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标题: 同志们看过来看过来啦~·snp、测序问题专贴 [打印本页]

作者: 小困 时间: 2011-8-9 15:56 标题: 同志们看过来看过来啦~·snp、测序问题专贴

看过来看过来~~~~~~~snp、测序问题专贴希望大家踊跃提问啦~~~~~~~~~

[ 本帖最后由小困于 2011-8-10 17:47 编辑 ]

作者: 何去何从 时间: 2011-8-9 15:59

小弟问一个比较菜鸟的问题，我想做一个基因KLOTHO的SNP 但是我在PUBMED的SNP查询上，没见有结果，或者是只有动物的SNP结果，没有人

的SNP结果，这是怎么回事，可我看见有的论文做过关于这个基因的SNP啊，这是怎么回事，是不是我就不能做这个基因的SNP了？

还有，我查询另一个基因的SNP人类的有72个结果，我应该确定几个作为我的备选呢，如何确定呢？

谢谢……

作者: 明天的明天 时间: 2011-8-9 16:00

请问一般测序的序列都很准确吗？
我的是1000以内的

作者: 阿拉蕾 时间: 2011-8-9 16:02

你们都叫哪个公司帮你克隆测序的？只提供pcr产物，要求克隆、测序，哪个公司比较好，什么价？

作者: 阿福 时间: 2011-8-9 16:03

你的片断多大
可以在pcr引物内侧1-20bp
在设计一个测序引物，pcr产物回收时
注意丢失的情况，应该可以有改善

作者: HOT兔 时间: 2011-8-9 16:04

请问snp位点找到了，但是在哪儿可以查到内切酶，怎么查
请教，怎么寻找SNP位点，需要做那些工作呢？

作者: 阿拉蕾 时间: 2011-8-9 16:05 标题: 回复 #9 HOT兔的帖子

你可以试试SNPBrowser这个软件。另外，为什么还要用RFLP这么古老的方法呀。你可以考虑试试其他方法，比如飞行时间之谱（MALDI-TOF），snplex等等。不过用什么方法还是主要取决于你的试验目的。

作者: 飞天小鹿 时间: 2011-8-9 16:08

TO：何去何从

不能参照别的物种或人种的snp信息，差别会很大的
你只能去cuturl('www.hapmap.org')去找这个基因chb（中国北京汉族）的 tagsnp
来作为备选

作者: 飞天小鹿 时间: 2011-8-9 16:10

你好。
我上周将PCR的产物纯化以后给生物公司测序，结果他们测出来的序列我到网上比对不是我做的物种，而是我们教研室其他同学做的物种。是不是我在回收的过程中污染了呢，还是提取DNA的时候就污染了呢。
我提取的试剂和实验用的移液器都是自己用的。除了切胶回收的时候大家是一起用的一个板子。
麻烦你帮我分析一下原因，我以为自己测完序就能写论文毕业了，现在出现这种情况，急啊。
在线等答案，谢谢楼主。

作者: 格格巫 时间: 2011-8-9 16:11

请教一下，我现在在做宫颈癌相关基因的SNP，标本是用的是宫颈癌组织，但大部分文献上用的标本是人外周血，想问下，现在SNP使用外周血是基于什么原则，我现在所用标本会不会影响实验结果，对实验合理性有什么影响？谢谢，

作者: 阿拉蕾 时间: 2011-8-9 16:12 标题: 回复 #13 格格巫的帖子

外周血就是人本来有的啊，就是遗传的，但是组织就有可能是局部突变的。也就是后天的因素了。这里有个例子，供你参考：非小细胞肺癌，EGFR等基因在组织中的突变类型跟后期用药的效果是相关的，检测病变组织中EGFR等基因的情况可以指导用药。但是外周血中的SNP等信息可能可以来预测单独个体的肺癌的可能，就是遗传上的倾向。

作者: 大虾米 时间: 2011-8-9 16:13 标题: 回复 #13 格格巫的帖子

要找的snp都可以使用正常组织和血液
没有什么区别的

作者: 假小子 时间: 2011-8-9 16:18

用PCR的方法提取了目的基因，连接到T载体后在大肠杆菌内转化，菌落PCR可以扩增出目的片段，再选择PCR阳性的菌落提取质粒，再进行PCR验证阳性。送去联合基因测序，说杂峰太多，没结果。请各位帮忙分析下，是怎么回事。苦了好几个月了，又是一场空啊。

作者: 阿拉蕾 时间: 2011-8-9 16:19 标题: 回复 #16 假小子的帖子

这关键在于质量提取以后dna德模扳量
不知道你们是否跑电泳或者定过量

作者: 假小子 时间: 2011-8-9 16:20 标题: 回复 #17 阿拉蕾的帖子

你好，每次胶回收后都再跑一次电泳来看看条带亮度的。每次的亮度都还不错的。

作者: 阿拉蕾 时间: 2011-8-9 16:21 标题: 回复 #18 假小子的帖子

那你和他们测序地说
比较亮，建议稀释一下
作测序，还有最好把你测序结果的原始
峰图发上来看看

作者: 橘子水儿 时间: 2011-8-9 16:22

请教楼主，四引物扩增受阻突变体系聚合酶链反应(tet ra2 primer amplification ref ractory mutation system polymerase chain reaction ,tetra-primer ARMS-PCR)检测已知的SNP效果如何？老外承认这种方法吗？谢谢

作者: 葡萄籽 时间: 2011-8-9 16:24

大家好，我也有一个问题，我的目的片段连接到载体上以后拿去测序，测序结果是：我的目的基因在这个载体上，但目的基因前面不是P7.5启动子的序列，多了些未知的序列，这是为什么呢？是不是我对目的片段进行末端平滑化的原因呢？会对以后的同源重组有很大的影响么？

作者: 阿拉蕾 时间: 2011-8-9 16:25 标题: 回复 #21 葡萄籽的帖子

你去载体了吗？
应该是载体序列~~~·

作者: 麻瓜 时间: 2011-8-9 16:26

各位前辈好！我准备做BRCA基因突变的研究，由于两个基因都很大，外显子有40多个，因此直接测序的成本很高，所以想先进行一下筛选再测序。

不知哪种方法比较好？原先考虑DHPLC应当不错，但是好像也要20元/片段，这样也太贵了。请问是不是RT-PCR也可以？价钱也比较便宜么？

小女子实在菜鸟，多谢各位帮忙了！

作者: HOT兔 时间: 2011-8-9 16:27 标题: 回复 #23 麻瓜的帖子

rt-pcr也很贵
以前BRCA1 BRCA2我都测过
中国人里面突变率不高不到5%
如果你要清楚的了解，除了测序没什么好办法
还有就是高频点很少，所以你筛选也很困难
至于技术上现有的筛选还是DHPLC最好~~~~~~·

作者: 天蓝蓝 时间: 2011-8-9 16:28

我大概是想做300例患者，300例对照，2个基因上的5个位点。

请问现在我这样的标本数是不是偏少了？我查了国外文献很多做到了患者和对照各5000，国内很多也是1000-1500

我这样的实验，用什么方法检测比较好呢？我是临床的，实验方面很弱，以前做过realtime pcr和抽RNA和扩增质粒，其他就不知道做了。

像我这种情况，如果是自己动手做，选用什么方法比较好呢？花费大概多少？

如果给公司做，一般用什么方法呢？价格呢？

作者: 天蓝蓝 时间: 2011-8-9 16:29

另外

我看了论坛以前的帖子，意思是化疗不影响SNPs，

所以受过治疗后的肿瘤病人可以抽血检查SNPs，

但是很多文献都是选用的病理诊断明确后，还没有开始化疗的病人的血液标本。。

请问我能否用大部分已经接受过治疗的患者和少数初治患者的标本一起分析SNP，然后做肿瘤易感的分析呢？

作者: 格格巫 时间: 2011-8-9 16:30 标题: 回复 #25 天蓝蓝的帖子

现在有很多种方法可以做snp
比较便宜的是用酶切，但是要位点合适能够刚好设计成为酶切位点检测，另外就是酶也不要太贵，这样的话用该方法很有优势
也可以用realtimePCR,但是探针设计合成比较贵而且周期长
再者就是用测序、质谱仪做了
测序又有不同的方法
呵呵说的有点笼统

作者: @木木@ 时间: 2011-8-9 16:31 标题: 回复 #26 天蓝蓝的帖子

要看什么疾病，你们的分组是不是科学
小样本的我们也得到过好的结果

作者: 小米虫子 时间: 2011-8-9 16:32

你好，请教一个问题：我要做一个基因的一个SNP,这个SNP在多篇文献上报道过的，但是发现在NCBI上没有该SNP，怎么回事？

作者: 王六六 时间: 2011-8-9 16:34

楼主，问个弱智点的问题。
我对PCR片段进行反向测序，得到的结果，位点为T，那我做统计的时候，应该用A还是用T？

作者: 小困 时间: 2011-8-9 16:35

请问大虾，一个笨问题，Pfu P出来的4KB产物，如何克隆测序啊。产物序列未知，如何选载体啊？谢谢

作者: 菠萝菠萝蜜 时间: 2011-8-9 16:36

各位高手帮帮忙，请教一个问题：我想筛查一个基因的SNP位点此基因片段比较大宜采用什么方法啊？谢啦！

作者: 小荷尖尖 时间: 2011-8-9 16:37

各位高手，老板临时布置的任务，而我对此领域还很陌生，小虾米一个，实验有些问题需要向大家请教：

1.前期对癌组织中XXX基因进行测序分析，发现几个有功能意义的突变（多态），其中1例某位点Y在血液和肿瘤组织中基因型不一致，请教此结果如

何理解、分析？是否有意义？

2.实验新发现某位点5'端启动子突变（只有1个样本有突变），对此结果如何理解、分析？

3.上述结果是否需进一步在正常人群中做验证？

4.是否有价值在此基础上进一步开展工作？

还望大家不吝赐教、指导，先谢谢各位高人！

作者: 丸子妹 时间: 2011-8-9 16:38

请教一个问题，我克隆得到一段800多bp片段，连接转化，摇菌，菌液PCR鉴定与目的片段相符，将菌液取出一般送去测序，另一半菌液-80度保存，第一次送菌液的时候测序得到730bp，因为我的片段是800bp，还差70个bp，将另一半菌液送出去测序，结果却得到380bp片段，这么相同菌液两次测到的结果相差这么大？而且怎么每次都跟预期片段相差这么大？

作者: 阿福 时间: 2011-8-9 16:39

各位老师，最近刚接触遗传学，第一个问题是如何找到易感基因，脑子里条理不是很清晰，我把我自己的条理总结了一下，哪位老师，有时间帮我看一看，帮我梳理一下，然后我再逐个技术或者方面开始具体看，要不然脑子一团浆糊，谢谢老师了！！！！

易感基因：（1）已知候选区域：①克隆
②提取DNA———微卫星DNA markers———PCR———测序———Linkage———定位———功能性研究
③提取DNA———SNP———RFLP, OLA, SSCP/ASH, ASPE, SBCE等

（2）未知候选区域：基因芯片大致定位———Linkage———

作者: 小荷尖尖 时间: 2011-8-9 16:40 标题: 回复 #36 阿福的帖子

这个关键的问题不在实验技术而是方法学
疾病遗传常见的2个模型一个是基于家系
的连锁分析，另外一个是基于散发样本的
关联分析，他们都可以是从某个区域开始或者
全基因组，关键的区别在于样本和分析软件
实验技术是根据不同的方案来设计的~~~~~~~~~~~

作者: 阿福 时间: 2011-8-9 16:41

各位老师，请教一个问题，用T7和Sp6对同一质粒测序经常是一个引物的测序结果很好，另外一个就很差甚至就没信号。最近老遇到这个问题。请大家帮我分析一下，谢了先。

作者: 菠萝菠萝蜜 时间: 2011-8-9 16:42

请问重复序列（基因组）做PCR电泳时严重拖尾，怎么解决

作者: 大虾米 时间: 2011-8-9 16:43

求助引物设计软件及使用方法，网上引物设计方法。谢谢！

作者: 飞天小鹿 时间: 2011-8-9 16:44

11个motif组成，每个motif的结构是20bp保守序列+(CA)n，变异类型是一个或几个motif插入或缺失

如何解决电泳拖尾问题

谢谢！

作者: 格格巫 时间: 2011-8-9 16:46

请问各位大虾
1.知道基因和位点，如何查SNP的rs号码？
如知道PDE4D基因83T/C多态性，如何知道它的rs号码？
2.SNP后直接加个数字是什么意思？如PDE4D基因SNP41。知道PDE4D基因SNP41，如何查SNP的rs号码？
***！

作者: 明天的明天 时间: 2011-8-9 16:47

求助!

我做家族遗传病的分子机制，已经知道相关突变位点。计划做真核表达质粒，观察迁移、分化、凋亡、周期等细胞改变，但感觉太没有新意，不知下

边还可以向哪些方向探究。

另外，我的pcr遇到麻烦，目的基因gc比例80%,用了GC Buffer虽然扩出来了，准备先连T载体再设计家酶切位点的引物二次PCR，但测序总是有烦人

的突变，测序也经常是两个方向不能同时测出，片段一个500，一个1500也不大啊。郁闷啊！三个月了载体都没有构建好！！！

作者: 何去何从 时间: 2011-8-9 16:47

我的问题是我做人的MRP2基因C-24T多态性，用的是PCR-RFLP方法分型。采用引物是C24T Fw:5'-CTG TTC CAC TTT CTT TGA TGA-3'。C24T Rev:5'-TCT TGT TGG TGA CCA CCC TAA-3'。内切酶为BbsI，PCR产物长度为210bp。我的问题是不知道酶切反应之后，MRP2-c24t多态性的突变子是能被酶切开还是不能被切开？被切开的片段长度为多少？谢谢！

参考文献为Polymorphism of the ABC transporter genes, MDR1, MRP1 and MRP2/cMOAT, in healthy Japanese subjects.S Ito, I Ieiri, M Tanabe, A Suzuki… - Pharmacogenetics …, 2001。

作者: 葡萄籽 时间: 2011-8-9 16:48

各位高手好！我是一名临床医生，对分子生物学几乎一无所知，目前要做关于基因筛查的课题。看了很多文献，仍然无法确定使用何种方法，请指教！

我研究一种常染色体隐性遗传疾病，国内的基因分析文献报道很少，国外文献较多。目前已定位的致病基因有15个，分布在不同染色体上，总共加起来204个编码外显子。

目前手上的先证者3个，好像都是独生子，临床上已诊断该病，需要对先证者和他们的父母做基因测序，期望找到新的突变。

国外文献上报道的方法很多，早期图位克隆、连锁分析，到现在的SNP探针基因芯片、genome-wide scans（全基因组扫描？），因为对这些方法不了解，对文献的理解也是一知半解，请大家帮忙出主意，谢谢！

作者: 不懂 时间: 2011-8-9 16:50

请教一个问题，我克隆得到一段800多bp片段，连接转化，摇菌，菌液PCR鉴定与目的片段相符，将菌液取出一般送去测序，另一半菌液-80度保存，第一次送菌液的时候测序得到730bp，因为我的片段是800bp，还差70个bp，将另一半菌液送出去测序，结果却得到380bp片段，这么相同菌液两次测到的结果相差这么大？而且怎么每次都跟预期片段相差这么大？

作者: 阿拉蕾 时间: 2011-8-9 16:51 标题: 回复 #47 不懂的帖子

这个我感觉是测序问题
你看看每次测序都能找到完整的载体序列的2端吗

作者: 菠萝菠萝蜜 时间: 2011-8-9 16:51

各位老师，请教一个问题，用T7和Sp6对同一质粒测序经常是一个引物的测序结果很好，另外一个就很差甚至就没信号。最近老遇到这个问题。请大家帮我分析一下，谢了先。

作者: 飞天小鹿 时间: 2011-8-9 16:52

请教一下，用Taqman法检测SNPs后，想送去测序。该怎么做啊？急，请高手指点。谢谢！

作者: 阿拉蕾 时间: 2011-8-9 16:53

QUOTE:

原帖由 飞天小鹿 于 2011-8-9 16:52 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
请教一下，用Taqman法检测SNPs后，想送去测序。该怎么做啊？急，请高手指点。谢谢！

要重新合成引物

作者: 假小子 时间: 2011-8-9 16:53

求助：各位好，我的基因大概1600bp多一点，我用克隆引物扩增，可是一直扩不出来，有仁兄知道什么原因吗？

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