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标题: 【讨论帖】大家来跟贴说说自己内参基因不稳定的情况吧！ [打印本页]

作者: 园丁## 时间: 2015-7-1 22:13 标题: 【讨论帖】大家来跟贴说说自己内参基因不稳定的情况吧！

看到有些站友问到过内参基因，给大家一些参考:
在人中一些内参基因会受哪些因素影响：
还有一张图是BETA 2M在不同组织及细胞系的表达水平
另外这个链接是今年一篇关于miRNA内参基因的文章，也很有意思，里面认为U6不可靠．
cuturl('http://rnajournal.cshlp.org/content/14/5/844.full.pdf+html')
注明一下，２张图抄袭自一家定量公司的讲座资料
（点击放大会清楚一些）

图片附件: 16821902.jpg (2015-7-1 22:13, 68.24 KB) / 该附件被下载次数 11
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=34298

作者: 园丁## 时间: 2015-7-1 22:14

beta 2m在不同组织与细胞系的表达波动
斑竹给俺加分吧:）

图片附件: 30333801.jpg (2015-7-1 22:14, 60.65 KB) / 该附件被下载次数 11
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=34299

作者: 园丁## 时间: 2015-7-1 22:14

大家来跟贴说说自己内参基因有没有遇到类似情况吧
有了大家的前车之鉴，后来者可以少走好多弯路啊！
希望注明选择的内参基因，实验处理条件，样品（细胞系或组织），否则没有借鉴价值了

作者: shanzhapia696 时间: 2015-7-1 22:15

内参有听说过PBGD么？
呵呵

作者: 园丁## 时间: 2015-7-1 22:15

QUOTE:

原帖由 kent 于 2015-7-1 22:14 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

强烈支持！如果有关于植物的内参基因就更好。我是做植物抗盐基因表达的相关研究，常选择的内参有28S，18S，actin-2, tubulin 等。

这就是这个帖存在的意义啦！大家支持啊，虽然几位斑竹为这个帖给俺加分投票（在这里谢了先！），不过大家贡献自己的经验才是正道，助人也是自助

作者: 园丁## 时间: 2015-7-1 22:15

QUOTE:

原帖由 shanzhapia696 于 2015-7-1 22:15 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

内参有听说过PBGD么？
呵呵

有的,据说低表达.卟胆原脱氨基酶（ Porphobilino gendeaminase简称PBGD）胆色素原脱氨酶？
提到表达水平,看到一个公司推荐内参基因和靶基因的表达水平尽可能相同。我个人觉得不是非常必要，不过如果做双色（比如fam靶基因，hex内参基因）时，2个基因表达水平尽可能接近还是有必要的，否则高表达的会抑制低表达pcr反应。
做相对定量没特殊情况还是别做双色。自找麻烦

作者: 555444 时间: 2015-7-1 22:16

我做的是一种经济作物，可是NCBI上登录的一些常见的内参基因都没有，只有α-tubulin，还有几个核糖体RNA的序列。觉得也没什么好选择的了。虽然我也知道内参并不一定就是恒定不变，但是也没办法了。

作者: 园丁## 时间: 2015-7-1 22:16

QUOTE:

原帖由 shanzhapia696 于 2015-7-1 22:15 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

内参有听说过PBGD么？
呵呵

正在等待实验结果中，从别人给的资料看到pbgd，直接抓出来共享

图片附件: 88720159.snap.jpg (2015-7-1 22:16, 53.43 KB) / 该附件被下载次数 9
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=34300

作者: any333 时间: 2015-7-1 22:17

其实很多研究者不管三七二十一，就RT-PCR了。
殊不知，他们得到的均一条带，一半以上来自于基因组和/或假基因。
其实RNA应该DNase消化干净基因组!再RT-PCR。

作者: 园丁## 时间: 2015-7-1 22:17

cuturl('http://www.chinabaike.com/article/316/327/2007/2007022047279.html')
假基因
与有功能的在顺序的组成上非常相似，却不具正常功能的基因。假基因是相应的正常基因在的不同位置上的复制品，由于突变积累的结果而丧失活性。假基因都是在的基因组中发现的，在中未见报道。
假基因的发现是在真核生物的研究中应用和技术而取得的成果第一个假基因是1977年在研究非洲爪蟾核糖体 5SRNA的基因时发现的。以后又发现编码蛋白质的结构基因也有相应的假基因，如小鼠、兔和人的或β珠蛋白的假基因等。大部分假基因在染色体上都位于正常基因的附近，但也有位置在不同的染色体上的。假基因和正常基因的结构上的差异包括在不同部位上的程度不等的缺失或插入、在内含子和外显子（见）邻接区中的顺序变化、在 5＇端启动区域的缺陷等。这些变化往往使假基因不能转录并形成正常的(mRNA)从而不能表达。
有一类假基因除了一般的特征之外，还有一些其他的特征暗示着它们的形成与mRNA有关：①在假基因中完全缺少在相应的正常基因中存在的内含子顺序；②在假基因的3＇末端有一段连贯的脱氧腺嘌呤核苷酸;③有些假基因与相应的正常基因在顺序组成上的相似性只限于相应的mRNA的3＇末端之前的部分所有这些特征都酷似具有内含子的正常基因的转录产物经加工后形成的mRNA。据此推测这种假基因的 DNA顺序可能不是来自正常基因的直接复制品，而是以mRNA为中介的正常基因的间接复制品，所以又称为加工基因。例如编码人的免疫球蛋白的轻链、β微管蛋白、小鼠的珠蛋白以及大鼠的微管蛋白基因的假基因都是加工基因。加工基因可能是在真核生物细胞中的mRNA先经反向转录形成 DNA，再整合到染色体上而形成的。已知致癌的 RNA病毒具备这种机制（见），然而加工基因形成的真正机制仍然是一个正在研究中的课题。　　

作者: dmg 时间: 2015-7-1 22:18

其实很多研究者不管三七二十一，就RT-PCR了。
殊不知，他们得到的均一条带，一半以上来自于基因组和/或假基因。
其实RNA应该DNase消化干净基因组!再RT-PCR。

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常规的TRIZol试剂抽提RNA，已经足以消除DNA的混入了，不需要再使用DNase来处理，其实最简单衡量自己抽提的RNA里面是不是含有基因组DNA的方法就是专门设计一对看家基因引物，该对引物正向和反向序列分别位于该看家基因的两个不同外显子上面，而中间待扩增的区域被内含子隔开，这样使用常规的PCR验证下自己反转的产物，看大小就知道自己的样品中混有的衡量的DNA是不是会干扰后续的实验咯。很多人习惯抽提的RNA用DNase消化处理，其实这一步大可不必。不过，要知道自己引物扩增的到底是不是目的基因，测序才是最好的方法咯。

作者: dmg 时间: 2015-7-1 22:18

至于单个内参基因到底适不适合用来做qPCR的比对标准，我觉得要分开对待。如果你的一批样品本身生长差异不大，而且未受到外界的胁迫作用，那么我认为使用单个内参基因的结果是可信，比如actin、GAPDH之类的，大胆使用就是了。但是，如果在你待研究的这批样品里面，本身就是处在不同生长时期或是受到外界不同时间段的胁迫处理，我的观点是，如果你选择单个内参基因来作为比对标准，你一定要提交绝对定量的结果验证你的这个内参基因确实表达不变，否则可能你的实验结果是假的（当然不是说你人为造假）。其实有很多时候，我们是无法找到绝对表达不变的单个基因用来作为比对的标准的，这个时候，多参照基因的选择就是绝对必须的了。可惜，很少在园子里看到这方面的讨论，抑或是目前好点杂志的审稿人都还未认识到这个问题的严重性吧。其实这个问题在2002年就有人提出了，他们把这方面的工作做得非常出色了，给大家参考两篇相关的文献：
1、Accurate normalization of real-time quantitative RT-PCR data by geometric averaging of multiple internal control genes. Genome Biology.
2、qBase relative quantification framework and software for management and automated analysis of real-time quantitative PCR data. Genome Biology.
特别是第一篇，我认为基本上在很多年内都可以成为qPCR的最权威的选择标准了。

作者: bring 时间: 2015-7-1 22:18

常规的TRIZol试剂抽提RNA，已经足以消除DNA的混入了，不需要再使用DNase来处理，其实最简单衡量自己抽提的RNA里面是不是含有基因组DNA的方法就是专门设计一对看家基因引物，该对引物正向和反向序列分别位于该看家基因的两个不同外显子上面，而中间待扩增的区域被内含子隔开，这样使用常规的PCR验证下自己反转的产物，看大小就知道自己的样品中混有的衡量的DNA是不是会干扰后续的实验咯。很多人习惯抽提的RNA用DNase消化处理，其实这一步大可不必。不过，要知道自己引物扩增的到底是不是目的基因，测序才是最好的方法咯。

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"常规的TRIZol试剂抽提RNA，已经足以消除DNA的混入了，不需要再使用DNase来处理" 不知道你提取RNA后是否进行过检测，如果没有的话，就不要轻易下结论，免得误导大家。
我们的经验是无论你用多么高级的TRIzol，总会有DNA的残留，需要DNase处理！！！

作者: H2O 时间: 2015-7-1 22:19

"常规的TRIZol试剂抽提RNA，已经足以消除DNA的混入了，不需要再使用DNase来处理" 不知道你提取RNA后是否进行过检测，如果没有的话，就不要轻易下结论，免得误导大家。
我们的经验是无论你用多么高级的TRIzol，总会有DNA的残留，需要DNase处理！！！

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抽提手法和技术不过关，用得着在这里探讨吗。

作者: zhezhe 时间: 2015-7-1 22:19

我在实验中很少确信我的材料用Trizol提取的RNA没有DNA的残留，我一定会用DNase处理的。此外要想真的确保没有基因组残留就要在有内含子的基因两侧设计引物，PCR看条带或者qPCR溶解峰是否单一。
如果做绝对定量还是要现做这个实验检测自己的样本的。否则对于表达量很低的基因怎么确定是基因组来源还是你的RNA呢？

作者: zhezhe 时间: 2015-7-1 22:20

QUOTE:

原帖由 bring 于 2015-7-1 22:18 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
常规的TRIZol试剂抽提RNA，已经足以消除DNA的混入了，不需要再使用DNase来处理，其实最简单衡量自己抽提的RNA里面是不是含有基因组DNA的方法就是专门设计一对看家基因引物，该对引物正向和反向序列分别位于该看家基因的两个 ...

很遗憾，即使象Ambion这样专门的RNA公司都认为
“All RNA Isolation Methods Yield RNA Containing Residual Genomic DNA.
Ambion has found that no RNA isolation method consistently produces RNA free of residual genomic DNA.”
详见cuturl('http://www.ambion.com/techlib/tn/95/9513.html')
确实设计跨内含子的引物是一个很好的办法，但是所跨的内含子要比较长才行，否则不能作Realtime定量，因为基因组污染所导致的长片段同样会影响定量的值。
有人认为rRNA作为内参基因还不错，包括作miRNA时候用的5S，普通RT用的18S，28S。缺点就是丰度比较高

作者: yayya 时间: 2015-7-1 22:20

QUOTE:

原帖由 zhezhe 于 2015-7-1 22:19 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

我在实验中很少确信我的材料用Trizol提取的RNA没有DNA的残留，我一定会用DNase处理的。此外要想真的确保没有基因组残留就要在有内含子的基因两侧设计引物，PCR看条带或者qPCR溶解峰是否单一。
如果做绝对定量还是要现做 ...

对，任何好的TRizol或是protocol都无法保证消除RNA抽提所含有的痕量的DNA污染，关键之处就在于这种痕量的DNA污染是不是会影响到后续的实验。设计一对看家基因，引物本身位于两个不同的外显子上未被内含子隔开，但是扩增区域被内含子隔开（最好相隔100bp-200bp），这样一对看家基因的引物就是mRNA和基因组都可以通用的引物，只不过扩增大小不一样，反转后的产物拿这对引物去扩增或是做溶解曲线，如果只有一条带或是单峰，则说明痕量的DNA污染根本就不是你考虑的重点：因为它根本就未影响到你后续的实验。但是如果出现双带或是双峰，那就说明你必须要用DNase去消化你的样品了，不过在我抽提过的几百份植物各个部位的RNA材料里面，只要抽提手法过关，是根本不需要用DNase消化这个步骤的，如果你技术不过关，乖乖的用DNase来处理。要不要选择DNase，完全取决于个人的技术和手法，而与TRizol无关，所以针对到底用不用DNase的讨论其实是非常无聊的东西，呵呵！见仁见智吧。

作者: gogo 时间: 2015-7-1 22:21

对于不同的发育期可能内参基因的表达也有不同吧，建议做试验前先做个预试验，看看到底哪个基因更适合做为内参。
如【Differential antimicrobial peptide gene expression patterns during early
chicken embryological development】cuturl('http://www.sciencedirect.com/science?_ob=ArticleURL&_udi=B6T5X-4TWSRP3-2&_user=1154139&_rdoc=1&_fmt=&_orig=search&_sort=d&view=c&_acct=C000051814&_version=1&_urlVersion=0&_userid=1154139&md5=c58071213f00c136c3c99b8c0edd1337')
文献中认为Ribosomal Protein L7 (RPL7) 在鸡胚胎发育过程中表达比ACTB, GAPDH, 28S, 和LDHA稳定。

作者: 911 时间: 2015-7-1 22:21

既然“任何好的TRizol或是protocol都无法保证消除RNA抽提所含有的痕量的DNA污染”，那么为什么要投入精力物力去证明它是否影响后续实验？仅仅为了证明那么点DNA是否影响后续实验就去设计引物再反转录再去扩增或是做溶解曲线，实在是浪费啊，哪有那么多时间和财力什么的，DNase处理也就40分钟的事情，花费也不多。
做实验前充分查阅文献，了解相关研究中使用的内参情况，结合自己或者师兄师姐（多咨询一下就好）的经验来做。再就做好预实验，选好了内参。我们一直都是用GAPDH的，做RT-PCR 时都设置复孔，从结果中就能了解到你加样的准确性，取平均值来分析结果，反正都是计算机自动处理，相对来说结果的可信度就高一点。

作者: 911 时间: 2015-7-1 22:21

QUOTE:

原帖由 yayya 于 2015-7-1 22:20 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

对，任何好的TRizol或是protocol都无法保证消除RNA抽提所含有的痕量的DNA污染，关键之处就在于这种痕量的DNA污染是不是会影响到后续的实验。设计一对看家基因，引物本身位于两个不同的外显子上未被内含子隔开，但是扩增区域 ...

师兄是生科院的吧？
我的感觉若是有money的话还是买qgien的盒子就可以，什么问题就解决了。
其实就是用trizol提取很难保证没有点点的DNA污染的，不过我在验证这点DNA的影响的时候我是倍比稀释的, 所有内参和目的基因在5%variance内并且溶解曲线也不错，我就认为没有影响。结果的重复性很好。
再逆转以前步骤越多耗时越长，后面的结果越不好说------

作者: +田田+ 时间: 2015-7-1 22:22

相关疾病：
头痛
顺便请教大家，我在用DNase（promega产品DNaseI）消化RNA中的DNA时，有时即使过夜也无法消化DNA，有时消化会把DNA，RNA全部消化掉，电泳看不到条带，一直很困惑不知道是什么原因？我提RNA较多了，不是新手，现在倾向 havocking 兄所说的，尽量在提取手法上多注意，pcr检测RNA看是否有污染我才进行后续的工作，但在处理污染的DNA上一直令我头痛。各位不知道有什么好经验没有。

作者: +田田+ 时间: 2015-7-1 22:22

常规的TRIZol试剂抽提RNA，已经足以消除DNA的混入了，不需要再使用DNase来处理，其实最简单衡量自己抽提的RNA里面是不是含有基因组DNA的方法就是专门设计一对看家基因引物，该对引物正向和反向序列分别位于该看家基因的两个不同外显子上面，而中间待扩增的区域被内含子隔开，这样使用常规的PCR验证下自己反转的产物，看大小就知道自己的样品中混有的衡量的DNA是不是会干扰后续的实验咯。很多人习惯抽提的RNA用DNase消化处理，其实这一步大可不必。不过，要知道自己引物扩增的到底是不是目的基因，测序才是最好的方法咯。

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所言及是。通过因物完全可以解决这个问题

作者: +田田+ 时间: 2015-7-1 22:22

QUOTE:

原帖由 +田田+ 于 2015-7-1 22:22 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

相关疾病：
头痛
顺便请教大家，我在用DNase（promega产品DNaseI）消化RNA中的DNA时，有时即使过夜也无法消化DNA，有时消化会把DNA，RNA全部消化掉，电泳看不到条带，一直很困惑不知道是什么原因？我提RNA较多了，不是新手，现在倾向 havock ...

这根本不是问题，把你的基因和primer 给我，我给你看看

作者: DDD 时间: 2015-7-1 22:22

最近看的一片文章
cuturl('http://www.springerlink.com/content/p20k12vm054326ur/')
有关管家基因在不同处理条件下的水平变化
影响因子不太高，但也能说明一些问题了

作者: vtongli 时间: 2015-7-1 22:23

最近遇到这样一个现象，将某蛋白的表达载体转染入293T细胞后，想通过qRTPCR看看该蛋白对某microRNA的量的影响。结果，做出的结果是：microRNA的Ct值组间未有明显差异，作为内参的U6的Ct值却明显降低（转染了目的蛋白的组）。
难道U6真的也不可靠？

作者: xue258 时间: 2015-7-1 22:23

关于DNA污染，我在国外的实验室，这里罗嗦两句
先简单介绍下老外的做法
用TRIZOl提RNA，然后用QIAGEN的minieasy 盒子纯化，加上QIAGEN的DNase盒子消化。测OD值，经过TRIZOl提取后比值1.9，经过上述折腾后比值一般不超过1.7。经过这样的提法，大概国内没几个实验室消费的起。
qiagen的说明书上写，一般按照他们的程序提可以去掉大多数DNA。我开始按老外的做，后来实在受不了，有一段时间我每天60个样本的RNA，怎么可能这样做？
于是我按照Qiagen说明书做，没有做DNase消化，但我做real time的时候通常加一个样品，这个样品里面是不加逆转录酶的。经过比较，扩增后基因组dna的影响小于0.5％。
因此我觉得用试剂盒提，然后注意操作是可以不用DNase消化的
另外，建议一下，如果你实在不放心，可以用qiagen的plus的盒子，这个盒子里面多一个柱子，可以高盐去除dna，仅仅多一步15秒的离心而已。

作者: 蒲公英 时间: 2015-7-1 22:24

关于DNA污染，我在国外的实验室，这里罗嗦两句
先简单介绍下老外的做法
用TRIZOl提RNA，然后用QIAGEN的minieasy 盒子纯化，加上QIAGEN的DNase盒子消化。测OD值，经过TRIZOl提取后比值1.9，经过上述折腾后比值一般不超过1.7。经过这样的提法，大概国内没几个实验室消费的起。
qiagen的说明书上写，一般按照他们的程序提可以去掉大多数DNA。我开始按老外的做，后来实在受不了，有一段时间我每天60个样本的RNA，怎么可能这样做？
于是我按照Qiagen说明书做，没有做DNase消化，但我做real time的时候通常加一个样品，这个样品里面是不加逆转录酶的。经过比较，扩增后基因组dna的影响小于0.5％。
因此我觉得用试剂盒提，然后注意操作是可以不用DNase消化的
另外，建议一下，如果你实在不放心，可以用qiagen的plus的盒子，这个盒子里面多一个柱子，可以高盐去除dna，仅仅多一步15秒的离心而已。
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我是用invetrogen的Trisol，没用试剂盒。但因为提的组织很微量，怕DNA酶消化过了反倒不好。听说用注射器针头反复吹吸也可以将DNA弄断，但从没试过。

作者: chengjie79 时间: 2015-7-1 22:24

我想请问下L19做qPCR的内参是什么原理啊？

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