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标题: 【分享帖】关于细胞培养中的污染 [打印本页]

作者: NBA 时间: 2015-6-9 21:23 标题: 【分享帖】关于细胞培养中的污染

相关疾病：
有关细胞技术的热门话题——细胞培养中的污染

细胞培养中常见的污染情况总结如下:
常见的污染如下：
1、细菌：细菌在普通倒置显微镜下为黑色细沙状，根据感染细菌的不同，可有不同的外形，培养液一般会浑浊变黄，对细胞生长影响明显。
仔细检查一下器皿的灭菌情况，是否在高压灭菌时放气时间足够，压力足够！尤其是和储存培养液接触的移液管等物品，连续两次污染的话有可能造成储存液污染，一定要注意！下次使用前检查一下培养液是否存在浑浊的现象！
可在培养液中加相应的抗生素处理
2、霉菌：培养液是清亮的，倒置显微镜下无杂质，37度孵箱培养2-3天，仍清亮，但出现絮状杂质，镜下可见呈细丝状的团状漂浮物，可看到明显的菌丝，细胞仍可生长，但时间长之后，细胞的活力状态变差，
用硫酸铜溶液擦拭CO2孵箱内，再把水盘里也加上饱和量的硫酸铜。或者在培养箱的托盘加入饱和的消毒磷酸氢二钠高盐液体,可以防止霉菌污染。
CO2孵箱被霉菌污染后，可把所有细胞暂时转移，采用过氧乙酸擦洗孵箱（包括隔板，箱壁）。并把过氧乙酸放置在孵箱内一个小时，使其蒸汽弥漫。待过氧乙酸的气味消散后，再移入细胞。孵箱应定期清洁（2月左右），尤其在多雨的季节。
其它培养箱清洗方法是：用84液擦洗－清水擦洗－75%酒精擦洗－紫外灯照。
预防霉菌污染，可在培养基里加3u/ml的两性霉素或制霉菌素或放线菌素D或双抗；但细胞一旦污染，很难挽救，制霉菌素或放线菌素D或双抗都于事无补，建议舍弃该污染细胞。，将环境彻底消毒，如果所有细胞都污染，可能是系统污染，检查一下培养基和器材，如果只是个别污染，可能是操作问题，就要注意操作
3、支原体：黑色的，好象多为多形，培养液一般培养液一般会浑浊，原体感染，国内血清很多都没有做支原体阴性检测，而支原体是牛血清中最常见的微生物之一。而且它不能用过滤的办法除去。支原体感染细胞以后，细胞病变不很明显，只是慢慢死去。
用泰乐菌素，兽用支原体病的药，但可用于细胞培养，无任何不良反应。Sigma公司的使用时用50ug/ml Tylosin培养液培养6天或连续传两代即可清除支原体污染。如果作为常用的抗生素的话, 建议用8ug/ml的浓度。
4、黑蛟虫：可以穿透滤膜，也可以通过空气传播，低倍下为黑色点状，高倍下可看见黑色的小虫游来游去，培养液也是不浑的，一般不会太影响，细胞还是可以用的。常常是细胞生长状态良好，且观测到的运动物无明显增多，且培养液颜色、透明度无明显变化，可在同一批号的血清养的细胞中发现类似现象。对细胞生长状态不会有明显影响，在细胞增殖旺盛之后会自然消失，除更换血清外无须特殊处理。建议如果细胞有可能是此种污染的话，可以增加细胞的种板密度，以提高细胞的生存率。
5、真菌：一般培养液清亮，不变色，镜下有丝状物，有些真菌开始很像死细胞碎片，只是它很多很多的小块很清楚，象珊瑚状，不象细胞碎片分不清，慢慢的会长出很细的黑色丝状物。真菌生长的比较慢，不象细菌那么容易被发现，但是一旦发现有它的存在细胞就被污染了，也很难救活了。
6、原虫：培养液可轻微浑浊，显微镜下那些细小的点状物数量非常多，轻微活动，细胞虽然可以生长但繁殖速度却明显减慢，而且细胞状态不好，边缘不清楚，细胞不透亮。他们与细胞可共生但会与细胞争夺营养。这种共生是非常普遍的，但他们的数量小，细胞站优势所以不会影响到细胞的正常生长，只有当他们到达一定的数量时就会影响到细胞的生长，最终形成恶性循环。
污染的可能原因：可能原因很多比如配液消毒问题、操作问题、环境问题等等
关于培养基的无菌状况，取培养基至培养瓶中（不加细胞），37度试培养一段时间后观察。如果没有细菌生长就是操作的问题。
也可以在培养基中事先加入双抗（硫酸链霉素和氨苄青霉素）。但双抗有时会影响细胞的状态，所以在做转染、检测细胞某项指标前一定要撤去双抗，以避免影响实验结果。
1、孵箱应定期用三氧机消毒或者紫外光照射，并用酒精和新洁尔灭试擦孵箱同时孵箱内的水应是三蒸水
2、超净台\取材\器材\培养液\培养瓶\操作等因素
3、超净台的风机不能过大，风机到6-8格。否则也可能能致霉菌污染
4、无菌室经甲醛熏蒸消毒后，可用同等量的氨水喷洒中和，约几小时即可进入操作。

作者: gogo 时间: 2015-6-9 21:23

污染是细胞培养第一大害！
不过好像一般普通培养真菌污染的概率比较大些，因为培养基中常会加入细菌抗生素

作者: remonte 时间: 2015-6-9 21:23

正愁分不清各种细菌呢，真是及时雨啊

作者: ending 时间: 2015-6-9 21:24

非常谢谢!我们实验估计是黑胶虫污染.

作者: HPLC使者 时间: 2015-6-9 21:24

很好！我培养的细胞，个别孔已发现霉菌，正在处理中。

作者: memory 时间: 2015-6-9 21:24

谢谢，我们实验室也经常看到黑胶虫，有人总认为是细菌，结果细菌培养是阴性。更换血清就可以了吗？
原来看到的心肌细胞培养专栏哪去了？有谁知道?

作者: october7 时间: 2015-6-9 21:25

非常感谢!
有哪些老师有好的图片也传上来就好了.
我的细胞死完了还找不到很确定的原因.

作者: iii_ii 时间: 2015-6-9 21:25

关于“黑胶虫”或“黑蛟虫”或“黑焦虫”的性质或本质，有谁能提供点资料么？比如生物学分类，生活习性，结构形态，高倍镜或电镜图片。另外，有英文相关文献么？至少名字有英文的么？有人研究这种“虫子”或“微生物”或“纳米级细菌”么？

作者: zhenxin 时间: 2015-6-9 21:26

我们实验室这段时间经常污染。在低倍镜下观察，是很多黑色的小点，在高倍镜下，发现黑色小点在原地轻微的颤动，这是黑胶虫吗？？

作者: ladyhuahua 时间: 2015-6-9 21:26

我的细胞也怀疑是黑胶虫污染,但是否经空气传播?因为同一培养箱中有的细胞中,高倍镜下可见小黑点游动,有的就没有,且黑点会长成黑虫

作者: 芙蓉宫主 时间: 2015-6-9 21:26

关于黑胶虫：
根据平时的操作，我觉得“黑胶虫”有没有可能是以下操作细节方面的问题导致的呢？
1、有时候血清瓶或者培养瓶上用标记笔写的字没有擦掉就直接泡酸，字迹溶解后沉积在酸缸中浸泡的瓶子里冲洗不净。
2、过火的时候不小心碰到酒精灯的灯芯，粉尘飞进培养液内。
3、有的同学习惯将移液管塞棉花的一端在酒精灯上焚烧一下，灰烬飞进培养液内。
请教！

作者: ALALA 时间: 2015-6-9 21:26

我们实验室就曾经利用制霉菌素制服过真菌污染，拯救了细胞，回想起来真是＂惊心动魄＂啊！

作者: 水母 时间: 2015-6-9 21:27

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腹水
看贴后,我怀疑我的杂交瘤被霉菌污染了.
24孔板中央老是有絮状物,细胞没死,但生长不佳.将絮状物吸出后,第二天又有.并且将细胞裹在里面生长.请问这样的瘤细胞能不能上腹水.

作者: standbyme 时间: 2015-6-9 21:27

相关疾病：
我培养基里都加了双抗，刚开始一瓶肿瘤细胞状态还好，但过了两三天培养基里会出现很多一团团的东西飘着，瓶底还是有贴壁的细胞，细胞培养基混浊，开始以为是细胞长得太多，导致接触抑制死亡，但是倒掉培养基，用PBS洗干净，把瓶内贴壁的细胞用胰酶消化分装后，第二天还是出现这种情况。有时如果传代的细胞特别少，每天给他换液，到了第三天左右，细胞数目不多，但也出现了上述的情况（很多碎片和团状物飘着），不知大家有没有遇到这种情况，帮忙分析分析。谢谢！（我养的都是肿瘤细胞）

作者: ero11 时间: 2015-6-9 21:27

很好，要是有污染的照片就更直观！！

作者: wawa 时间: 2015-6-9 21:28

污染后，培养液味道变臭了是什么污染。

作者: NBA 时间: 2015-6-9 21:28 标题: 回复 #16 wawa 的帖子

培养液味道变臭了应该是厌养菌污染.

作者: 33号 时间: 2015-6-9 21:28

相关疾病：
我培养基里都加了双抗，刚开始一瓶肿瘤细胞状态还好，但过了两三天培养基里会出现很多一团团的东西飘着，瓶底还是有贴壁的细胞，细胞培养基混浊，开始以为是细胞长得太多，导致接触抑制死亡，但是倒掉培养基，用PBS洗干净，把瓶内贴壁的细胞用胰酶消化分装后，第二天还是出现这种情况。有时如果传代的细胞特别少，每天给他换液，到了第三天左右，细胞数目不多，但也出现了上述的情况（很多碎片和团状物飘着），不知大家有没有遇到这种情况，帮忙分析分析。我也有同样问题

作者: mybioon 时间: 2015-6-9 21:29 标题: 回复 #18 33号的帖子

我现在也出现了类似的情况
有可能是支原体污染

作者: 阿k 时间: 2015-6-9 21:29

相关疾病：
曾经做单抗铺巨噬细胞，铺好发现细胞全是会动的，跑的还挺快！！仔细一看，全是滴虫。感情这只老鼠感染了滴虫！！！！我那个郁闷阿！

作者: xevin 时间: 2015-6-9 21:30

我的细胞污染探索
某天打开孵箱，看到我的L1210的培养瓶培养液又是黄黄的，觉得很不错，今天又可以传代了，可是在镜下一看，细胞虽然明显增加了，但并没有象以前那样长满，而且更让我心惊的是怎么出现了许多黑色的小点，杆状，而且好像在动来动去，翻转，旋转，在细胞很多的地方小点就少，而在细胞较少的地方小点就多，细胞的活力也没有以前好了，第一反应细菌污染，请实验室老师过来看，说不是细菌污染，这个点要比细菌的小黑点大的多，也好象不是霉菌，没有菌丝，没有常见的团壮的生长，肯定不对劲，但到底是什么，说不上来。最后，决定换液、洗涤、离心，换瓶，操作结束后镜下看黑点几乎看不到了，有点放下心来。
隔天后去看，培养液还和上面的一样，但镜下，那种东西又出来了，在细胞少的地方，几乎呈现出粗砂粒样，我欲哭无泪，知道可能不行了，郁闷的换液后，回家上网·搜，一个名词跳了出来：黑胶虫。黑色、杆状、运动、细胞不会很快死亡，这些描述简直惊人的一致，我确定了，我受到了黑胶虫的袭击。但黑胶虫是什么，由于网上说法不一，我决定探究一下。

作者: xevin 时间: 2015-6-9 21:31

这是我的探究过程：首先，培养液略黄，稍有浑浊，镜下观察，细胞还没有死，但是已经不长了，那种东西已经是铺天盖地了，满眼望去，尽是粗砂粒样，细胞好像成了一个个汪洋中的小岛。
细胞涂片，送到化验室，革兰氏染色，不久电话回报怀疑－－真菌。第一反应不可能，亲自去了化验室，看到了片上一个个瓜子样的小点，染色呈黑色。看我还有些怀疑，化验室的同事又作了滴片，镜下暗视野40倍可见一个个亮白色芝麻样的东西在游来游去，再次涂片染色仍和以前一样，并且可以见到芽孢样的形状，他们确定无疑是真菌，但不是常见的念珠军、霉菌，具体是什么，也说不上来。由于已经盖棺定论，计划的HE染色、支原体没有进行。
已经将污染的细胞扔掉了。休整几天。
附照片。
1、这是未污染时的细胞

作者: xevin 时间: 2015-6-9 21:31

1、这是未污染时的细胞

图片附件: 36598482.snap.jpg (2015-6-9 21:31, 57.88 KB) / 该附件被下载次数 4
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=33414

作者: xevin 时间: 2015-6-9 21:31

2、这是污染后的

图片附件: 47901057.snap.jpg (2015-6-9 21:31, 65.63 KB) / 该附件被下载次数 6
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=33415

作者: xevin 时间: 2015-6-9 21:32

另一张

图片附件: 64947358.snap.jpg (2015-6-9 21:32, 64.22 KB) / 该附件被下载次数 3
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=33416

作者: xevin 时间: 2015-6-9 21:32

染色后

图片附件: 35835299.snap.jpg (2015-6-9 21:32, 50.98 KB) / 该附件被下载次数 3
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=33417

作者: xevin 时间: 2015-6-9 21:32

滴片：视野中白色的亮点就是感染物。另外，上染色图红染的是细胞，其周深色点壮的就是污染物

作者: vcve 时间: 2015-6-9 21:33

真是太感谢了，上面的照片怎么和我的情况一模一样，我本以为是培养瓶不干净，杂质太多造成的。现在细胞还在快速生长，传代后培养液第二天就变黄了，那些小点点很多，还是贴壁的、不动，有时和细胞很难区分。恐怕我的情况也是污染了。。。

作者: youreyes 时间: 2015-6-9 21:33

我的细胞也有这种情况，　不过，没有楼上的图片那么严重，小黑点还比较少，我用PBS洗了３遍　在换上新鲜的培养液小黑点少了很多，只是个别的．我开始也怀疑是细菌污染　，因为太像杆菌了，后来单独培养这种小黑点，不浑浊　，应该不是细菌．但我觉得也不是真菌．最有可能就是传说中的黑胶虫，但这是一种什么生物啊？其实对细胞的影响还是蛮大的

作者: 白白的 时间: 2015-6-9 21:34

我的肿瘤细胞在用小牛血清培养的过程中，
有不少的黑点，但是培养液颜色细胞等感觉都正常，
长势一般（新复苏的，且更换培养基了），总体还是慢吧。
然后为了处理黑点，我过滤了血清并且将细胞离心下来转移至一次性培养瓶中，黑点减少，但是细胞长势依旧。
然后另外一瓶（重复使用玻璃培养瓶），我更换了胎牛血清，
当天发现里面有大量的黑色杆状的类似黑胶虫问题，
但是第二天虽然现在仍有一些黑点，
细胞长势还不错！
所以我认为黑胶虫问题，很大程度是和血清质量有关的，
至于培养瓶等还是小问题，
应该不是污染。

作者: 婴儿脸 时间: 2015-6-9 21:34

我培养基里都加了双抗，刚开始一瓶肿瘤细胞状态还好，但过了两三天培养基里会出现很多一团团的东西飘着，瓶底还是有贴壁的细胞，细胞培养基混浊，开始以为是细胞长得太多，导致接触抑制死亡，但是倒掉培养基，用PBS洗干净，把瓶内贴壁的细胞用胰酶消化分装后，第二天还是出现这种情况。有时如果传代的细胞特别少，每天给他换液，到了第三天左右，细胞数目不多，但也出现了上述的情况（很多碎片和团状物飘着），不知大家有没有遇到这种情况，帮忙分析分析。我也有同样问题

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我也有同样问题，是不是细胞污染了？

作者: 子衿青青 时间: 2015-6-9 21:34

我培养基里都加了双抗，刚开始一瓶肿瘤细胞状态还好，但过了两三天培养基里会出现很多一团团的东西飘着，瓶底还是有贴壁的细胞，细胞培养基混浊，开始以为是细胞长得太多，导致接触抑制死亡，但是倒掉培养基，用PBS洗干净，把瓶内贴壁的细胞用胰酶消化分装后，第二天还是出现这种情况。有时如果传代的细胞特别少，每天给他换液，到了第三天左右，细胞数目不多，但也出现了上述的情况（很多碎片和团状物飘着），不知大家有没有遇到这种情况，帮忙分析分析。谢谢！（我养的都是肿瘤细胞）

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我也出现这种状况，有哪位大虾能解答一下，已经养了两个月细胞的，还是没养好，急啊！！我养的是肾小管上皮细胞

作者: utt0989 时间: 2015-6-9 21:35

想问问楼主，我的细胞在培养瓶里养四五天还是好的，但铺到六孔板里，长满后用无血清培液就会出现一团团黑黑的浮着，细胞变得模糊了，这种情况像是支原体污染吗，请指教啊，不胜感激

作者: am10 时间: 2015-6-9 21:35

相关疾病：
我的细胞中，突然出现黑色的圆点，应该不是细菌感染，因为细胞还在贴壁生长，但是长得不太好。那个黑点点好像还是贴壁的。各位大虾，这是什么情况，帮忙分析分析

作者: lagua123 时间: 2015-6-9 21:36

我的培养瓶里一天后就出现了絮状沉淀贴壁的黑点和黑色细丝状旋转运动的东西都有培养基也变黄了我真是中了个大奖齐了

作者: tie8 时间: 2015-6-9 21:36

相关疾病：
【黑胶虫】
“黑胶虫”是近十几年才发现的一种细胞污染物，“黑胶虫”的分类目前尚无鉴定确认。“黑胶虫”可寄生于动物细胞，也可以生存于培养基中，依靠细胞和培养基中的营养为生，并随细胞传代而传代。“黑胶虫”与细胞竞争性生长，开始时对细胞并没有什么影响，但当黑胶虫的数量多到一定程度的时候，细胞生长就会受到影响直至死亡，严重影响了科研活动的开展和进行。所以“黑胶虫”的污染常在培养条件改变、细胞接种密度降低、细胞状态不佳时显现并使实验中断，尤其在冻存细胞复苏时可造成大量细胞死亡。本培养基，对“黑胶虫”具有很好的抑制作用。通过使用此种特殊培养基，“黑胶虫”的污染可以得到有效的控制，为防止污染和抢救有价值的细胞提供了强有力的技术手段，是节约人力物力、减少不必要的经费支出和保证科研工作的顺利进行的重要手段。
【支原体】
无论生物医学研究还是生物活性制剂及药物的开发，细胞培养成为不可或缺的重要工具之一。真核细胞（eukaryotic cell）培养面对的最大问题是各种潜在的微生物污染，包括真菌（fungi）、酵母菌（yeasts）和细菌（bacteria）等。细菌感染中尤以支原体污染（mycoplasma）最为严重，不同于其它细菌感染，支原体感染不易发现，需要特殊的检测手段才能确定，并且支原体感染对常见抗生素不敏感，总体细胞培养支原体感染率大约在30％。消除支原体污染的最佳方式是抛弃培养的细胞，对接触细胞的所有器具进行高压灭菌，重新复苏细胞。但较多情况下，被污染的细胞不可替代，因此使用特效抗生素消除支原体污染非常重要。“HBK”开发的出一系列支原体检测和消除试剂，其中MycoER由两种抗生素组成，分别属于Macrolide和Tetracycline类抗生素，结合我们推出的最佳细胞处理程序，消除支原体有效率在85％以上，细胞产生抗性的比例不超过15％。
【细菌、真菌污染污染】
细菌污染：细菌是一种原核细胞微生物，其大小以微米(μm)计。常见的污染细菌有革兰氏阴性菌和大肠杆菌、假单胞菌等，革兰氏阴性菌中白色葡萄球菌等比较常见。一旦发生细菌污染较易发现，多数情况下培养基短期内颜色变黄，表明有大量酸性物质产生，出现明显混浊现象；有些细菌污染在静置的培养液中十分不明显，稍加振荡后细菌和裂解的细胞产生的碎片会浮起。
真菌污染：真菌污染是细胞培养过程中最常见的一种，尤其在阴雨季节进行细胞培养更易污染。污染培养细胞的多位烟曲菌、黑曲霉、毛霉菌、孢子菌、白色株菌、酵母菌等。霉菌污染后多数在培养液中形成白色或浅黄色漂浮物。一般肉眼可见，较易被发现，短期内培养液多不浑浊，显微镜下可见于细胞之间纵横交错穿行的丝、管、及树枝状菌丝，并悬浮漂荡在培养液中。
虽然只是几份说明，希望解决各位实际问题。对国产培养基、血清、试剂方面原和大家交流经验心德。

作者: newway 时间: 2015-6-9 21:37

另一张

......

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这点不黑啊。之前也遇到过，感觉就是真菌。有些连在一起呈链状，应该是常见的真菌，和黑焦虫差远啦。没见识过黑焦虫的真面目呢！

作者: newway 时间: 2015-6-9 21:37

我的细胞中，突然出现黑色的圆点，应该不是细菌感染，因为细胞还在贴壁生长，但是长得不太好。那个黑点点好像还是贴壁的。各位大虾，这是什么情况，帮忙分析分析

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我也遇到过，用环丙沙星能清除，可能是支原体，不管是不是支原体，四环素类能解决，而且不复发

作者: BUK 时间: 2015-6-9 21:38

冻存细胞MDA-MB 231培养第二天，
怀疑有污染了，感觉细胞形态不是很好，另外有一种比较大、细胞质很淡的细胞生长，是不是污染了啊。。。？
谢谢大家赐教。

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