分析测试百科

标题: 做液相色谱过程中一些心得，从0到有些感性和理性的认识 [打印本页]

作者: fengyan22 时间: 2011-5-31 11:41 标题: 做液相色谱过程中一些心得，从0到有些感性和理性的认识

做了一阵子液相，慢慢的从无到有，从0到有些感性和理性的认识，常常有中感觉，或者是大彻大悟，或者是茅塞顿开，或者是有些慨然。。。觉得有必要写下来，算是个人的一些偶得和体会，希望能够对象偶一样得新手有所启发和帮助。
HPLC分析大致说来由三部分组成：样品制备，液相条件摸索，数据处理。
前两者是决定性得，raw data出来了，任怎样处理，只是修饰性得工作，当然REPORT做得漂亮，也是很重要得，毕竟是直接给人看得。
1。样品制备
往往很多时候人们忽略样品制备得重要性，尤其是对于中药。偶就是这样子，一上来只想的去摸条件，去改变仪器得东东，却忽视了一旦样品制备了，很多决定性得东西就在里面，任你色谱条件如何都改善和美化不了得。更而且，好得样品处理方法可以省去液相很多麻烦。想想也是，毕竟很多时候一个好得条件真的很难得，然而却可以在样品前处理或制备过程中解决掉。如果偶做得多了，有了例子来证明，也许更有说服力。偶会注意积累的。
样品的制备主要包括以下几个内容：
样品采集：对于中药，如果以制定质量标准为目的，则需要注意采集时间，地点，部位，甚至规格
样品保存：常常我们不会在采集到后马上处理，所以要注意样品的保存，一般偶觉得应该阴干后放到干燥通风处，如果是特殊样品则需特别处理。
样品提取制备
样品净化;包括一系列的处理过程，有时候和提取是同步的
样品最后所用溶剂

偶觉得选择最优条件的原则有如下：
A。目的是定性还是定量，或者半定量：若定性，则不要求提的非常干净；若定量，则要注意是否提取完全
B。是检测某一类，某一个化合物还是，还是什么都要。这和定性定量有相通之处。前两者要求针对这种化合物，这类东东选择溶剂，而后者则是选择一个尽可能都提的出来的溶剂，比如甲醇。这一项同样也决定了提取方法。比如挥发油类一般用SOXLET
C。在可以的情况下，尽可能选择和流动相相同的溶剂溶解样品。当然一般开始没有摸色谱条件时不知道哪个溶剂系统适合，但是当流动相确定后则可以反过来调整。这样可以尽量避免溶剂峰。
SOME TIPS：
1。换柱子时不要心不在焉哦，不然很容易忘记注意FLOW的方向。。。
2。注意记录，每个色谱图对应的色谱条件，以备将来查阅。详尽的试验记录是个好的习惯，偶就是开始大大咧咧什么都没记，到后来才去一个一个的看，查对，FT，真的会晕的。现在老老实实记录，不会花费多少时间，永远不要过于自信自己的记性哦
3。如果是PDA记得观察你的谱图是在哪个波长下哦，偶就是本该在203下看的，却忘记选择波长，于是看到很令人伤心的谱峰，幸亏后来发现了，及时更正，塞，多好的条件啊，差点错过，汗。。。。
4。经常检查洗针和洗泵头的瓶子里是否空了，因为它们的消耗量也是很大地。。。。不然。。。针不能洗了，你说会有什么后果哩？？？

关于液相的经济帐
偶不是很多考虑经济的问题，但是有时候仔细想想这个帐的意义还是很大的
很多人不喜欢用乙腈，原因有三：1。毒，虽然甲醇也毒。2。贵。3。难回收，这个是针对制备。
但是乙腈却有它自己的优点：
1。对UV检测干扰小，尤其是边缘吸收的化合物，可在185－205范围内检测
2。粘度小，柱压底，溶剂强度稍高
3。乙腈虽然毒，但是它的毒性仅为抛光醇的十分之一。
4。虽然贵，但是分析一个样品的造价仅比甲醇高2－4％（根据文献）

所以，这样看下来，乙腈还是很好地。。。。

还有呢，就是国产还是进口的问题。偶觉得，开始觉得当然是进口好啊，但是现在不这样认为了。第一：摸条件本身就是试验，拿进口色谱纯的乙腈一瓶一瓶灌，时间长了才发现用的不少呀，可不比灌水咯；第二：两者相差价格太大，太大。也许可以用国产的摸好条件再用进口的。。。。不过有些罗嗦，而且一个液相的大拿曾经和偶说：进口，国产，差不多，区别就是国产地要滤滤干净，进口地似乎好些，可以省事。。。。汗。偶宁愿多劳动，省很多呢
不过突然想到前面提到的这个想法可以在制备上用。制备真的好费好费，FT,简直是喝溶剂，虽然在分析上摸条件好了，但是制备上还是有不同，需要再摸的，所以可以用国产。。想到偶当初一瓶瓶的灌进口不知灌了多少瓶，
再汗ING

some tips:
1.generally, when we run a sample set, i think its better for us to set the injection times of the first row to be 2 because i have met some conditions that all the samples in the same sample set has a perfect reproducibility but the first one. i think there r many factors involved in, such as the condition of the colomn and the UV lamp, or the suitibility of the whole system. so, i consider its a better choice for us to let the first sample run two times to achieve a good result. it is a good method for us to check out wether the variety between the first row and the others comes from the sample itself or comes from our system unstability.

2. very often the injection volumne is 10 ul in HPLC. but in my own experience, i have to inject some volumes like 1,2,3,4 ul, and i found that the accuraccy is poor, although i got a R and R^2 of something like 0.9998, especially when the injection volume is below 1 ul, the accuraccy is too poor to be trusted and validated. so, its reasonable to inject the common 10ul i think, and better for us to avoid a small injection volume.

3.when we make sample preparation, better for us to chose glass flask and bottles but avoid the plastic ones, especially when we prepare standard liquid in which there are small amount of standards and easily to be affected by impurity.

4.是这样子的。最近做液相，重现性不是很好。不知道是什么原因开始。在丁香里也看到很多战友的重现性不好的。保留时间倒是没问题，问题出在峰面积，差异比较大。后来终于发现了，因为自己偷懒，每次都冲到没峰出来，就直接用下次的初始条件平衡。但是分离度总会有差异。如果每次用甲醇冲足够的时间，再平衡足够的时间，问题就解决了。看来，偶这种偷懒是非常非常地不可取的哦。。。大家不要学我。。。。因为真的浪费了好多时间啊。。。。

to be continued.

作者: lintianyi 时间: 2011-5-31 11:42

我在做中药样品处理时也颇有同感，一个薄层色谱花了一个多月的时间没做出结果，后来突发灵感改为索氏提取法，几乎不用过滤，简便，问题很快解决，有趣。
结论：索氏提取不失为样品提取的好方法，我现在经常采用。再就是溶剂和提取时间的选择，。。。。。固陋寡闻见笑了

作者: fu8u8 时间: 2011-5-31 11:42

俺也说说吧，俺刚开始作中药样品时，查阅了大量的文献，按照文献的条件来作中药样品处理，作HPLC，发现老多的文献数据并不正确。原来，不同的柱子，不同的SPD，以及不同的工作站，即使在同样的色谱条件下，跑出的峰差别很大。俺想，不要轻易的否定一篇文献，因为条件不完全相同，得出的结果会有所差别。

作者: tj001009 时间: 2011-5-31 11:43

师弟总结得极是，想我做制备的时候灌乙腈的速度（用的MERCK 4升装），真是瀑布汗～！不过说老实话，我碰见过国产乙腈不行的时候，当时是用FISHER的摸的条件，在分析上好好的但上了WATERS的制备，用国产的乙腈就找不到谱峰了。呵呵，想来是国产的杂质多，当然，也不排除流速放大的时候出现错误（嘻嘻，那是第一次做）。
ANOTHER TIPS, 柱子的批号要记牢，对于一个稍具规模的实验室来说，色谱柱都应该是以十根计，有时同一牌号的不同批号色谱柱，会让你的谱峰漂得一塌糊涂。同时，保护好你的柱子以及预柱。我的经验是，做完就藏起来，毕竟有过惨痛教训（借给同学分析了一下鞣质，柱压轻松上升100bar）。有条件的话，色谱柱应该与预柱对应，这样可以保证前后间隔一段时间得到的数据仍然有效。
中药分析的时候，一些杂质和糖类的末端吸收总是使得谱图前面有一堆大峰，极其难看。建议用 C18小柱预处理一下，很简单，5ml上样，2ml水洗，定容到5ml容量瓶。只要操作的时候注意，重复性一般都比较高。尤其是中药提取物做HPLC- MS的时候，如果没有预处理，请随时准备好50％异丙醇清洗离子源，否则就等着接受怪模怪样的分子离子峰吧。呵呵。

作者: fengyan22 时间: 2011-5-31 11:44 标题: 回复 #4 tj001009 的帖子

偶觉得develop一个好的analysis method真的不是件容易的事情。这是几多失败后的感触。好了，还是说些有用的东东吧。

1。定量中常常遇到这种情况，要确定对照品的峰。可以参考文献。但是在自己做的时候，最好还是验证一下。如何验证呢，就是把标准品加入到样品中去，看看哪个峰增强了。当然，还要考察不同的流动相条件，看是否一个风变成了两个峰。这是偶失败后得出的结论。因为难排除刚好在你的色谱条件下两个不同的化合物RT相同的情况。当然，它们的紫外光谱也是个参考。但如果都是同类化合物，如皂甙的话，就难说了。偶觉得这一条很中药，真的很重要。。。。。。。。。。。。。。。
2。定量分析的样品前处理中，尽量减少操作步骤。偶的意思是，如果可以一下子稀释30倍，就不要先稀释6，再稀释5，因为这样在操作取样过程中很多损失的可能。很浅显的道理，但是，偶是犯了错误才想到的。
P.S.:选择适当的容器和移液方法也很重要，比如同样是20ML，用注射器就比用移也管要准确
3。关于做定量：
如果等度可以得到满意的分离效果，尽量不要用梯度，梯度是实在没有办法的选择。因为即使有柱温箱，由于泵的混合或者流动相变化也会引起基线漂移或者RT变化，是件很麻烦的事情

就先这些吧。

P.S.呵呵，谢谢师兄鼓励Smile

作者: LUMGR 时间: 2011-5-31 11:44

我来从柱子方面谈谈个人看法:
1.不同成分的分离选用不同的柱子,选用不同填料的柱子进行比较,以求最佳分离效果.
2,柱子的冲洗,不同填料的柱子有不同的冲洗方法,例如多数C-18柱子,就要注意不能用纯水冲洗,否则会降低柱效.
3.柱子的保护,必要时可以加上保护柱,可以降低柱子的污染,延缓柱效的降低,对于酸碱性的流动相要考虑到柱子的PH值是否适应.

作者: fengyan22 时间: 2011-5-31 11:44

more tips:
1。除非是万不得已，不然尽量不要选用水作为最后进样的溶剂，因为一般情況下水溶液容易发霉，不能在样品室存放多于三天的，除非每次用完都拿出来再放到冰箱。偶遇到过这种情况。水溶液最后发现有很多沉淀，汗。。。。
2。一般情况下数据分析软件都有BACK UP功能。偶觉得这个很重要，定期的把自己的数据导出来，不然万一液相的电脑出神么问题就要哭了。

作者: hongyan417 时间: 2011-5-31 11:45

QUOTE:

原帖由 lintianyi 于 2011-5-31 11:42 发表 http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif
我在做中药样品处理时也颇有同感，一个薄层色谱花了一个多月的时间没做出结果，后来突发灵感改为索氏提取法，几乎不用过滤，简便，问题很快解决，有趣。
结论：索氏提取不失为样品提取的好方法，我现在经常采用。再就是溶剂和提取时 ...

的确，在我的实验里，比较几种样品处理的方法，发现索氏提取率的确很高（足够的时间），与[url=]ASE（溶剂加速提取）[/url]提取率相当，不过重现性不是太好，但RSD还是符合要求的，对于超声提取，提取效率不及索氏提取，但重现性比索氏好。当然啦！ASE提取效率最高，而且重现性最好了，这就是ASE最具吸引的地方。

作者: eesa_dc_seein 时间: 2011-5-31 11:45

用HPLC分析中药，不用梯度很难把大部分峰分得漂亮些，
用梯度重现性又不好，特别是峰面积，保留时间还好一点。
对于用溶剂溶解样品时，
最好还是用流动相溶解，
否则用强溶剂溶解还容易导致前沿峰。

作者: 孙彧730 时间: 2011-5-31 11:46

我的毕业论文就是一个中药的指纹图谱和质量标准，在试验过程中发现，一些中药的对照品比较贵，所以在试验中，配制了对照品，一定要注意闭光，冷藏。因为一个配好的对照溶液要保存好，这样不会浪费很多。在做梯度洗脱时，要注意梯度条件、柱温、柱子一定要固定好，这样重现性相对稳定一些。中药在含量测定时，溶剂峰影响得不是特别大，但是在指纹图谱中要区分溶剂峰和组分峰的区别。还有一点，在做指纹图谱时，假设最后要用Ｌｃ－ｍｓ来定性时，在流动相选择时，要注意起始的有机溶剂要甲醇20％或乙腈12％、以上，这样离子比较容易激发。

作者: fengyan22 时间: 2011-5-31 11:49

前两天看到的一篇不错的文章
Optimizing Purified Sample Recovery on Reverse-Phase HPLC Systems
关于峰纯度和重现性
由分析放大到制备为了得到好的峰纯度和重现性需要考虑的一些因素：
制备柱的特性
分离相关化合物所用的梯度
接样器的switch time
检测器时间延迟
进样技巧
由检测器到样品收集的体积
软件的响应速度

快速PRE－RP-HPLC的一些关键因素：
样品的色谱时间
所需要的纯度范围
纯度检测手段（UV,ELSD,MS）
所需的重现性范围等

建立一个快速的PRE-HPLC方法需要考虑的因素：
选择合适的流动相
尽量用短柱，小粒径的填料
每次的色谱时间在3－10MIN
大概每次进样100MG（21.2MM ID），和需要的纯度有关

快速PRE-HPLC 中样品收集所需考虑的因素
一般的制备峰寛可以从1－20MIN，而FAST PRE-HPLC的峰寛一般10－60SECONDS,RUN TIME为3－10MIN
对所有硬件的相应时间要求也有所提高

还讲到以下概念：
Collection Valve Switch Time
Detector Time Constant
Using a DMSO Solvent Sandwich
Delay Volume My heart
Method Used to Determine Delay Time
Software Processing Speed
Delay Volume (II)
Delay Volume (III)

Optimizing Purifled Sample Recovery on Reverse-Phase HPLC Systems
cuturl('http://www.antpedia.com/?uid-35804-action-viewspace-itemid-146068')

作者: lian1982800 时间: 2011-5-31 11:50

我做HPLC时用的溶剂开始用都是fisher的产品，从保留时间到基线一直没什么问题，后来换用了国产的溶剂（嘻嘻，降低成本嘛），烦恼就多多了，尤其是基线一路上扬，后来发现是有些溶剂在检测波长处吸收值偏高所致，而且不同批号的吸收值还有很大差异（汗）。后来结果是每瓶溶剂使用前必测一下该波长处的吸收一直持续到又换回到fsher了。说这些呢，是想提醒大家注意一下在hplc检测中流动相及接触流动相的容器对检测结果的影响。

作者: luohu0126 时间: 2011-5-31 11:50

同意二牛的意见，我在做有关离子对的hplc，条件本身就不稳定，对柱子的损坏本身就很大，后来参考了国内的一篇文献，用了2.5％的醋酸（也怪我自己没有脑子，没有多考虑），结果，流动相走了两小时，柱子就坏了，狂ft，到现在还没有找到合适的柱子，已经浪费快2个月了，老板一直在催。

在此，也向各位大虾讨教：什么类型的色谱柱对于离子对分离的效果比较好?谢谢！

作者: gitde 时间: 2011-5-31 11:51

我也说说流动相中添加酸的例子。
有一次在做某一化合物的时候，几个参考文献的流动相均没有提到加酸，只是水和乙腈，所以我在做的时候也没有加，结果换了很多体系都不行，后来试着加了0.1%的磷酸，立即出现了很好的峰。
更绝的是在做另一化合物的时候，流动相中加入0.1%的乙酸，加入0.2%，直至0.5%的乙酸时，保留时间从15，16分钟一直提到7分钟。
可见有时pH是很重要的。实验前应该考虑被分析的化合物的性质。

作者: hewen0925 时间: 2011-5-31 11:51

　　C18柱的冲洗方法

　　流动相是缓冲盐，对不怕水的色谱柱，如Agilent ZORBAX可直接用100%水冲洗，对怕水的色谱柱,不能直接用100%水冲洗，可用5%甲醇水溶液冲洗，然后均可100%甲醇冲洗并保存，如长时间保存可改用80%甲醇保存，防止甲醇挥干损坏色谱柱;流动相是有机系，可直接用甲醇冲洗保存。

　　希望对大家有帮助

作者: yinshengxu 时间: 2011-5-31 11:51

我的经验：关键的第一点俺不会分析的化合物的性质sorry
所以每次筛选条件时，先基本一个体系和比例，然后啪啪啪啪分别调节PH2.5、3.5、5.0、6.0、6.5等等从酸到碱三四个同体系同比例的流动相，一一试验，反正俺觉得效率不算低。
你们觉得弱吗Smile

作者: fengyan22 时间: 2011-5-31 11:52

关于ELSD的线性
开始做ELSD时没有知道这一点：ELSD的amount and area之间不是线性的，如下所述:
ELSD provides a non-linear response, resulting from the various light scattering mechanisems and from the particle size distribution. the non-linear ELSD response is described by the widely used empirical model.
y=am^b,where m represents the amount injected, and a and b are numerical coefficients.

所以在做calibration curve时，应该选择log-log的方式，得到y=a+bx的直线，其中Y代表log value of the peak area, and X the log value of sample amount, a the intercept and b the slope.

根据自己的结果，这样子出来的结果还是很不错的。

reference:
analyst,2002,127,35-41

另外还有两篇介绍ELSD基本原理和应用的文献，比较早：
1。journal of chromatography,265(1983) 1-18
2.journal of chromatography, 288,(1984) 253-275

作者: fengyan22 时间: 2011-5-31 11:52

一个很有意义的公式可以说明样品制备在一个完整的分析过程中是多么重要：
Vt^2=Vs^2+Va^2
其中Vt表示：整个实验过程中产生的变异或者误差
其中Vs表示：样品制备过程中产生的变异或者误差
其中Va表示：仪器分析过程中产生的变异或者误差

其中Vs^2=Vh^2+Vex^2+Vc^2+Vcl^2
Vh----样品混勻 homogenization
Vex--- 样品提取 extraction
Vc---- 样品浓缩 concentration
Vcl--- 样品净化 cleanup

所以，无论后面的仪器分析过程是多么的精确，如果样品制备没有做好，那么也会得不到好得accuracy, precision and reproducibility,也就不是一个好得analytical method

作者: fengyan22 时间: 2011-5-31 11:53

　　仪器或者分析方法常用得一些参数：

　　Merit for Instruments or Analytical Methods

　　1 准确度：Accuracy 表示和真实值之间得差异(Deviation from true value)

　　2 精密度：Precision 重复实验得重现性

　　3 灵敏度：Sensitivity 对微小浓度变化检测能力

　　4 检测现：Detection limit 所能检测到得最低浓度

　　5 线性范围：Linear dynamic range 标准曲线得线性范围

　　6 选择性：Selectivity 分辨检测物和干扰物得能力

　　7 分析时间：Speed of analysis Time 样品制备和分析所用时间之和

　　8 分析通量：Throughput 特定时间内所能分析得样品得量

　　9 自动化程度：Ease of automation 系统得自动化程度

　　10 系统适应性或者是耐消耗能力：Ruggedness 仪器得持久性，或者对突发时间得适应反应能力

　　11 移动性：Portability 系统的可移动性

　　12 环保：Greenness 废物产生和耗能

　　13 费用：Cost 仪器费用和人力费用

作者: yxh04 时间: 2011-5-31 11:53

我看了大家这么多经验真实收益良多。
实验中的问题大家已经说的差不多了，我就想说说我前一段时间做实验的体会，我觉得仪器的维护和系统的平衡太重要了，因为我也做的是中药，测定其中的三萜皂苷元，用甲醇提取的，提取液中有很多挥发油，刚开始系统还可以，晚上做完实验后，我也没好好冲洗液相柱，做过一段后，实验结果的重现性很差，最后发现提取液中的挥发油都吸附在固定相上，影响柱效。从那以后我都用甲醇小流量冲过夜，这样实验结果的重现性就好了。

作者: heyugudu 时间: 2011-5-31 11:53

我在用液相作指纹图谱，有个问题始终不太明白：如果我做的图就是有一个成分在同样的检测条件下是倒峰，行不行？但是别的文献上都没有出现过倒峰，不知是何原因？

我们在实验中也出现过这种情况，想必是由于进样的溶剂与流动相不同，这样在基线平衡的时候，由于紫外吸收不一样，就会出现倒峰了，用流动相直接溶解样品试试，应该可以解决这个问题了Smile

作者: guyanyehua 时间: 2011-5-31 11:54

各位大虾，我是半路出家做分析，对液相一知半解，我现在用乙腈：水16：84作流动相分析样品中的芍药苷，样品是经醇提后直接稀释用0.45um滤膜处理后进样，前面出峰很多，不过芍药苷峰还是分得不错，就是后面的出峰时间很长（芍药苷峰在12min，后面到50min还有峰出来），我想知道有没有什么好的方法可以解决这个问题啊？（我考虑用梯度法，将芍药苷后面的东西快速冲出来，但是我这里不能作梯度，另外就是用溶剂将对样品进行预处理，但是也得考虑回收率的问题，）希望大家给我一点指导，谢谢了！！

作者: nescafe 时间: 2011-5-31 11:54

我想这是由于你的样品组分非常复杂的缘故。你可以尝试，在芍药苷峰出后，用进样注射器进一针乙腈，可能可以使它快速出来，就不用等太长时间了。不妨试试看

作者: 406101675 时间: 2011-5-31 11:55

QUOTE:

原帖由 guyanyehua 于 2011-5-31 11:54 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
各位大虾，我是半路出家做分析，对液相一知半解，我现在用乙腈：水16：84作流动相分析样品中的芍药苷，样品是经醇提后直接稀释用0.45um滤膜处理后进样，前面出峰很多，不过芍药苷峰还是分得不错，就是后面的出峰时间很长（芍药苷峰在12mi ...

如果你仅仅分析芍药苷的含量或者所要分析的峰在一定时间都出来了，那也没关系的，其他的峰您可以不予考虑，在50min或适当的时间停止，再用100%的乙腈洗柱，然后用流动相乙腈：水（16：84）平衡。这些动作均可以在Agilent 的Chemstation 软件上实现。

作者: wxw1981_2001 时间: 2011-5-31 11:56

我用的是ｗａｔｅｒｓ　　ａｔｌａｎｔｉｃｓ柱子。在使用前一定要仔细阅读柱子使用说明书，它会表明柱子耐压程度，pH范围，如何清洗再生等。做生物样品时，一定要加上保护柱，定期的冲洗保护柱。或反冲保护柱，此时不要与检测器相连。反冲柱子前与柱子厂家联系看是否能反冲。ｗａｔｅｒｓ柱子前后填料很紧可以反冲，用乙腈和水不同比例冲洗，时间不宜过长二小时即可。

欢迎光临分析测试百科 (http://bbs.antpedia.com/)