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标题: 【求助】一个做qPCR时RNA和cDNA浓度的问题 [打印本页]

作者: 中国特色 时间: 2015-6-3 17:15 标题: 【求助】一个做qPCR时RNA和cDNA浓度的问题

做realtime有段时间了，现在有几个疑问请教大家，
一般提取组织RNA后都会测量浓度，然后根据RNA浓度调整体积，使得进行转录的RNA总量一致，最后得到的cDNA就不再测浓度，直接加1ul进入25ul的Sybrgreen反应体系。
但是即使加入的RNA量一致，但是转录后得到的cDNA量都是有差别的，我最近测了一批cDNA浓度，样本间的差异比较多，现在的问题是：我是否需要根据cDNA的实际浓度调整加进去的cDNA溶液体积，使得实际每管cDNA的量相同？
还有个问题就是：因为只要相对表达量，每个基因都有要和管家基因相比较，这样一来是不是其实真正加多少cDNA进去并不重要了，因为最后都会normalized by housekeeping gene?
这两个问题想了很久，想听听大家的意见

作者: am10 时间: 2015-6-3 17:15

个人不是特别赞同你的“一般提取组织RNA后都会测量浓度，然后根据RNA浓度调整体积，使得进行转录的RNA总量一致”这一做法。如果做很多，那岂不是很麻烦。而且似乎根本无法保证RNA浓度都在同一起跑线上。
我的解决办法就是同时作内参的表达量然后计算相对表达量

作者: 2541 时间: 2015-6-3 17:15

是这样。一般提取组织后测RNA的浓度，然后反转录的时候保证reaction mixture里面RNA的量是一样的。然后你反转录成了cDNA。这个时候不必要测浓度。因为你的反转录体系都是一样的，理论上讲（建议用multipipetide）你生成的cDNA也是一样的。
我最近也在想为什么cDNA的浓度不一样。楼主我们再讨论。我觉得用OD值测cDNA。其实测到的什么都有。有cDNA，有dNTP,有残余的oligoDT，还有未完全转录的RNA。很难说清楚到底那里面有多少是cDNA。所以不建议测cDNA的浓度。其实我做实验还发现了一个问题。这个cDNA的浓度是否一致和RNA的质量有关。OD260/OD280越高，有机物污染越少，cDNA就越一致。反之，他们相差很大。
第二个问题，我同意你的观点。每组样品中，只要和house keeping gene比较，那么加入的cDNA的量是不重要的。但是要保证每次一致。

作者: 中国特色 时间: 2015-6-3 17:16

谢谢楼上两位朋友的意见！
谢谢楼上朋友关于“用OD值测cDNA。其实测到的什么都有。有cDNA，有dNTP,有残余的oligoDT，还有未完全转录的RNA。”的解释，
对于“cDNA的浓度是否一致和RNA的质量有关。OD260/OD280越高，有机物污染越少，cDNA就越一致。反之，他们相差很大”我想有这个可能性。
今天特地做了一次对照试验（我是用Qiagen的kit提取RNA，RNA的260/280接近2.1）：
同一个样本的RNA做两次cDNA合成，横向比较，同时不同样本RNA也做cDNA合成，结果很有意思，同一个样本的cDNA终浓度非常接近，不管cDNA的260/280是1.8或2.1；而不同样本的cDNA浓度间的差异似乎和260/280的值相关性不好分析，即使在RNA的260/280接近2.1时cDNA浓度也有相差明显的。
现在的问题是如果260/280的值都很相近，还有什么其他可能因素是引起cDNA浓度不等的原因么？
不知道说清楚问题没有，谢谢大家！

作者: am10 时间: 2015-6-3 17:16

还有反转录效率问题。

作者: JK.jon 时间: 2015-6-3 17:17

既然做了内参的表达分析，为什么还要控制起始RNA的量呢？

作者: am10 时间: 2015-6-3 17:17

QUOTE:

原帖由 am10 于 2015-6-3 17:15 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

个人不是特别赞同你的“一般提取组织RNA后都会测量浓度，然后根据RNA浓度调整体积，使得进行转录的RNA总量一致”这一做法。如果做很多，那岂不是很麻烦。而且似乎根本无法保证RNA浓度都在同一起跑线上。
我的解决办法就是 ...

首先，cDNA不能用测OD值的方法来确定浓度。OD值能直接测的是单链和双链核酸，所以你不能直接将蛋白稀释了测OD值来确定浓度，而要加上考马。RNA（单链）和质粒（双链）就可以直接稀释来测。逆转录后样品里成分复杂，虽然CDNA含量最多，但具体结构不能确定，不能测OD值。

请问，假如你要检测某细胞系加药后某基因的表达情况，你怎么比较？如果以不加药作为对照，检测不通时间点的表达情况，你的RNA起始量就不一样，你怎么比较之间的差别？
是，我们要比较的是相对变化，但那也是有条件的。起始RNA量不一致，你的样品之间差别能保证不是因为RNA量的不同引起的？就像WB，为什么每次都要看actin或者GAPDH等蛋白表达是不是很齐？照你这样说，我只要用软件计算各自泳道里目的蛋白与内参蛋白的差值再比较久行了，现在这样的软件多的是还免费的呢。
如果你真是那样做的，试验数据和结果是不可信的。有意见我们可以再讨论！

作者: dior 时间: 2015-6-3 17:20

对于realtime，模版没必要定量，因为实验过程中，每个模版都会加一个内参的检测。
对于相对定量而言，我们假设模版的内参的表达是固定的。样本之间的比较是以这个为基础的。尽管具体反应的时候每个模版的用量可能不同，但是后期我们通过依据内参对数据进行处理，得出两个样本某个基因表达的差异。
对于绝地定量，是需要做标准曲线的，对于每个模版也没必要事先定量，而且通过实验后的到的ct值，在标准曲线上可以得出该样本的用量的。

作者: whitesheep 时间: 2015-6-3 17:22

首先，cDNA不能用测OD值的方法来确定浓度。OD值能直接测的是单链和双链核酸，所以你不能直接将蛋白稀释了测OD值来确定浓度，而要加上考马。RNA（单链）和质粒（双链）就可以直接稀释来测。逆转录后样品里成分复杂，虽然CDNA含量最多，但具体结构不能确定，不能测OD值。
请问，假如你要检测某细胞系加药后某基因的表达情况，你怎么比较？如果以不加药作为对照，检测不通时间点的表达情况，你的RNA起始量就不一样，你怎么比较之间的差别？
是，我们要比较的是相对变化，但那也是有条件的。起始RNA量不一致，你的样品之间差别能保证不是因为RNA量的不同引起的？就像WB，为什么每次都要看actin或者GAPDH等蛋白表达是不是很齐？照你这样说，我只要用软件计算各自泳道里目的蛋白与内参蛋白的差值再比较久行了，现在这样的软件多的是还免费的呢。
如果你真是那样做的，试验数据和结果是不可信的。有意见我们可以再讨论！
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用药前后比较目的基因与内参基因的比值不就可以了么？为什么非要起始RNA量一样呢？我就不相信你能调到某几个RNA的量一样。个人觉得作内参，其实就是克服无法统一起始RNA量的难题，如果起始RNA量一样，还作内参干吗？
再讨论。。

作者: ns5fan 时间: 2015-6-3 17:22

内参就是用来衡量起始RNA量是否一致。

图片附件: 29208941.jpg (2015-6-3 17:22, 41.33 KB) / 该附件被下载次数 30
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=33160

作者: ns5fan 时间: 2015-6-3 17:23

我设了复孔，去除了点样的误差，这样的CT值差别应该不大吧？
而且我每次的步骤都是固定的，每次的GAPDH组CT值都在18左右，很稳定。

作者: bs4665 时间: 2015-6-3 17:29

保险的做法就是,在后期数据处理的时候,把所有内参都设定为1,在这种情况下,理论上待检基因的表达应该是真实的.

作者: ns5fan 时间: 2015-6-3 17:29

遇到一个问题：
实验室里有同学做这个实验时，在qPCR前再次测所谓的浓度，“重新定量”，最后跑出来的结果是：内参CT值大小不齐，而目的基因的CT值都差不多大小。
有高手能解释一下吗？我只知道这样做肯定不科学，但不明白为什么。

作者: 3N4G 时间: 2015-6-3 17:30

我们实验室的做法同上，RT前定量，去=取1ul反应产物上Q-RT-PCR.结果内参还是很齐的，最后用双Delta，以control组的相对表达量为1，得出目的基因的表达变化。

作者: 33号 时间: 2015-6-3 17:30

我同意用内参校订的方法，但我也认为初始浓度还是初步均一一下为好，否则，假定一个比较极端的情况，一个用了50ngRNA，一个用了5ugRNA，同样的RT反应，其他成分添加的一样多，逆转录的效率能一样吗？而且接下来的PCR过程中，内参的Ct值如果差了5－6，那么同样可以推出PCR过程中模板量差距很大，那么PCR 过程的扩增效率也有很大差异，这样即使扣除内参，你觉得数据可信吗？
我最近遇到的怪事情是RNA浓度已经相对很一致，但是内参的Ct差了4，所以现在我不知道待测基因扣除内参来进行比较的结果可不可靠。或者真的是我的“内参”不是真的稳定？那也差太多了，正苦恼中..........

作者: am10 时间: 2015-6-3 17:31

用分光光度计测RNA的含量其实是比较不准确的，OD280的读数与杂质含量关系很大。同时，不同样品杂质含量差异可能会比较大，会引起反转录效率不同。这解释了既使RNA含量一样，realtime PCR后内标基因的Ct差异可能会有差别。如果cDNA模板差异过大，通过delta delta Ct计算得到的结果是相当不可靠的。个人觉得样品间内标基因Ct差值应该在1以内，最好是0.5。
如果有人问，要是内标基因Ct差值大于1怎么办？很简单，稀释cDNA模板。我的经验是，Ct差值为1，稀释cDNA模板1.8-2.2倍。这个需要摸一下，多做几次。

作者: abc816 时间: 2015-6-3 17:31

利用OD260/OD280来调整RNA的浓度只是为了尽可能得到比较统一的扩增效率，但是RNA模板中的成分很复杂，不同样本中的PCR抑制因子的含量也不同，得到的cDNA的浓度可能仍然不一样，不过这些都不影响后期结果的处理，利用内参基因双delta计算公式就是为了校正不同样本中的浓度不同。不同样本内参基因的Ct不同，很正常，如果每一个都一样才叫奇怪呢，内参基因也就失去它的价值了！不同样本的内参Ct不可能一样，但是同一样本的重复间一定要相差不大！

作者: dog002 时间: 2015-6-3 17:32

个人认为
反转录前必须要测浓度，不同浓度的RNA反转录效率不同，并且试剂盒说明RNA量不要超过一定浓度。不测浓度怎么知道是不是超过浓度限制。一般来说，总RNA量相同，反转录后PCR内参基本平行，因此不需要测cDNA浓度。但也有内参基因不平行的情况，缺氧处理时就常出现这种情况。如果总RNA量相同而内参不平行，可能是内参有问题，没有绝对的内参，可以更换内参试试。因此不测浓度，只用内参相对定量是不科学的，要在RNA总浓度一致并且内参也比较平行的情况下才能相当定量。
和Northern类似，要把样品量调一致再上样是同样的道理。

作者: dog002 时间: 2015-6-3 17:32

我同意用内参校订的方法，但我也认为初始浓度还是初步均一一下为好，否则，假定一个比较极端的情况，一个用了50ngRNA，一个用了5ugRNA，同样的RT反应，其他成分添加的一样多，逆转录的效率能一样吗？而且接下来的PCR过程中，内参的Ct值如果差了5－6，那么同样可以推出PCR过程中模板量差距很大，那么PCR 过程的扩增效率也有很大差异，这样即使扣除内参，你觉得数据可信吗？
我最近遇到的怪事情是RNA浓度已经相对很一致，但是内参的Ct差了4，所以现在我不知道待测基因扣除内参来进行比较的结果可不可靠。或者真的是我的“内参”不是真的稳定？那也差太多了，正苦恼中..........
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建议更换内参试试。

作者: dior 时间: 2015-6-3 17:32

同样的细胞，不同处理后，提取RNA，做qPCR相对定量，内参基因的CT值有一两个处理组相差比较大，其他基本没什么差异，这样结果可靠吗？是不是只要看待测基因扣除内参来进行比较就可以？不同组内参基因的CT值要一样吗？谢谢

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