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标题: 【求助】荧光定量Ct值大于33就没有意义？ [打印本页]

作者: 黄花菜 时间: 2015-7-1 22:01 标题: 【求助】荧光定量Ct值大于33就没有意义？

据roche一位工程师说样品扩增Ct值超过33个cycle就没有意义（没有意义具体是什么概念也不明白）了，定量标准品最低浓度的也要Ct在33以上，请问大侠是否有道理？为什么？有公式可以推导么？好像很多临床样本定量结果Ct都在33以上。

作者: ha111 时间: 2015-7-1 22:01

不是33吧？

是37吧？

作者: xuuuu 时间: 2015-7-1 22:02

假如PCR的循环数是40个左右的话,CT值在33 (也就是10的三次方左右),这样低的拷贝数就很难确定是标本本身的CT或是由于污染引起的CT值(大家都知道PCR灵敏度很高,稍有点污染就扩增出来),为此,很多临床样本定量结果Ct都在33,即10的三次方,低于次则不报.

作者: zhezhe 时间: 2015-7-1 22:02

应该是37以上。

作者: jrwyyplt 时间: 2015-7-1 22:02

一般来讲，目前市面上的试剂盒都是以37为界，，对于可以定量的试剂盒来讲，如果试剂盒的灵敏度可以达到1个或10个，那么37以后为阴性，对于定性的试剂盒，由于样品的原因无法定量，所以以33为界，就是如maxlu 所说的，10的三次方,低于次医院的检测结果则不报.

作者: dotaaa 时间: 2015-7-1 22:02

我想请教大家一个问题：我在跑pcr的时候同样的条件下跑不出来内参，只能跑出目的基因，请问我是否可以分开设置延伸温度而用相同的循环数，这样是否就不怎么影响实验结果？谢谢各位了！！

作者: dotaaa 时间: 2015-7-1 22:03

补充一下我做的sybr green real time pcr，我目的基因引物Tm值分别为58.69和61.29，内参引物Tm值分别为62.04和62.41。我以前的pcr延伸条件是60度20秒。再次谢谢大家！

作者: 黄花菜 时间: 2015-7-1 22:03

可以将延伸温度改为61度1分钟试试。

作者: tianmei001 时间: 2015-7-1 22:04

可以用两步法，90度15秒，61度30秒，试一试吧！

作者: yapuyapu 时间: 2015-7-1 22:04

天啊！老板要我做单个细胞的real-time PCR。也就是说起始模板只有两个拷贝的啊！可以做的出吗？

作者: 大脑门儿儿 时间: 2015-7-1 22:04

这可不一定，我看过一篇国外的文献，很有名的杂志，有做到60cycles的。科研和临床检测不一样，具体问题具体分析。

作者: pencil菲 时间: 2015-7-1 22:05

60 cycles 一般要TaqMan才行，如果你用SYBR green，超过33-35cycle以后就有大量的non-specific扩增。还要看你是用的什么仪器和什么反应。

作者: BUK 时间: 2015-7-1 22:05

eal time PCR 的实验结果严格分析，也要经过统计学分析验证，比如实验精密度，标准品的准确度，及特异性和灵敏度等。关于CT值是37还是33有效，是有来于本身的实验检测内容。如你是使用成型的定量试剂盒，可以参考其说明书。我这里手上有个CT值临界值的产考文献，相信对大家有所帮助。

作者: is2011 时间: 2015-7-1 22:05

个人认为只要是在标准曲线范围之内就是可信的。
当然还必须要有阴性对照，阴性对照部更有扩增，否则会很难判断是不是污染

作者: summerxx 时间: 2015-7-1 22:06

也有公司说要小于30才好，其实做实验分析，30-35也可做参考，可能不太稳定，但确实是有。

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