分析测试百科

标题: 【求助】请高手鉴定破骨细胞 [打印本页]

作者: 雪原 时间: 2015-7-11 17:30 标题: 【求助】请高手鉴定破骨细胞

我最近做的破骨细胞照片
清高手鉴定
听说是多核的
我该用啥方法鉴定啊
多谢了

图片附件: 98112623.snap.jpg (2015-7-11 17:30, 34.91 KB) / 该附件被下载次数 16
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=34783

作者: 雪原 时间: 2015-7-11 17:31

能看见是多核的吗？

图片附件: 18174162.snap.jpg (2015-7-11 17:31, 38.79 KB) / 该附件被下载次数 13
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=34784

作者: tudou85 时间: 2015-7-11 17:31

破骨细胞的鉴定可以分多种：这个是我在一篇论文中找的，具体你可以找一下论文！
1.形态学观察　破骨细胞是一类多核、体积大的巨细胞，在相差倒置显微镜下观察容易识别。细胞直径达30～100μm，含几个至数十个核。培养2小时后胞浆伸展，形态清晰，呈油煎蛋形、长条形、漏斗形、不规则形等
2)TRAP染色反应　抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)为破骨细胞的特异性标志酶，应用偶氮偶联组化分析法酶活性部位显示红色反应。以萘酚二磷酸盐为底物，偶氮副品红为显色剂，TRAP在酒石酸钾钠存在条件下将萘酚AS-BI磷酸盐水解为萘酚AS-BI，与显色剂结合形成红色沉淀
3)TrATPase染色反应　抗酒石酸酸性三磷酸腺苷酶(TrATPase)与破骨细胞质子泵功能有关，是破骨细胞骨吸收微环境酸化，发挥骨吸收所必需的酶。应用镁激活铅染色法，以ATP二钠盐为底物，硫化铵为显色剂，形成PbS棕黑色颗粒阳性反应，分布在胞浆中
4)降钙素受体测定　破骨细胞及其前体含有丰富的降钙素受体，结合位点>106/细胞。降钙素受体只在定向破骨细胞前体及成熟破骨细胞中表达，因而是反映破骨细胞分化的特异性标志，并是与巨噬细胞多核体的鉴别指标。应用免疫细胞化学染色法，经ABC试剂反应和显色反应，呈橙黄色阳性反应，苏木精复染后核呈淡蓝色
5)骨片吸收陷窝观察　骨吸收陷窝形成是破骨细胞的特异性功能标志，应用薄牛骨片(10～50μm薄)培养破骨细胞，经3天培养，有活性的破骨细胞在骨片上形成明显的吸收陷窝，基底粗糙不平、边界清晰，呈圆形或不规则形

作者: 雪原 时间: 2015-7-11 17:31

对了
以上照片都是400倍的

图片附件: 14042777.snap.jpg (2015-7-11 17:31, 29.15 KB) / 该附件被下载次数 13
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=34785

作者: 雪原 时间: 2015-7-11 17:32

多谢斑竹关照

图片附件: 55712497.snap.jpg (2015-7-11 17:32, 39.77 KB) / 该附件被下载次数 13
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=34786

作者: 雪原 时间: 2015-7-11 17:32

上面的是瑞氏染色的片子

图片附件: 86822896.snap.jpg (2015-7-11 17:32, 31.27 KB) / 该附件被下载次数 19
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=34787

作者: 雪原 时间: 2015-7-11 17:33

贴壁后的照片

图片附件: 51652739.snap.jpg (2015-7-11 17:33, 25.47 KB) / 该附件被下载次数 20
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=34788

作者: 雪原 时间: 2015-7-11 17:33

感觉瑞氏染色的效果不好
有会做的高手帮忙指教一下
多谢了

图片附件: 57171612.snap.jpg (2015-7-11 17:33, 53.57 KB) / 该附件被下载次数 18
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=34789

作者: tianmei001 时间: 2015-7-11 17:33

大家帮看看最上面的是刚从呱股骨和胫骨骨腔分离出来的细胞,血细胞比较多,后面几张是贴壁的,尤其是瑞氏染色的,能否看见多核状态?第一次做,实在迷茫,无从下手,请大家多多指点!感激不尽了!

作者: NBA 时间: 2015-7-11 17:34

谈一下个人总结破骨细胞的内容，仅供楼主参考：
１　破骨细胞的发育来源
破骨细胞的发育来源较为明确，是造血干细胞分化为单核/巨噬细胞后在多种细胞因子（TNF-a、RANKL、RANK、OPG、M-CSF、PGE2等）的调控下分化为成熟的具有多个细胞核的巨细胞。
２　破骨细胞的鉴定
破骨细胞呈特异性的抗酒石酸的酸性磷酸酶染色阳性（TRAP+），F-actin染色阳性，表达降钙素受体、组蛋白酶K（cathepsin-k）、整合素αvβ3（integrinsαvβ3），内可以分解骨组织，体外培养可以在骨片、象牙或者人工骨组织培养板上可以形成吸收性陷窝。
３附上几篇关于破骨细胞鉴定的较为权威具体的文献
（１） Chambers, T. J. Regulation of the differentiation and function of osteoclasts. J. Pathol, 2000; 192: 4–13
（２） Boyle, W.J., Simonet, W.S. & Lacey, D.L. Osteoclast differentiation and activation. Nature, 2003; 423: 337–342
（３）Udagawa, N. Takahashi N, Akatsu T,et al. Origin of osteoclasts: mature monocytes and macrophages are capable of differentiating into osteoclasts under a suitable microenvironment prepared by bone marrow-derived stromal cells. Proc. Natl Acad. Sci. USA, 1990;87:7260–7264
（４） Lee SH, Rho J, Jeong D, et al. v-ATPase V0 subunit d2–deficient mice exhibit impaired osteoclast fusion and increased bone formation Nat Med. , 2006; 12:1403 - 1409
（５） Teitelbaum, S., L., and F. P. Ross. Genetic regulation of osteoclast developmentand function. Nat. Rev. Genet,2003;, 8: 638–649.
（６）Teitelbaum, S.L. Bone resorption by osteoclasts. Science,2000;289:1504–1508
４小鼠的破骨细胞TRAP+照片（×１００）

图片附件: 88233009.snap.jpg (2015-7-11 17:34, 57.1 KB) / 该附件被下载次数 13
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=34790

作者: 雪原 时间: 2015-7-11 17:34

谢谢回复！我用400倍的染色后看细胞都没有你的大，是不是我分离的不对？
那经过造血干细胞分化为破骨细胞，需要培养多少天？需要加1.25-二羟基维生素D3吗？
我还想问问，依您的经验来看，我的是吗？

作者: babybabe 时间: 2015-7-11 17:35

不知道楼上战友分离的是否是小鼠的破骨细胞，种属差异可能也是存在的。
个人诱导培养过破骨细胞，但是没有直接分离获得过破骨细胞，所以不敢妄下结论您获得的是否为破骨细胞。
具体的培养和鉴定方法在附上的文献内有详细的介绍。
好运！

作者: 雪原 时间: 2015-7-11 17:35

谢谢战友回帖。我分离的是大鼠破骨细胞，大概有2-3月龄。其实应该用乳鼠的，但是我是新手，借着师哥分离心脏后的大鼠就继续做了，不知道这样差异会不会很大。具体文献也看过，国内外也没有破骨细胞的纯分离培养。只是在形态学方面想请教一下大家。

作者: 雪原 时间: 2015-7-11 17:35

附上我的方法，请大家多多指点：
分离得到大鼠股骨，胫骨；刮净骨外膜及其他附着组织；于培养液中剪掉两端骨诟；用针头抽取培养液，然后冲洗骨腔；直至骨腔变白；将冲洗得到的悬液静置。吸取上层培养液于6孔培养板培养。24小时后吸取培养液以去除不贴壁悬浮细胞；更换培养液。3天后，吸取培养液80%继续培养。
2-3天时，细胞明显贴壁，且有长长的伪足出现。个别细胞还呈现空泡状，但在400倍倒置相差显微镜下看不到多核状。3天后，经瑞氏染色后，细胞多核状态不明显，上面有图。
我现在买不到薄牛骨片，无法进一步鉴定；各位大侠有相关经验，敬请赐教！Smile

作者: 雪原 时间: 2015-7-11 17:36

我还想问一下高手们，在冲洗骨髓腔的过程中，会不会有成纤维状的细胞？
如果培养基里面不加1，25-（OH）2维生素D3，破骨细胞是不是就分化的晚？如果染色主要见到的是单核，但有伪足的细胞，那是不是破骨细胞前体？敬请赐教

作者: quiqui008 时间: 2015-7-11 17:36

不必客气
我感觉感觉骨髓腔内的应该不是成纤维细胞
造成其他原代贴壁细胞污染的主要应该是上皮细胞
再说骨腔内应该是没有啥成纤维组织的

作者: quiqui008 时间: 2015-7-11 17:37

前面3张好像焦距有问题

作者: 雪原 时间: 2015-7-11 17:37

附上最新破骨细胞多核形态瑞氏染色图片，请高手帮忙鉴定。

图片附件: 43526812.snap.jpg (2015-7-11 17:37, 43.39 KB) / 该附件被下载次数 5
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=34791

作者: 雪原 时间: 2015-7-11 17:38

关于TRAP染色鉴定，需要购买利副品红，AS-BI磷酸盐，请问哪里能购买到？普通试剂公司都没有这种药品。请大家帮忙！

作者: 33号 时间: 2015-7-11 17:38

QUOTE:

原帖由雪原于 2015-7-11 17:38 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

关于TRAP染色鉴定，需要购买利副品红，AS-BI磷酸盐，请问哪里能购买到？普通试剂公司都没有这种药品。请大家帮忙！

SIGMA 有全套试剂盒卖，也可以分开买试剂盒内的单种试剂，全套试剂盒大约１４００元。

作者: bring 时间: 2015-7-11 17:39

那个骨片实验应该是必须做的．否则没有说服力，那个东西肯定没卖的，我见过的都是自己制作的. 似乎要求做的非常薄.

作者: gogo 时间: 2015-7-11 17:39

不知道你用的是长骨分离的还是诱导法，从前几张来看好像是长骨分离法，但是后来你换液的时间，和培养液又是诱导法。请问你是用什么培养基？
我现在也是在分离破骨细胞，用的是机械长骨分离法，细胞出来了，但是我有时候我分辨不清有些是多核的破骨细胞，有些是多个单核细胞聚集在一块，可能是我的显微镜不太好吧。还有就是单核细胞比较多，正在想用什么办法过滤一下。你的第二张照片我也看到过，一堆单核细胞中，看到一个体积比较大的细胞，但是胞浆比较均匀，不像多核的样子，有谁能告诉这个是什么细胞？

作者: 雪原 时间: 2015-7-11 17:40

我用的是长骨分离法，并没有经过诱导培养，培养基也只是DMEM培养基+ 双抗+15%小牛血清。单核细胞多的原因是，破骨细胞还没有完全分化，而且单核细胞也不会贴壁，一旦贴壁，伸出伪足才会显现破骨细胞特征。那个大的细胞我感觉不像是破骨细胞前体，具体什么我也不敢说。通常我经过3-6天培养后，进行染色，多核细胞显现比较明显。

作者: gogo 时间: 2015-7-11 17:40

这位战友，我对破骨细胞培养的方法理解和你有不同。长骨分离法取得的细胞就已经是成熟的破骨细胞了，从骨髓中取出的细胞悬液30分钟左右就需要换液一次，是那时候成熟的破骨细胞已经贴壁，通过差异贴壁的方法稍微纯化一下破骨细胞。这个时候如果不加入诱导因子，破骨细胞的前体细胞是不会向破骨细胞分化的。而且成熟的破骨细胞在体外的存活时间一般在3-6天。
其中理解可能有误，请指正。

作者: 雪原 时间: 2015-7-11 17:41

谢谢指正！可是，我刚刚分离出来的细胞培养30分后没有破骨细胞的任何基本形态，而且染色后依然没有多核形态。而且我培养10天后仍然没有死亡。上面的染色图片就是我6-8天左右染色的结果。我是遵照一些博硕论文上面的方法操作的，基本上都没有用到维生素诱导。我想经过染色，看到的多核细胞（最后一张图片）应该就是破骨细胞。谢谢你提出的宝贵意见。期待与您继续探讨！

作者: 雪原 时间: 2015-7-11 17:41

请问战友用的是什么动物？我用的是幼鼠（4周龄），不是乳鼠。会不会种属之间，年龄段之间还会有差异呢？期待回帖。Smile

作者: gogo 时间: 2015-7-11 17:42

相关疾病：
骨质疏松症
应该不会是种属之间的差异，幼鼠的成熟的破骨细胞更加容易存活而已。我觉得机械分离法培养破骨细胞最重要的是提高成熟的破骨细胞的纯度，它不像诱导法那样可以得到大量的破骨细胞样细胞（osteoclast like cell)，有一篇文献的提高纯度的方法我觉得挺好的，正准备也用此法，你可以参考一下：“高纯度破骨细胞分离培养与功能表达”中国骨质疏松杂志　2001 年2 月第7 卷第1 期。你用此法试试呢？咱们交流交流。　

作者: gogo 时间: 2015-7-11 17:42

再请问这位战友，做骨吸收实验的时候，我想用象牙片，你知道怎么获得吗？谢谢。

作者: 雪原 时间: 2015-7-11 17:42

谢谢战友提供信息给我！我想用牛骨片，这东西没得买，只能自己做，要买新鲜的牛骨，-30度冻存后，用钢尺锯分割成200微米左右，然后用金刚砂石磨成10-50微米厚，冻存，使用前进行相应处理即可了。我觉得象牙骨片可能更不好买到吧，而且买到会新鲜吗？
我是学食品营养的，对破骨细胞要求可能没那么严格，只要有趋势就可以，我现在很想知道，我最后一张染色后图片，是否就是破骨细胞呢？请多多指教。

作者: gogo 时间: 2015-7-11 17:43

瑞氏染色我没有做过，不太了解。你的最后那张图片我觉得很像破骨细胞，多核，伪足都能看到。如果方便的话再做一下trap染色，骨吸收实验更好。

作者: 雪原 时间: 2015-7-11 17:43

感谢战友指教！我昨天去书店看了一看，似乎书上写的方法中都会在培养基中加1，25-（OH）2D3诱导了，看样子我需要进一步改进了。还有，你能买得到萘酚AS-BI磷酸钠吗？还是直接使用的TRAP试剂盒呢？是不是医院都会有钢尺锯呢？

作者: gogo 时间: 2015-7-11 17:43

机械长骨分离法得到的成熟的破骨细胞是osteoclast,而通过各种生长因子直接或者间接得到巨噬细胞击落刺激因子或者rankle，从而诱导单核细胞融合形成的多核细胞称为osteoclalstlike cell,这两种细胞都可以对三种鉴定方法显示阳性结果。有师兄告诉我说osteoclastlike cell的某些蛋白质不表达，但是我没有看到相关文献，也没有特意去查找。不知大家对这个问题怎么看？
不好意思，我不知道萘酚AS-BI磷酸钠的用处，也没有购买了。trap染色我打算让别人做了，自己做一下骨吸收实验就好了，trap有专门的试剂盒，但是好像比较贵，可以自己配置，好像也不是特别复杂。
钢尺锯骨科应该有吧。

作者: 雪原 时间: 2015-7-11 17:44

谢谢战友回复，我现在快被这个实验弄晕了，以前都没接触过，课题设计方面也有些困难。我还想检测m RANKL的表达呢，复杂吗？

作者: 雪原 时间: 2015-7-11 17:45

是RANKL的mRNA表达，写错了。

作者: 雪原 时间: 2015-7-11 17:45

真的吗？那是什么细胞呢？请您指点！急！

作者: zhezhe 时间: 2015-7-11 17:46

我指的是楼上贴出来的图片．站友的图片中的细胞是破骨细胞，但最好采用ＴＲＡＰ染色，颜色会非常漂亮．

作者: 雪原 时间: 2015-7-11 17:46

感谢您的建议，我最近在购买AS-BI磷酸盐时遇到问题，买不到，可能要买试剂盒了，对了，您知道怎么卖吗？还有，站友贴出来的图片是我早期作出来的破骨细胞，染色很不成功，但是确实是经过那样变成最后你看到的多核图片的。请继续指教！不胜感谢！我还有很多问题想问您！

作者: abc816 时间: 2015-7-11 17:47

照的是两个大气泡

作者: abc816 时间: 2015-7-11 17:47

看不清楚是什么细胞．建议采用自制ＴＲＡＰ染液染色，在一般光学显微镜下鉴定．如果有条件，可兼用ＤＡＰＩ对细胞核染色，用荧光显微镜检查．

作者: abc816 时间: 2015-7-11 17:47

另外，楼上的照片染上色的细胞不一定是多核，但凭经验应该是破骨细胞．因为osteoclast precusors也表达mature osteoclast的一些specific markers, 比如TRAP.

作者: 雪原 时间: 2015-7-11 17:48

楼上那张片（最后一张）是已经养11天的了，我觉得应该不会是前体了吧，因为我染过3-5天的细胞，生长状况在倒置显微镜下观察和11天的形态基本相同，数量不多，但是染色效果就不出来1月16日那样。不知这么说有没有道理？我是学食品营养的，还请大俠多多指点。这是我第一个月首次作出来的细胞阿。

作者: 雪原 时间: 2015-7-11 17:48

我想用自制的TRAP孵育液，可是买不到AS-BI磷酸盐。请指教

作者: 雪原 时间: 2015-7-11 17:48

我还想问一下，我用的是1-2个月龄的WISTER大鼠，这样行不行？没经过诱导。附上我最后一次的染色图片。

图片附件: 46796089.snap.jpg (2015-7-11 17:48, 44.31 KB) / 该附件被下载次数 11
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=34793

作者: 079777chao 时间: 2015-7-11 17:49

单核的破骨细胞都可以叫破骨细胞的前体细胞，而且前体细胞在体外培养时可以分裂，尤其是在有Ｍ－ＣＳＦ时．而且，在分裂以后的前体细胞还是前体细胞，在体外，没有sRANKL时，不会differentiation.
ＴＲＡＰ染色的原料从Sigma可以买到．

作者: 雪原 时间: 2015-7-11 17:49

感谢指点！说说的我的个人想法，请指点。就图片分析来看，已经是多核细胞，应该就是分化后的破骨细胞，他的前体细胞，之所以称为前体，是因为他还不具备破骨细胞的特性，特征。而分化后，很少见具有前体细胞特征得细胞，那还可以说：在分化以后的前体细胞还是前体细胞吗？如果细胞不是多核的，那么看见图片的多核现象，又是为什么呢？
我是食品专业的，初次接触细胞方面，恳请多多指点！如果想法有偏差，也请及时帮忙纠正，谢谢了！

作者: 555444 时间: 2015-7-11 17:49

Okey, here are the points: mature osteoclasts (OCs) are TRAP postive giant cells with multi-nucei. They share common origin with monocytes/macrophage lineage. In vivo, in bone microenvironment, or in vitro, under suitable conditions, OCs progenitors will be turned into osteoclasts. In the process of differentiation, people usually call monocleated TRAP positive cells as pre-osteoclasts, or osteoclasts precursors.
Hope this would be some help.

作者: 雪原 时间: 2015-7-11 17:50

谢谢指点。可是按照英文所述，那么如何区别破骨前体细胞和破骨细胞呢？活性相同，都是多核的。我看过一篇Science Direct文献，上面说破骨细胞前体是单核的，只有和一些因子，诸如RANKL. 1,25-(OH)2D3等结合是才会分化为多核细胞。真有些搞不清楚了。
我想请问大俠，如果我想做MTT，那么用胰蛋白酶能消化下来吗？要不要细胞刮刀？浓度多少？多长时间？
细胞培养6-8天时，是破骨细胞呢？还是前体？
谢谢大俠一直帮助！

作者: 555444 时间: 2015-7-11 17:50

In the first place, I would like to clarify that all the points I listed at 2007-02-06 13:15 are my opinions. Of course, some of fresh cells you isolated are mature osteoclasts, however, there must be many cells which are at pre-osteoclasts (mononuclear cells) stage, although they are TRAP positive too.
In the second place, from my point of view, you can employ both methods to isolate cells from the bones. But, if you isolate cells by using trypsin, the cells may need longer time to recovery.
In conclusion, the cells you harvested will not be pure mature osteoclasts.

作者: 雪原 时间: 2015-7-11 17:50

那么如果获得的成熟破骨细胞不纯的话，对下一步试验，诸如MTT，骨片吸收，以及进一步检测RANKL的mRNA会不会影响呢？
我看到文献说，破骨细胞的寿命在10天左右，可是我的细胞能够存活15天左右，可能大概就是你所说的原因。那么如果我想做进一步的实验，我该培养多少天时采用呢？
还有请您指点有关MTT试验，用胰蛋白酶能消化下来吗？要不要细胞刮刀？浓度多少？多长时间？
感谢指点!期待您的回帖！

作者: 555444 时间: 2015-7-11 17:51

To anwser your questions:
(1) I do not think RANKL mRNA is expressed in osteoclasts. Please double check. To my knowledge, RANKL is expressed in osteoblasts, activated T-cells and activated synovial fibroblasts. Osteoclasts only express RANK.
(2) I do not know how to anwer other of your questions because I do not know the aims of your study. But, you could use the cells once they attached.

作者: 雪原 时间: 2015-7-11 17:51

谢谢！您说的（1）我有些不同的理解，RANK是破骨细胞的配基，当破骨细胞繁殖时，通过外界物质刺激，特异性的表达RANKL,而成骨细胞中的特异性表达因子是OPG，当OPG表达过多时，会对体系内破骨细胞的RANKL产生拮抗，从而抑制破骨细胞生长。

作者: 555444 时间: 2015-7-11 17:52

首先，破骨细胞是终端细胞，根本不能分裂，就是你说的繁殖．请仔细订正．（前体例外）．
其次，破骨细胞不表达RANKL, 只表达RANK, 请再次订正．
最后，一种细胞会分泌许多细胞因子的，分泌osteoprotegerin (OPG)的osteoblasts也同理．（是之成也萧何败也萧何也）．

作者: 555444 时间: 2015-7-11 17:52

As i mentioned above, osteoclasts are terminal cells which never proliferate, (except their precursors).
And, there is none RANKL expressed on osteoclasts, except its receptor, RANK.
Osteoblasts not only express RANKL, but also osteoprotegerin (OPG).

作者: 555444 时间: 2015-7-11 17:52

This is the abstract of that paper (I have the full text of this paper too):
"We examined the role of osteopontin (OPN) in the osteoclastogenesis of arthritis using collagen-induced arthritis (CIA). Cells
from arthritic joints of wild-type (OPN +/+) mice spontaneously developed bone-resorbing osteoclast-like cells (OCLs). The cultured
cells showed an enhanced expression of receptor activator of nuclear factor jB ligand (RANKL) and a decreased expression of
osteoprotegerin (OPG). The addition of OPG reduced the number of OCLs, indicating that the osteoclastogenesis depends on the
RANK/RANKL/OPG system. The cells also produced OPN abundantly and anti-OPN neutralizing antibodies suppressed the
development of OCLs. Moreover, the addition of OPN increased the expression of RANKL and augmented differentiation of OCLs
from OPN-deficient (OPN )/)) cells. OPN, like the combination of 1a,25-dihydroxyvitamin D3 and dexamethasone, also enhanced
the RANKL expression and decreased OPG expression in a stromal cell line, ST2. These results suggest that OPN acts as a positive
regulator in the osteoclastogenesis of arthritis through the RANK/RANKL/OPG system.
2004 Elsevier Inc. All rights reserved."

作者: 555444 时间: 2015-7-11 17:53

如果你详细看看上边摘要，就知道在这句话中：＂The cultured
cells showed an enhanced expression of receptor activator of nuclear factor jB ligand (RANKL) and a decreased expression of
osteoprotegerin (OPG).＂，"the cultured cells" 没有说是破骨细胞．
如果你再去读该文章的813页，你就彻底明白了：OPN enhances the RANKL expression and suppresses the OPG expression on stromal cells:
Because the harvested cells from joints were a heterogeneous
mixture of cells derived from multiple sources,
such as stromal cells, osteoclast precursors, and lymphocytes,
etc., there are limitations in evaluating mRNA
expression. To clarify the effect of OPN on the expression
of RANKL and OPG, we used a murine stromal
cell line, ST2. As positive control, we used 1,25(OH)2D3
and Dex, which are well-known agents that induce
stromal cells to express RANKL and reduce their expression
of OPG [3,4,8,12,19]. While the combination of.....

作者: 雪原 时间: 2015-7-11 17:53

看样子，我还需要进一步研读一下文章，感谢您提出的建议。
我还想请问有关MTT试验，用胰蛋白酶能将贴壁的破骨细胞消化下来吗？浓度多少？多长时间？要不要细胞刮刀？

作者: langlang 时间: 2015-7-11 17:53

这里有人用 raw cell + rankl + M-csf 诱导法 make 破骨细胞么？
你们的两个细胞因子的浓度如何？
要几天才能长出来？
再问氧过破骨细胞的前辈们，最后的破骨细胞的比率有多大？那些破骨细胞大多是几个核的？？
万分感谢！！

作者: 555444 时间: 2015-7-11 17:54

QUOTE:

原帖由 langlang 于 2015-7-11 17:53 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

这里有人用 raw cell + rankl + M-csf 诱导法 make 破骨细胞么？
你们的两个细胞因子的浓度如何？
要几天才能长出来？
再问氧过破骨细胞的前辈们，最后的破骨细胞的比率有多大？那些破骨细胞大多是几个核的？？
万分感 ...

相关疾病：
先天性卵巢发育不全综合征

RAW264.7 cells were first used by Hsu et al to generate osteoclasts in vitro (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 96, pp. 3540–3545, March 1999), and this method is widly used. By using this approach, I myself can produce osteoclasts with more than a hundred nuclei. I remind of you that, do not like primary cells, you do not need to use M-CSF in this model. sRANKL alone is enough.

作者: langlang 时间: 2015-7-11 17:54

前辈，
真的难以想象还能形成多于100核的 osteoclast. 那么你开始时候的细胞密度是多少的时候加的cytokine? 1*10^6/well?
再次感谢

作者: langlang 时间: 2015-7-11 17:55

不好意思再问一句
几天能形成osteoclast阿？

作者: 555444 时间: 2015-7-11 17:55

前辈，
真的难以想象还能形成多于100核的 osteoclast. 那么你开始时候的细胞密度是多少的时候加的cytokine? 1*10^6/well?
再次感谢

=================================================

2-10 million cells/60-mm petri-dish. 60-200 ng/ml sRANKL.

作者: 555444 时间: 2015-7-11 17:55

不好意思再问一句
几天能形成osteoclast阿？

================================

Osteoclasts appeared from day 3 on.

作者: remonte 时间: 2015-7-11 17:56

前辈
再问个关于TRAP Assay的问题
我用的是 sigma的kit. 最后一步要用hematoxylin
复染色。我感觉好像效果反而不好，不知道你认为如何？
好像hematoxylin会将细胞浆染成粉色，所以TRAP反而不清晰

作者: remonte 时间: 2015-7-11 17:56

前辈
你用60-mm petri-dish.的阿，那么每次要用很多RANKL的阿，这个好贵啊。
你每一个well里面有多少ml呢？
谢谢

作者: 555444 时间: 2015-7-11 17:57

前辈
再问个关于TRAP Assay的问题
我用的是 sigma的kit. 最后一步要用hematoxylin
复染色。我感觉好像效果反而不好，不知道你认为如何？
好像hematoxylin会将细胞浆染成粉色，所以TRAP反而不清晰
......

===============================================================================================================

The purpose of countstain the cells with Hematoxylin is to see nuclei. Nuclei are blue labelled by Hematoxylin, not the color what you mentioned. Your are right, countstaining is not necessary for there is no problem to see nuclei without this step.
What is the cat# of Sigma kit you are using? I used to use 386/7-A but I do not like it.

作者: 555444 时间: 2015-7-11 17:57

前辈
你用60-mm petri-dish.的阿，那么每次要用很多RANKL的阿，这个好贵啊。
你每一个well里面有多少ml呢？
谢谢
......

==============================================================================================================

I made sRANKL by myself so does not matter how big the cell culture vehicle used. However,if you purchase RANKL you should use 8-well chambered slides, of course depends on what is the purpose of your experiments. For instance, if you want to extract RNA from the cells, you have to use dishes otherwise you would not have enough products. If you want to see osteoclasteogenesis, I think either 8-well chambered slides or 48-well plate will do.
For 60-mm Petri-dishes, 4 ml medium/dish.
I know commercial RANKL is very expensive, around 180USD/10ug.

作者: 555444 时间: 2015-7-11 17:58

The purpose of countstain the cells with Hematoxylin is to see nuclei. Nuclei are blue labelled by Hematoxylin, not the color what you mentioned. You are right, countstaining is not necessary.
What is the cat# of Sigma kit you are using? I used to use 386/7-A but I do not like it.

作者: dog002 时间: 2015-7-11 17:58

前辈
如果不用hematoxylin复染的话，是不是就是在37度孵育1个小时后将溶液倒出，在空气中干燥后显微镜下观察？
我现在想不起来cat No.了，得去实验室查一下

作者: dog002 时间: 2015-7-11 17:58

前辈
你真的好厉害自己做sRANKL, 你是自己PCR 然后E.Coli表达纯化么？
我试验目的是see osteoclasteogenesis，所以我现在在用12 well plate, each well 1.5 ml, 但是也保不准以后要提取RNA, 昂贵的RANKL的确是个问题。

作者: dog002 时间: 2015-7-11 17:59

再问一个问题
在每一个well里面，好像如果培养液越少，也就是每一个well里面培养液高度越小，细胞反而长得更快。所以在设计每个well的液面高度时候又没有什么讲究呢，还是每一种细胞都不一样？我想，可能是液面越低，越容易氧气渗透。
非常感谢

作者: 555444 时间: 2015-7-11 18:00

前辈
如果不用hematoxylin复染的话，是不是就是在37度孵育1个小时后将溶液倒出，在空气中干燥后显微镜下观察？
我现在想不起来cat No.了，得去实验室查一下

==================================================================

10-15 min maximum will do, at 37oC. But not Sigma kit. Sigma kit is an hour.

作者: 555444 时间: 2015-7-11 18:00

前辈
再问一个问题
在每一个well里面，好像如果培养液越少，也就是每一个well里面培养液高度越小，细胞反而长得更快。所以在设计每个well的液面高度时候又没有什么讲究呢，还是每一种细胞都不一样？我想，可能是液面越低，越容易氧气渗透。
非常感谢
......

==============================================================================================================

(1) when you plate RAW264.7 cells, you add sRANKL. (same time).
(2) cells will stop to proliferate when sRANKL is added, so your problem is not a problem.
(3) the reason you have this problem (cells still dividing when RANKL added) is: your raw264.7 cells are too old (i mean the generation).

作者: DCS 时间: 2015-7-11 18:01

前辈
还有个问题，如果每个well, 2-10*10^6 cell, 那就差不多每天都要换培养液了，RANKL的消耗很大啊

作者: DCS 时间: 2015-7-11 18:01

前辈
非常感谢阿，bow~~~
cell still dividing when RANKL add,除了the cell generation is too old(我用的是15代,应该多少代之前比较好呢？) 是否还有因为我加了M-CSF? 这个cytokine可以让osteoclast precursor分裂。
谢谢！！

作者: 555444 时间: 2015-7-11 18:01

QUOTE:

原帖由 DCS 于 2015-7-11 18:01 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

前辈
还有个问题，如果每个well, 2-10*10^6 cell, 那就差不多每天都要换培养液了，RANKL的消耗很大啊

2-10 million cells per 60-mm Petri-dish. If you use small wells in a plate, certainly cell number has to be reduced.

作者: 555444 时间: 2015-7-11 18:01

QUOTE:

原帖由 DCS 于 2015-7-11 18:01 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

前辈
非常感谢阿，bow~~~
cell still dividing when RANKL add,除了the cell generation is too old(我用的是15代,应该多少代之前比较好呢？) 是否还有因为我加了M-CSF? 这个cytokine可以让osteoclast precursor分裂。
...

There is no any difference with/without M-CSF, but M-CSF is not necessary.
Passage <20 should be ok for osteoclasteogenesis.

作者: DCS 时间: 2015-7-11 18:02

前辈
我的sigma的TRAP assay kit的 catalog No. 387A-1kT.
孵育一个小时以后，再复染。而且他还要做一个没有tartrate 的对照，不知道是不是也用不着。
如果不想复染，是不是就是避光孵育1个小时以后，自来水冲洗，空气风干就可以显微镜下观察了呢？

作者: DCS 时间: 2015-7-11 18:02

前辈
你是说generation>20就最好不要用了么？
rawcell 长得太快了。
谢谢！！

作者: 555444 时间: 2015-7-11 18:02

QUOTE:

原帖由 DCS 于 2015-7-11 18:02 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

前辈
我的sigma的TRAP assay kit的 catalog No. 387A-1kT.
孵育一个小时以后，再复染。而且他还要做一个没有tartrate 的对照，不知道是不是也用不着。
如果不想复染，是不是就是避光孵育1个小时以后，自来水冲洗，空气风干 ...

I do not like that kit for cells labelled as brown but not dark red (more pretty).

作者: 555444 时间: 2015-7-11 18:03

QUOTE:

原帖由 DCS 于 2015-7-11 18:02 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
前辈
你是说generation>20就最好不要用了么？
rawcell 长得太快了。
谢谢！！

freeze some younger cells.

作者: DCS 时间: 2015-7-11 18:03

前辈
你是说 TRAP+ 不会显示深红而是棕色？

作者: dior 时间: 2015-7-11 18:04

有没有站友愿意转让给我一些骨片呢？

作者: 555444 时间: 2015-7-11 18:04

QUOTE:

原帖由 dior 于 2015-7-11 18:04 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
有没有站友愿意转让给我一些骨片呢？

I prepared dentin slices by myself.

作者: dior 时间: 2015-7-11 18:05

可是去哪里找到钢锯和磨石呢？

作者: 555444 时间: 2015-7-11 18:05

QUOTE:

原帖由 dior 于 2015-7-11 18:05 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

可是去哪里找到钢锯和磨石呢？

you can not use 钢锯和磨石 at all. I will tell you the brand of the instrument later.

作者: 555444 时间: 2015-7-11 18:05

Diamond band saw (Well™, model 3241); and different grade of sandpapers.

作者: DCS 时间: 2015-7-11 18:05

前辈
你一般培养osteoclast多少天呢，如果第三天开始形成的话？
谢谢！！

作者: DCS 时间: 2015-7-11 18:06

好像如果培养太久了，细胞就会大片的脱落。
是不是一直等到培养液变黄才换呢？（同时也换cytokine）
谢谢！

作者: 555444 时间: 2015-7-11 18:06

QUOTE:

原帖由 DCS 于 2015-7-11 18:05 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
前辈
你一般培养osteoclast多少天呢，如果第三天开始形成的话？
谢谢！！

一般情况下，４－６天形成的成熟破骨细胞就可以用来做实验．当然，要看你的实验目的，如果你要研究细胞的早期分化，刺激一两天甚至１０几分钟几个小时就够了．

作者: 555444 时间: 2015-7-11 18:07

QUOTE:

原帖由 DCS 于 2015-7-11 18:06 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

好像如果培养太久了，细胞就会大片的脱落。
是不是一直等到培养液变黄才换呢？（同时也换cytokine）
谢谢！

细胞大片脱落证明RANKL抑制了细胞的分裂，是正常的．但换培养液（含RANKL）的时间一般是隔一天一次，不是等到培养液变黄才换，那样就太迟了，RAW细胞本身性命都不保了，还如何分化呢？

作者: DCS 时间: 2015-7-11 18:07

谢谢前辈
那么如何防止细胞的大片脱落呢？

作者: 555444 时间: 2015-7-11 18:08

脱落是正常现象，证明你的ＲＡＮＫＬ有作用．

作者: DCS 时间: 2015-7-11 18:08

前辈
我上次养osteoclast，细胞的大片脱落是发生在9天后，所以我想尽量缩短在9天以内完成osteoclast的培养。
上次在100ng/ml RANKL 16ng/mlMCSF 条件下是有好多多核细胞但是>3的不多.

作者: JK.jon 时间: 2015-7-11 18:09

前辈
我上次养osteoclast，细胞的大片脱落是发生在9天后，所以我想尽量缩短在9天以内完成osteoclast的培养。
上次在100ng/ml RANKL 16ng/mlMCSF 条件下是有好多多核细胞但是>3的不多.

==================================================================================================

if cells partially dying from D2, it is a good phenomenon (RANKL effectively). your cells dying of overgrew (D9), no good.
check either your cells or the qulity of your RANKL. (I guess something wrong in your cells)

作者: DCS 时间: 2015-7-11 18:09

这次我用12well plate, 10^6cell/well, from D2,0.5ml培养液的那个well,有好多细胞dying, 我不知道还要不要继续这个well.

作者: DCS 时间: 2015-7-11 18:09

但是 0.75ml 的well, 细胞数一样，RANKL量一样，就没有问题，不知道怎么回事

作者: 555444 时间: 2015-7-11 18:10

QUOTE:

原帖由 DCS 于 2015-7-11 18:09 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

但是 0.75ml 的well, 细胞数一样，RANKL量一样，就没有问题，不知道怎么回事

你指的0.75ml 的well（的plate）是多少well的，是和什么plate(or chambered slides)相比的？你说没有问题，可能是误判．不知道你发现没有，RAW264.7细胞本身（不加ＲＡＮＫＬ）就有一些多核细胞，你说加RANKL最多只能诱导出３个核的破骨细胞，显然不是成功的．
对不起，我提了许多意见，但愿对你有所帮助．

作者: DCS 时间: 2015-7-11 18:10

plate是 12well plate, 我就是在这个plate里面，同时做了control (treat nothing),都是10^6cell/well, 但是分成0.75ml 0.5ml 两个情况，对于每个情况分别treated with 100ng/150ng/ml, 但是三天后都没有明显的fusion. 并且在0.5ml的well里面分别有一个加了cytokine的和没有加 cytokine的well里面大量细胞在第二天死掉。
还有我用的是humanRANKL, is that ok? I saw some paper they use hRANKL.
非常感谢前辈，对我很有帮助！！！
BOW~~~~~

作者: 555444 时间: 2015-7-11 18:11

QUOTE:

原帖由 DCS 于 2015-7-11 18:10 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

plate是 12well plate, 我就是在这个plate里面，同时做了control (treat nothing),都是10^6cell/well, 但是分成0.75ml 0.5ml 两个情况，对于每个情况分别treated with 100ng/150ng/ml, 但是三天后都没有明显的fusion. ...

too many cells/well but medium (nutrition) was not enough.
I guess human's works on mouse cells too.

作者: 45778 时间: 2015-7-11 18:11

那我现在换成12 well plate, 10^5cell/well, 您看怎么样？
100ng or 150ng/ml RANKL

作者: 555444 时间: 2015-7-11 18:11

QUOTE:

原帖由 45778 于 2015-7-11 18:11 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
那我现在换成12 well plate, 10^5cell/well, 您看怎么样？
100ng or 150ng/ml RANKL

We have used cells from different sources as osteoclast precursors.
When we used RAW cells, we never count the number of cells. of course you can count. this is the tricky: cells should initially cover the bottom of the well, let's say, 80-90% confluent, does not matter what kind of plate used.

作者: DCS 时间: 2015-7-11 18:12

前辈
你是说不管放入多少细胞，都会是80-90%附着在盘底么？不太明白confluent在这里的意思。谢谢！！！

作者: DCS 时间: 2015-7-11 18:12

前辈
你说12 well plate ,in each well, how many volum is the better?

作者: 555444 时间: 2015-7-11 18:12

QUOTE:

原帖由 DCS 于 2015-7-11 18:12 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

前辈
你是说不管放入多少细胞，都会是80-90%附着在盘底么？不太明白confluent在这里的意思。谢谢！！！

细胞数目太多不好（太多培养液会变黄），太少也不好（太少细胞之间没有接触，因为ＲＡＷ细胞缺乏移动性）。你把细胞植入well后，静置片刻（５－１０分钟），然后在倒置显微镜下看看，细胞和细胞之间有一两个细胞的距离，就是80-90%附着在盘底，这样的细胞量正好。
记住你植入了多少细胞悬液，算算其中有多少细胞。下次就知道要放多少细胞了。

作者: 555444 时间: 2015-7-11 18:13

QUOTE:

原帖由 DCS 于 2015-7-11 18:12 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

前辈
你说12 well plate ,in each well, how many volum is the better?

能加多少加多少，越多越好。只要实验组和对照组一样，就可以了。但为了节省你的RANKL, 就要酌情了。另外不能太满，碰到盖子就不好了。(2/3 of the well is the best).

作者: DCS 时间: 2015-7-11 18:13

现在老板让我鉴定osteoclast的特征性，让我检测rank的表达，所以我现在不知道培养多少细胞才够harvest cell, 能够做western blot ?
你知道哪里的rank抗体比较好么？
谢谢！！

作者: 555444 时间: 2015-7-11 18:14

QUOTE:

原帖由 DCS 于 2015-7-11 18:13 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

现在老板让我鉴定osteoclast的特征性，让我检测rank的表达，所以我现在不知道培养多少细胞才够harvest cell, 能够做western blot ?
你知道哪里的rank抗体比较好么？
谢谢！！ ...

rank怎么可以作为osteoclast的标记呢? 它在单核细胞中也表达的.
如果要做rank的Western blot, 用R&D的streptavidin-anti mRANK为好.

作者: DCS 时间: 2015-7-11 18:14

这里的单核细胞是指 osteoclast precursor么？

作者: DCS 时间: 2015-7-11 18:14

那么多少细胞量才够作一次western blot的呢？

作者: DCS 时间: 2015-7-11 18:15

前辈， osteoclast 的 phenotype是什么呢

作者: 555444 时间: 2015-7-11 18:15

这里的单核细胞是指 osteoclast precursor么？

===============================================================================================================

monocytes/macrophages, like RAW264.7 cell line. Or primary monocytes/macrophages from animals. Yes, they are osteoclast precursor cells.

欢迎光临分析测试百科 (http://bbs.antpedia.com/)