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标题: 【求助】如何验证引物特异性？？ [打印本页]

作者: memory 时间: 2015-6-3 09:33 标题: 【求助】如何验证引物特异性？？

我做的PCR结果除了目的条带还稳定地出现一条同样大小的非目的条带，我想应该是引物的问题，但是怎么验证引物扩增的就只有靶基因的目的条带还是有其他匹配的可扩增的非目的条带啊？
急切盼望各位高手指点！！

作者: zhy平平 时间: 2015-6-3 09:33

OLIGE。6软件就可以验证引物的特异性。。如果存在同源性你可以BLAST一下。我不知道你的非目的条带是指什么？如果在100BP一下的应该是引物二聚体。。做普通PCR影响不大。。荧光定量的就不能有任何非目的条带。。我建议你提高一下退火温度。。每次提高3-4度随着温度的升高目的基因的特异性就越高杂带就越少。。但是目的基因扩增出来的量就会变少。。如果提高温度不行那就要换换引物。。不要轻易更换引物。要反复的做预试验。。

作者: memory 时间: 2015-6-3 09:35

非常感谢啊！
我说的非特异条带不是引物二聚体，退火温度也提高试过了，还是有。
但是olige.6和blast我还不怎么会用啊，能否有具体的操作方法啊？
谢谢了啊！

作者: zzzz 时间: 2015-6-3 09:36

在专门的引物设计软件中，“Oligo”是最著名的。它的使用并不十分复杂，但初学者容易被其复杂的图表吓倒。Oligo 5.0的初始界面是两个图：Tm图和ΔG图；Oligo 6.0的界面更复杂，出现三个图，加了个Frq图。“Oligo”的功能比“Premier”还要单一，就是引物设计。但它的引物分析功能如此强大以至于能风靡全世界。oligo的下载和安装我就不多说了，打开oligo相信也无需多讲。打开oligo的页面如下

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http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=33128

作者: zzzz 时间: 2015-6-3 09:36

单击file菜单再点open或点击“打开”快捷图标或者用快捷键“CTrl＋O”可打开下面的窗口

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http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=33129

作者: zzzz 时间: 2015-6-3 09:37

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在打开的OPEN窗口内选择FreqSeq再点“打开

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作者: zzzz 时间: 2015-6-3 09:37

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选择drosfr或者其它一个文件点击“打开”

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作者: zzzz 时间: 2015-6-3 09:38

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出现以下窗口，点击“window”再点击“Tile”

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作者: zzzz 时间: 2015-6-3 09:40

出现以下窗口，图中显示的三个指标分别为Tm、ΔG和Frq，其中Frq是6.0版本的新功能，为邻近6至7个碱基组成的亚单位在一个指定数据库文件中的出现频率。该频率高则可增加错误引发的可能性。因为分析要涉及多个指标，起动窗口的cascade排列方式不太方便，可从windows菜单改为tile方式。如果觉得太拥挤，可去掉一个指标，如Frq，这样界面的结构同于Oligo 5.0，只是显示更清楚了。

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作者: zzzz 时间: 2015-6-3 09:40

∆G值反映了序列与模板的结合强度，最好引物的∆G值在5’端和中间值比较高，而在3’端相对低（如图：）
Tm值曲线以选取72℃附近为佳，5’到3’的下降形状也有利于引物引发聚合反应。Frq曲线为“Oligo 6”新引进的一个指标，揭示了序列片段存在的重复机率大小。选取引物时，宜选用3’端Frq值相对较低的片段。再点击Search再点“Fo'r Primers and probes”或使用快捷键F3

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作者: zzzz 时间: 2015-6-3 09:41

出现以下窗口，点OK就OK了。当然你也可以点击“Prameters”和“Search Range”选择你要的参数和你上下游引物的位置及你扩增产物的长度

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作者: zzzz 时间: 2015-6-3 09:41

出现Search Status窗口，点“OK”

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作者: zzzz 时间: 2015-6-3 09:42

出现Primer pairs窗口，＃代表引物对的编号，依次为引物对所处的位置、产物的长度、最适合的退火温度、和GC的百分含量

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作者: zzzz 时间: 2015-6-3 09:42

点击任一行出现“PCR”窗口，告知你扩增片断的位置，最合适的退火温度等等信息。

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作者: zzzz 时间: 2015-6-3 09:45

关掉“PCR窗口”和“primer Pairs窗口”回到原来的窗口你就能看到你引物的序列和位置，图中手型鼠标所指即为引物序列。

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作者: zzzz 时间: 2015-6-3 09:46

至此引物设计已经完成，你可以用“Analyse”菜单分析你的引物：有无引物二聚体、发卡结构等等。

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作者: whitesheep 时间: 2015-6-3 09:47

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当上下游引物全选好以后，需要对引物进行评价并根据评价对引物进行修改。首先检查引物二聚体尤其是3’端二聚体形成的可能性。需要注意的是，引物二聚体有可能是上游或下游引物自身形成，也有可能是在上下游引物之间形成（cross dimer）。二聚体形成的能值越高，越不符合要求。一般的检测（非克隆）性PCR，对引物位置、产物大小要求较低，因而应尽可能选取不形成二聚体或其能值较低的引物。第二项检查是发夹结构（hairpin）；与二聚体相同，发夹结构的能值越低越好。一般来说，这两项结构的能值以不超过4.5为好。当然，在设计克隆目的的PCR引物时，引物两端一般都添加酶切位点，必然存在发夹结构，而且能值不会太低。这种PCR需要通过灵活调控退火温度以达到最好效果，对引物的发夹结构的检测就不应要求太高。第三项检查为GC含量，以45-55％为宜。有一些模板本身的GC含量偏低或偏高，导致引物的GC含量不能被控制在上述范围内，这时应尽量使上下游引物的GC含量以及Tm值保持接近，以有利于退火温度的选择。好了，oligo使用的简单介绍到此结束。谢谢

作者: zhy平平 时间: 2015-6-3 09:48

怎样输入基因序列啊?

作者: fox_79 时间: 2015-6-3 09:49

十分感谢大家如此详细的介绍，解说中有一处我不明白，还望指教？
、∆G值反映了序列与模板的结合强度，最好引物的∆G值在5’端和中间值比较高，而在3’端相对低（如图：）
这句话的意思是不是：5‘端和中间与模板结合强，3’端与模板结合弱的引物为较好的引物？
若我的理解正确的话，为什么会这样呢，3‘端不应该越强越好么？

作者: dog002 时间: 2015-6-3 09:49

都是照搬，不懂的还是不懂。怎么分析已知引物？

作者: zzzz 时间: 2015-6-3 09:50

通过BLAST验证，既可知道序列是否正确，也可同时了解引物的特异性、引物的位置及PCR产物的大小等。
基于完全匹配原则设计的引物，可以用Blast的“Nucleotide-nucleotide BLAST (blastn)”或“Search for short, nearly exact matches”搜索，具体方法为：
1. 打开Blast，点击“Nucleotide-nucleotide BLAST (blastn)”或“Search for short, nearly exact matches”
2. 等新页面完全显示后，将引物序列直接copy到“Search”框（没有必要将下游引物序列转换成其互补链），下面3种方法都可以（我觉得这3种方法的搜索结果没有什么区别，没仔细比较过哦！）
　（１）直接拷贝上游引物序列，然后直接将下游引物序列拷贝在上游引物后面
　（２）直接拷贝上游引物序列，在上游引物序列后加一空格，然后直接将下游引物序列拷贝在空格后面
　（３）直接拷贝上游引物序列，换行，然后直接拷贝下游引物序列
注意：记住上、下游引物的长度，如上游引物为19bp、下游引物为18bp，这在查看Blast结果时有用。
3. 点击“BLAST！”，新页面完全出来以后，点击“Format！”。
4. 结果完全出来后，查找有没有和1-19、20-37同时完全匹配的基因，其他的就不用考虑了。当然，如果下游引物序列所对应的基因片段的3'端正好和上游引物序列的3'端的1或2个碱基互补，那就可能是19-37或18-37。
如果有，那你的引物序列就是正确的。

作者: feiya 时间: 2015-6-3 09:50

谢谢你的讲解，但经过这样的blast，对检测引物的特异性效果还是不好啊
还有没有更好的方法呢

作者: 一叶 时间: 2015-6-3 09:51

楼上战友提出的问题很好。引物的延伸从3’端开始，因此3’端的几个碱基与模板DNA均需严格配对，不能进行任何修饰，否则不能进行有效的延伸，甚至导致PCR扩增完全失败。考虑到密码子的简并性，引物3’端最后一个碱基最好不与密码子第三个碱基配对，引物5’端可以有与模板DNA不配对碱基，在5’端可以引入一段非模板依赖性序列如：5’端加上限制性核酸内切酶位点序列（酶切位点5’端加上适当数量的保护碱基）5’端的某一位点修改某个碱基，人为地在产物中引入该位点的点突变以作研究以及5’端标记放射性元素或非放射性物质（如生物素、地高辛等）。。过去认为，引物3’端应牢牢结合在模板上才能有效地进行延伸，故3’端最好为G或C，现在的观点认为，引物的5’端应是相对稳定结构，而3’端在碱基配对的情况下最好为低稳定性结构，即3’端尽可能选用A或T，少用G或C这是因为仅仅3’端几个碱基与非特异位点上的碱基形成的低稳定性结构是难以有效引发引物延伸的，如果3’端为富含G、C的结构，只需3’端几个碱基与模板互补结合，就可能引发延伸，造成假引发。不知道上面的战友明白没有？我在总结一下：引发延伸是多个因素的综合结果。如果3’端富含G、C的结构只需3’端几个碱基与模板互补结合，就可能引发延伸，造成假引发。而如果选用A或T这种低稳定性结构仅仅靠3’端几个碱基是不能引发的。需要综合其他因素才引发。。就避免了假引发的发生。。

作者: jude 时间: 2015-6-3 09:51

我写的专门进行PCR引物特异性评估的网站：
cuturl('http://biocompute.bmi.ac.cn/CZlab/MFEprimer-2.0/')

作者: jude 时间: 2015-6-3 09:51

QUOTE:

原帖由一叶于 2015-6-3 09:51 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
楼上战友提出的问题很好。引物的延伸从3’端开始，因此3’端的几个碱基与模板DNA均需严格配对，不能进行任何修饰，否则不能进行有效的延伸，甚至导致PCR扩增完全失败。考虑到密码子的简并性，引物3’端最后一个碱基最好不与密 ...

是这样的，简单的使用BLAST而不考虑其他因素，是很难对一对引物做出有效的评估的。
Bioinformatics. 2009 Jan 15;25(2):276-8. Epub 2008 Nov 27.
MFEprimer: multiple factor evaluation of the specificity of PCR primers.
Qu W, Shen Z, Zhao D, Yang Y, Zhang C.
Beijing Institute of Radiation Medicine, State Key Laboratory of Proteomics, Beijing, China.
Abstract
SUMMARY: We developed a program named MFEprimer for evaluating the specificity
of PCR primers based on multiple factors, including sequence similarity,
stability at the 3'-end of the primer, melting temperature, GC content
and number of binding sites between the primer and DNA templates.
MFEprimer can help the user to select more suitable primers before
running either standard or multiplex PCR reactions. The cDNA and genomic
DNA databases of 10 widely used species, as well as user custom
databases, were used as DNA templates for analyzing primers specificity.
Furthermore, we maintained a Primer3Plus server with a modified
Primer3Manager for one-stop primer design and specificity checking.
PMID: 19038987

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