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标题: 【求助】实时荧光定量PCR数据统计 [打印本页]

作者: PCR 时间: 2015-6-3 09:15 标题: 【求助】实时荧光定量PCR数据统计

刚做完PCR不知道怎么统计数据,检测一个因子在脾脏中的表达,假设测得的数据是:
1号正常老鼠脾脏内参 15.5 16 因子18 18.5
2号正常老鼠脾脏内参 16.5 17 因子 18.5 18
3号正常老鼠脾脏内参 16 16 因子18 18
1号有病老鼠脾内参 16 17 因子 17 17.5
2号有病老鼠脾内参 18 19 因子 18 18
3号有病老鼠脾脏内参 18 19 因子 17 17
只做了一个复孔,我想问一下这样怎么统计阿,万分感谢.

作者: dog002 时间: 2015-6-3 09:16

用2的负得而他得儿他T法

作者: 园丁## 时间: 2015-6-3 09:16

第一步：计算ΔCt
1号：ΔCt1正常=18.25-15.75=2.5
2号：ΔCt2正常=18.25-16.75=1.5
3号：ΔCt3正常=18-16=2
1号：ΔCt1病=17.25-16.5=0.75
2号：ΔCt2病=18-18.5=-0.5
3号：ΔCt3病=17-18.5=-1.5
第二步：计算ΔΔCt，以1号正常样为参照
ΔΔCt2正常=2-（ΔCt2正常-ΔCt1正常）=2
ΔΔCt3正常=2-（ΔCt3正常-ΔCt1正常）=1.4
ΔΔCt1病=2-（ΔCt1病-ΔCt1正常）=3.4
ΔΔCt2病=2-（ΔCt2病-ΔCt1正常）=8
ΔΔCt3病=2-（ΔCt3病-ΔCt1正常）=16

作者: xue258 时间: 2015-6-3 09:17

相关疾病：
先天性卵巢发育不全综合征

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http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=33122

作者: qianqin1977 时间: 2015-6-3 09:19

其实一个复孔没有意义的，一般都做三个复孔，这样得出来的结果才可靠。real time PCR是很灵敏的，稍微一点误差影响结果的。另外如果做相对定量就只要一步ΔCt，如果是绝对定量就要两步ΔCt

作者: PCR 时间: 2015-6-3 09:19

QUOTE:

原帖由 园丁## 于 2015-6-3 09:16 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
第一步：计算ΔCt
1号：ΔCt1正常=18.25-15.75=2.5
2号：ΔCt2正常=18.25-16.75=1.5
3号：ΔCt3正常=18-16=2
1号：ΔCt1病=17.25-16.5=0.75
2号：ΔCt2病=18-18.5=-0.5
3号：ΔCt3病=17-18.5=-1.5
第二步：计算ΔΔCt，以1号正常样为参 ...

设两个复孔也是这样取三个的平均值,如果要用统计方法的话,是把最后的2-ΔCtΔCt 算出来比较异常和正常有无统计学差异吧

作者: PCR 时间: 2015-6-3 09:20

QUOTE:

原帖由 qianqin1977 于 2015-6-3 09:19 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

其实一个复孔没有意义的，一般都做三个复孔，这样得出来的结果才可靠。real time PCR是很灵敏的，稍微一点误差影响结果的。另外如果做相对定量就只要一步ΔCt，如果是绝对定量就要两步ΔCt ...

相对定量就只要一步ΔCt，如果是绝对定量就要两步ΔCt不是很明白,我做的应该是相对定量

作者: whitesheep 时间: 2015-6-3 09:20

QUOTE:

第二步，算出来的是倍数啊，后续怎么统计呢？

作者: qhyu 时间: 2015-6-3 09:21

QUOTE:

第三步是不是直接进行t-test呢？

作者: milkdog 时间: 2015-6-3 09:23

……另外如果做相对定量就只要一步ΔCt，如果是绝对定量就要两步ΔCt

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相对定量必须有内参和对照，所以肯定是两步，主要用于基因表达分析；
绝对定量是通过已知拷贝数的标准品，作梯度稀释，制作标准曲线，通过标准曲线来计算未知样品的拷贝数等，主要用于病毒等定量；
两种定量方法有相通的地方，也有不同。

作者: milkdog 时间: 2015-6-3 09:23

设两个复孔也是这样取三个的平均值,如果要用统计方法的话,是把最后的2-ΔCtΔCt 算出来比较异常和正常有无统计学差异吧

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从你的结果看，该基因在正常样品和疾病样品中的表达差异还是挺明显的。感觉样本量少，正常和疾病各才三个

作者: PCR 时间: 2015-6-3 09:24

QUOTE:

原帖由 milkdog 于 2015-6-3 09:23 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
设两个复孔也是这样取三个的平均值,如果要用统计方法的话,是把最后的2-ΔCtΔCt 算出来比较异常和正常有无统计学差异吧
...

谢谢,我的样本不只是这些的,我只是想知道怎么计算的,我看有的计算方法不是只是拿正常1号的作为参照,是把所有的正常的ΔΔCt做为参照,那样是一对一的,我想这有什么区别阿

作者: milkdog 时间: 2015-6-3 09:24

参照是认为设定的，选择参照不会影响最终的分析结果，把所有正常样本作为参照，就是把所有正常样本的ΔCt作生物学平均，然后疾病样本的平均ΔCt与之比较得出表达量的情况。

作者: junhun 时间: 2015-6-3 09:25

是不是所以样本的内参CT值差异不能很大。要是差异很大，需重新做实验，或者，可以将同一样本的内参和目的基因CT值同时放大，这样做的目的是将所有样本内参CT都扩到一个相同的数值。这样可以吗？谢谢了

作者: vvmmoy 时间: 2015-6-3 09:25

先讲讲内参的作用：
内参主要用来校正起始模板量差异以及后续处理中带来的人为差异，相当于数据处理中常用的归一化。
我举个例子说吧：
有A、B两个样本，A样本是从10万个细胞抽提RNA逆转成cDNA做模板，B样本是从20万个细胞抽提RNA逆转成cDNA做模板，我们要看这两样本中某一基因的表达差异，选GAPDH基因为内参。不考虑其他因素影响的情况下，如果A样本的内参Ct值为20的话，B样本的Ct值就是19（2倍差异），同样，假设A、B样本中目的基因表达量一致的话，A样本目的基因Ct值为25，那B样本的Ct值就为24，然后计算各自ΔCt为-5，ΔΔCt为0，得出A、B样本表达量一致。
如果内参Ct值差异大，要具体问题具体分析，先看三个重复的Ct值差异（尽量控制在0.5以内），复孔没问题时，如果采用染料法，再检查熔解曲线是否正常，如果这些都没有问题就不需要重做了。
Ct值的大小由定义的阈值决定，阈值可以在扩增曲线的指数增长期任意人为设定，所有Ct值的大小本身没什么意义，ΔCt（样本目的基因和该样本内参Ct值的差值）才是恒定的。

作者: 小游abc 时间: 2015-6-3 09:26

QUOTE:

原帖由 vvmmoy 于 2015-6-3 09:25 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

先讲讲内参的作用：
内参主要用来校正起始模板量差异以及后续处理中带来的人为差异，相当于数据处理中常用的归一化。
我举个例子说吧：
有A、B两个样本，A样本是从10万个细胞抽提RNA逆转成cDNA做模板，B样本是从20万个细胞抽 ...

您好前辈，我想问一下为什么A、B样本从不同数量的细胞中提取就像您说的数量差是两倍，为什么就会产生Ct值得相差为一啊？而且您已经让基因表达量一致了，然后打比方A样本目的基因Ct值为25，那B样本的Ct值就为24？就是总体没明白，您能不能再帮我讲讲？初学PCR小菜鸟一枚~谢谢

作者: junjie05 时间: 2015-6-3 09:26

相关疾病：
先天性卵巢发育不全综合征

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作者: junjie05 时间: 2015-6-3 09:27

请问这个最后用什么统计学方法啊 T检验还是非参数检验才能说明问题a 谢谢求解答

作者: woshi 时间: 2015-6-3 09:27

ct值相差1，也就是差一个循环，1个循环扩增1倍。也就是2的1次方，不就是两倍吗。最后都要换算成2的-ΔΔCt次方的。

作者: mickeylin 时间: 2015-6-3 09:29

只做一个复孔怎么可能做统计分析？！

作者: am10 时间: 2015-6-3 09:29

最后用什么做变量进行统计分析呢？
是用2的-ΔΔCt次方做变量吗？
统计方法的选择呢？使用非参数秩和检验吗？
好多战友都只算到2的-ΔΔCt就没再说下去了。。。。谁能解惑啊？？

作者: cj_mondy 时间: 2015-6-3 09:30

参照是认为设定的，选择参照不会影响最终的分析结果，把所有正常样本作为参照，就是把所有正常样本的ΔCt作生物学平均，然后疾病样本的平均ΔCt与之比较得出表达量的情况。

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你好！我最近做QPCR，分析目标基因在实验组和对照组之间表达是否有差异，选了16个样本，8个阳性，8个阴性，加内参基因正好一块板。我想问的是，最后统计的时候我先把阳性的各样本deltaCT平均，阴性的deltaCT平均，两个平均值相比较，这样算比值可以吗？还是其他的统计方法？
机器上的软件是用2-deltadeltaCT，取的默认的一组作为参照，直接算出RQ值，但我觉得用这个RQ值来分析的方法是不对的。

作者: S6044 时间: 2015-6-3 09:31

第一步：计算ΔCt
1号：ΔCt1正常=18.25-15.75=2.5
2号：ΔCt2正常=18.25-16.75=1.5
3号：ΔCt3正常=18-16=2
1号：ΔCt1病=17.25-16.5=0.75
2号：ΔCt2病=18-18.5=-0.5
3号：ΔCt3病=17-18.5=-1.5
第二步：计算ΔΔCt，以1号正常样为参照
ΔΔCt2正常=2-（ΔCt2正常-ΔCt1正常）=2
ΔΔCt3正常=2-（ΔCt3正常-ΔCt1正常）=1.4
ΔΔCt1病=2-（ΔCt1病-ΔCt1正常）=3.4
ΔΔCt2病=2-（ΔCt2病-ΔCt1正常）=8
ΔΔCt3病=2-（ΔCt3病-ΔCt1正常）=16
......

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请问选择哪个正常组作对照有区别吗？比如你选1号正常和2号正常？谢谢

作者: 1221 时间: 2015-6-3 09:31

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作者: tie8 时间: 2015-6-3 09:32

第一步：计算ΔCt
1号：ΔCt1正常=18.25-15.75=2.5
2号：ΔCt2正常=18.25-16.75=1.5
3号：ΔCt3正常=18-16=2
1号：ΔCt1病=17.25-16.5=0.75
2号：ΔCt2病=18-18.5=-0.5
3号：ΔCt3病=17-18.5=-1.5
第二步：计算ΔΔCt，以1号正常样为参照
ΔΔCt2正常=2-（ΔCt2正常-ΔCt1正常）=2
ΔΔCt3正常=2-（ΔCt3正常-ΔCt1正常）=1.4
ΔΔCt1病=2-（ΔCt1病-ΔCt1正常）=3.4
ΔΔCt2病=2-（ΔCt2病-ΔCt1正常）=8
ΔΔCt3病=2-（ΔCt3病-ΔCt1正常）=16
......

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如过将每一组值（做的多的话）的ΔCt减去最大或最小的是不是就能全部每一粉都可以比较了？TTEST，但是选则双尾还是单尾？是成对检验1还是其他2或3（excel中）

作者: am10 时间: 2015-6-3 09:32

如果是几块板不同批次跑qPCR，那每一块板是否要都设置一个相同的样本，否则没有对照？如果每块板没加同一个对照样本怎么统一RQ值啊谢谢？

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