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标题: 【求助】Real time 2-△△ct 统计方法 [打印本页]

作者: 黄花菜 时间: 2015-6-3 16:17 标题: 【求助】Real time 2-△△ct 统计方法

Real－time已经做完，最近却又为统计犯愁了。两组动物，一组是对照组，n＝8；另外一组是给药组，n＝8。试图对比基因X的变化。采用b－actin作为内参，使用2-△△ct 法。
对照组的△ct值（n＝8）如下：
5.99 6.95 8.55 7.005 7.97 7.12 6.94 6.76
给药组的△ct值（n＝8）如下:
4.72 5.49 2.82 4.64 6.93 5.05 7.115 3.99
计算相对mRNA的表达量很好办，就是直接将两组分别平均获得平均△ct 值，-△△ct ＝给药组的△ct均值－对照组的△ct均值。此处的相对表达量约为4.2左右
但是在计算P值的时候，我自己认为就是使用两组t检验，在excel里直接用对照组的8个△ct作为第一组，给药组的8个△ct作为第二组，双尾，双样本等方差，得P值为0.003，请问正确否？
还有，柱状图的方差是怎么来的？2-△△ct 的结果能否用柱状图表示（我觉得使用Table 表示不直观）？我的理解是把用2 - stdv △ct 对照组or给药组作为柱状图的方差，不知道是否正确？

作者: whitesheep 时间: 2015-6-3 16:19

△△ct应该为同组的样本的△ct值减去校正样本的△ct值
校正样本可以选择该组△ct值最小的那一个。
如对照组的△△ct 分别为：
5.99-5.99 6.95-5.99 8.55-5.99 7.005-5.99 7.97-5.99 7.12-5.99 6.94-5.99 6.76-5.99
然后用每个样本的2的-△△ct次方的值用来统计，如第一个样本是2的0次方，即为1。
统计的方法就偶不懂了～

作者: 黄花菜 时间: 2015-6-3 16:19

有点疑问就是那这样的话，对照组8个样本岂不是都有一个mRNA倍数，取其平均？
给药组也有8个mRNA倍数，取其均值
再把这两个均值相除得二组之间的倍数？
自己尝试了一下，结果和我自己在1楼那种方法的结果差别很小Smile可能是殊途同归

作者: am10 时间: 2015-6-3 16:20

来是想知道两组之间X基因的表达差异。
如果要均数相除的话，是否还加一个标准误比较好？或者还有其他的计算用来表述其差异的方法？
没做过类似的分析，似乎如果有一个学统计的指导一下比较好……

作者: am10 时间: 2015-6-3 16:21

那肯定是有效果了～
恭喜恭喜～

作者: S6044 时间: 2015-6-3 16:22

用这种方法的一个必要前提就是扩增效率相同,要是不相同,这种统计方法就不能用,至少不准确.
所以如果要有说服力,还要作扩增曲线.

作者: 黄花菜 时间: 2015-6-3 16:22

呵呵Big SmileBig Smile
确实发现差异了
非常需要2-△△ct 方法中标准差/标准误的计算方法却一直无法得到证实。只能自己按照那两篇文献摸索

作者: 黄花菜 时间: 2015-6-3 16:22

QUOTE:

原帖由 S6044 于 2015-6-3 16:22 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

用这种方法的一个必要前提就是扩增效率相同,要是不相同,这种统计方法就不能用,至少不准确.
所以如果要有说服力,还要作扩增曲线.

这个自然做过Smile
几乎相同都在85－100％之间

作者: yizhi 时间: 2015-6-3 16:23

我也在为Real-time PCR使用 2-△△ct 法的计算相对表达量和统计方法的问题犯愁呢，最近看了一些文献，我把我自己理解的方法写出来供大家参考。
1、计算相对表达量：我的理解和wangp249版主所说的方法一致，就是直接将两组分别平均获得平均△ct 值，-△△ct ＝实验组的△ct均值－对照组的△ct均值，再转换为2-△△ct 即为实验组相对与对照组的基因表达量。其中的△ct均值应该用均数±标准差表示；△△ct 计算时为两均数±标准差相减，其计算方法为均数直接相减，标准差等于实验组和对照组标准差平方和的正的平方根，结果仍表示为均数±标准差形式。计算2-△△ct 时直接用△△ct中均数那个值就可以了，但后边应注明变异范围；变异范围计算时取△△ct中均数-标准差和均数+标准差两个值，然后再分别使用2-(均数-标准差)和2-(均数+标准差)即为变异系数。
2、统计方法：我们经常参考的那篇经典文献中认为不能直接用原始的ct值来统计，应转换为2-ct来统计。我认为可以将每个样本都转换为2-△ct，然后使用两组的2-△ct进行t检验，不过这时后计算出来的是相对于内参的基因表达量，当然也可以用两组的2-△ct做柱状图了。
欢迎大家指正和讨论，让我们把这个问题给搞清楚，我发现好多人都对这种方法很困惑。附件有点大，不好上传，如需要我上面提到的方法的文献可以PM我，我会邮箱发给你。

作者: 黄花菜 时间: 2015-6-3 16:23

和我的做法一模一样!! 我取的标准差也是这么取的
希望有更多的人讨论标准差和柱状图的标准差的做法

作者: feiya 时间: 2015-6-3 16:23

t检验的P值可以考察差异,一般t检验默认为95%的置信区间,也就是说当P>0.05时表示假设成立,两组样本没有显著性差异;当P<0.05时,假设不成力,两组样本存在显著性差异.
有时要求严格时也可以把置信区间提高到99%,这样当P<0.01时存在显著性差异.
上面说的都是双尾分布的t检验,单尾分布时要将0.05或0.01除以与P比较看差异.

作者: zhy平平 时间: 2015-6-3 16:24

请问你的P 值咋算啊？是TTEST（尾？类？）

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