体分析，你用的C57小鼠，我没做过，有可能会和SD乳鼠心肌细胞存在差异，所以不能生搬硬套的给你一些解释，很可能我说的就是错的。
但我想提一下，细胞聚团是不是一个不好的现象，还是这本身就是心肌细胞一种的正常现象？这样聚团现象是不是对你的实验有很大的不良影响，这个问题是不是一定需要解决的？谢谢这位战友的支持！

作者: ukonptp 时间: 2015-5-11 16:54

不知道5Br的浓度是不是有问题，我的是0.0015%，细胞贴壁了，但不见波动，数目也很少，一天后就基本死光光了。

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我个人觉得是5-Brdu的问题可能性较小，你若怀疑，就一半不用，一半使用，相互比较看看，结果如何。

作者: ukonptp 时间: 2015-5-11 16:55

我用的0.06%的胰酶，一边水浴37度一边低速磁力搅拌（机器不好不知道转速），每次8分钟的消化都有很多鼻涕状的东西。。吹散后离心也有絮状物，结果细胞数量很少。都3天了，还是没多少细胞，不过都是清亮的，所以还想养看看。细胞周围会有大片大片的透明的膜状物，那是什么啊？？

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比较明显的症状是细胞消化过度了，消化可以不用搅拌，摇一摇也是可以的，还有吸取上清可能会比较慢，在消化时就不要点酒精灯，酒精灯会产生局部高温增强酶的活力，使细胞消化过度；消化液也不要放37度预热，室温放置就行，环境温度较高时，细胞也很有可能也会消化过度。

作者: ukonptp 时间: 2015-5-11 16:56

您说的这种情况，我也遇到过，但很抱歉，无法给你比较合理的解释。
一种现象，被后的原因可能会有多种，因此可能需要具体情况具体分析，你用的C57小鼠，我没做过，有可能会和SD乳鼠心肌细胞存在差异，所以不能生搬硬套的给你一些解释，很可能我说的就是错的。
但我想提一下，细胞聚团是不是一个不好的现象，还是这本身就是心肌细胞一种的正常现象？这样聚团现象是不是对你的实验有很大的不良影响，这个问题是不是一定需要解决的？谢谢这位战友的支持！
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谢谢！我只是觉得聚团很丑，然后心肌细胞没铺开，不过今天和昨天看铺的比较开了，个人感觉是控制成纤维的生长很重要，再次感谢您一直以来的帮助。

作者: 笑弯了腰 时间: 2015-5-11 16:56

看了前面的帖子，受益匪浅，多谢lz的悉心解答让我增长了不少知识。
我也是在进行心肌细胞的培养，之前一直失败，后来听别人说我吹打的力气太轻了，每次都没有把组织块吹打起来，从而细胞大部分还黏在上面，又进行下一步的消化了，所以的出来的细胞大部分已经死了。
后来加大力度吹打以后，成功了1-2次，现在又出现了细胞全部死亡的现象，步骤，方法，力度和原来几乎相似。我和lz的实验方法相似，也是胰酶和胶原酶混合（均为0.08%)，37度消化，间断手摇，吹打，吸取上清。
这几次失败的时候发现在4-5次消化时组织块就蓬松胀大，大概是原来的2倍左右，消化吹打以后组织块周围漂浮了很多絮状物质，像是没有完全消化的组织，如果吸取上清的话很容易把絮状物吸出来，这样离心的话很不容易全部沉淀弃上清。在最后一部离心重悬后消化液变的很粘稠，过筛时根本下不去。
请教楼主这种情况是消化还不到火候么？是不是需要在继续延长时间？谢谢！！

作者: wiwi 时间: 2015-5-11 16:56

第一次养心肌细胞，麻烦各位大侠看看怎么回事，我觉得可能是消化过度，吹打不匀，这是低倍镜下拍摄的

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作者: wiwi 时间: 2015-5-11 16:57

这是高倍镜下的，已经养了5天了。。很不健康

图片附件: 46552436.snap.jpg (2015-5-11 16:57, 105.79 KB) / 该附件被下载次数 18
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=32074

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http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=32075

作者: wiwi 时间: 2015-5-11 16:58

一堆一堆的，是不是就是吹打没吹散？

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http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=32076

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http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=32077

作者: 箭头儿 时间: 2015-5-11 16:58

看了前面的帖子，受益匪浅，多谢lz的悉心解答让我增长了不少知识。
我也是在进行心肌细胞的培养，之前一直失败，后来听别人说我吹打的力气太轻了，每次都没有把组织块吹打起来，从而细胞大部分还黏在上面，又进行下一步的消化了，所以的出来的细胞大部分已经死了。
后来加大力度吹打以后，成功了1-2次，现在又出现了细胞全部死亡的现象，步骤，方法，力度和原来几乎相似。我和lz的实验方法相似，也是胰酶和胶原酶混合（均为0.08%)，37度消化，间断手摇，吹打，吸取上清。
这几次失败的时候发现在4-5次消化时组织块就蓬松胀大，大概是原来的2倍左右，消化吹打以后组织块周围漂浮了很多絮状物质，像是没有完全消化的组织，如果吸取上清的话很容易把絮状物吸出来，这样离心的话很不容易全部沉淀弃上清。在最后一部离心重悬后消化液变的很粘稠，过筛时根本下不去。
请教楼主这种情况是消化还不到火候么？是不是需要在继续延长时间？谢谢！！
......

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个人觉得一旦出现絮状物质，一般不是什么好东西，如果离心重悬后消化液很稠，连过筛都不行，建议吹打散试试，不过可能细胞状态也不行了。
我估计是消化过度，少量多次，我觉得吹打不在于力气大小，更要注意速度要慢，但振幅要大，即要把细胞吹散，但又不至于对细胞形成太大的冲力，同时要注意避免气泡产生。
我也是从不行到现在还可以，你也加油，一定行的。

作者: 箭头儿 时间: 2015-5-11 16:59

第一次养心肌细胞，麻烦各位大侠看看怎么回事，我觉得可能是消化过度，吹打不匀，这是低倍镜下拍摄的

这是高倍镜下的，已经养了5天了。。很不健康

一堆一堆的，是不是就是吹打没吹散？

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感觉像是细胞碎片，没有完整的细胞轮廓，也不是正常心肌细胞那样成簇生长。而且杂质特别多。应该不是没吹散。另外，细胞很稀啊。

作者: JK.jon 时间: 2015-5-11 16:59

谢谢lz的悉心指导，这次试验过程中第5次消化时出现了上清粘稠的情况，一共22只小鼠消化时间为15min，10min，10min，8min，8min，6min，6min，3min，3min，最后组织块已经消化不见。吹打力度较上次减轻，出现絮状物又只能吸上来的时候我尝试加培养基中和后吹打，将组织块吹散，培养液变得很浑浊，过筛还是有些困难，但也不是完全下不去的状态了，1.5h差速贴壁时观察培养瓶中少量成纤维贴壁，并没有贴满，48h后可以观察到心肌细胞贴壁但是数量并不是很多，成纤维细胞倒是快速的生长，很旺盛。
请问LZ有什么方法可以改善这种情况？在培养基中吹打开那种絮状物会损伤细胞么？这次也是因为消化过度导致的细胞数量偏少么？万分感谢

作者: qhyu 时间: 2015-5-11 16:59

QUOTE:

原帖由 JK.jon 于 2015-5-11 16:59 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

谢谢lz的悉心指导，这次试验过程中第5次消化时出现了上清粘稠的情况，一共22只小鼠消化时间为15min，10min，10min，8min，8min，6min，6min，3min，3min，最后组织块已经消化不见。吹打力度较上次减轻，出现絮状物又只能吸上来的时候我尝试 ...

小鼠产量会低，不知道你用哪种酶消化，我消化过程始终没有出现絮状沉淀。如果你在第5次吹打，估计后面的细胞也都不多，因为吹打本来就可以将细胞吹散，只是机械损伤可能较大。我没有试过这样吹打，但一般出现明显的絮状物，在我看来，结果都不好。如果你一定要吹打，注意不要引起气泡。如果你絮状物没有彻底吹散，过筛肯定是困难的。
不知道你22只小鼠种了多大的面积？我12只小鼠大约能种6孔板中3-4个孔，成纤维生长旺盛加Brdu可有效改善。周围的人做小鼠心肌细胞不多，所以不知道较大的产量是多少。
不知道你的情况是不是类似，你种下去第二天看，细胞会呈一团一团地跳动吗？我的几次来看，小鼠心肌细胞头2-3天会抱团，一个集落一个集落地跳，3天后会慢慢铺开，表现为细胞团块越来越小，跳动的面积越来越大，到第4-5天时可以看到成片跳动，如果种的密度低，就很难看到成片跳动的景象，多是一个集落一个集落地跳。

作者: 雪花子 时间: 2015-5-11 17:00

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你的消化时间从15分钟下降到3分钟是别人的经验？我养大鼠的心肌细胞应该差不多吧。。估计后面也要减少点时间。有絮状物人家都说是消化过度呢。。有人说消化就放在培养箱中，中途去晃一下就行了，你怎么消化的？

作者: 雪花子 时间: 2015-5-11 17:00

我根据大家的建议修改的操作步骤，麻烦看看哪可以改进的（实验经费不多，因此只用0.06%胰酶）
1. 2-4天大鼠乳鼠酒精浸泡15秒，取心，置于有4度pbs的培养皿中，用pbs清洗2遍（有人说先剪碎再清洗比较好？）
2. 剔除心脏周围的血凝及纤维组织，抽取5ml胰酶，少量放入50ml烧杯中，大部分（留点冲洗）倒入50ml离心管，将心脏放入小烧杯剪碎，倒入50ml离心管，用剩余的胰酶冲洗一遍
3. 消化：将含有心肌的50ml的离心管放入34℃的水浴锅中10min，轻轻晃动数次。第一次消化液弃去。以后消化为8分钟（中间摇晃几次）。
4. 离心：第二次以后的消化液轻轻吹打，自然沉淀，各取2ml上清放入2 只（1,2号）离心管，再各加入2mlDMEM离心10分钟（800转？还是1000转？）。补加4ml胰酶入2步骤中的离心管，继续消化。离心好的1,2号离心管，弃上清，各加2mlDMEM再次离心。（同志们？是不是需要离心2次啊？）
5. 重复消化和离心。消化时间每次适量减少？或者适量减少胰酶的量？
6. 所有离心2遍的离心管弃上清，加入含有20%胎牛血清、双抗、brdu的DMEM 2ml重悬，合并重悬的液体（这里需要过筛么？？），轻轻吹打均匀。放入细胞瓶，90min差数贴壁。调整细胞浓度500000个每毫升。24下时候换液，此后隔日换液。
希望各位提出意见，建议，不胜感激

作者: 鸽子不哭 时间: 2015-5-11 17:00

细胞洁净度的处理，我在DXY上看到过一位前辈曾说过，换液时可以可用PBS洗几遍，好像会少一些；我个人认为，死细胞是无法避免的，所以我们只能去尽可能的优化条件去减少死细胞的数量，而贴壁的死细胞可能与我们的培养条件有关，因为细胞是已经贴壁然后再死的（时间长了也会死的这个不算在内）。而整个心肌细胞培养的过程我觉得最关键的可能在于消化的控制，心脏剪碎和取心脏，因为这一方面决定了细胞的生长的状态和细胞活力，另一方面关乎细胞培养的结果可重复性，而在消化和取心脏过程中，我们应该尽可能的去注意条件和操作手法的控制（如消化时间，细胞冰浴，心脏取的大小等）。
对于台盼蓝细胞计数，我一般也是数的是大的圆的，但有一些也是大的，形状不规则的，有时数量还比较多，不知各位老师也是否计算在内，我一般是计算的。从我使用的protocol来看，我用的也是混合酶消化，但同样的操作条件下，优秀结果的重复性太差，每次细胞的频率和幅度也不完全一致，可能因为仪器是通过检测，所以能够较精确的比较每一次的结果差异性，跳动的频率有时60多次，有时90多次；同时间细胞的跳动幅度也不一致；且细胞起跳时间也不一致，有时24小时就跳的非常好，而有时48小时才跳的勉强接受。
不知各位老师对于心肌细胞原代培养有什么独特的好的想法，欢迎您提出来，我们大家共同讨论，三个臭皮匠顶一个诸葛亮嘛，祝每一次都能做出比较完美的结果，谢谢您！
......

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老师您好：我最近在学习做心肌细胞原代培养，但是出现了向您上述的细胞贴壁以后死亡的情况，就是我晃动培养液的时候，一些细胞就在培养液里飘动，而一些细胞明显是贴壁了，但是外圈变亮，核颜色较深，一看就是细胞已经死了。时间不长啊就是48小时贴壁以后，基本上一个视野下也就有十个不到的心肌细胞，但是有约有几百个死细胞，我觉得就是我已经将细胞消化下来了，但是在好像就是在培养液里不成活。也不知道是我消化下来的时间太长了么，还是培养基的成分不对，我用的血清不是CIBIC的，10%的FBS，DMEM高糖，1%的双抗。
另，您能把您的protocal给我发一份么？我用的是0.25%的胰酶直接消化的，我消化的是KM乳鼠，一次约消化十只，一次放不到2ml的胰酶，大约消化三十秒左右，一共约消化30-40次左右，根据胰酶的颜色来判断是不是消化到时间了！其他地方和园子里的其他兄弟姐妹们都差不多，就是酶的浓度比较大，而且我不用二型胶原酶，您帮我看看我哪里有问题啊！我都分了不下十次了，郁闷的要死，回头我给您上传一张照片您帮我看看啊！
谢谢您~

作者: JK.jon 时间: 2015-5-11 17:01

大家好，我的心肌细胞培养后，贴壁了，但是不见搏动，不知道为什么，请大家来探讨一下，谢谢.以下是我的操作步骤：1. 消化液为：0.0625%胰酶(Amresco)+0.04%胶原酶B(Roche)
2.将SD乳鼠心脏剪成小碎片，加入上述消化液3ml,第一次消化10min,弃上清。
3. 第二次及以后加入消化液3ml，每次消化4min,将上清小心吸出，加入到含10%小牛血清(GIBCO)的DMEM高糖培养基中终止消化。并将上述含有上清的离心管置于冰上。
4.如此，消化12次后，将上述上清过200目滤网，4°，800bpm，8min, 6ml 20%小牛血清(GIBCO)的DMEM高糖培养基重悬，接种于培养瓶中，1.5h差速贴壁，种于6孔板中。

作者: 鸽子不哭 时间: 2015-5-11 17:01

我就是想让您帮我分析一下，我的细胞就是不贴壁，或者贴壁了以后就是死亡的状态，您能帮我分析一下原因么？不知道是消化过了，还是消化的不够啊。我也是按照您的PROTOCAL做的，但是上次的结果还是不好，您说我可能是硬件上的问题么？比如孵箱，我做的是KM乳鼠，希望您多指教啊！

作者: NBA 时间: 2015-5-11 17:02

恩，没事，您忙完给我回复就好，有时间回复，没时间也没有关系啊！我就是想让您帮我分析一下，我的细胞就是不贴壁，或者贴壁了以后就是死亡的状态，您能帮我分析一下原因么？不知道是消化过了，还是消化的不够啊。我也是按照您的PROTOCAL做的，但是上次的结果还是不好，您说我可能是硬件上的问题么？比如孵箱，我做的是KM乳鼠，希望您多指教啊！

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我个人觉得这是可能是细胞被消化过度，其次是培养条件有问题，你在接种细胞前计数时用台盘蓝染色观察一下细胞活力，细胞是圆圆的非常透亮的，且反光性很好，这是细胞活力高的表现，若是这说明细胞是没有问题的；在此基础上检查一下血清，培养基和培养箱，看是否有存在问题，谢谢！

作者: 鸽子不哭 时间: 2015-5-11 17:02

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原帖由 NBA 于 2015-5-11 17:02 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
恩，没事，您忙完给我回复就好，有时间回复，没时间也没有关系啊！我就是想让您帮我分析一下，我的细胞就是不贴壁，或者贴壁了以后就是死亡的状态，您能帮我分析一下原因么？不知道是消化过了，还是消化的不够啊。我也是按照您的PROTOCAL ...

谢谢您的回复，我这两天再试试，回头我把我分的方法写一个PROTOCAL给您，您帮我看看，我这两天也在试试是不是我血清的问题。谢谢啦~

作者: xuuuu 时间: 2015-5-11 17:03

小鼠产量会低，不知道你用哪种酶消化，我消化过程始终没有出现絮状沉淀。如果你在第5次吹打，估计后面的细胞也都不多，因为吹打本来就可以将细胞吹散，只是机械损伤可能较大。我没有试过这样吹打，但一般出现明显的絮状物，在我看来，结果都不好。如果你一定要吹打，注意不要引起气泡。如果你絮状物没有彻底吹散，过筛肯定是困难的。
不知道你22只小鼠种了多大的面积？我12只小鼠大约能种6孔板中3-4个孔，成纤维生长旺盛加Brdu可有效改善。周围的人做小鼠心肌细胞不多，所以不知道较大的产量是多少。
不知道你的情况是不是类似，你种下去第二天看，细胞会呈一团一团地跳动吗？我的几次来看，小鼠心肌细胞头2-3天会抱团，一个集落一个集落地跳，3天后会慢慢铺开，表现为细胞团块越来越小，跳动的面积越来越大，到第4-5天时可以看到成片跳动，如果种的密度低，就很难看到成片跳动的景象，多是一个集落一个集落地跳。
......

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hello, 看了你的帖子，收获很多。
我也养C57小鼠心肌。20个可铺成12个孔。也能成片跳动。
请教你个问题：你是每天换液吗，还是第一天换一次，以后每48小时换一次？

作者: qhyu 时间: 2015-5-11 17:03

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原帖由 xuuuu 于 2015-5-11 17:03 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
小鼠产量会低，不知道你用哪种酶消化，我消化过程始终没有出现絮状沉淀。如果你在第5次吹打，估计后面的细胞也都不多，因为吹打本来就可以将细胞吹散，只是机械损伤可能较大。我没有试过这样吹打，但一般出现明显的絮状物，在我看 ...

这产量不错啊！我是第一天换一次，以后2-3天换一次。能否继续交流？
不让留QQ，请见PM。

作者: cj_mondy 时间: 2015-5-11 17:04

老师您好：我最近在心肌细胞原代培养，用的是0.25的胰酶消化3到5分钟，共消化三次，然后差速贴壁，每隔一个小时贴一次，用的培养液是高糖DMEM+10%的FBS；a-MEM+10%KSR，现在用高糖DMEM+10%的FBS养的养了5天，没有细胞，用a-MEM+10%KSR养的有不同形态的细胞，都看不到搏动，附上照片，请老师帮忙看看是不是心肌细胞。

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作者: 人小鬼大 时间: 2015-5-11 17:04

大家好，我的心肌细胞培养后，贴壁了，但是不见搏动，不知道为什么，请大家来探讨一下，谢谢.以下是我的操作步骤：1. 消化液为：0.0625%胰酶(Amresco)+0.04%胶原酶B(Roche)
2.将SD乳鼠心脏剪成小碎片，加入上述消化液3ml,第一次消化10min,弃上清。
3. 第二次及以后加入消化液3ml，每次消化4min,将上清小心吸出，加入到含10%小牛血清(GIBCO)的DMEM高糖培养基中终止消化。并将上述含有上清的离心管置于冰上。
4.如此，消化12次后，将上述上清过200目滤网，4°，800bpm，8min, 6ml 20%小牛血清(GIBCO)的DMEM高糖培养基重悬，接种于培养瓶中，1.5h差速贴壁，种于6孔板中。
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消化的温度应该是37°，不是冰上。

作者: NBA 时间: 2015-5-11 17:05

老师您好：我最近在心肌细胞原代培养，用的是0.25的胰酶消化3到5分钟，共消化三次，然后差速贴壁，每隔一个小时贴一次，用的培养液是高糖DMEM+10%的FBS；a-MEM+10%KSR，现在用高糖DMEM+10%的FBS养的养了5天，没有细胞，用a-MEM+10%KSR养的有不同形态的细胞，都看不到搏动，附上照片，请老师帮忙看看是不是心肌细胞。

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我们一般是用DMEM+10%FBS培养心肌细胞，没有用过a-MEM+10%KSR，在培养第2天时观察的心肌细胞形状和上图较为接近，这段时间有时部分细胞会有跳动了，一般第三天基本大部分细胞都有不错的跳动了，但若要确定是心肌细胞的话，估计还需要在显微镜下观察是否跳动，若有跳动，那么肯定是心肌细胞了，单从形状判断是不够准确的，一般在第三天后SD乳鼠的心肌细胞就会连为一片了，长的非常大，细胞较密时是分不清楚心肌细胞形状的。
另外，0.25的胰酶消化3到5分钟，共消化三次，我最一开始也是通过提高酶浓度，减少消化时间消化细胞的，但发现这种方式获得的细胞可能状态不是很稳定，有时会很好，有时会很差，实验次与次之间的差异性较大；用高糖DMEM+10%的FBS养的养了5天，没有细胞，可能是消化获得的细胞量较少或者是接种的细胞已经死亡了。
建议仅供参考，自己多琢磨几次就会好很多的，原代细胞培养受个人的操作影响还是很大的，所以需要尽量减少人为的影响，使每次实验细胞的状态都较为一致，这样可能会获得更合理的结果。

作者: any333 时间: 2015-5-11 17:05

消化的温度应该是37°，不是冰上。

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恩，是的，我是在37°水浴消化的，可就是心肌细胞不搏动，有搏动的话，频率也是很低啊！不知道为什么，急死了！

作者: any333 时间: 2015-5-11 17:05

你好，麻烦帮我分析一下，我养的原代心肌细胞，大部分不搏动，即使有搏动，也是很低的频率，而且不是成片的搏动，都快急死了，谢谢你。
以下是我的步骤：
动物：SD新生乳鼠10只（1-2天的）
消化液：0.08%胰酶（PH7.2，PBS配）
培养液与消化终止液：10%FBS(GIBCO)+DMEM/F12 (新鲜配制）
1.将小鼠浸入75％酒精中1-2分钟，手持眼科剪，于胸骨下剪一小口，取出心脏。
2.然后将心脏放于装有预冷的PBS液的培养皿中，剔除心脏周边的血凝及纤维组织。
3.预冷的PBS液漂洗3次，转移至一个青霉素小瓶中，用剪子将心脏剪成1mm3的碎块，然后再加入5毫升0.08%胰酶，盖上瓶盖，用封口膜封口。
4.放入37℃水浴箱中，温和摇动，10min，自然沉淀，小心吸取上清，上清弃去不要，因上清中主要是血红细胞、细胞碎屑和死细胞。
5.再将5ml胰酶加入盛有心脏组织的青霉素小瓶中，消化10min，吸管轻轻吹打1min，自然沉淀后小心转移上清至另一离心管中，离心管中装有培养基（10%FBS(GIBCO)+DMEM/F12 ）以终止消化。
6.重复上述过程，约消化5-6次，每次10分钟，直至组织块消化完全为止。
7.将每次消化所得的细胞悬液在离心管中混匀，过200目尼龙滤网，然后离心，1000转×10min，弃上清。
8.加9ml培养基，混匀，接种于3个25ml培养瓶中。
9.放于37℃，5%二氧化碳培养箱中培养，1.5小时后，小心吸出培养液，将培养液吸入小瓶中，滴管吹打均匀后，种于6孔板中，每孔2ml。
10.48小时后换液。

作者: NBA 时间: 2015-5-11 17:06

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原帖由 any333 于 2015-5-11 17:05 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

你好，麻烦帮我分析一下，我养的原代心肌细胞，大部分不搏动，即使有搏动，也是很低的频率，而且不是成片的搏动，都快急死了，谢谢你。
以下是我的步骤：
动物：SD新生乳鼠10只（1-2天的）
消化液：0.08%胰酶（PH7.2，PBS配）
培养液与消化终止液：10 ...

我尝试分析看看一下你的步骤，也不知道说的对不对，若有不妥之处，还请各位老师指正，谢谢!
1. 乳鼠在酒精中浸泡可能容易死掉，若有喷壶，可以每一只直接喷洒清洗皮肤表层，这样老鼠不容易死掉，心脏的活力可能会高一些；另心脏会在左边胸腔偏下一些，可以沿4-5肋骨间剪开，一般情况下心脏会跳出来的，直接剪掉即可，取心脏速度可能会快一些。
3. 可以在PBS或HBSS中剪切，这样细胞受到液体的包裹，一方面容易剪切，另一方面可能有一定的保护作用，剪到1-2mm左右即可，不要太小，可能会损伤较大，时间也会长很多。
5. 放在水浴锅消化前轻轻摇动数次，消化结束后，可以不用吹打，不然难以吸干净消化液，在吹打时细胞会破碎，释放出DNA，导致吸取上清非常麻烦，需要很长时间；尽量保持吸液的时间较短，吸液过程不要吹打细胞，细胞在消化液中受到吹打很容易死亡。
6. 按照这种方法，可能需要十几次才能消化完全；若消化到12次时，剩余的组织过多，也可以不用再消化了，将剩下的组织加入含有DMEM+10%FBS的tube中轻轻吹打，大量的细胞会散落下来，这样重复三次，每次收集上清液，一起离心取细胞。
7. 离心和过滤，这两个步骤先后顺序无所谓。
8. 10只乳鼠接种一个25cm的培养瓶足够，差速贴壁1.5hr。
9. 取差速贴壁后的上清，进行胎盘蓝染色计数，计心肌细胞数目，一般96孔板，20K- 30K/well，可能密度比较合适，可以等面积计算到6孔板中，不过开始培养时，密一点细胞会更好一些，容易跳起来，等稳定了，再调整到合适的密度。
10. 祝实验顺利！

作者: dreaming 时间: 2015-5-11 17:07

恩，是的，我是在37°水浴消化的，可就是心肌细胞不搏动，有搏动的话，频率也是很低啊！不知道为什么，急死了！

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你有没有加BRDU呢，抑制成纤维细胞生长

作者: any333 时间: 2015-5-11 17:08

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原帖由 NBA 于 2015-5-11 17:06 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

我尝试分析看看一下你的步骤，也不知道说的对不对，若有不妥之处，还请各位老师指正，谢谢!
1. 乳鼠在酒精中浸泡可能容易死掉，若有喷壶，可以每一只直接喷洒清洗皮肤表层，这样老鼠不容易死掉，心脏的活力可能会高一些；另心脏会在左 ...

就像你所说的一样，消化结束时，每次直接吸上清而不吹打，获得的上清很透明且无蛋清样物质，就是需要消化的次数多一些，我这次是这样做的，等观察了细胞后，再向你汇报。

作者: any333 时间: 2015-5-11 17:08

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原帖由 dreaming 于 2015-5-11 17:07 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
恩，是的，我是在37°水浴消化的，可就是心肌细胞不搏动，有搏动的话，频率也是很低啊！不知道为什么，急死了！

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你有没有加BRDU呢，抑制成纤维细胞生长
...

谢谢你的回复。我没有加BRDU，不知道影响是否很大。

作者: dreaming 时间: 2015-5-11 17:09

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原帖由 any333 于 2015-5-11 17:08 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

谢谢你的回复。我没有加BRDU，不知道影响是否很大。

成纤维细胞比心肌细胞有生长优势，要加BRDU抑制，心肌细胞才能良好的生长。不贵，建议你买一支。

作者: @STAR@ 时间: 2015-5-11 17:09

我想问下学长就是上面的那个图如果来看这个细胞密度能有多少那？我昨天用了 15只老鼠可是密度都不到10 但是我继续做实验必须将细胞密度达到60以后怎么上才能让细胞多点密度大点那？谢谢了

作者: @STAR@ 时间: 2015-5-11 17:10

就是没吹散

作者: kulee 时间: 2015-5-11 17:10

您好，现在才看到这么好的贴子，不知道会不会迟，我想问下楼主，您是怎么计算同步跳率和跳动幅度的，用的什么仪器？什么牌子的？能不能告诉我，我现在急需这方面的指标！谢谢您！

作者: dog002 时间: 2015-5-11 17:10

你好，请问可以把心肌细胞提取后每天的照片上传不？我用的是1.24mg/ml 的胰酶，每次消化5min，大概消化15次，最终还有一些组织没有消化完。每消化一次就立即终止并离心得细胞。所得的所有细胞1h差速贴壁后转入7个孔（24孔板）进行培养（加BrdU），24h后换液为无BrdU的DMEM。我刚提出来的细胞是圆圆的，有的表面坑坑洼洼感觉消化过头了。1-6天都是圆圆的并成团存在，但48h就有成团的细胞跳动（圆细胞组成的团团）。3天后将一个小孔消化转入一个35mm的小皿中，2-3d 细胞才开始出现梭形。

作者: hyuu 时间: 2015-5-11 17:11

前辈所做的是最后加medium重悬细胞，而大多数方法是从第二次开始收集消化悬液转移终止消化，这样涉及到转移上清悬液吹打的过程，很容易导致细胞破裂，但前辈最后收集重悬细胞与分次收集悬液有做过比较么？另外，在剪取心肌时，动作真要很快么？还有胰酶用量不超过3ML，刚好浸没组织块是不是最合适的啊？

作者: qqq111 时间: 2015-5-11 17:11

0.05%胶原酶是加到混合酶后的终浓度，还是开始的工作浓度，谢谢！

作者: NBA 时间: 2015-5-11 17:12

您好，现在才看到这么好的贴子，不知道会不会迟，我想问下楼主，您是怎么计算同步跳率和跳动幅度的，用的什么仪器？什么牌子的？能不能告诉我，我现在急需这方面的指标！谢谢您！

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RTCA 实时心肌细胞分析系统。
-- 艾森生物杭州有限公司。

作者: NBA 时间: 2015-5-11 17:13

你好，请问可以把心肌细胞提取后每天的照片上传不？我用的是1.24mg/ml 的胰酶，每次消化5min，大概消化15次，最终还有一些组织没有消化完。每消化一次就立即终止并离心得细胞。所得的所有细胞1h差速贴壁后转入7个孔（24孔板）进行培养（加BrdU），24h后换液为无BrdU的DMEM。我刚提出来的细胞是圆圆的，有的表面坑坑洼洼感觉消化过头了。1-6天都是圆圆的并成团存在，但48h就有成团的细胞跳动（圆细胞组成的团团）。3天后将一个小孔消化转入一个35mm的小皿中，2-3d 细胞才开始出现梭形。

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1. 胰酶浓度可以再降一点，可以降到0.05%- 0.1%（0.05mg/mL- 0.1mg/mL），酶浓度高的话，对细胞损伤会比较大。
2. 每次消化后再血清中和也是一种经典的方法，但这种方法获得的细胞活力不一致，损伤也比较大，可以考虑，将组织块消化到一定程度，有点发白时，将这些组织块收集用培养基吹散，这样获得细胞活力更好。我们一般是消化12次，每次8min，中间消化的细胞丢弃，只收集最后的组织块吹散的细胞，这些组织块的细胞质量更好。

作者: NBA 时间: 2015-5-11 17:14

以下是一些我个人在实验过程中的体会，与大家分享一下，希望对各位实验有所帮助：
1. 细胞活力：原代心肌细胞活力是第一重要的，如果分离得到的细胞活力高，即使细胞密度偏高或偏低，也可以检测到较好的IMP和FP信号，但若细胞活力偏低，对细胞密度的要求就会比较苛刻，必须在一定的范围内，细胞才能跳的比较好，但是持续时间会比较短。
2. 心肌细胞跳动状态好不好主要由两个方面组成，一个是连续跳动持续时间，另外一个是跳动幅度（跳动力度），这两个因素主要由细胞活力和换液时间所影响，细胞活力更高，连续跳动持续时间和跳动幅度也会更长更高，换液时间间隔过长也会使细胞跳动减弱。
3. 在Cardio Device上一般种植密度为17K，在CardioECR Device上一般种植密度为24K，浓度差异主要是因为在100hr以上，细胞的跳动状态就会变得不太稳定，但17K密度在100hr以上FP信号一般比较弱，所以通过提高细胞密度来获得更强的FP信号，但是密度过高细胞又跳动不起来，所以必须维持在一个浓度范围内，我们一般选择24K（这个细胞浓度可能会因个人的计数方式而略有偏差）。
4. 在取心脏过程中，手术剪刀和镊子等器械必须经过酒精棉球擦拭干净后才能放在酒精灯下烘烤，如果手术剪刀和镊子等器械上沾有血渍或溶液，这时在酒精灯下烘烤会使这些物质碳化和焦化，产生碎小的毒性物质，影响细胞活力；一般放置酒精灯外焰烘烤，持续3-5s，如果时间过短，温度没有上升，起不到杀菌效果。
5. 剪开胸腔时，从颈部肋骨往下数三根，用大剪刀剪开，开口可以更大一些，快一些，一刀即可暴露心脏（快，准，狠为三字要诀），如果开口较小，再用眼科剪刀剪开一些，轻轻拔开心包膜，让心脏跳出胸腔，再剪掉放入冰浴的无血清培养基，迅速挤掉心脏内的血液。
6. 所有试剂开口即用，用完即关，切勿在台内裸露过久。加样槽放置右前方，废液缸放置左前方，正前方放置试管架，操作区域放置DEVICE等，任何物品或操作绝对不允许从加样槽和开口的试剂上方穿过，因为我们的试剂均无抗生素，切记！
7. 获取的心脏在剪碎时，使用锋利吻合度好的眼科剪刀，可以半年更换一次（根据使用频率也可调整），在剪碎过程中，保守估计在30次以上，剪碎至2-3mm左右即可，这个过程中，记住如果有大块组织，可以将其挑出剪小，保持组织块大小较为均一，不要剪得过小。
8. 消化液的使用量，消化次数总计12次，前面8次可以维持3-5ml的量取消化，后面4次减半消化，前面8次可以多摇动几次，使用暗劲，将组织块在消化液中尽量散开，后面4次，轻轻摇柔几下，当取出消化液时，切勿摇动。
9. 消化组织吹打：在吹打获取细胞悬液的过程中，吸管一定要放置液面以下，不要产生气泡，使用暗劲将培养基保持在一个节律吹打，不要过快过慢，让培养基流动带动组织块内的细胞掉落下来；第一次吹打一定要轻柔，次数维持在5-6次即可，第二次可以快一些，猛一些，吹打次数大约在10次，第三次可以再用点力，吹打次数大约在15-20次。

作者: gogo 时间: 2015-5-11 17:15

我也在做心肌细胞培养，想请教下，细胞长了4天，但没有伸展的很开，也没有形成共同的节律，因为快放假了比较着急用，此时的细胞可以用来做缺血再灌注实验吗？对节律无要求，但是不知道会不会对检测蛋白有影响？

作者: newway 时间: 2015-5-11 17:15

请问一下各位，，心肌细胞的纯度要达到好多才能拿来做实验啊

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