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标题: 如何用LC-MS测定标准品的纯度 [打印本页]
作者: lxycxf    时间: 2011-7-14 21:32     标题: 如何用LC-MS测定标准品的纯度

由于标准品是自己分离获得，所以需要测定其纯度。用DAD检测器测其纯度，可能不准，有人建议用LC-MS测定，那么如何测定呢？
1.原理是什么？
2.需要测定那些数据？
3.获得的数据如何处理？（是不是类似于紫外做线性关系呢？）
谢谢。
作者: weiminji    时间: 2011-7-18 18:46

从LC-MS 工作的原理上看，在标定标准品纯度方面，该仪器可以做两件事：

1. 配同等浓度的溶液，用已知含量的标准品标定自己纯化标准品的纯度。标准品经MS离子化后，检测的主要色谱峰即为目标化合物的色谱峰，水分、重金属、其他结构的杂质即使保留时间一样也不会出峰干扰，结果比较可靠。

2. LC-MS进样后检测总离子流，有机杂质可以产生色谱峰，该色谱峰在保留时间上与目标化合物色谱峰的保留时间会有差别，从而可以观察标准品的纯度问题。一些在DAD上不响应的杂质，在MS上会出峰，从而使测定的结果更准确。但也存在一个问题，不同化合物离子化效率不同，同样的浓度会产生不同的峰面积。
作者: jtdxzn    时间: 2011-7-18 19:26

主要是某些杂质在紫外下无吸收峰，所以会觉得LC不够准确。事实上用LCMS同样存在这个问题，某些物质不易离子化。
作者: 北漂的斌儿    时间: 2011-7-18 21:53     标题: 回复 #1 lxycxf 的帖子

其实如果紫外响应好的话，使用不同的液相条件采用HPLC测定纯度还是可信的，质谱测定纯度受到离子化不同的影响，结果不太可信
如果要定纯度可以采用热分析的方法
作者: zdh30924    时间: 2011-7-19 09:43

LC-MS可以测定标准品的纯度，但必须有对照品进行比较，用已知含量的标准品外标法确定自己标准品的量值，然后换算成纯度，属于外标法定量的一种，主要能避免DAD测定纯度过程中杂质带来的干扰。
作者: troy.tper.lee    时间: 2011-7-19 10:02

支持2楼观点1和5楼观点。LC-MS定标，需要对照品直接对未知纯度的样本进行定量，计算回收率就可以了。如果想要通过全扫描来测含量是很难的：
原因一，质谱存在离子化和质量歧视现象----有些化合物是不能离子化的；能离子化的化合物响应与浓度也不一样，差别很大，主要由化合物的结构决定，如杂原子等；不同质谱仪化合物测定的范围是不同的；
原因二，色谱上的影响和基质上的差异。
我经常会遇到想通过质谱做杂质的，基本上都被我否定了，就是由于太困难。一般会要求他们先进行高浓度色谱分离之后将峰接出来，给他们做一个基础的鉴定，利于发文章。别一种情况就是有试样和对比样，两个进行全扫描之后进行对比。
作者: xyj-323    时间: 2011-7-19 10:11

LC/MS有可能测出不纯化合物里的所有成分，但是也有可能有的杂质质谱也不响应。所以LC/MS测定标准品的纯度也会有问题而造成测定结果不准确。如果用LC/MS 测样品纯度，那就用总离子流图归一看含量。
作者: Shine    时间: 2011-7-19 10:22     标题: 回复 #1 lxycxf 的帖子

来自赛默飞世尔科技刘工回答：

其实使用LC/MS技术也不能保证准确测定纯度，LC/MS测定由于会受所采用离子化技术的限制。样品中某些杂质可能在所使用离子化技术下不能离子化或者离子化效率很低，导致该杂质不能检测到，测定纯度无法实现，当然如果所测杂质和主成分相关，一般可采用与主成分相同的离子化方法，结合适合的色谱分离方法测定。

为较全面的测定样品纯度，建议还是通过分别采用ESI(+),ESI(-),APCI(+),APCI(-)均去测定，并结合LC-DVD数据，更不要忘记传统却有效的方法——熔沸点测定方法，评价样品纯度。
作者: ztj970831    时间: 2011-7-19 10:37

LC—MAss更差劲，柱子短，进样量小。还是想别的办法吧
作者: 生活eesf    时间: 2011-7-19 10:38

准不准不在于仪器,在于标准方法, 无论色谱法怎么侧,都是测有机杂质,你知道你的样品中无机杂质是多少么?
作者: swn_nyve_vb    时间: 2011-7-19 10:39



QUOTE:
原帖由 lxycxf 于 2011-7-14 21:32 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
由于标准品是自己分离获得，所以需要测定其纯度。用DAD检测器测其纯度，可能不准，有人建议用LC-MS测定，那么如何测定呢？
1.原理是什么？
2.需要测定那些数据？
3.获得的数据如何处理？（是不是类似于紫外做线性关系呢？）
谢谢。 ...

建议采用不同模式不同色谱柱分离来测定纯度

质谱的分离是根据不同的分子量来分离的，遇到同分异构体就很难确定纯度。
作者: mengge    时间: 2011-7-19 10:43

1、原理是：含量比例等于峰面积的比例.

2、需要测定：相关化合物对应的峰的面积。那些数据?

3、获得的数据处理：单个峰的面积除以总的峰面积，既是含量或者纯度。
作者: xiemufeng    时间: 2011-7-19 10:48

对于对照品的纯度，首先要有一个较为客观的认知：所测得的纯度系数绝非真实值，工作中也没必要获取真实值，只有所得数据的误差可满足工作需要即可。否则就会陷入“画地为牢、墨守成规”的思维定式，对该纯度值“格物致知”。

洞悉了以上道理后，就会明白：对照品纯度系数的测定绝不无必要采用HPLC-MS法，普通的容量分析法与液相法足以。

分析人员爱穿牛角尖，这便是一个典型例子，呵呵……

上海药检所 谢老师回复
作者: 21ty    时间: 2011-7-19 11:12

关于标准品纯度检定的问题记得以前药审中心发过一个技术指导要求，并没有规定必须用什么样的检测器。其实标准品纯度检定是一个数据综合问题，要结合核磁、质谱、紫外、红外以及色谱归一化的数据做综合性评判。
核磁至少6张谱，包括氢谱、碳谱、二维谱4张（包括哪4张记不太清了），各谱信号均有明确归属和解释。如果你的样品纯度低于90%的话，估计核磁上应该肯定有归属不了的信号。
质谱（必须是一级全扫描谱）各谱峰有明确解释并符合该化合物裂解规律。
紫外与红外数据应能佐证该化合物结构，没有明显的官能团差异。
最难办的是色谱归一化数据，不论用什么样的检测器，如非质量型的紫外、DAD、MS等及质量型的示差折光、ELSD等，都需要做的是10倍样品测定最大进样量（标准曲线最高点）并延长采样时间（至少达到目标化合物保留时间的3倍）考察归一化数据，然后再通过调整流动相将目标化合物保留时间延长3倍同样10倍最大进样量考察归一化数据。理论上还要再换两种色谱柱（或不同的色谱柱）和两种不同的检测器（不同类型的，最好包含一种质量型的）考察上面的数据。有时候还要附带上薄层色谱不同板子不同展开剂的数据，同样要考察检测最大量的与10倍最大量的。
以上数据都没问题，您就可以拍着胸脯大声喊出您的标准品纯度了。
至于如何用LC-MS测定标准品的纯度，您结合仪器特性，完成上面的数据综合评定一下就好了。当然如果能提供更多的信息与数据，那就更加完美了。
作者: manyouhome    时间: 2011-7-19 12:10

最简单的方法HPLC-DAD和LC-MS都运用进行检测，用已知浓度的标准品作为样品，在两种方法下进行定量，看哪种方法更准确，再用该方法对你分离的样品进行定量。
作者: 维尼    时间: 2011-7-19 15:16

医药企业在进行纯度确定的时候，一般都是用LC和核磁，而LC-MS不作为纯度定量的手段。
作者: xiaoxiao22    时间: 2011-7-19 20:34

同意“21ty ” 的做法和观点。

做标准品样品，要有标准品做对照，只要测定结果和标准品一致，基本上就可以用了；最好四大光谱都测一下，提高准确率。

如果你是做标准品（世界上还没有这个标准品），那么要把各种仪器都要用上，把物理、化学和结构性质都要搞清楚。就如前面“shine”说的，熔沸点得测一下，看看沸城
作者: zhanchunrui    时间: 2011-7-20 09:53

这是一个关于标准品纯度验证的问题。
首先，需要明确标准品的纯度定值不是检测实验室或者检测人员开展的工作，必须是由获得相应资质、按照量值传递、能够溯源到上一级基准符合要求及程序开展。
至于LC-MS，其原理本身不具有定值、测定纯度的可能性，只用于定性测定。
作者: analchemie    时间: 2011-7-20 10:07

质谱定量的基础是离子流强度和离子数目成正比，LC-MS法可以理解为将质谱仪作为色谱仪的检测器，其定量方法与色谱法相同。

若对某一组份进行定量测定，可以采用色谱分析法中的归一化法、外标法、内标法等不同方法进行。与色谱法定量不同的是，LC-MS除可以利用总离子流色谱图进行定量之外，还可以利用质量色谱图进行定量，这样可以最大限度的去除其它组份干扰。

为了提高检测灵敏度和减少其它组分的干扰，MS定量分析经常采用选择离子扫描方式。对于待测组分，可以选择一个或几个特征离子，而相邻组份不存在这些离子。这样得到的色谱图，待测组份就不存在干扰，同时有很高的灵敏度。用选择离子得到的色谱图进行定量分析，具体分析方法与质量色谱图类似。但其灵敏度比利用质量色谱图会高一些。
作者: jiangxm    时间: 2011-7-20 10:20

标准物质的标定，如果是对照品用质量平衡法，如果是标准品则与国际标准品进行比较。

质量平衡法：

一是结构确证：元素分析，核磁共振，质谱，红外，紫外等。

二是纯度验证：吸收系数，比旋度，熔点，热分析等。

在一和二通过的基础上，三是含量赋值：含量=100%-两种以上色谱的平均杂质%-水分%-炽灼残渣%。
作者: xgly36    时间: 2011-7-20 10:27

以MS作为检测器，通过质荷比进行组分的定性分析，做全扫描分析，完全分离后，用百分比进行计算其纯度。
作者: grc7636    时间: 2011-7-20 10:30

LC-MS是采集经液相色谱柱分离后流出物中目标化合物的分子离子峰，对于质量数不同的杂质并不能检出。即便是检测总离子流，由于各种物质离子效率的差别也不能确定目标化合物的纯度，因此LC-MS法不适合测定样品的纯度。

如果要测定纯度的是化学药，还是采用化学法，非水滴定、酸碱滴定等更为准确。

若是从中草药中提取分离的化合物可采用HPLC法，但要采用两种以上不同分离机理或不同色谱条件并经验证的色谱方法相互验证比较(不同的色谱柱、不同的流动相、不同HPLC检测仪)
作者: peiwuli    时间: 2011-7-20 11:11

测自己合成标准品的纯度，实际就是对标准品准确定量。

1.如果有标准对照品的情况下，使用LC-MS相比于LC-DAD更准确，原因是LC-MS能够在多种模式(ESI+，ESI-，APCI+，APCI-，APPI+，APPI-等)下以多级碎裂离子作为定量依据，能够更好的消除基质干扰(金属离子、其他杂质等)。

2.如果想没有标准对照品的情况下测纯度，LC-MS也很准确地测定，原因是标准品主成分和杂质的离子化效率是不同的，还有很多杂质是不能离子化的。

因此，测自己合成标准品的纯度，有标准对照品时，LC-MS准确度远远好于LC-DAD;没有对照品时，LC-MS也很难测定。

另外，也可以采用最简单有效的溶点、沸点法测纯度。
作者: jiaxiaofang    时间: 2011-7-20 11:40

1、原理是什么?

答：LC-MS检测与液相色谱检测原理类似，就是把液相色谱的检测器换成质谱。因为质谱能够检测化合物的分子量，所以相比于液相色谱只能检测化合物吸收值，质谱仪检测的特异性更强。

2、需要测定那些数据?

答：你可以把你纯化获得的标准品用LC-MS做一个M/Z全扫描，看看标准品里是否含有其他杂志。但是如果你需要确切的知道你的标准品里目的化合物的含量，还是需要有个已知的纯标准品做一个比对。因为不管液相色谱检测还是LC-MS检测，样品峰的强度与浓度的换算都需要与纯的标准品进行比对。

3、获得的数据如何处理?(是不是类似于紫外做线性关系呢?)

答：我们单位有一台美国AB公司的API3200，可以对标准品进行MRM多反应检测质谱定量.获得的数据类似于液相色谱的峰形图，可以用样品的峰面积与标准品分析的峰面积标曲比对，获得样品中目的化合物的含量.
作者: yyid    时间: 2011-7-23 11:21

如果想要测得准确的纯度，必须要有相应的标准品。否则通过任何方法得到的结果都只能是参考，不会被认可。LC-MS也不是万能的，也没有办法测定纯度。
作者: xgangchu    时间: 2011-7-25 09:25     标题: 回复 #1 lxycxf 的帖子

问题没有说清楚是什么标准品，标准品的基本数据，性质等。

可以采用下列方法试一试：

1、可以使用有机溶剂提取纯品中的杂质，然后定量测定，这需要知道是什么杂质，且要有标准品才可以定量;

2、可以使用GC/MS-FID，使用面积归一化法，除主峰外的所有杂志都要合并计算;

3、层析法，除掉杂质，再测主含量;

4、直接使用标准品定量测定;

以上方法供参考，祝成功。



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