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标题: 【求助】荧光定量PCR的CT值太高 [打印本页]

作者: 铜雀 时间: 2015-7-3 11:08 标题: 【求助】荧光定量PCR的CT值太高

小弟最近在做荧光定量PCR，发现无论是actin还是目的基因的CT值都很高（30多），目的基因30多也就罢了，actin不会这么高啊！我先后做过以下调整：
1、增加模板浓度，稀释10倍、5倍、2倍，不稀释的都试过，没有什么质的变化
2、增加引物浓度，做了一个梯度，发现变化也不大
3、怀疑是逆转录试剂盒不行，换了另一个进口试剂盒（promega）还是老样子
4、重新测了一下提取的RNA，浓度和纯度都可以（A260/280=1.9左右
5、引物blast了，很好。溶解曲线也是单峰，Tm在90左右。
6、操作应该不会有什么大的失误
现在实在不知道哪里出了问题。。。。求各位高手帮我想想是哪里出了问题
我的体系如下：10ul 染料（Go Taq Mix，promage公司）、2ul cDNA（不稀释）、上下游引物各0.4ul、补水至20ul

作者: 铜雀 时间: 2015-7-3 11:09

发现一个问题，溶解曲线虽然是单峰，但是纵坐标的Rn的值很高，别人的都是小于0.1，我的1-5. 是不是这个原因啊？

作者: langlang 时间: 2015-7-3 11:09

你actin的产物预计是多少bp？跑过胶看看没？
建议换一对引物。

作者: 铜雀 时间: 2015-7-3 11:09

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你actin的产物预计是多少bp？跑过胶看看没？
建议换一对引物。

好像是200 bp左右，没有跑过胶，我试试看吧

作者: shkudo 时间: 2015-7-3 11:10

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好像是200 bp左右，没有跑过胶，我试试看吧

200bp对于Real-time PCR太大了，一般来说是几十个bp最合适。个人认为还是引物的问题。
另外不排除RNA提取过程和逆转录过程中DNA的污染，建议先用DNAse处理后再进行逆转录。

作者: daod 时间: 2015-7-3 11:10

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小弟最近在做荧光定量PCR，发现无论是actin还是目的基因的CT值都很高（30多），目的基因30多也就罢了，actin不会这么高啊！我先后做过以下调整：
1、增加模板浓度，稀释10倍、5倍、2倍，不稀释的都试过，没有什么质的变化
2、增加引物浓 ...

建议先进行普通的PCR，用actin鉴定模板的质量。循环数设在22-26之间，跑胶后，看ACTIN的表达情况，再分析原因。

作者: luoliqiong 时间: 2015-7-3 11:10

首先做半定量来检验一下引物和体系，其次定量需要对模板进行稀释（以10的指数）做标曲。引物长度不是问题，片段短当然更好。纵坐标的阈值是可以手动调节的，有个计算公式。国产和进口试剂的阈值是不同的

作者: whitesheep 时间: 2015-7-3 11:11

今天跑了一次胶，如上图所见。前两道是actin，后四道是目的基因。95度15秒，60度1分钟，四十个循环。
个人感觉cDNA模板和引物应该没有问题。难道是荧光定量PCR的机器坏了？我用的是AB7500.
各位大侠实验室的荧光定量PCR机器多长时间维修一次？

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作者: ns5fan 时间: 2015-7-3 11:11

好像是引物的问题，请重新设定引物看看，呵呵！第6和第7到RT-PCR的CT值和其他两个有区别吗？

作者: 铜雀 时间: 2015-7-3 11:11

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原帖由 ns5fan 于 2015-7-3 11:11 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
好像是引物的问题，请重新设定引物看看，呵呵！第6和第7到RT-PCR的CT值和其他两个有区别吗？

第六和第七道我没有加样啊。请问是如何看出引物有问题呢？

作者: bring 时间: 2015-7-3 11:12

有可能是RNA降解的原因，建议将RNA跑个电泳看看。

作者: ending 时间: 2015-7-3 11:12

奥，呵呵，我以为你actin 4个也对应着有4个目的扩增片段哪，呵呵

作者: qqq111 时间: 2015-7-3 11:12

请问各位大侠做实时荧光定量PCR，你们的模板cDNA 10微升体系的，一般稀释多少呢？还是要自己摸索啊

作者: woshi 时间: 2015-7-3 11:12

做实时荧光定量PCR最好不能低于20ul体系，不然荧光信号不稳定。

作者: 铜雀 时间: 2015-7-3 11:13

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原帖由 woshi 于 2015-7-3 11:12 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

做实时荧光定量PCR最好不能低于20ul体系，不然荧光信号不稳定。

引物特异性差，重新设计引物，多设计几条

作者: xyw5 时间: 2015-7-3 11:13

从图上看产物的量很多。
你可以在PCR扩增过程中取样跑电泳，即不同循环下取样或取一管。
从电泳中就可以看出来是大致是哪个循环下就出峰了。（相当于用普通PCR仪做定量）
如果比较早就出峰，可能是你的Sybr有问题或管有问题（管盖不够透明之类的）或是仪器光路系统有问题等

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