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标题: 【求助】引物间形成二聚体怎么办？ [打印本页]

作者: jude 时间: 2015-6-3 15:38 标题: 【求助】引物间形成二聚体怎么办？

因为基因片段是固定的，两侧的酶切位点也是固定的，所以别无选择。但引物间形成了比较多的二聚体，使产物很少。
这种情况该怎么处理啊

作者: woshi 时间: 2015-6-3 15:39

不能重新设计就试试降低一下引物浓度，调整一下体系如优化镁离子浓度或改变模板量。除此之外，形成引物二聚物的原因很多，如聚合酶是否活化,还有program，退火温度太高，时间太短，延伸时间太短都可能是原因。

作者: whitesheep 时间: 2015-6-3 15:40

我认为应该在PCR程序中，把循环中的退火温度提高才对，避免二聚体的形成。必要的时候，做两步PCR——退火和延伸都在70或72度进行。

作者: dog002 时间: 2015-6-3 15:41

有一种特殊的引物方案可以最大限度地减少引物二聚体。
此方法是在设计引物时，在上下游引物的5'端加上序列一样的寡核苷酸尾巴，使得PCR进行到第三个循环时引物二聚体产物会自身退火形成发卡结构而阻碍继续扩增。具体的文献不在手边，有空再替您找找^_^

作者: woshi 时间: 2015-6-3 15:41

多谢各位，可惜我这段序列是插在GST载体上，不能随便改酶切位点的。所以只能用目前的引物。

作者: kulee 时间: 2015-6-3 15:42

兄弟，酶切位点不会改变的，只不过是在原有引物序列的5‘端加上一段额外序列，P完后用酶切一下不就ok了么？
文献为:
Jannine Brownie, The elimination of primer-dimer accumulation in PCR, Nucleic Acids Research, 1997,25:3235-3241

作者: bring 时间: 2015-6-3 15:42

考虑一下用热启动Taq酶吧，我记得好像QIAGEN 和Invitrogen都有一种HotStarTaq DNA polymerase, 该酶在室温时是没有活性的，必须95度15 min进行热激活，这样在热激活的时候使室温配PCR反应体系时引物形成的二聚体解链，接下来直接进入PCR，形成引物二聚体的机会就少多了。值得一试，只是该酶比较贵。

作者: 969 时间: 2015-6-3 15:42

QIAGEN的hotstar比较好使,的确挺贵，但是有时候也不是适合所有的反应。

作者: JK.jon 时间: 2015-6-3 15:43

我的经验是：使用booster PCR.尽量降低引物浓度，使引物和模版的浓度比降下来，提高模版对引物的竞争力。

作者: JK.jon 时间: 2015-6-3 15:48

我一直在用hotstar，感觉不错。

作者: JK.jon 时间: 2015-6-3 15:49

整个操作应在冰上进行

作者: xue258 时间: 2015-6-3 15:49

适当提高退火温度并调整体系中的Mg2+浓度，结合热启动，通常可以有效减少引物二聚体的量。当然，你同时也可以减少引物的量，也会有一定的帮助。

作者: milkdog 时间: 2015-6-3 15:50

有一种特殊的引物方案可以最大限度地减少引物二聚体。
此方法是在设计引物时，在上下游引物的5'端加上序列一样的寡核苷酸尾巴，使得PCR进行到第三个循环时引物二聚体产物会自身退火形成发卡结构而阻碍继续扩增。具体的文献不在手边，有空再替您找找^_^

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这不是跟抑制性PCR一个道理吗？

作者: zhy平平 时间: 2015-6-3 15:50

我在做的时侯也遇到同样的问题,最后我提高退火温度,同时减少引物的用量就可以将条带扩增出来了,但是要注意扩增结果,我阔出的结果不是很亮,最后优化Mg2+,酶,多家一些模板就可以了

作者: am10 时间: 2015-6-3 15:51

我一直在用hotstar，感觉不错。

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你能具体讲解一下什么是热启动，如何操作吗？

作者: remonte 时间: 2015-6-3 15:51

热启动吗？好像有些酶要在９４度６－10min才能达到最佳酶活，所以在扩增前，先将体系在９４度处理一下

作者: qianqin1977 时间: 2015-6-3 15:51

QIAGEN 的hotstar 热启动是95度15分。就是在你的PCR程序上在循环前加上热启动步骤。

作者: youyou99 时间: 2015-6-3 15:52

提高退火温度

作者: S6044 时间: 2015-6-3 15:53

我以前做热启动是这样做的，1.将样品加好后，放于冰上；2.启动PCR仪，待温度上升至70-85度时，迅速将样品放于PCR仪中进行反应。我们也有人是这样做的：先将样品加好（除酶外），然后把样品放于PCR仪中反应，待温度为94度时，再加入酶于样品中，然后按程序进行反应即可。

作者: yizhi 时间: 2015-6-3 15:57

考虑一下体系，包括你的引物浓度，dNTP浓度，DNA浓度，Mg++浓度，还有你的Taq酶，因为你问题的确很麻烦，必须好好优化体系，慢慢的一步一步来，不要怕麻烦，OK!

作者: youyou99 时间: 2015-6-3 15:57

我有一个问题：
在进行hotstart的时候，酶是最后才加的,加完了以后还需要混匀吗？

作者: ns5fan 时间: 2015-6-3 15:58

所谓的热启动，是将样品放于PCR仪中反应，待样品在94度充分变性后，再加入酶于样品中进行PCR。不是上面兄弟提到的酶要在９４度６－10min才能达到最佳酶活，这样做可以防止非特异的扩增并减少酶的失活！缺点是操作不如冷启动方便。无论什么时候，加样或者其他的操作，均相的反应效率最高，混匀是没有什么错误的。
如果PCR结果有引物二聚体形成，如果不严重，有目的条带，直接回收即可，没有必要追求一定很漂亮的扩增结果。

作者: am10 时间: 2015-6-3 15:58

还可以做套式PCR:
即在目的片段两端外面选择序列设计一对引物,这对引物因为没有位置的限制,可以设计的理想一点,扩增出比目的片段稍长的一段后,作为模板用楼主现在的引物来扩增,比直接扩更有效
再结合楼上各位老师的经验,应该会取得比较理想的结果

作者: xevin 时间: 2015-6-3 15:59

有没有用来计算引物之间相互作用的软件啊，哪位指点一下

作者: cj_mondy 时间: 2015-6-3 15:59

我用QIAGEN的hotstar 没有这么麻烦，冰上将样本和酶混合后，直接上PCR仪，循环前95度15分激活酶。不用先加热样本，再加酶。

作者: bs4665 时间: 2015-6-3 16:02

各位：
问一下，如果有引物二聚物，可以测序吗？

作者: ldh 时间: 2015-6-3 16:02

看您的引物二聚物的量。很少量的是可以测出来的，但是结果不太好,；二聚物多了，只能测出来引物！

作者: caihong 时间: 2015-6-3 16:03

我用QIAGEN的hotstar 没有这么麻烦，冰上将样本和酶混合后，直接上PCR仪，循环前95度15分激活酶。不用先加热样本，再加酶。
－－－－－－－
问一下：如何在冰上混呢？

作者: caihong 时间: 2015-6-3 16:03

看您的引物二聚物的量。很少量的是可以测出来的，但是结果不太好,；二聚物多了，只能测出来引物！

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测序前的纯化没有用么?

作者: newway 时间: 2015-6-3 16:03

QUOTE:

原帖由 caihong 于 2015-6-3 16:03 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
我用QIAGEN的hotstar 没有这么麻烦，冰上将样本和酶混合后，直接上PCR仪，循环前95度15分激活酶。不用先加热样本，再加酶。
－－－－－－－
问一下：如何在冰上混呢？ ...

将PCR管插在冰上。最好将冰捣碎，这样比较容易而且也比较固定。

作者: toy 时间: 2015-6-3 16:04

我想问问：我们实验室习惯是最后离心一下，把PCR管壁的组分都甩在一起混匀。
如果在冰上，怎么混呢？
具体这步，您是如何操作的？

作者: purrr 时间: 2015-6-3 16:04

有一个问题：引物二聚体会是很大的片断吗？

作者: cj_mondy 时间: 2015-6-3 16:11

有一个问题：引物二聚体会是很大的片断吗？

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相关疾病：
先天性卵巢发育不全综合征46XX性发育睾丸疾病

因为我们的引物一般是在４０个以下，很少在４０以上，我用过一个４５ＢＰ的一个４６ＢＰ的引物．ＰＣＲ　如果发现引物二聚体，一般都是跑到最前头的那个弥散的条带，大约在１００－２００ＢＰ的区间里吧！！

作者: cj_mondy 时间: 2015-6-3 16:11

测序前的纯化没有用么?

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测序前的纯化当然有用。

作者: xue258 时间: 2015-6-3 16:14

我想问问那位有OLIGO 6 的注册号，我想看看我设计的引物是否会形成二聚体或者发夹结构，是不是用OLIGO 6 来分析？
怎么分析？现在试验停住了，以前没有设计过。
向各位求助！！

作者: langlang 时间: 2015-6-3 16:14

可以用GENETOOL工具，可以结合原序列的情况和引物的情况，给予预测

作者: zzzz 时间: 2015-6-3 16:15

再问：因为没有操作过热启动
1）是不是用的酶是特殊的，一般的Taq酶不可以，而要用HOTSTAR？
2）前面一个朋友提到的booster PCR是什么？请指点
多谢拉

作者: zhy平平 时间: 2015-6-3 16:16

QUOTE:

原帖由 zzzz 于 2015-6-3 16:15 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
再问：因为没有操作过热启动
1）是不是用的酶是特殊的，一般的Taq酶不可以，而要用HOTSTAR？
2）前面一个朋友提到的booster PCR是什么？请指点
多谢拉

热启动法,一般的酶也可以.只是一种增加特异性的方法,对酶没什么特殊的要求.
booster PCR,未见中文解释.!Stupid

作者: zzzz 时间: 2015-6-3 16:16

我也碰到过，我是把退火温度降低，同时降低引物/模板比，这样做出来的

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