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标题: 引物设计重点考虑因素、设计技巧及引物设计软件推荐 [打印本页]

作者: 嗡嗡 时间: 2011-8-12 10:39 标题: 引物设计重点考虑因素、设计技巧及引物设计软件推荐

引物设计重点考虑因素、设计技巧及引物设计软件推荐【转自丁香园论坛】
我最近合成了几十对引物，，在实战中多多少少有些心得，拿出来给大家分享。我感觉想把引物合成的比较好，除了前引物和后引物的Tm不能相差太大，我们还要重点考虑以下因素：

一、GC% GC含量
对于PCR反应来说GC含量在40%—60%，一般50%左右比较合适；而对于测序引物和杂交探针来说GC含量至少应为50%。产物中GC含量最好大于引物中的GC含量。
二、Degeneracy 多义性
当设计多义引物时应尽量减少引物多义性，这样会带来更好的特异性，应尽量避免3末端的多义性，因为这里即使一个碱基的错配都能阻止引物延伸。
三、3’ End Stability 3 末端稳定性
引物稳定性影响它的错配效率，一条理想的引物应该有一个稳定性较强的5 末端和相对稳定性较弱的3 末端。如果引物3 稳定性强，有可能在即使5 末端不配对的情况下造成错配，形成非特异性扩增条带（secondary bands）。而3 末端稳定性低的引物较好的原因是在引物发生错配时，由于3 末端不太稳定引物结合不稳定而难以延伸。
四、GC Clamp GC钳
引物与目的位点的有效结合需要有稳定的5 末端。这一段有较强稳定性的5 末端称为GC钳。它保证引物与模板的稳定结合。选择有合适稳定性的引物能在确保不产生非特异性条带的前提下尽量降低退火温度。
五、Secondary Structures 二级结构
二级结构是引物设计中必须考虑的一个重要因素。二级结构能显著影响反应中能与模板正确结合的引物数量，发卡结构的存在能限制引物与目的位点的结合能力，从而降低扩增效率，形成发卡环的引物则不能在PCR扩增中发挥作用。
六、Hairpin 发卡结构
发卡结构的形成是由于引物自身的互补碱基分子内配对造成引物折叠形成的二级结构，并由于发卡结构的形成是分子内的反应,仅仅需要三个连续碱基配对就可以形成。发卡结构的稳定性可以用自由能衡量。自由能大小取决于碱基配对释放的能量以及折叠DNA形成发卡环所需要的能量，如果自由能值大于0 则该结构不稳定从而不会干扰反应，如果自由能值小于0 则该结构可以干扰反应。
七、Dimer 二聚体
引物之间的配对区域能形成引物二聚体，它是相同或不同的两条引物之间形成的二级结构。它造成引物二聚体扩增并减少目的扩增产物，二聚体可以在序列相同的两条引物或正反向引物之间形成，如果配对区域在3 末端问题会更为严重，3 末端配对很容易引起引物二聚体扩增。
八、False Priming 错配
如果引物可以结合除目的位点外的其他区域，扩增效率将明显降低目的产物带将减少或出现涂布（smear）。3 末端连续几个碱基配对形成错配的倾向要高于引物上游区域同样数量的碱基配对，在使用引物设计软件时，您可以分别设定确认为错配的3 末端或引物全长形成连续碱基配对的数量。

顺便说一下，如果是新手，刚开始接触引物设计，推荐使用Primer Premier 5.0，因为它界面简单，易学易用；如果你想把引物设计得尽善尽美，公认的首选软件是Oligo，其次我认为是DNAstar。Oligo功能强大，所以使用起来就没有Primer Premier 5.0那么简便。先用Primer Premier 5.0设计，然后把设计好的引物拿到Oligo里去检测这对引物的优劣，我想这对大多数引物设计者是一个不错的选择！

补充一：具体说一下引物中GC含量问题
引物的GC含量一般为40-60%，以45-55％为宜，过高或过低都不利于引发反应。有一些模板本身的GC 含量偏低或偏高，导致引物的GC含量不能在上述范围内，这时应尽量使上下游引物的GC 含量以及Tm 值保持接近（上下游引物的GC含量不能相差太大），以有利于退火温度的选择。如果G-C比例超出，则在引物的5’端增加As或Ts；而如果A-T比例过高，则同样在5’端增加Gs或Cs。但也有认为：原来普遍认为PCR引物应当有50%的GC/AT比率的观点其实是不对的，以人基因组DNA为模板，用81%AT的引物可以产生单一的、专一的、长250 bp，含有70% AT的产物。完全没有必要复杂地去计算产物和引物的解链温度，PCR引物的GC/AT比率应当等于或高于所要放大的模板的GC/AT比。

作者: 嗡嗡 时间: 2011-8-12 10:40

补充二：关于自由能问题（如何根据自由能判断引物质量）
1、ΔG值(自由能)反映了引物与模板结合的强弱程度。一般情况下，引物的ΔG值最好呈正弦曲线形状，即5’端和中间ΔG值较高，而3’端ΔG值相对较低，且不要超过9（ΔG值为负值，这里取绝对值），如此则有利于正确引发反应而可防止错误引发。3′末端双链的ΔG是0～－2 kcal/mol时，PCR产量几乎达到百分之百，随着其绝对值的增加产量逐渐下降，在－6时只有40%、到－8时少于20%、而－10时接近于0。
2、引物二聚体及发夹结构的能量一般不要超过4.5，否则容易产生引物二聚体带而且会降低引物浓度从而导致PCR 正常反应不能进行，与二聚体相关的一个参数是碱基的分布，3’端的连续GGG 或CCC 会导致错误引发。二聚体形成的能值越高越稳定，越不符合要求。与二聚体相同，发夹结构的能值越低越好。虽然有些带有发夹环，其ΔG为－3 kcal/mol的自身互补引物也可以得到不错的结果，但是如果它的3′末端被发夹环占据时就很麻烦，即会引发引物内部的延伸反应，减少了参与正式反应引物的数量。当然，如果发夹环在5′末端对反应就没有多大的影响了。

补充三：关于产物需要测序的PCR引物的设计问题
在DNA测序的PCR中最好用5′末端稳定(如GC含量较多)，而3′末端不太稳定(如AT含量较多)的引物，这种引物的结构可以有效地消除假引发反应。这就是基于引物内部稳定性的经验之谈。其3′末端稳定性低的引物在这些反应中能起好作用的原因在于，接近或在3′末端上的碱基与非靶位点碱基所形成的配对的稳定程度还不足以引发DNA合成，所以不会产生假产物。因此，为了有效地引发反应，引物的5′末端和中央部分必须与靶DNA也形成双链。与此相反，带有稳定的、GC丰富的3′末端的寡核苷酸不需要其所有的核苷酸序列都与靶序列配对，只凭借其3′末端与靶序列任何位点的牢固配合就可以引发反应，产生非专一产物。无论如何，寡核苷酸3′末端最后5个核苷酸的稳定性小于－9 kcal/mol的，通常就是专一性的探针或引物。寡核苷酸3′末端越不稳定，假引发的可能性越低。

以上内容基本涵盖了我设计引物的全部心得和体会，现在全部拿出来给大家分享，希望对大家有所帮助！

作者: 小蜜蜂 时间: 2011-8-12 10:41

谢谢urbest，我想请问
1.设计多重PCR，有什么经验可询吗？
2.在GENEBANK中找到mRNA序列，有CDS，STS分别代表何意？设计引物时要考虑外显子、内含子的位置吗？
谢谢指教！

作者: 花裙子 时间: 2011-8-12 10:42

多谢，我也是刚开始做pcr，到这里来学习，但是在网上下载的软件，按说明安装了之后为什么不能使用呢？

作者: 嗡嗡 时间: 2011-8-12 10:44

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原帖由 花裙子 于 2011-8-12 10:42 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
多谢，我也是刚开始做pcr，到这里来学习，但是在网上下载的软件，按说明安装了之后为什么不能使用呢？

很可能是你下载的软件不行，或者是需要注册，你还没有注册，到网上找个注册机就好了

作者: 嗡嗡 时间: 2011-8-12 10:44

QUOTE:

原帖由 小蜜蜂 于 2011-8-12 10:41 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
谢谢urbest，我想请问
1.设计多重PCR，有什么经验可询吗？
2.在GENEBANK中找到mRNA序列，有CDS，STS分别代表何意？设计引物时要考虑外显子、内含子的位置吗？
谢谢指教！ ...

1、多重PCR，我没设计过，也不敢多说。
2、在GENEBANK中找到的mRNA序列，其中CDS代表翻译成蛋白的序列，STS是序列标签位点。至于设计引物是否要考虑外显子内含子的位置，这要取决于你的试验目的了，看你研究的目的片断是什么。现在世界范围的研究中，研究启动子和外显子的比较多，相对来说研究内含子的要少很多。

作者: 快乐的大脚 时间: 2011-8-12 10:45

谢谢楼主，获益匪浅。我想请问一下楼主，在设计REAL TIME引物时应该注意哪些因素？好象REAL TIME引物与普通跑胶的引物除了扩充长度不一样以外，还要多考虑很多因素。还有用sybr染料和taqman探针检测时，引物设计也不一样。sybr特异性要求更高，有没有什么比较好的软件。

作者: 嗡嗡 时间: 2011-8-12 10:46

QUOTE:

原帖由 快乐的大脚 于 2011-8-12 10:45 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
谢谢楼主，获益匪浅。我想请问一下楼主，在设计REAL TIME引物时应该注意哪些因素？好象REAL TIME引物与普通跑胶的引物除了扩充长度不一样以外，还要多考虑很多因素。还有用sybr染料和taqman探针检测时，引物设计也不一样。sybr ...

比Primer5 还好的生物软件就是oligo了，这两个结合着使用应该没有什么大问题的，你问的问题在软件的说明书里面都有提到的，你可以下个说明书自己看一下。

作者: 我是一片云 时间: 2011-8-12 10:47

学习了,谢谢
olige设计引物好象要注册,请问有没有***版啊?

作者: 饭团团 时间: 2011-8-12 10:48

正在读primer premier 的 primer design guideline cuturl('http://www.premierbiosoft.com/tech_notes/PCR_Primer_Design.html')
结合你文中所提问些问题：

1。Guideline里说“Primers with melting temperatures above 65oC have a tendency for secondary annealing.” 这个“secondary annealing”如何理解？
2。GC Clamp和3端稳定性：可以这样简单理解吗：5端要GC多，3端要GC少。 Guideline里讲3端最后5个碱基里要避免3个G或3个C。但是对5端没有谈。
3。发卡结构：Guideline里说Optimally a 3' end hairpin with a ΔG of -2 kcal/mol and an internal hairpin with a ΔG of -3 kcal/mol is tolerated generally。其实第一还是G/C在3端的比例问题，第二是G/C配对问题。

作者: 阿拉蕾 时间: 2011-8-12 10:49

urbest总结的不错！
Degeneracy 多译为“兼并性”

补充几点：
1、除了上面的因素还要考虑产物的自由能或待扩区域的自由能，通过引物退火温度同产物退火温度的差值来衡量，20度左右就可以。
2、要保证足够的长度，这是引物设计的首要原则，只有足够长度才能保证引物的特异性，25个左右。可以blast检验引物的特异性。
3、多重引物的设计关键是两点：1、引物间尽量无聚体形成，特别是头部。2、引物间长度不能相差太大，但应能分开在跑胶时，100－200bp左右。才能保证扩增效率的接近。

作者: 阿福 时间: 2011-8-12 10:50

我感觉Primer Premier 5.0这个软件设计的引物一般,OLIGA没用过,不敢妄下评论,推荐大家使用在线的引物设计网站,prime 3,这个里面设计的不错，我做realtime引物设计的时候用Primer Premier 5.0设计了好几对都不能用(有杂带,可能是我RNA里面有基因组的污染),用prime 3设计了一对却很好，至少是没有杂带,一家之言~~

作者: 嗡嗡 时间: 2011-8-12 10:51

用primer5设计出来的引物（必要时更改个别碱基）对于常规PCR一般是没有问题的，我和我舍友做常规PCR的时候，都是用Primer5设计的，跑出来的条带都很漂亮，并且没有杂带。目前为止，我还没有跑过很很复杂的PCR，所以如果PCR对引物要求很高的话，Primer5的设计是不是合适，我真不敢说了。但我想，根据最基本的原理，我们尽量多考虑几个方面，设计起来问题应该也不大。

顺便说一下，我认为减少错配最简单有效的办法就是把引物长度适当延长，当然不能过长，呵呵。

作者: 米米 时间: 2011-8-12 10:52

请问楼主我要设计基因芯片的探针〔60bp左右〕，那种免费的软件会比较好呢？请楼主多多指教！

作者: 不懂 时间: 2011-8-12 10:54

刚上来引物设计的关键是不是把软件摸清楚？

作者: 大虾米 时间: 2011-8-12 10:56

再请教楼主一个弱智问题，在OLIGO6中，进行错误效率分析，如下图所示，哪个数值表示正确引发效率，哪个数值表示错误引发效率啊？

图片附件: 1.jpg (2011-8-12 10:56, 67.77 KB) / 该附件被下载次数 26
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=8232

作者: 天蓝蓝 时间: 2011-8-12 10:57

请问楼主，我的引物进行BLAST之后，发现跟很多序列的query coverage都是100%，当然这里面也有我的目的基因，这个对我的PCR产物影响大吗？
将引物跟我的目的基因序列比对之后，有一些错配，就是我的引物长度是16个碱基，产物长度是367个碱基，然后错配最高的有8个碱基，而且两个引物的3末端都有错配，但用OLIGO分析引物的其他条件都很好。这个引物可以用吗？

作者: 葡萄籽 时间: 2011-8-12 11:03

请问LZ，ΔG高低是怎么定义的？我的意思是假如ΔG有三个数值：-8，-7，-6，这个三个数值里面，ΔG最高的是-8吗？谢谢！

作者: 假小子 时间: 2011-8-12 11:04

新手设计引物，发现高Range的文献报道的引物，很多都不符合我们所说的引物设计原则。。。现在是有关的引物设计的看得越来越多越来越糊涂了。。。

作者: 假小子 时间: 2011-8-12 11:05

你好：
我想请问一下，引物和产物之间的Tm差值有什么要求吗？我从书上看到说不能相差20度。可我用Primer Premier设计出来的引物，上下游之间Tm差值很小，但引物和产物之间相差30多度，我设计的好几个基因的引物全都这样，这是怎么回事？怎么解决呢？
我做的是qPCR,只想看一下基因表达的变化。

作者: 麻瓜 时间: 2011-8-12 11:06

我觉得引物设计后面的选择固然重要，但是谈的人已经很多了，感觉不用再做重复介绍了。关键是前面碱基序列该如何选择？难道把CDS里的全部搞进去嘛？那要是一个基因两个SNP位点的话，要扩增两个片段，都用这个序列的话，那出来的两对引物还不是一样的了？这肯定不对的呀

作者: 竹蜻蜓 时间: 2011-8-12 11:07

根据我的个人经验来看，影响引物能不能用的最大问题是错配问题，建议楼上的朋友将引物BLAST一下。

常规PCR的话，没有错配，一般都是没问题的。

当然，如果对引物要求高的话，就多考虑一些因素好了。

作者: 蒲公英 时间: 2011-8-12 11:07

楼主你好，我用P5设计出来引物后，用Oligo 检测，最后得出的结果是Excessive difference between product and primer melting temperatures.
请问这个影响大吗？我可以用这对引物吗？

作者: @木木@ 时间: 2011-8-12 11:08

非常好，支持！可以帮助理解很多概念问题。
但是，有一点情况没理解，“3′末端双链的ΔG是0～－2 kcal/mol时，PCR产量几乎达到百分之百，随着其绝对值的增加产量逐渐下降，在－6时只有40%、到－8时少于20%、而－10时接近于0。”
双链的ΔG是指引物和模板链？怎么看的呢？谢谢！

作者: 嗡嗡 时间: 2011-8-12 11:09

QUOTE:

原帖由 @木木@ 于 2011-8-12 11:08 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
非常好，支持！可以帮助理解很多概念问题。
但是，有一点情况没理解，“3′末端双链的ΔG是0～－2 kcal/mol时，PCR产量几乎达到百分之百，随着其绝对值的增加产量逐渐下降，在－6时只有40%、到－8时少于20%、而－10时接近于0。”
双链的ΔG是 ...

你好，关于你提到的这个问题我现在已经印象模糊了，说实话我现在很少用primer5或者oligo设计引物了，推荐你使用楼上说的软件（其实是一个在线的网站，效果很好），或者使用再上面一点我提到的NCBI里面那个引物设计的程序。因为我觉得这两个地址真的是很不错。

如果真的还搞不定你的问题，我们再讨论ΔG的问题。

作者: 蓝蜗牛 时间: 2011-8-12 11:10

我用Primer Premier 5.0设计的引物在NCBI上用BLAST没找到我做得基因，这引物能用吗？

作者: 嗡嗡 时间: 2011-8-12 11:11

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原帖由 蓝蜗牛 于 2011-8-12 11:10 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
我用Primer Premier 5.0设计的引物在NCBI上用BLAST没找到我做得基因，这引物能用吗？

鉴于你说的问题，给你推荐一个简单实用的引物设计网址，cuturl('http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/index.cgi?LINK_LOC=BlastHomeAd')

该网站整合了引物设计和序列比对。但愿对你有帮助。

作者: 大仙 时间: 2011-8-12 11:13

请教LZ一个问题！
我将做的的是rt-pcr，在设计引物遇到想不通的地方：师兄做的是检测细胞中IL10的表达，通过genebank查找到mRNA其cds，用primer5设计好引物，扩增序列为173bp:而我做的是从细胞中通过rt-pcr扩增后，胶回收转染腺病毒。
1，问题是我能否用他设计的引物？用的话，问题是他做的扩增后只是一段DNA（才173BP），只是检测表达水平！而我做转染要求的是IL10基因的完整cDNA序列？
2，以上实验引物设计的有没区别，各自设计的不同在哪？应该根据什么来设计？（不是问引物设计后检测的11法则）

大家见笑了，实在是不懂！郁闷中！！！不懂就问！先谢谢大家了！

作者: 小米虫子 时间: 2011-8-12 11:14

楼主，你好，我想设计微卫星引物，多重PCR。不知道可以用什么软件来设计引物？

作者: 橘子水儿 时间: 2011-8-12 11:15

谢谢搂主的好贴，能否帮忙设计一下实时定量PCR引物和探针啊。序列在附件里。下面是我自己用Primerexpress 设计的，不知道有没有错！扩了两次没有结果。
Name: LFA-IgG.txt-542F
Sequence: GCGTGGAGGTGCATAATGC

Name: LFA-IgG.txt-607R
Sequence: CCACACGGTACGTGCTGTTG

and the TaqMan probe:

Name: LFA-IgG.txt-565T
Sequence: ACAAAGCCGCGGGAGGAGCAG（G含量比C多，故用互补链）
5’JOE-CTGCTCCTCCCGCGGCTTTGT-3’TAMRA

作者: 爱哭鬼 时间: 2011-8-12 11:18

楼主你好，我做的是RAPD－SCAR，先把RAPD扩出的特异条带胶回收，测序后，根据测序结果重新设计相对稳定的双引物（与RAPD引物比），可我用primer5.0设计的3对引物都没有扩出预期结果，RAPD扩时只有特异条带出现，可SCAR引物扩时却不是这个结果，请各位大侠指点，谢谢了！

作者: 冰激凌小姐 时间: 2011-8-12 11:19

楼主，设计真核表达的序列引物需要考虑什么东东？

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