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标题: 【讨论帖】microRNA内参，u6,u6a,u6b，到底如何选择 [打印本页]

作者: 园丁## 时间: 2015-6-1 15:06 标题: 【讨论帖】microRNA内参，u6,u6a,u6b，到底如何选择

我的做法是先逆转录再荧光定量pcr！
逆转录使用特异性引物（u6的反向引物）。
u6，also as know RNU6A,RNU6B，分别对应 RNU6-1，RNU6-2，
U6 F CTCGCTTCGGCAGCACA
U6 R AACGCTTCACGAATTTGCGT
这个引物是在google学术搜索里面检索出来文献最多的，有多篇cancer reserach高影响因子使用，且经丁香园内朋友使用，反应很好！
在生工合成的，今天pcr结果非常好！U6的ct 13.1左右。
另外，多谢园友提醒，这些u6都是用于人的。不清楚，也没有验证是否可以用于老鼠！
希望能够给大家一点帮助。

作者: 园丁## 时间: 2015-6-1 15:07

后记：U6 F CTCGCTTCGGCAGCACAU6 R AACGCTTCACGAATTTGCGT这个引物是在google学术搜索里面检索出来文献最多的，有多篇cancer reserach高影响因子使用，所以在没有人回答的情况下，选择了这个。在生工合成的，今天pcr结果非常好！U6的ct 13.1左右。不知道别的U6引物实验结果怎么样，但是我可以证明，这个用着很好！希望能够给大家一点帮助。对你有帮助的话，请投票支持！

作者: 园丁## 时间: 2015-6-1 15:08

U6 F CTCGCTTCGGCAGCACA
U6 R AACGCTTCACGAATTTGCGT
这个引物是在google学术搜索里面检索出来文献最多的，有多篇cancer reserach高影响因子使用，所以在没有人回答的情况下，选择了这个。
在生工合成的，今天pcr结果非常好！U6的ct 13.1左右。
不知道别的U6引物实验结果怎么样，但是我可以证明，这个用着很好！
希望能够给大家一点帮助。

作者: JK.jon 时间: 2015-6-1 15:18

我刚开始做micro-rna，也不知用什么引物？本来打算直接买U6的试剂盒，可是挺贵的，
谢谢楼主的提供，先合成试试.谢谢了，那请问楼主是用的TAKARA的RT-PCR试剂盒吗？
谢谢了，急需！

作者: S6044 时间: 2015-6-1 15:19

请问一下楼主：你的U6是人的还是什么物种的？包括了探针序列吗？

作者: chengjie79 时间: 2015-6-1 15:22

楼主好，我现在也要准备做血浆的MICROrna,不知道楼主用什么方法提的microRNA,用的什么试剂盒，推荐一下，谢谢!

作者: shenkunjie 时间: 2015-6-1 15:22

楼主U6有RT引物吗？
需要合成茎环RT引物吗？

作者: 园丁## 时间: 2015-6-1 15:23

QUOTE:

原帖由 shenkunjie 于 2015-6-1 15:22 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
楼主U6有RT引物吗？
需要合成茎环RT引物吗？

u6的rt引物，就是pcr时的反向引物。
不需要颈环的！

作者: 园丁## 时间: 2015-6-1 15:24

逆转录时不用oligo dt 和随机6碱基引物，改用U6的反向引物U6 R AACGCTTCACGAATTTGCGT。
就是进行特异性逆转录！

作者: am10 时间: 2015-6-1 15:25

我用的是u6的内参，但是RT和pcr的盒子都用的是AB家的，还有想问，如果是做血浆的microRNA和做血清的，有什么差别呢？

作者: dior 时间: 2015-6-1 15:26

我们做组织及细胞的microRNA用的U6，做血浆/血清的miRNA的内参文献报道各家不一，大多是用的syn-cel-miR-39 spike-in control, miR-16，极少数用U6，还有用总RNA量或体积做内参的。目前针对血液miRNA仍无有效的内参，正在研究中。

作者: xevin 时间: 2015-6-1 15:46

我刚开始做micro-rna，也不知用什么引物？本来打算直接买U6的试剂盒，可是挺贵的，
谢谢楼主的提供，先合成试试.谢谢了，那请问楼主是用的TAKARA的RT-PCR试剂盒吗？
谢谢了，急需！

以前做过一点，原先是做RNAi的shRNA，做完后，老板对microRNA兴趣，买了试剂盒让我做。哈，很方便，那时的老板舍得烧钱啊

作者: S6044 时间: 2015-6-1 15:49

我也是用的最后一个U6的引物做的，现在好像效果不错

作者: october7 时间: 2015-6-1 15:50

同志们，你们都做的是什么物种啊？

作者: 2541 时间: 2015-6-1 15:54

亲爱的楼主你好：
非常感谢你分享U6的引物序列！对我来说简直就是救命稻草！我现在在做的是检测H19 mRNA到底是在细胞核还是细胞质里，需要分离细胞核细胞质提取RNA，然后做Q-PCR检测H19的量，细胞质中可选的内参有很多，比如所Actin或是GAPDH，细胞核目前选择的是U6，所以要查找U6的序列设计上下游引物，用下游引物做RT，然后做Q-PCR。我都找了2天了，都没找到全长的U6，只在文献中查到27-100碱基的序列，楼主的分享很给力！但是我还是想知道人U6的序列是多少？希望楼主可以告诉，非常感谢的说！

作者: 2541 时间: 2015-6-1 15:54

U6 F CTCGCTTCGGCAGCACA
U6 R AACGCTTCACGAATTTGCGT
这个引物是在google学术搜索里面检索出来文献最多的，有多篇cancer reserach高影响因子使用，所以在没有人回答的情况下，选择了这个。
在生工合成的，今天pcr结果非常好！U6的ct 13.1左右。
不知道别的U6引物实验结果怎么样，但是我可以证明，这个用着很好！
希望能够给大家一点帮助。
......

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我想请问下楼主：包含U6引物序列的文献怎么查找，特别是“cancer reserach高影响因子”的，希望楼主方便的话给我提供几篇，我好作为依据！非常感谢的说！

作者: 园丁## 时间: 2015-6-1 15:55

u6的序列可以在ncbi里面找，
cancer res的高影响因子的文章可以在google学术里面找关键字:u6 primer mirna 高级搜索的杂志名：cancer res

作者: 园丁## 时间: 2015-6-1 15:57

不好意思，我做的细胞，没有做血清，没有发言权。
但是或许可以类推吧！

作者: zhy平平 时间: 2015-6-1 15:58

QUOTE:

原帖由 园丁## 于 2015-6-1 15:55 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

u6的序列可以在ncbi里面找，
cancer res的高影响因子的文章可以在google学术里面找关键字:u6 primer mirna 高级搜索的杂志名：cancer res

灰常感谢LZ的回答~目前我遇到一个新的问题想向你请教！
1. 我的实验背景之前已经说了是检测细胞质和细胞核中H19的表达~所以我设了3个组，总cell，cell质，cell核，总cell要设GAPDH和U6的内参，cell质GAPDH，cell核U6，还是每个都设2个捏？
2.我分别提总RNA后做反转录是一个一个体系(PCR)中同时加入oligo(dT)和U6-R进行反转录还是平均分两管分别加oligo(dT)和U6-R进行反转录？
3.2中的两种转录方法我都试过~可是奇怪的是我做Q-PCR的时候U6的CT并不像LZ之前所说的在13.1作用，我一U6CT值竟然在5.6.7作用。会不会太小了啊？可是我做H19和GAPDH都在20-25作用很正常！难道U6对Q-PCR另有要求？
不解中。。。。求LZ不吝赐教~

作者: 园丁## 时间: 2015-6-1 16:01

不好意思，因知识所限，第一个问题无法回答。
第二个问题，我当时也考虑过对u6,是进行特异性的反转录（用u6-r），还是用oligo(dT）常规扩增，后来选了只用u6-r做。考虑到既然mirna用了特异性的引物，u6也用特异性的，更具有可比性。
第三个问题，你提取mRNA的试剂是trizol？还是过柱子纯化miRNA？
u6的ct值问题，根据你逆转录时加入的量有关，我做过9，但是5.6.7没有做过。
1、你得实验组和对照组u6ct值一直很稳定，都是5.6.7？
上面你回答是，那么加上你的u6溶解曲线是狭窄的单峰，估计你得结果没有问题！

作者: 1221 时间: 2015-6-1 16:01

MicroRNA（miRNA）是一组在细胞增殖，细胞分化，细胞死亡等细胞过程发挥作用的小非编码RNA。而miRNA基因表达水平的定量检测已经成为研究上述课题，寻找疾病相关的生物标志物的基本方法
miRNA基因表达水平常用的方法是荧光定量PCR，而荧光定量PCR实验中，起始样本量，样本收集，RNA制备和定量，反转录效率的差异都可能导致定量的错误。内源性对照基因是目前纠正初始样本量，RT效率的最准确的方法。
small nuclear RNA (snRNA)和small nucleolar RNA (snoRNA)长度与miRNA相近，200bp左右，在多种组织细胞中高表达，不涉及miRNA的调节途径，且与miRNA探针设计方法相同，所以snoRNA是很好的内参选择。研究证实常用的snoRNA assays包括
Human: U6, RNU48, RNU44, U47, and RNU6B
Mouse: snoRNA-202, snoRNA-234, snoRNA-420
还有一类是在不同实验条件下变化差异很小的miRNA
Human/mouse tissues: miR-152, -186, -25, -92, -26b, -16
Human/mouse cell lines: miR-374, -16, -93, -186, -26b, -92 1
还有一类是传统沿用的
18S rRNA or U6

作者: 大尾巴 时间: 2015-6-1 16:02

您好！我想请问一下，昆虫microRNA做半定量pcr时选择什么作为内参？可以选择U6吗？为什么？那U6的序列怎么获得的？我看到您说u6的rt引物，就是pcr时的反向引物，不需要颈环，是不是通过oligo6.0设计出来的？渴望得到您的解答！谢谢~~

作者: join 时间: 2015-6-1 16:02

我做血清中的miRNA,用miR-16做内参，效果不好,U6跑的结果也不行，还没有合适的内参选择，不知怎么办了？

作者: 33号 时间: 2015-6-1 16:02

我汗死了，用u6做出不错的结果，结果审稿人居然说U6不是合适的内参（神经损伤实验）。这个怎么办啊~

作者: moonlight45 时间: 2015-6-1 16:03

相关疾病：
头痛
3Q 正在头痛U6引物设计呢我的miRNA引物是茎环设计的，U6难道不用茎环的？

作者: 园丁## 时间: 2015-6-1 16:03

QUOTE:

原帖由 moonlight45 于 2015-6-1 16:03 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
相关疾病：
头痛
3Q 正在头痛U6引物设计呢我的miRNA引物是茎环设计的，U6难道不用茎环的？

U6并不是一个miRNA,所以没有对其进行进行颈环设计。

作者: 园丁## 时间: 2015-6-1 16:04

QUOTE:

原帖由 33号 于 2015-6-1 16:02 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

我汗死了，用u6做出不错的结果，结果审稿人居然说U6不是合适的内参（神经损伤实验）。这个怎么办啊~

自己查找一下神经损伤实验的miRNA的内参，
1、参考别人文章里的内参，重做实验。
2、找证据证明U6在你这里可以当内参使用。
另外像GAPDH一样，U6并不是万能的内参。

作者: 园丁## 时间: 2015-6-1 16:05

QUOTE:

原帖由 join 于 2015-6-1 16:02 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

我做血清中的miRNA,用miR-16做内参，效果不好,U6跑的结果也不行，还没有合适的内参选择，不知怎么办了？

相关疾病：
肝癌
呵呵，血清中不知道是否有U6，可能的确不是好的内参，建议搜下miRNA血清内参，国内多篇肝癌miRNA诊断文章。

作者: 园丁## 时间: 2015-6-1 16:06

QUOTE:

原帖由 大尾巴 于 2015-6-1 16:02 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

您好！我想请问一下，昆虫microRNA做半定量pcr时选择什么作为内参？可以选择U6吗？为什么？那U6的序列怎么获得的？我看到您说u6的rt引物，就是pcr时的反向引物，不需要颈环，是不是通过oligo6.0设计出来的？渴望得到您的解答！谢谢~~ ...

只需要找到你们领域的一篇miRNA pcr的文章即知道选用什么内参。
另外，我一般都不做半定量，那个结果不利于发文章。
花同样的时间，仅仅贵一点，我一般都用SYBR。
taq-man太贵，一般也不用。

作者: dog002 时间: 2015-6-1 16:06

自己查找一下神经损伤实验的miRNA的内参，
1、参考别人文章里的内参，重做实验。
2、找证据证明U6在你这里可以当内参使用。
另外像GAPDH一样，U6并不是万能的内参。
......

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其实大部分的都是用u6作为内参的，少数使用的s12，还有一篇文章提到u6在损伤后改变。。。
刚好通讯作者是我的一个推荐审稿人。结果他在前一篇文章以u6为内参，后一篇通过深度测序发现u6改变。，。。。。
我汗

作者: 园丁## 时间: 2015-6-1 16:07

QUOTE:

原帖由 dog002 于 2015-6-1 16:06 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
自己查找一下神经损伤实验的miRNA的内参，
1、参考别人文章里的内参，重做实验。
2、找证据证明U6在你这里可以当内参使用。
另外像GAPDH一样，U6并不是万能的内参。
......

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1、呵呵，仔细读他的文章，看u6到底变化多少，扣除这个影响后，你的miRNA变化如何。
2、看你RNA样本是否还在，重做。
3、若都不在，就实话实说，就说你这个实验不可能重做。让他再评估下U6的使用情况。或者你讨论里面讨论下这个内容，同时引用review的文献。

作者: xue258 时间: 2015-6-1 16:07

楼主，相见恨晚啊，我的U6都用的ABI的效果暂时还不好

作者: 园丁## 时间: 2015-6-1 16:07

QUOTE:

原帖由 xue258 于 2015-6-1 16:07 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
楼主，相见恨晚啊，我的U6都用的ABI的效果暂时还不好

不可能吧，ABI自己的效果都不好？那你自己合成岂不是结果一样。
是不是RNA降解了？

作者: xue258 时间: 2015-6-1 16:09

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原帖由 园丁## 于 2015-6-1 16:07 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

不可能吧，ABI自己的效果都不好？那你自己合成岂不是结果一样。
是不是RNA降解了？

我是存放在-80°的应该不会呀，ratio有2.0，还可以,而且做的miRNA的曲线都还挺正常的，倒是U6很不正常，CT值很大？？

作者: 园丁## 时间: 2015-6-1 16:09

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原帖由 xue258 于 2015-6-1 16:09 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

我是存放在-80°的应该不会呀，ratio有2.0，还可以,而且做的miRNA的曲线都还挺正常的，倒是U6很不正常，CT值很大？？

引物的运输和长期保存都是干粉，按理说同一批中，miRNA的引物都没出问题，u6也不该有事。
1、逆转录的时候是用的u6的反向引物作为特异性逆转录引物吗？
2、有没有第二次换另外时间提取的RNA做，结果如何？
3、你做的什么样本？好像有同学血液样本用U6是检查不出来的。搜一下文献，看是否你的这个样本，用的是另外的内参。
4、如果一切都正常的话，现在合成PAGE级别的引物很便宜，你合成一对用用试一下吧。

作者: xue258 时间: 2015-6-1 16:10

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原帖由 园丁## 于 2015-6-1 16:09 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

引物的运输和长期保存都是干粉，按理说同一批中，miRNA的引物都没出问题，u6也不该有事。
1、逆转录的时候是用的u6的反向引物作为特异性逆转录引物吗？
2、有没有第二次换另外时间提取的RNA做，结果如何？
3、你做的什么样本？好 ...

我用的是RNU6B作为内参的，它的average ct 有的资料给的就是26.6，我一个sample做的是27应该没大问题，很可能是另一个sampleRNA降解了。今天打算重新准备sample看看。

作者: 园丁## 时间: 2015-6-1 16:10

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原帖由 xue258 于 2015-6-1 16:10 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

我用的是RNU6B作为内参的，它的average ct 有的资料给的就是26.6，我一个sample做的是27应该没大问题，很可能是另一个sampleRNA降解了。今天打算重新准备sample看看。 ...

很好。祝顺利。
如果他的内参平均为26左右，是不是太低了？
检验再检索下你专业的相关文献，是不是需要换个内参？
见楼上有个神经方面的miRNA内参选u6，reviewer提出问题，说这个u6无法用作神经方面的内参。

作者: xue258 时间: 2015-6-1 16:11

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原帖由 园丁## 于 2015-6-1 16:10 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

很好。祝顺利。
如果他的内参平均为26左右，是不是太低了？
检验再检索下你专业的相关文献，是不是需要换个内参？
见楼上有个神经方面的miRNA内参选u6，reviewer提出问题，说这个u6无法用作神经方面的内参。 ...

谢谢哦，等下去看结果。
感觉介绍内参的文章还是很少的，我暂时没找到相关的文献。如果这个内参不能用我老板就要灭了我了。
如果之前查了它的CT这么靠后我就订别的了。

作者: purrr 时间: 2015-6-1 16:11

楼主，我是新手上路，迷茫了好久，看到帖子真的是泪流满面
想向您请教几个问题，
（1）我想要用real-timePCR检测细胞中的成熟microRNA,但是ABI的Taqman探针实在是太贵了，想用SRBY GREEN做，
但是不知道RT茎环引物的设计该从何下手？希望楼主可以指点迷津~~
（2）我同时还想检测microRNA调节的上下游mRNA的量，我查了文献，发现大部分文献中的mRNA和microRNA分开使用不同的内参，比如说mRNA用GAPDH做内参，microRNA用U6做内参。为什么microRNA要单独使用一个内参标准呢？

作者: 园丁## 时间: 2015-6-1 16:11

1.你自己在论坛里面查下。有这个RT的资料。我试了一下用关键词“颈环”
2.因为大多时候mRNA和miRNA的退火温度不同，无法同一批跑PCR，所以分别有自己的内参。

作者: dog002 时间: 2015-6-1 16:12

不好意思，我做的细胞，没有做血清，没有发言权。
但是或许可以类推吧！

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你做的人的细胞么？是人的U6？

作者: dog002 时间: 2015-6-1 16:13

1.你自己在论坛里面查下。有这个RT的资料。我试了一下用关键词“颈环”
2.因为大多时候mRNA和miRNA的退火温度不同，无法同一批跑PCR，所以分别有自己的内参。

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还有您给的这个U6的退火温度好像很低，能不能和miRNA的Q-PCR一起跑呢？

作者: 阿福 时间: 2015-6-1 16:15

有谁知道 ABI 的U6试剂盒的具体名字和代码吗？貌似网上找不到

作者: 园丁## 时间: 2015-6-1 16:15

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原帖由 dog002 于 2015-6-1 16:12 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
不好意思，我做的细胞，没有做血清，没有发言权。
但是或许可以类推吧！

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你做的人的细胞么？是人的U6？

恩，是人的u6.
u6作为内参，是忽略退火温度的影响的，这对序列不是我设计的。
当你现有的知识无法解释，而你又急着用时，可以先借用别人的序列使用。
当然，如果事后还有疑惑，可以再次评判U6作为内参在你的样本里面是否妥当。
认为u6作为内参不合适的，是u6量的稳定性决定的，而不是引物的退火温度。

作者: 园丁## 时间: 2015-6-1 16:16

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原帖由阿福于 2015-6-1 16:15 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
有谁知道 ABI 的U6试剂盒的具体名字和代码吗？貌似网上找不到

建议直接电话ABI客服
cuturl('http://www.baidu.com/link?url=b7c49830fc293c5e471ef23de092fddc99fdd688680ca9fb20cc8c8de7924e212c53bbfd6cd6e09677f4468271a5')
ABI东西太贵。呵呵。

作者: shenkunjie 时间: 2015-6-1 16:17

请问U6有几种？U6-1是 U6-2一样的么？

作者: 园丁## 时间: 2015-6-1 16:17

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原帖由 shenkunjie 于 2015-6-1 16:17 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

请问U6有几种？U6-1是 U6-2一样的么？

u6，also as know RNU6A,RNU6B，分别对应 RNU6-1，RNU6-2。

作者: am10 时间: 2015-6-1 16:18

QUOTE:

原帖由 园丁## 于 2015-6-1 16:17 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

u6，also as know RNU6A,RNU6B，分别对应 RNU6-1，RNU6-2。

楼主你好，我最近也遇到了问题。我用的是takara 的rt-pcr的试剂盒，mir以及u6逆转录时用的都是特异性的锐博公司提供的引物，实时定量pcr的上下游引物也用的是他们公司的。但是pcr的扩增效率只有60%，请问下，你觉得问题可能出在哪里？另，你的mir实时定量的上下游引物也是找生工设计的么？

作者: 园丁## 时间: 2015-6-1 16:18

mir实时定量的上下游引物是我自己设计的。
主要是参照Chen2005年的文章，附件中有原文和support文件.
同时曹雪涛院士也是用的锐博的mirna引物，但是他公布了序列，附件中有原文和support文件：
可以仿照设计，并且有自己的miRNA引物序列可供发表文章使用。然后拿到英俊合成的PAGE纯化的引物。
用的也是takala的全套pcr产品。
对于扩增效率只有60%，如果排除了温度的影响，不好意思，我没有什么好的建议，唯一的建议就是换引物。
祝好！

作者: shenkunjie 时间: 2015-6-1 16:18

问了他们公司，他们说他们准备再检测下，看看是不是60°是最好的退火温度！有消息会马上告诉你的！

作者: shenkunjie 时间: 2015-6-1 16:19

mir实时定量的上下游引物是我自己设计的。
主要是参照Chen2005年的文章，附件中有原文和support文件.
同时曹雪涛院士也是用的锐博的mirna引物，但是他公布了序列，附件中有原文和support文件：
可以仿照设计，并且有自己的miRNA引物序列可供发表文章使用。然后拿到英俊合成的PAGE纯化的引物。
用的也是takala的全套pcr产品。
对于扩增效率只有60%，如果排除了温度的影响，不好意思，我没有什么好的建议，唯一的建议就是换引物。
祝好！
......

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你好，还有个问题想请教下你。我买的锐博的说明书上有一个rt-pcr的体系，takara也有个rt-pcr的体系，两者体系是不一样的，比如说引物的量，cDNA的量等等，我想请问，你采用的是哪个呢？谢谢指导！

作者: 园丁## 时间: 2015-6-1 16:19

QUOTE:

原帖由 shenkunjie 于 2015-6-1 16:19 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
mir实时定量的上下游引物是我自己设计的。
主要是参照Chen2005年的文章，附件中有原文和support文件.
同时曹雪涛院士也是用的锐博的mirna引物，但是他公布了序列，附件中有原文和support文件：
可以仿照设计，并且有自己的miRN ...

你好。
我是自己使用的合成引物。
所以使用的是takara的rt-pcr的体系，用的是特异性引物针对的引物的量。
我也见过锐博的说明书，其实你仔细看下，他们可以综合在一起使用，不冲突的。
如果还有疑惑，我就去实验室翻我的记录后给你回复。

作者: mickeylin 时间: 2015-6-1 16:19

我的做法是先逆转录再荧光定量pcr！
逆转录使用特异性引物（u6的反向引物）。
u6，also as know RNU6A,RNU6B，分别对应 RNU6-1，RNU6-2，
U6 F CTCGCTTCGGCAGCACA
U6 R AACGCTTCACGAATTTGCGT
这个引物是在google学术搜索里面检索出来文献最多的，有多篇cancer reserach高影响因子使用，且经丁香园内朋友使用，反应很好！
在生工合成的，今天pcr结果非常好！U6的ct 13.1左右。
另外，多谢园友提醒，这些u6都是用于人的。不清楚，也没有验证是否可以用于老鼠！
希望能够给大家一点帮助。
对你有帮助的话，请投票支持！对你有帮助的话，请投
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楼主没提探针，您用的是sybgreen 染料吗？

作者: 园丁## 时间: 2015-6-1 16:21

对，没用探针。当时发现国外有些高影响因子的文章没用探针，加上经济考虑，选择sybr green。

作者: mickeylin 时间: 2015-6-1 16:21

QUOTE:

原帖由 园丁## 于 2015-6-1 16:21 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
对，没用探针。当时发现国外有些高影响因子的文章没用探针，加上经济考虑，选择sybr green。

那您跑胶或测序以证明是特异目的产物，除了溶解曲线

作者: 园丁## 时间: 2015-6-1 16:22

那您跑胶或测序以，除了溶解曲线

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跑胶证明是特异目的产物,未测序。

作者: eor 时间: 2015-6-1 16:23

第二个问题，我当时也考虑过对u6,是进行特异性的反转录（用u6-r），还是用oligo(dT）常规扩增，后来选了只用u6-r做。考虑到既然mirna用了特异性的引物，u6也用特异性的，更具有可比性。

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您好，我是新手，最近要做microRNA的东西，选择染料法，向同学大概了解了一下，但是还是有很多地方不明白。例如您上面讲的特异性反转录，同学告诉我的是在反转录之前需要多一步加A尾，之后就和mRNA一样了，而且可以用mRNA的反转录试剂盒。您上面提到的“进行特异性的反转录（用u6-r），还是用oligo(dT）常规扩增”是什么意思，是扩增的时候只加这条链吗，还是在别的步骤有什么特殊的操作？
另外，我在搜索目的基因序列时找的比较困难，好不容易有篇文献中提供了序列，但是说巢式pcr，然后提供了四条链，分F1 ，F2， R1 ，R2 ，之后我查了相关资料，说是进行两次pcr，没明白是什么意思，现在迷茫中，希望您帮忙解答，万分感谢。

作者: cj_mondy 时间: 2015-6-1 16:23

楼主，问您一个问题。
我想要定量的是与AGO2蛋白结合的miRNA的量。先用anti-AGO2抗体做IP之后，再用Trizol处理洗脱液，提取相应的RNA做反转录以及realtime定量。这个时候就不能再用U6作为内参了。因为它虽然是小RNA但是不与AGO2结合。想问您这个实验中应该选取什么内参来定量呢？

作者: 园丁## 时间: 2015-6-1 16:24

QUOTE:

原帖由 cj_mondy 于 2015-6-1 16:23 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
楼主，问您一个问题。
我想要定量的是与AGO2蛋白结合的miRNA的量。先用anti-AGO2抗体做IP之后，再用Trizol处理洗脱液，提取相应的RNA做反转录以及realtime定量。这个时候就不能再用U6作为内参了。因为它虽然是小RNA但是不 ...

您好，水平有限无法回答，见谅，请单独发帖请教，如果关于研究机密，请隐藏掉你的蛋白名称。我想应该有文章做过蛋白结合miRNA，看下文章中是如何找内参的。
提问几个问题，仅供参考，不知道AGO2结合几种miRNA? 有几个结合位点？你是做AGO2的结构，找与miRNA结合位点吗？

作者: veiwu 时间: 2015-6-1 16:25

QUOTE:

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您好，水平有限无法回答，见谅，请单独发帖请教，如果关于研究机密，请隐藏掉你的蛋白名称。我想应该有文章做过蛋白结合miRNA，看下文章中是如何找内参的。
提问几个问题，仅供参考，不知道AGO2结合几种miRNA? 有几个结合位点？你是 ...

用oligo(dT）常规反转录U6 RNA,做U6cDNA real time的时候选U6 F CTCGCTTCGGCAGCACA U6 R AACGCTTCACGAATTTGCGT作为引物呢
还是只用forward primer，反向引物用uni-miR qPCR primer（Takara盒子里的）？

作者: youyou99 时间: 2015-6-1 16:26

我的做法是先逆转录再荧光定量pcr！
逆转录使用特异性引物（u6的反向引物）。
u6，also as know RNU6A,RNU6B，分别对应 RNU6-1，RNU6-2，
U6 F CTCGCTTCGGCAGCACA
U6 R AACGCTTCACGAATTTGCGT
这个引物是在google学术搜索里面检索出来文献最多的，有多篇cancer reserach高影响因子使用，且经丁香园内朋友使用，反应很好！
在生工合成的，今天pcr结果非常好！U6的ct 13.1左右。
另外，多谢园友提醒，这些u6都是用于人的。不清楚，也没有验证是否可以用于老鼠！
希望能够给大家一点帮助。
对你有帮助的话，请投票支持！对你有帮助的话，请投票支持！
......

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u6引物有没有物种特异性？

作者: youyou99 时间: 2015-6-1 16:26

不知道有人比较过骨髓中U6与U6B那个更适合做内参吗？U6感觉用的多些，但不知在骨髓中如何
有人知道U6在骨髓中一般CT值多少呢

作者: 园丁## 时间: 2015-6-1 16:27

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原帖由 youyou99 于 2015-6-1 16:26 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

不知道有人比较过骨髓中U6与U6B那个更适合做内参吗？U6感觉用的多些，但不知在骨髓中如何
有人知道U6在骨髓中一般CT值多少呢

强烈建议个人查下文献，相信您不是第一个做骨髓中的mirna的。
当然，也可以开新贴询问，因为u6的ct值一般文献里面没有。
祝顺利！

作者: shenkunjie 时间: 2015-6-1 16:28

对啊，查了20多篇，没有一篇把原始CT值放上来的

作者: panda王 时间: 2015-6-1 16:28

用oligo(dT）常规反转录U6 RNA,做U6cDNA real time的时候选U6 F CTCGCTTCGGCAGCACA U6 R AACGCTTCACGAATTTGCGT作为引物呢
还是只用forward primer，反向引物用uni-miR qPCR primer（Takara盒子里的）？

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请问关于这个问题，您现在有答案了吗？可不可以分享一下。

作者: panda王 时间: 2015-6-1 16:28

请问楼主，TAKARA家的microRNA试剂盒（加尾法）做qRT-PCR时，可以使用您推荐的U6引物吗？

作者: xue258 时间: 2015-6-1 16:29

战友好，最近刚刚在接触miRNA，菜鸟级别的。有几个问题想向您请教一下。我准备做miRNA的染料法荧光定量分析，想采取PolyA加尾法进行反转录。我查了文献，文献中说加尾之后进行反转录，需要加入反转录引物，后续PCR定量时只需要设计上游引物，下游引物是通用的。但是内参基因U6是有一对引物且反转录引物就是U6的下游引物。那么现在我想知道，我每个样本要做目的基因和内参U6，那我是不是需要每个样本进行2管加尾反转录，目的基因管加尾后反转录加入RT Primer，而我的内参U6管，加尾后要加入U6下游引物？还是说不用分开做反转录，直接把每个样本加尾处理后反转录加入RT Primer即可？后续做荧光定量直接用反转录后的模板加入上游引物和下游通用引物就行~~盼回复~~

作者: october7 时间: 2015-6-1 16:29

楼主，我想问一下，我想RT-pcr一种microRNA,想选择U6做内参，我设计了microRNA的颈环引物作为逆转的时候使用，但是我想知道，你分享的引物是U6逆转的时候用的特异性的引物吗？还有如果是的话，这是针对SNU6-1的还是2的？，真的很想知道，谢谢楼主

作者: 园丁## 时间: 2015-6-1 16:29

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原帖由 october7 于 2015-6-1 16:29 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

楼主，我想问一下，我想RT-pcr一种microRNA,想选择U6做内参，我设计了microRNA的颈环引物作为逆转的时候使用，但是我想知道，你分享的引物是U6逆转的时候用的特异性的引物吗？还有如果是的话，这是针对SNU6-1的还是2的？，真的很想知 ...

不好意思，我primer blast后没有找到具体的这个引物是SNU6-1 还是SNU6-2.
另外，我好久没有做microRNA，这个东西忘的差不多了。
针对SNU6-1的还是2，有什么差别吗？

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