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标题: 梯度洗脱是基线下滑的原因 [打印本页]

作者: shengling288 时间: 2011-7-15 10:45 标题: 梯度洗脱是基线下滑的原因

所用的流动相分别是: 流动相A为磷酸盐缓冲液（含硫酸铵），流动相B为磷酸盐缓冲液，在梯度洗脱时，基线严重下滑，请问这是什么原因呀？

作者: nancy7752 时间: 2011-7-15 14:05

楼主。换台仪器怎么样呢

作者: baohailin 时间: 2011-7-15 15:33

楼主能贴张图看看吗？是没平衡够时间吧？

作者: Doctorcbw 时间: 2011-7-15 15:34

波长？

具体梯度形状？

作者: 心情se567 时间: 2011-7-15 15:34

梯度洗脱的基线一般都不太好，只要不干扰就行。

作者: emuchhh 时间: 2011-7-15 17:27

我只知道我这的机器很挑牌子,磷酸盐要买进口的,新开封的，走出来的基线才好，不然就会有杂峰，不过扣掉空白也是可以的阿！！

作者: llqjsh 时间: 2011-7-15 17:28

基线严重下滑导致的原因是什么啊？如果是不干扰，那也没关系。所用的柱子，条件，情况都没说明白，最好附上一张图谱

作者: llqjsh 时间: 2011-7-15 17:29

基线严重下滑导致的原因是什么啊？如果是不干扰，那也没关系。所用的柱子，条件，情况都没说明白，最好附上一张图谱

作者: zhoukoutian 时间: 2011-7-15 17:51

是商品柱还是自己做的柱子？？？？

作者: s201015017 时间: 2011-7-15 18:47 标题: 参考参考

这是当然的，一般梯度洗脱时，随着流动相中有机相强度的增大，会将有机相中的杂质洗脱出来，所以最好用进口的色谱纯试剂和超纯水。还有建议作一个空白比对以及样品空白比对，有了这两张图之后就可以对自己的基线漂移进行判定了，是溶剂进行梯度切换时带来的影响，还是样品杂质？
一般的说作梯度时基线是有一定的漂移的，这具体漂移多少算过量，还要具体情况具体分析～特别是像你的流动相里还有盐。

作者: luxw 时间: 2011-7-15 19:08 标题: 流动相和仪器

1.流动相不纯是其中之一，尤其是盐的含量较大，更容易不平稳。比如如果你用分析级的甲醇或乙腈，甚至是已永远走不稳的
2.色谱柱是不是被污染了，这个的话可以通过压力的增大来判断；另外，如果使用保护柱或预柱，就拆下来再试验
3.仪器的管路是否被污染，尤其是泵上的滤头等处，建议一段时间后就更换

作者: renminliu 时间: 2011-7-15 22:24

请分别测一下流动相A和B的吸光度或吸收光谱，看是否有区别！

作者: 北漂的斌儿 时间: 2011-7-16 00:25 标题: 回复 #1 shengling288 的帖子

个人意见
1、梯度洗脱的时候基线下滑是常出现的，如果不干扰你的实验，可以不考虑，或者选择合适的梯度变化条件或恒度洗脱；
2、梯度洗脱的基线下滑原因较多，常见的有：
流动相比例变化：导致紫外吸收的变化，如果能保证前后的盐浓度一致，可以降低基线漂移；
仪器存在问题：做仪器自检，确定仪器紫外灯，光路系统，流路系统正常
检测波长过低：过低的波长，流动相会存在吸收，导致流动相比例变化，基线漂移
流动相有杂质：选择进口试剂或者质量有保证的试剂
色谱柱：在高强度盐下，色谱柱会损坏较快，应该确保色谱柱合适
3、在您的流动相体系下，漂移存在是正常的，但是不知道您的漂移是否会影响结果，最好能有基本的色谱条件，这样比较好看问题？

[ 本帖最后由北漂的斌儿于 2011-7-16 00:26 编辑 ]

作者: qqqq12723 时间: 2011-7-16 10:33 标题: 流动相不干净导致

应该是减少的流动相中有一个污染物所致

作者: rm1009 时间: 2011-7-16 13:32

楼主是不是走得很广的梯度，一般走大梯度的话基线都会越走越低的。不影响出峰就行了。

作者: qiuyf-2007 时间: 2011-7-17 11:50

是否考虑是检测器出了问题！检测器对物质的响应有了很大的变化.

作者: zhuifeng269600 时间: 2011-7-17 11:50

脏了，基线会上升！下滑会不会是平衡不够！

作者: 笑语嫣然 时间: 2011-7-18 08:59

你的A，B流动相都是缓冲液吗，那你的柱子是什么柱子，C18是不可以这样用的，损伤很大，基线漂移正常，但突然严重下降不正常，请给出柱子类型

作者: lhquan 时间: 2011-7-18 10:15

同意大家的建议，基线下滑，有可能是平衡时间不够，多平衡一段时间，可以将控制面板清零反复几次，不妨可以试一试。

作者: jtdxzn 时间: 2011-7-18 19:30

梯度洗脱的情况下出现基线漂移是很正常的现象，除非等度洗脱或者以足够缓慢的梯度进行洗脱，才有可能避免

作者: 维尼 时间: 2011-7-19 14:53 标题: 关于基线下滑

曾经把磷酸盐缓冲液在冰箱放了两天又用的，基线跑低，后来重新配的流动相，就走平了。但是楼主的情况没有特别明白，能否把色谱条件都列上，更能看出问题所在

作者: yxmangel 时间: 2011-7-20 12:00

应该是平衡时间不够，曾经做过需要平衡6-7个小时的缓冲盐体系，未稳时基线也是一直下滑。

作者: gdlkm123 时间: 2011-7-21 15:19 标题: 回复 #1 shengling288 的帖子

这种情况经常见于以下情况：（1）仪器未稳定好，主要包括检测器预热不够；柱温箱温度未平衡好；室温空调未稳定；
（2）起始流动相不干净，与有机流动相不平衡；（3）样品溶解液有高度不溶性污染成分；
不常见的情况有：（1）管路污染，流动池被污染被逐渐清洗干净；（2）紫外灯老化，寿命到期。
要逐项排查。

作者: zwjaja 时间: 2011-7-21 15:29 标题: 回复 #21 a17425481 的帖子

基线变化在梯度洗脱中很正常，每种溶剂的紫外吸收都不一样，在比例变化时，产生吸收的变化属于正常的现象

作者: baiquan 时间: 2011-7-21 16:16 标题: 回复 #1 shengling288 的帖子

在用疏水色谱分离蛋白质时，通常流动相A液为3.0M 硫酸铵 + 50mM PBS, B液为50mM PBS，在梯度洗脱过程中经常会出现基线下滑的情况，有时还会有基线上升的现象。这主要是由于使用的硫酸铵中存在某些杂质，这些杂质存在本底紫外吸收，当A液从3.0M硫酸铵随梯度运行变为0时，常常会造成基线下滑。一般情况下，基线下滑对蛋白质分离影响不大。另外，有时检测器氘灯的的能量不足时，也可能引起基线下滑。

作者: dinghong 时间: 2011-7-21 16:45 标题: 回复 #1 shengling288 的帖子

这很正常，我们知道，液相色谱主要用的检测器是紫外检测器，原理是被测物质具有紫外吸收，这样通过传感器对紫外光强度的变化产生感应，转换为电信号，加以连续记录，以信号强弱对时间作图，得到色谱图。而被测物质是通过流动相经过色谱柱，利用吸附／解吸附等分离原理将被测物与其他组份分开，然后载被测物到紫外检测器的检测池中，且一直处于流动状态，而流动相其实不是对紫外线完全没有吸收，所以会有本底吸收值，我们可以通过参比技术等消除，并保持稳定，形成一个基线，但前提是流动相的组分保持不变，如果组份发生变化，吸收值也受到影响，基线就会发生变化，也就会漂移，当然这种漂移是有方向的，也就是你看到的下滑或上飘，下滑或上飘取决于流动相组分变化时对紫外的吸收是变大还是变小。

作者: guorfeng 时间: 2011-7-21 16:49 标题: 回复 #1 shengling288 的帖子

1.检测波长越靠近末端吸收，基线漂移越严重。2.磷酸盐浓度越大，基线漂移也越严重。特别是在选用磷酸调节pH值之后更明显。3.如果使用串联泵发生基线漂移，可以换个并联泵试试。4.采用乙腈比选用甲醇的漂移严重。5.梯度设计欠合理性。6.进针之间的平衡不够充分，从而影响下一针出峰。7.被测物质的溶剂状态不合理（比如是否需要更换溶剂或调整被测物的处理方式）8.其它个别因素，包括流动相系统杂质干扰（但这是小概率事件，一般不会有这么大的影响）
以上所指的是基线单向漂移，若出现上下漂移，则首先考虑机械问题，仪器使用故障等。一般来说，梯度有基线漂移，属正常，只要不干扰分离和解析即可。

作者: phj98 时间: 2011-7-21 16:56 标题: 回复 #1 shengling288 的帖子

梯度洗脱随着有机相的变化经常会出现基线漂浮的问题，原因为流动相A和流动相B的本底吸收不一致所致；楼主的问题有多方面的原因，首先检测波长，波长越低，基线漂浮越明显；其次试剂的级别，应选用色谱纯试剂，包括水；最后应考虑盐的浓度，浓度越大对基线漂浮的影响越大；楼主流动相S中添加了硫酸铵，可考虑浓度高低可能对基线有影响，建议首先流动相A中不添加硫酸铵后考察基线，以此判断是否是硫酸铵的原因所致。
梯度洗脱基线漂浮本身可能有多方面原因，楼主应逐一排除。

作者: woxdtc 时间: 2011-7-22 14:00 标题: 回复 #1 shengling288 的帖子

梯度洗脱时流动相必须一致，洗脱时要么改变PH，要么改变离子强度，因此A液必须是低离子浓度（或低PH值）的磷酸缓冲液，B液必须是高离子浓度（或高PH值）的磷酸缓冲液，这样就不会出现基线下滑现象。

作者: wuyuzgp 时间: 2011-7-22 14:06 标题: 回复 #1 shengling288 的帖子

（1）变化一下流动相的摩尔浓度，看看是否过高引起，建议在10 ~ 50 mmol/L。。。（2）奇怪流动相为何用两个缓冲体系，建议用一个。。。

作者: xia_hairong 时间: 2011-7-22 14:10 标题: 回复 #1 shengling288 的帖子

这个要具体问题具体分析，引起梯度下滑的原因要从多方面考虑：
1、流动相是否平衡好？尤其是加了缓冲盐的流动相
2、梯度变化是否过大？加了缓冲盐的流动相如果梯度变化过大，也是引起基线不稳的因素之一
3、选择的是什么类型的检测器？如果是示差检测器，流动相变化和色谱柱温度是否稳定的影响更大，如果是DAD的检测器，尤其在低紫外吸收波长，接近溶剂的末端吸收时，基线也很不容易平衡，另外，随着流动相中有机相的比例不断增大，也会引起基线下滑
解决方案参考：
1、把色谱柱重新干净后，重新平衡色谱柱
2、把梯度变化变小和平和
3、调整流动相的组成
4、改变紫外吸收波长

以上是个人见解

作者: xlh3888 时间: 2011-7-22 14:17 标题: 回复 #1 shengling288 的帖子

首先,先问一下用到什么检测器,如果用的是紫外检测器,有可能是流动相性质差异过大,梯度洗脱时紫外吸收差异较大造成的,另外,两种流动相都用到缓冲盐有误.一般是用一种缓冲盐,另一种用极性有机试剂,如甲醇,乙腈,异丙醇等(反相色谱柱).

作者: yu-tongquan 时间: 2011-7-22 14:20 标题: 回复 #1 shengling288 的帖子

建议：
1、试剂不纯，杂质过多。特别是A液，最好用色谱纯试剂或优级纯试剂，一定要用15Ω以上超纯水；
2、用同样梯度和流速反复洗脱空柱（不要进样），观察基线是否漂移；
3、注意观察样品洗脱过程中压力是否稳定。仅供参考。

作者: wfan 时间: 2011-7-22 14:24 标题: 回复 #1 shengling288 的帖子

关于梯度洗脱基线下滑和抬高我都遇到过，只要大比例更改流动相时就会下滑很大（比如是50%甲醇直接换成100%甲醇的时候会出现，而当50%甲醇在10min慢慢变成100%时则要好很多）。我认为是由于两相溶剂自身的紫外吸收不同，当急速更换流动相时，后面的流动相与更换前的流动相本底紫外吸收差别很大，当后面的紫外在检测波长下吸收低于前面的流动相时，就出现下滑（类似出现倒峰）；反之，则会出现基线抬高现象，例如我在使用THF时，它的末端吸收在235nm，而乙腈在190nm，所以，当100%乙腈换成我的流动相（水：乙腈：THF-50:40:10）的时候，基线就会抬高出现一个平台。

后来我发现这还与色谱柱有关，色谱柱性能高的时候，不会出现这个情况或者情况要好一些，因为当流动相往前推进的时候，在性能高的色谱柱上是均匀前进的，所以是一个渐变的过程，不会出现流动相急变的情况。而性能不好的色谱柱，它会在色谱柱的某些部位残留有没有更换好的溶剂，平衡时间长一些才能全部置换出来，当这些溶剂出来的时候就会出现出现倒峰或基线抬高的现象。

当然还与溶剂的质量好坏有关，进口的甲醇就比国产的甲醇的溶剂峰要小很多，在1-2min出现的溶剂倒峰很小，有时候都没有，梯度洗脱的时候基线漂移也会小一些。

我觉得他这个问题，应该是磷酸盐缓冲液质量不合格（正常的磷酸缓冲液在大于210nm都是没有本底吸收的），并且他的检测波长估计还在很短的位置，这样硫酸铵在280nm都会干扰紫外吸收，在低波长估计影响更大。他用一个紫外吸收强的溶剂系统A换成一个紫外吸收弱的溶剂系统B就会出现倒峰，基线下滑。他没有说具体的情况也没有给出图谱，也只能推测。

我那时候用THF的时候就遇到这个问题，后来发现旧柱子平衡时间大于2小时就没事了，后来买了新的色谱柱也没有这个问题，所以也没有深究这个问题。

希望上述回答能解决问题。

作者: hshzhang 时间: 2011-7-22 14:39 标题: 回复 #1 shengling288 的帖子

1.首先要了解基线以及影响基线稳定的因素。检测器信号、柱子冲洗平衡与流动相的关系。

2.检查非梯度淋洗时，基线是否稳定，若不稳定，要冲洗柱子直至稳定，最好用纯有机溶剂如甲醇或乙腈等先冲洗，在用流动相平衡，若梯度分别用两种流动相洗涤柱子，特别注意柱子要洗净。

3.如果上述情况后基线稳定，应该稳定。那么梯度淋洗流动相组成比例在一定时间内变化基线也应稳定。若不稳定从混合器和检测池检查，很可能是检测池出了问题，混合器混不均匀。

4用得是安洁伦公司的1100HPLC，还是shimazu的。

总之要耐心检查。

作者: ngoir 时间: 2011-7-23 11:08

什么检测器，自己按梯度条件配一系列的流动相，覆盖你整个梯度的，直接放检测器上检测，就可以知道是不是由流动相组成发成变化引起的

作者: shark423 时间: 2011-7-23 11:09

要是B也不加硫酸铵而A中有，并且A与B中的磷酸盐浓度一致，随着梯度的变化，B的比例在上升，吸收值肯定是要降低的，基线下移就很正常了

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