标题:
【求助】第一次做荧光定量PCR,得到的扩增曲线很奇怪
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作者:
dadaai
时间:
2015-7-13 20:16
标题:
【求助】第一次做荧光定量PCR,得到的扩增曲线很奇怪
第一次做荧光定量PCR,得到的扩增曲线很奇怪,不知道是什么原因,求指教!还有要是CT值过高是不是应该增加模板的浓度啊?
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作者:
yazi
时间:
2015-7-13 20:17
标题:
【回复】
我是这样认为的:
你看到那个红色的线了吗,那应该是阙值线,如果你没有手动调整过的话,在阙值线以下的都是背景杂信号,忽上忽下的很正常,后边没有在一定范围内起峰,说明是无产物扩增的,如果你用的SYBR Green I 法,也同时会有溶解曲线分析吧,若那里边也是没有很尖锐的峰出现(我这里是笼统的说法),只能说明你这个扩增是没有产物出现的。而且你图不是很清晰,看不清楚纵轴是什么标示。
问题很多,不能在这一概而就的说明
希望有所帮助,如果有说错地方,请各位高手指点
作者:
小妖精@
时间:
2015-7-13 20:17
标题:
【回复】
非常感谢,但是我的溶解曲线有单一峰,而且特异性非常好啊。那就说明有扩增产物啊。那个阈值通常需要改动么?
作者:
dadaai
时间:
2015-7-13 20:18
标题:
【回复】
为什么大家把溶解曲线看的这么重要呢,我觉得本末倒置了,若是你的扩增曲线都没有再一定范围内起峰的话,溶解曲线即使是单一峰又有什么用呢?况且你还要看峰的尖锐程度,峰的高低。我就说这么几个例子吧:
1. 以前用某乐的96-microplate,总在77~80度左右有单一小侧峰,考虑引物问题等众多事情后仍旧无解,最后同样实验条件使用某A的8-Strip tube,前边的杂峰消除。
2. 做过NTC,发现三重复都在38Ct时左右起峰,溶解曲线很单一,与内参同温度,但峰最高值是其一半左右,至今仍无解。
所以你只能有扩增才能用溶解来证明是不是扩增正确,而不能没扩增却用溶解来说明有扩增,如果实在不放心,那就那扩增产物跑胶,理论可行,但我没有试过。
作者:
双子座
时间:
2015-7-13 20:19
标题:
【回复】
稀释100倍模板再试试,一般是模板量太大了
作者:
大大
时间:
2015-7-13 20:19
标题:
【回复】
模板浓度降低后怎么样?楼主解决这个问题了吗?
我最近也遇到类似的扩增曲线,但我的几个样品中,每次只有一个样品发生这种奇怪的扩增曲线。其他样品的多个基因扩增都很正常。推测是模板中混有影响荧光测定的东西。不知乙醇,异丙醇残余是否有影响。
作者:
jishiben
时间:
2015-7-13 20:20
标题:
【回复】
个人感觉是没有有效扩增,没有看到指数期和平台期,楼主再稀释一下模版看看吧。
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