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标题: 我认为最好的在线引物设计软件 [转自丁香园论坛] [打印本页]

作者: 小鼹鼠 时间: 2011-8-13 16:39 标题: 我认为最好的在线引物设计软件 [转自丁香园论坛]

我认为最好的在线引物设计软件 [转自丁香园论坛]

看到版上经常还是有许多战友为引物的设计感到头疼。不过这也难怪，虽然原理我们都知道，但是设计的时候却未必能都考虑的很完全。
在这里我向大家隆重推荐一个在线的引物设计软件，是斯坦福大学的，我认为是最好的在线引物设计软件，我用它设计接近100多对引物，可以说是屡试不爽。它用起来也很简单，最重要的是效果非常好，考虑的因素也非常的多。
先不说那么多了：网址：cuturl('http://seq.yeastgenome.org/cgi-bin/web-primer')
下面我继续图示。

作者: 小鼹鼠 时间: 2011-8-13 16:40

首先输入你想要p的片断，含有数字也无所谓，选择pcr选项。

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作者: 小鼹鼠 时间: 2011-8-13 16:41

点击“submit”进入下面的页面。
其中在Select YES to Amplify a region with EXACT endpoints of the DNA sequence entered NO YES这一项中，一定要选择yes，其他的各项目，大家可以点击查看说明，也都是非常的好理解。暂时，我们先不要改软件自设的默认值，直接submit

[ 本帖最后由小鼹鼠于 2011-8-13 16:42 编辑 ]

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http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=8250

作者: 小鼹鼠 时间: 2011-8-13 16:42

然后我们就得到了结果，它会把所有可能的引物都会列出来，而且会把最好的一对帮你挑选出来，of course，我们要选择最好的。

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http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=8251

作者: 小鼹鼠 时间: 2011-8-13 16:43

然后点击“This is the BEST pair of primers”就得到了设计好的引物。而且也会显示出“The sequence of DNA that will be amplified by these primers is ”如果你不放心，你可以将该序列和你的原始序列比较一下，不会有问题的了。

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http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=8252

作者: 小鼹鼠 时间: 2011-8-13 16:44

然这是最顺利的情况，但是有时并不是这么简单，例如我前两天帮一个战友设计引物，他想要的序列：
atcgat cagattatca aataatatac caaaattgat acatatgata catatgaatg
721 atatatgttt tggatatatt atttgttaaa attaattcat caggtgatga tgtgatgata
781 atcattgaaa aatgacaaaa atcccctgat taagtataat aaaaatagta agtaaaaaag
841 gcaaattttt acttacaaaa tattacatat tggaataaat aatttaatct ttcatatata
901 taactgtgat acatcataaa tatatatata gcaaaagaaa gatataaatt attatcattt
961 tttttgatca ttattgctat aattattatc ctgcttgttt aactataata atagcaatga
1021 atgaatcaaa atttaaatga tacgttaaaa tccaaccaat atgttataaa ttttctttca
1081 ttt

作者: 小鼹鼠 时间: 2011-8-13 16:45

我们直接提交得出的结果：

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http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=8253

作者: 小鼹鼠 时间: 2011-8-13 16:46

这样的话，按照默认的设的值并不能得到合适的引物，很明显如果让我们自己人工设，可能就不会考虑这么的详细：首先第一个问题，GC含量太低。

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http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=8254

作者: 小鼹鼠 时间: 2011-8-13 16:46

为了重新设计，我们点击浏览器上的后退，回到前一页，也就是默认值的设定这一页。

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http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=8255

作者: 小鼹鼠 时间: 2011-8-13 16:47

可是我的基因出来的是这种结果怎么办？
Primers for PCR

There were 1 forward primers in the valid range for GC content.
There were 4 reverse primers in the valid range for GC content.
There were 1 forward primers in the valid range for melting temperature.
There were 0 reverse primers in the valid range for melting temperature.

ERROR
The Tm range was too stringent, no primers were found in that range

作者: 小鼹鼠 时间: 2011-8-13 16:47

我们可以改两个地方，第一，Optimum primer length: Minimum length: Maximum length:中，我们可以将Maximum length改成一个更大的值，例如35；Minimum GC改成20，然后submit，
可是我们发现还是有问题。

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http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=8256

作者: 小鼹鼠 时间: 2011-8-13 16:48

这一次的原因是引物自己配对的问题，同样我们回到前一页，这次我们把Self End Anneal由原来的12改成16，submit。这样我们就得到了新的引物。

图片附件: 1.jpg (2011-8-13 16:49, 40.94 KB) / 该附件被下载次数 13
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=8257

作者: 小鼹鼠 时间: 2011-8-13 16:49

就这样，有时默认值不行的，可以微调一样，便很容易得到比较理想的引物。我用了那么久，几乎从来没有问题。大家可以随时点击【info】选项，进一步深入了解每个选项的意思。

作者: 小鼹鼠 时间: 2011-8-13 16:49

参数改了好多还是不行，要不你再帮我看看，谢谢了，呵呵
1 ggatccccgg gcagagctgg ggggggattt gttagcatct cttgataaac ttaattgtct
61 ctcgtcactg acggcacaga gctattgatg ggtctcaacc cccagctagt tgtcatcctg
121 ctcttctttc tcgaatgtac caggagccat atccacggat gcgacaaaaa tcacttgaga
181 gagatcatcg gcattttgaa cgaggtcaca ggagaaggga cgccatgcac ggagatggat
241 gtgccaaacg tcctcacagc aacgaagaac accacagaga gtgagctcgt ctgtagggct
301 tccaaggtgc ttcgcatatt ttatttaaaa catgggaaaa ctccatgctt gaagaagaac
361 tctagtgttc tcatggagct gcagagactc tttcgggctt ttcgatgcct ggattcatcg
421 ataagctgca ccatgaatga gtccaagtcc acatcactga aagacttcct ggaaagccta
481 aagagcatca tgcaaatgga ttactcgtag tactgagcca ccatgcttta acttatgaat
541 ttttaatggt tttattttaa tatttatata tttataattc ataaaataaa atatttgtat
601 aatgt

作者: 小鼹鼠 时间: 2011-8-13 16:52

看了结果你知道为什么你的引物为什么这么难以设计了，因为N端和C端的性质差别太大，属于极品的那种呵呵。

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作者: 小鼹鼠 时间: 2011-8-13 16:53

很多时候虽然它给出的结果看上去并不是那么好，但是用起来还是没有问题的。你试试我给你设计的这个吧。

作者: 小鼹鼠 时间: 2011-8-13 16:53

N端和C端的差别怎么看，参数怎样修改才好，不会每个都试一下吧，你怎么修改的参数，另外我设计出来的怎么都是上千的大片段，怎么改成几百的，我还有一个基因，可能也是极品，自己设计了两对，摸了n多的条件，到现在也没扩出来，多谢了，再帮帮忙，好人做到底了。呵呵
gATAGCTGCC ATCGGCTGAC CTAGAGAAGA CACATCAGCT GATCCTTTGG 50
ACCCTCTGAC TTGAGACAGA AGTTCTGGGC TTCTCCTCCT GCGGCCTAGC 100
TCTGAGACAA TGAACGCTAC ACACTGCATC TTGGCTTTGC AGCTCTTCCT 150
CATGGCTGTT TCTGGCTGTT ACTGCCACGG CACAGTCATT GAAAGCCTAG 200
AAAGTCTGAA TAACTATTTT AACTCAAGTG GCATAGATGT GGAAGAAAAG 250
AGTCTCTTCT TGGATATCTG GAGGAACTGG CAAAAGGATG GTGACATGAA 300
AATCCTGCAG AGCCAGATTA TCTCTTTCTA CCTCAGACTC TTTGAAGTCT 350
TGAAAGACAA TCAGGCCATC AGCAACAACA TAAGCGTCAT TGAATCACAC 400
CTGATTACTA CCTTCTTCAG CAACAGCAAG GCGAAAAAGG ATGCATTCAT 450
GAGTATTGCC AAGTTTGAGG TCAACAACCC ACAGGTCCAG CGCCAAGCAT 500
TCAATGAGCT CATCCGAGTG GTCCACCAGC TGTTGCCGGA ATCCAGCCTC 550
AGGAAGCGGA AAAGGAGTCG CTGCTGATTC GGGGTGGGGA AGAGATTGTC 600
CCAATAAGAA TAATTCTGCC AGCACTATTT GAATTTTTAA ATCTAAACCT 650
ATTTATTAAT ATTTAAAACT ATTTATATGG AGAATCTATT TTAGATGCAT 700
CAACCAAAGA AGTATTTATA GTAACAACTT ATATGTGATA AGAGTGAATT 750
CCTATTAATA TATGTGTTAT TTATAATTTC TGTCTCCTCA ACTATTTCTC 800
TTTGACCAAT TAATTATTCT TTCTGACTAA TTAGCCAAGA CTGTGATTGC 850
GGGGTTGTAT CTGGGGGTGG GGGACAGCCA AGCGGCTGAC TGAACTCAGA 900
TTGTAGCTTG TACCTTTACT TCACTGACCA ATAAGAAACA TTCAGAGCTG 950
CAGTGACCCC GGGAGGTGCT GCTGATGGGA GGAGATGTCT ACACTCCGGG 1000
CCAGCGCTTT AACAGCAGGC CAGACAGCAC TCGAATGaGT CAGGTAGTAA 1050
CAGGCTGTCC CTGAAAGAAA GCAGTGTCTC AAGAGACTTG ACACCTGGTG 1100
CTTCCCTATA CAGCTGAAAA CTGTGACTAC ACCCGAATGA CAAATAACTC 1150
GCTCATTTAT AGTTTATCAC TGTCTAATTG CATATGAATA AAGTATACCT 1200
TTGCAACC

作者: 小鼹鼠 时间: 2011-8-13 16:54

自己搞了几个，好像要把整个都扩出来，太大了吧，不知道这样出来的引物行不行，条件放的太宽吧

作者: 小鼹鼠 时间: 2011-8-13 16:55

1你怎么修改的参数？
根据结果里面，哪一项不符合，然后适当的把条件放宽。
2都是上千的大片段，怎么改成几百的？
我看不懂引物长度是有限制的啊
3还有一个基因，可能也是极品
授人以鱼，不如授人以渔，对不对？

作者: 小鼹鼠 时间: 2011-8-13 16:55

这个非常好设计啊，把tm稍微降低就可以了啊，而且肯定也不会影响效率的啊

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http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=8259

作者: 小鼹鼠 时间: 2011-8-13 16:56

我也是看那项不符合再修改那项，不知道这样放宽条件设计的引物好用吗，你有没有试过这样的能P出来吗？
这个扩出来的是1208bp，太长了吧，引物长度是可以改，但是跟PCR产物的长度没有关系吧，我是想问怎么设计几百的PCR产物长度。多谢了，这个设计软件的网站很好用。

作者: 小鼹鼠 时间: 2011-8-13 16:56

请教：
我需要在引物上引入酶切位点怎么办呢？就是有几个碱基会和模板不匹配，是直接把模板的相应位置的碱基修改之后再贴上去搜索引物吗？

作者: 小鼹鼠 时间: 2011-8-13 16:56

请问P的片段哪里搞呀

作者: 小鼹鼠 时间: 2011-8-13 16:57

请教下要设计巢式PCR的引物又该怎么设计呢？要引入酶切位点又该怎么办呢？

作者: 小鼹鼠 时间: 2011-8-13 16:57

我现在按照你提供的网址检索大鼠的GnRH及受体的引物,象没有,不知道是我的操作问题,还是其他原因？

作者: 小鼹鼠 时间: 2011-8-13 16:57

你要扩的片段序列未知是吗？

作者: 小鼹鼠 时间: 2011-8-13 16:58

你好，我根据你上面的信息做了设计，请你帮忙看一下这么改合适吗，谢谢！ Get primers

Primers for PCR

There were 0 forward primers in the valid range for GC content.

ERROR
The GC range was too stringent, no primers were found in that range
然后我将Minimum GC: ４０ Maximum GC: 70
出来以下结果Primers for PCR

There were 39 forward primers in the valid range for GC content.
There were 66 reverse primers in the valid range for GC content.
There were 19 forward primers in the valid range for melting temperature.
There were 11 reverse primers in the valid range for melting temperature.
There were 19 forward primers with valid self anneal values.
There were 11 reverse primers with valid self anneal values.
There were 19 forward primers with valid self end anneal values.
There were 11 reverse primers with valid self end anneal values.

There were 209 pairs of valid primers.

This is the BEST pair of primers

List of all valid pairs of primers

然后我用This is the BEST pair of primers是不是就ｏｋ了

作者: 小鼹鼠 时间: 2011-8-13 16:58

楼主,你好,我现在做RT-PCR已经从年前做到现在了,还是P不出来,条件换了好多了就是不行,郁闷!现在我考虑是不是引物设计的有问题啊,我用了你推荐的软件还是弄不出来.能不能请楼主帮我看看,大鼠的BACE1,上游:5'-AGACGCTCAACATCCTGGTG-3'
下游:5'-CCTGGGTGTAGGGCACATAC-3',下面是其目的基因序列:
1 ccccagcctg cctaggtgct gggagccggg agctggatta tggtggcctg agcagccgac
61 gcagccgcag gagctgggag tccctcacgc tgcaaagtcc gcctggaaga ccctgaaagc
121 tgcaggctcc gatagccatg cccgcccctc ccagccccac aaggggcccg atccccccgc
181 tgaggctggc ggtcgccgtc cagatgtagc tgggtccccc ggatcgccat cgtcctcttc
241 tctcgtgcgc tacagatttc tcctgcccac tctccaccgc cgggagcagg aactgagcga
301 ggggcctgca gactctgcag tcctgatgcc cccgaggccg ctctcctgag agaagccacc
361 accacccaga cttaggggca ggcaagaggg acagtcgcca accggagcca caaggcccgg
421 gctcaccatg gccccggcgc tgcgctggct cctgctatgg gtgggctcgg gaatgctgcc
481 tgcccaggga acccatctcg gtatccgact gccccttcgc agcggcctgg cagggccacc
541 cctgggcctg aggctgcccc gggagacgga cgaggaacct gaggagcctg gccggagagg
601 cagctttgtg gagatggtgg acaacctgag gggaaagtcc ggccagggct actatgtgga
661 gatgaccgtg ggcagccccc cacagacgct caacatcctg gtggacacgg gcagtagtaa
721 ttttgcagtg ggggctgccc cacacccttt cctgcatcga tactaccaaa ggcagctgtc
781 cagtacatac cgagacctcc gaaagtctgt gtatgtgccc tacacccagg gcaagtggga
841 gggggaactg ggcactgacc tggtgagcat ccctcatggc cccaacgtca ctgtgcgtgc
901 caacattgct gccatcactg aatcggacaa gttcttcatc aatggttcca actgggaggg
961 catcctaggg ctggcctatg ctgagattgc caggcctgac gactccttgg agcccttttt
1021 tgactccctg gtgaagcaga cccacattcc gaacatcttt tccctgcagc tctgtggcgc
1081 tggcttcccc ctcaaccaga ctgaggcact ggcctcggtg ggagggagca tgatcattgg
1141 tggtatcgac cattccctat acactggcag tctctggtac acacccatcc ggcgggagtg
1201 gtattatgaa gtgatcattg tacgtgtaga aatcaatggt caagatctga aaatggactg
1261 caaggagtac aactatgaca agagcatcgt ggacagtggc accaccaacc ttcgtttgcc
1321 caagaaagta tttgaagctg cagtcaagtc catcaaggca gcctcctcga cggagaagtt
1381 cccggatggc ttttggctag gggagcagct ggtgtgctgg caagcaggca cgaccccttg
1441 gaacattttc ccagtcattt cactttacct catgggtgaa gtcaccaatc agtccttccg
1501 catcaccatc cttcctcagc aatacctacg gccagtggaa gatgtggcca cgtcccaaga
1561 cgactgttac aagttcgccg tctcacagtc atccacaggc accgttatgg gagcggtcat
1621 catggaaggc ttctatgtgg tctttgatcg agcccgaaag cgaattggct ttgctgtcag
1681 cgcttgccat gtgcacgatg agttcaggac ggcggcagtg gaaggtccgt ttgtcacggc
1741 agacatggaa gactgtggct acaacattcc acagacagat gagtcaacac ttatgaccat
1801 agcctatgtc atggctgcca tctgcgccct cttcatgttg ccactctgcc tcatggtatg
1861 tcagtggcgc tgcctacgct gcctgcgcca tcagcatgat gactttgctg atgacatctc
1921 cctgctgaaa taaggaggcc agtgggcaga tgacagagat ccccctggac cacatctggg
1981 tggttccctt tggtcacgtg agttggagat atggatggta cctgtggcca gagcacctca
2041 ggaccctcac caacctgccg aatgcttctg ccttgacaga aaagagacac ttggcaagct
2101 ggattacagg gcttgcaagg gctgtttgaa acaggaggga gaaagcagca ttctggtg
还有一个是大鼠的APP,上游:5'-GGATGCGGAGTTCGGACATG-3'
下游:5'-GTTCTGACTCTGCTCAAAG-3' 其目的基因序列为:
1 gtttcctcgg cggcgggagg cgagagcacc gggagcagag cgagcgcggg gccaccggag
61 acggcggcgg cggcgcggac acagccaggg cgcggcggat cttccactcg cacacggagc
121 actcggtggc ccacgcagga tcacgatgct gcccagcttg gcactgctcc tgctggccgc
181 ctggacggtt cgggctctgg aggtacccac tgatggcaac gccgggctgc tggcagaacc
241 ccagatcgcc atgttctgtg gtaaactcaa catgcacatg aatgtgcaga atggaaagtg
301 ggagtcagac ccgtcaggga ccaaaacctg cattggcacc aaggagggca tcttgcagta
361 ctgccaagag gtctaccctg aactgcagat cacaaacgtg gtggaagcca accagccagt
421 gaccatccag aactggtgca agcggggccg caagcagtgc aagacacaca cccacatcgt
481 gattccttac cgttgcctag ttggtgagtt tgtgagcgac gcccttctcg tgcccgacaa
541 gtgcaagttc ctacaccagg agcggatgga tgtttgtgag acccatcttc actggcacac
601 cgtcgccaaa gagacatgca gcgagaagag cactaacttg cacgactatg gcatgctgct
661 gccctgcggc atcgacaagt tccgaggggt agagtttgta tgctgcccgt tggccgagga
721 aagcgacagc gtggattctg cggatgcaga ggaggatgac tctgatgtct ggtggggtgg
781 agcggacaca gactacgctg atggcggtga agacaaagta gtagaagtcg ccgaagagga
841 ggaagtggct gatgttgagg aagaggaagc tgatgatgat gaggatgtgg aggatgggga
901 cgaggtggag gaggaggccg aggagcccta cgaagaggcc accgagagaa caaccagcac
961 tgccaccacc accacaacca ccactgagtc cgtggaggag gtggtccgag ttcccacgac
1021 agcagccagc acccccgacg ccgtcgacaa gtacctggag acacccgggg acgagaacga
1081 gcatgcccat ttccagaaag ccaaagagag gctggaagcc aagcaccgag agagaatgtc
1141 ccaggtcatg agagaatggg aagaggcaga gcgtcaagcc aagaacttgc ccaaagctga
1201 caagaaggcc gttatccagc atttccagga gaaagtggaa tctctggaac aggaagcagc
1261 caatgagaga cagcagcttg tagagacaca catggccaga gttgaagcca tgctcaatga
1321 ccgccgccgc ctggccctcg agaattacat cactgcactg caggcggtgc ccccaaggcc
1381 tcatcatgtg ttcaacatgc tgaagaagta cgtccgtgcg gagcagaaag acagacagca
1441 caccctaaag cattttgaac atgtgcgcat ggtggacccc aagaaagctg ctcagatccg
1501 gtcccaggtt atgacacacc tccgtgtgat ctacgagcgc atgaaccagt ctctgtccct
1561 gctctacaat gtccctgcgg tggctgagga gattcaagat gaagtcgatg agctgcttca
1621 gaaggagcag aactactccg acgatgtctt ggccaacatg atcagtgagc ccagaatcag
1681 ctacggaaac gacgctctca tgccttcgct gacggaaacc aagaccaccg tggagctcct
1741 tcccgtgaat ggggaattca gcctggatga cctccagccg tggcaccctt ttggggtgga
1801 ctctgtgcca gccaataccg aaaatgaagt cgagcctgtt gacgcccgcc ccgctgctga
1861 ccgaggactg accactcgac caggttctgg gctgacaaac atcaagacgg aagagatctc
1921 ggaagtgaag atggatgcag aattcggaca tgattcagga tttgaagtcc gccatcaaaa
1981 actggtgttc tttgctgaag atgtgggttc gaacaaaggc gccatcatcg gactcatggt
2041 gggcggcgtt gtcatagcaa ccgtgattgt catcaccctg gtgatgttga agaagaaaca
2101 gtacacatcc atccatcatg gcgtggtgga ggtcgacgcc gccgtgaccc cagaggagcg
2161 ccatctctcc aagatgcagc agaacggata tgagaatcca acttacaagt tctttgagca
2221 aatgcagaac taagccccac ccgcgccaca gcagcggcct ctgaacttgg acagcgaaac
2281 cattgcttca ctacccatcg gtgttcattt ataaaataac gtggaaagaa acaaaccctt
2341 ccgtttattt actcaccctc ggcttttgac agctgtgctg taacacaagt agatgcctga
2401 acttgaatta atatacaaat cagtaatgta ttctcgcttt ctctctttac attctggtct
2461 ctacattaca tgattcatgg gttttgtgta ctgtaaaaaa aaaaattagc tgtatcaaac
2521 tagtgcatga atagattctc tcctaattat ttatcacata catagcccct tagcccgttg
2581 tatattattc ttgtggtttg tggcccggaa aaaactccta cttgaaatat gctttaaaaa
2641 tcgatggggg atgcttcttg tgaacgtggg cgtctagctg cttctcctac gtattctttt
2701 cctgatcact atgcattttg aacatttttt taagtattcc aaatgactta gaaaattctt
2761 tttccatgac tgcatcttac tgtacagatt gctgcttctg ctctctttgt gatataggaa
2821 taagaggata cacattgatt tctttgtgcc tgttttatgt gcacacatta ggcattgaga
2881 atttgaacat tttttttgtc catgtatctt tggatctttg ataaaaaaaa attaaaaaaa
2941 aattatccct gttcatcata agcactttta cgggtggggg gagggagtgt tctgctggtc
3001 tccaattacc aagaattctc caaaaattaa ttttctgcag gatgattgta cagaatcatt
3061 gcttatgcca tgatagcttt ctacactgta ttacataaat aaattaaata aaataactcc
3121 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa

作者: 小鼹鼠 时间: 2011-8-13 16:58

给大家提供一些设计引物注意事项，这是有经验的教授告诉我的，他们用眼睛就能看出来:

1．引物必须位于起始密码子与终止密码子之间，即CDS之间
Start coding: AUG ( atg )
Stop coding: UAA、UAG、UGA ( taa tag tga )
2．要使目标序列与内参在同一胶中电泳则扩增片断长度要差开。且Tm要互相接近
3．引物终止于G或C比较好。

作者: 小鼹鼠 时间: 2011-8-13 16:59

1 cctccgaaac catgaacttt ctgctctctt gggtgcactg gaccctggct ttactgctgt
61 acctccacca tgccaagtgg tgaagttcat ggacgtctac cagcgcagct attgccgtcc
121 aattgagacc ctggtggaca tcttccagga gtaccccgat gagatagagt atatcttcaa
181 gccgtcctgt gtgcccctaa tgcggtgtgc gggctgctgc aatgatgaag ccctggagtg
241 cgtgcccacg tcggagagca acgtcactat gcagatcatg cggatcaaac ctcaccaaag
301 ccagcacata ggagagatga gcttcctgca gcatagcaga tgtgaatgca gaccaaagaa
361 agatagaaca aagccagaaa atcactgtga gccttgttca gagcggagaa agcatttgtt
421 tgtccaagat ccgcagacgt gtaaatgttc ctgcaaaaac acagactcgc gttgcaaggc
481 gaggcagctt gagttaaacg aacgtacttg cagatgtgac aagccaaggc ggtgagccgg
541 g
版主:你好.以上是我的原文序列,麻烦你帮我设计一下引物好吗,谢谢!

作者: 小鼹鼠 时间: 2011-8-13 17:01

楼主你好！我想问一下，这个软件是不是只能设计已知片段的引物？但在许多情况下，我们所扩增的都是未知的片段，所以如果是设计未知片段的引物，有什么比较好的软件吗？

作者: 小鼹鼠 时间: 2011-8-13 17:02

1 tgcgttcgcg ggacccacgg gctcgcccca gcctacactc cgactgtttg ccacctcctc
61 ctgcctcctc ccctcccttc cccgccctcc agtacacttg atcactgaag cttcgagctg
121 cgcggccggg gcgtccctgc gcctctctcc ccaagacctg cgcgctcttg cggctcggac
181 ggtcgctcgc ctggctctac tccacttggc cgtctctgtg tgcagtcgca gaacttcgaa
241 gtggggtttg cgctgcggca ggggcgtttc gcttttgttt ggttttgttg tttatttcat
301 ttcatttttt ttttttttcg gagagaggcg aggcggtggt ccacacccgc ccggggagga
361 agatgtcaaa cgtgagagtg tctaacggga gcccgagcct ggagcggatg gacgccagac
421 aaaccgagca ccccaagcct tccgcctgca gaaacctctt cggcccggtc aatcatgaag
481 aactaacccg ggacttggag aagcactgcc gagatatgga agaagcgagc cagcgcaagt
541 ggaatttcga ctttcagaat cataagcccc tggagggcag atacgagtgg caggaggtgg
601 agaggggcag cttgcccgag ttctactaca gacccccgcg cccccccaag agcgcctgca
661 aggtgccggc gcaggagagc ttggatgtca gcgggagccg ccaggcggtg ccttcaattg
721 ggtctcaggc aaactctgag gaccggcatt tggtggacca aatgcctgac tcgtcagaca
781 gtccggctgg gttagcggag cagtgtccag ggatgaggaa gcgacctgcg gcagaagatt
841 cttcttcgca aaacaaaagg gccagcagaa cagaagaaaa tgtttcagac ggttccccga
901 atgctggcac tgtggagcag acgcccaaga agcccggcct tcgacgccag acgtaaacag
961 ctccgaatta agaataattc cttgtttatt agatacatca ctgctttatg aagcaaggaa
1021 gacatacatg aaaaaaa

还得麻烦版主帮我设计引物，以上是原文序列！
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• 《丁香园-医园》（普及版）（第十五期8月10日发布）

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1 cccaggttcc ggctcctctg ccccgcggct acaaacccca ccgcggagga agttggttga
61 acttgctttc cgctgcgggt acgaaggtat cgtcacaagt agcagcatca tgtcgactgg
121 ggacagtttt gagactcggt ttgaaaaaat cgacaacctg ctgcgggatc ccaaatcgga
181 agtgaattca gattgtttgc tggatggatt ggatgctttg gtttatgatt tggattttcc
241 tgccttaaga aaaaacaaaa atattgacaa ctttctaagc agatataaag acacaataaa
301 taaaattaga gatttacgga tgaaagctga agattatgaa gtagtaaagg taatcggcag
361 aggtgcattt ggagaagttc aattggtaag gcataaatcc accaggaagg tttatgctat
421 gaagcttctc agcaaatttg aaatgattaa gagatctgat tctgcttttt tctgggaaga
481 aagggacatc atggcatttg ccaatagtcc ttgggttgtt cagctttttt atgcattcca
541 agatgaccga tatctctata tggtgatgga gtacatgcct ggtggagacc ttgtaaacct
601 gatgagcaac tacgatgtgc ctgaaaagtg ggcacgattc tatactgcag aagtagttct
661 cgcattggat gcratccatt ccatgggttt tattcataga gatgtgaagc ctgacaacat
721 gctgctggat aagtctggac atttgaagtt agccgacttt ggtacttgta tgaagatgaa
781 taaggaaggt atggtacgat gtgatacagc agttggaaca cctgattata tttcacctga
841 agtattaaaa tcacaaggcg gtgatggcta ttatggacga gagtgtgact ggtggtcagt
901 tggtgtattt ttatatgaaa tgcttgtagg tgatacacct ttttatgcag attctttggt
961 tgggacgtac agtaaaatta tgaaccataa aaattcactt actttccctg atgataatga
1021 catatcaaaa gaggcgaaaa atctcatttg tgccttcctt acggacagag aagtgagatt
1081 gggcagaaat ggtgtagagg aaatcaaacg tcatctcttc ttcaaaaatg atcagtgggc
1141 ttgggaaacg ctccgagaca ctgtagcacc agttgtgcct gatttaagta gtgacattga
1201 tactagtaat tttgatgact tagaagaaga taaaggagat gaagaaacat ttcctattcc
1261 aaaagctttt gttggcaatc agctaccttt tgtaggattt acatattata gcaatcgtag
帮朋友的忙，要我发帖，请版主帮忙设计一下引物，谢谢！

作者: 小鼹鼠 时间: 2011-8-13 17:02

LZ你好，我的问题就更麻烦了，我需要的DNA序列只能从已知的蛋白质序列经逆翻译得到，然后还要设计引物，作PCR。有人给我提供了一个软件cuturl('http://www.bioinformatics.org/sms2/rev_trans.html')，可以直接翻译蛋白质序列，但得到的DNA序列设计引物时总是出错。LZ能帮我一下吗？

这是鸵鸟的一种蛋白质序列：
APGNKAECEREKGYCGFLKCSFPFVVSGKCSRFFFCCKNIW
请帮我翻译一下，再帮忙设计个引物，十分感谢！

作者: 小鼹鼠 时间: 2011-8-13 17:03

请问上下游引物的Tm值和GC含量相差很多没关系吗

作者: 小鼹鼠 时间: 2011-8-13 17:03

我想还是不要相差太大吧，因为本身这条链就不是很厂，我怕到时候扩不出来，谢谢帮助！

作者: 小鼹鼠 时间: 2011-8-13 17:03

MS不适用于扩基因组的

作者: 小鼹鼠 时间: 2011-8-13 17:04

我改了很多设置,结果都是
"The parameters given did not yield any valid primer pairs."
我就不知道是哪出问题了,请教高手们帮忙看一下行吗?
片段序列如下:
1 agtcccctct aaacacgggg gatgtcggac tgtctggctg gaagacagag cttcatttag
61 gagctacctc taaccccctc cctgctgagt gccctggggc ccttgctggt tcagcttcct
121 ccctcctcat gaaaagactc gccatgagct ctcagagcct gggacaaaag gcaccgggga
181 ggacccccag cccctatcaa gtcctgctgc caggtgttct gccctgaacg gccttggaga
241 agagaacaca catccatcat cttctacctt gggaggtgga agcgggggtc ctctctacac
301 agcagtcagg accccagatg gtaaagccct tcacgccatc tgctgggctc ctacctgagc
361 aagctcagag gcacatgaga aggggaggca gctgcctgga gaccctctct cccccaggcc
421 cacctgtctg caacccagct gaggccatgc cctccccagg gaccgtctgc agcctcctgc
481 tcctcggcat gctctggctg gacttggcca tggcaggctc cagcttcctg agccctgaac
541 accagagagt ccag
拜托了!

作者: 小鼹鼠 时间: 2011-8-13 17:04

楼主您好，我用了您提供的方法，所能改的参数都试了，可是没有引物。楼主我想做表达，您能帮我在开放框两端设计一对引物吗？我用PRIMER5，OLIGO6设计了多对引物去做了3个月，还是P不出来，急急！！！
GAGGCCGGGCAGGGGGCGGGGCCGGCGAATGCCCGTCCCGACCCGTCGCGCCTCCCCTGTTAGCTCCCTGCCAGCCGAGGCGGGGCGAACCTCTGCCCTGTTGCGTGGGAGTGACTCACAGCTCCCGCCCCTTTTGGCTCCGCTTTCTCGCGGCCAGTCCCTCGCACCACGTGCCCTCCTGGCCGCGCCCCCAGCTGCCCTTTCCAACTGCCTGTTGGAAGCCGCTGTAAAACGTCGTGAGGAGCGCCGCTGCTTTACGGCTGCCTCTCCCAGACTAGAGCCCCGGAGCGCCCACCGCCGTCAGCCGCGTCTTCAAGCTAGTCGGCCCCGCGGAGAGCGAGAGACCCTGCGCACCGCAGCCCTCTCCGCTGCGCCCATTCCTGCCGCCGGCGATGTAACTCGGGGAGGCAGCGGTGCCCGCTGGCCCGGGGTTGAGACAGGCGGCAGGTGCCTGTGAGGCGGGCGGGTGCCGGGGGCCAGCAGG（起始密码子）ATGGAGGAAAGCATGGAAGAGGAGGAGGGGGGCAGCTACGAGGCGATGATGGACGACCAGAACCACAACAACTGGGAGGCTGCGGTGGACGGCTTCCGGCAGCCCCTGCCACCTCCGCCGCCCCCCTCGTCGATCCCGGCCCCTGCCCGAGAGCCTCCGGGGGGGCAGCTGCTGGCGGTGCCCGCGGTCTCCGTGGACAGGAAAGGCCCCAAGGAGGGGCTCCCGATGGGGCCGCAGCCACCGCCGGAGGCTAATGGGGTGATCATGATGTTGAAGAGCTGCGACGCGGCCGCCGCCGTGGCCAAGGCGGCCCCCGCCCCCACCGCCAGCTCCACCATCAACATCAACACCTCCACCTCCAAGTTCTTAATGAATGTTATAACTATTGAAGATTATAAGAGCACATACTGGCCAAAATTGGATGGTGCCATAGATCAACTTTTAACTCAGAGTCCTGGTGACTATATCCCCATATCCTATGAACAGATATACAGTTGTGTGTATAAATGTGTATGCCAGCAGCACTCGGAACAGATGTATAGTGATCTGATTAAAAAGATAACTAATCACTTAGAGAGAGTCTCAAAGGAGCTGCAGGCCAGCCCTCCAGATCTCTATATTGAAAGATTTAATATAGCTCTTGGACAATATATGGGAGCATTGCAGAGCATTGTGCCTCTTTTCATATATATGAATAAGTTTTACATCGAAACCAAGCTTAACAGAGACTTAAAAGATGACCTTATAAAGCTGTTTACGGAACATGTTGCAGAAAAGCACATTTACAGCCTAATGCCTTTACTTTTAGAAGCCCAGTCAACACCATTTCAGGTCACACCTTCAACTATGGCAAATATTGTGAAAGGCCTGTATACCCTCAGACCAGTAGTGGGTTCAGATGGCTCCAACTCTATTTTCTAA(终止密码子)ATTTATTCCAAACATTCTCCCTCCGGCGGTGGAATCTGAACTTTCTGAATATGCTGCTCAAGATCAGAAATTTCAAAGAGAACTTATACAGAATGGTTTTACAAGGGGTGACCAGTCCCGGAAGAGAGCTGGGGATGAGTTGGCTTATAATAGCTCGTCAGCATGTGCAAGTTCCAGGGGGTACAGATAGTGAATGTATTGAATATGCTTTCCTTCCTGAAAAGAGGACACACTGGAGCTGCAGAGACTGTATTCAGAGCACAGTGGGGGCTGCACACACTCAGGAGCTCTGTCACAAAGCTGTTCATGGAAGAGGATGTTGGACTTCTTACTTGGTTTGTAATTTTAAAACAAAAACTAAAAAAAAAAAAAAC

作者: 小鼹鼠 时间: 2011-8-13 17:05

恩，我试用了一下，果然很好用，但是真正结果还不知道，等扩出来就知道了

作者: 小鼹鼠 时间: 2011-8-13 17:05

楼主，您好，看了你的介绍很受用，自己也学着设计了一下，请问，为什么我设计的几对引物扩出来的长度都是1170bp?是不是可以自己设定呢? 我想扩全长怎么弄呢?请赐教,谢谢!

作者: 小鼹鼠 时间: 2011-8-13 17:06

我的参数也改了很多,但是还是说"ERROR",请帮忙找一下,谢谢!
1 gccctcgccg cccgcggcgc cccgagcgct ttgtgagcag atgcggagcc gagtggaggg
61 cgcgagccag atgcggggcg acagctgact tgctgagagg aggcggggag gcgcggagcg
121 cgcgtgtggt ccttgcgccg ctgacttctc cactggttcc tgggcaccga aagataaacc
181 tctcataatg aaggcccccg ctgtgcttgc acctggcatc ctcgtgctcc tgtttacctt
241 ggtgcagagg agcaatgggg agtgtaaaga ggcactagca aagtccgaga tgaatgtgaa
301 tatgaagtat cagcttccca acttcaccgc ggaaacaccc atccagaatg tcattctaca
361 tgagcatcac attttccttg gtgccactaa ctacatttat gttttaaatg aggaagacct
421 tcagaaggtt gctgagtaca agactgggcc tgtgctggaa cacccagatt gtttcccatg
481 tcaggactgc agcagcaaag ccaatttatc aggaggtgtt tggaaagata acatcaacat
541 ggctctagtt gtcgacacct actatgatga tcaactcatt agctgtggca gcgtcaacag
601 agggacctgc cagcgacatg tctttcccca caatcatact gctgacatac agtcggaggt
661 tcactgcata ttctccccac agatagaaga gcccagccag tgtcctgact gtgtggtgag
721 cgccctggga gccaaagtcc tttcatctgt aaaggaccgg ttcatcaact tctttgtagg
781 caataccata aattcttctt atttcccaga tcatccattg cattcgatat cagtgagaag
841 gctaaaggaa acgaaagatg gttttatgtt tttgacggac cagtcctaca ttgatgtttt
901 acctgagttc agagattctt accccattaa gtatgtccat gcctttgaaa gcaacaattt
961 tatttacttc ttgacggtcc aaagggaaac tctagatgct cagacttttc acacaagaat
1021 aatcaggttc tgttccataa actctggatt gcattcctac atggaaatgc ctctggagtg
1081 tattctcaca gaaaagagaa aaaagagatc cacaaagaag gaagtgttta atatacttca
1141 ggctgcgtat gtcagcaagc ctggggccca gcttgctaga caaataggag ccagcctgaa
1201 tgatgacatt cttttcgggg tgttcgcaca aagcaagcca gattctgccg aaccaatgga
1261 tcgatctgcc atgtgtgcat tccctatcaa atatgtcaac gacttcttca acaagatcgt
1321 caacaaaaac aatgtgagat gtctccagca tttttacgga cccaatcatg agcactgctt
1381 taataggaca cttctgagaa attcatcagg ctgtgaagcg cgccgtgatg aatatcgaac
1441 agagtttacc acagctttgc agcgcgttga cttattcatg ggtcaattca gcgaagtcct
1501 cttaacatct atatccacct tcattaaagg agacctcacc atagctaatc ttgggacatc
1561 agagggtcgc ttcatgcagg ttgtggtttc tcgatcagga ccatcaaccc ctcatgtgaa
1621 ttttctcctg gactcccatc cagtgtctcc agaagtgatt gtggagcata cattaaacca
1681 aaatggctac acactggtta tcactgggaa gaagatcacg aagatcccat tgaatggctt
1741 gggctgcaga catttccagt cctgcagtca atgcctctct gccccaccct ttgttcagtg
1801 tggctggtgc cacgacaaat gtgtgcgatc ggaggaatgc ctgagcggga catggactca
1861 acagatctgt ctgcctgcaa tctacaaggt tttcccaaat agtgcacccc ttgaaggagg
1921 gacaaggctg accatatgtg gctgggactt tggatttcgg aggaataata aatttgattt
1981 aaagaaaact agagttctcc ttggaaatga gagctgcacc ttgactttaa gtgagagcac
2041 gatgaataca ttgaaatgca cagttggtcc tgccatgaat aagcatttca atatgtccat
2101 aattatttca aatggccacg ggacaacaca atacagtaca ttctcctatg tggatcctgt
2161 aataacaagt atttcgccga aatacggtcc tatggctggt ggcactttac ttactttaac
2221 tggaaattac ctaaacagtg ggaattctag acacatttca attggtggaa aaacatgtac
2281 tttaaaaagt gtgtcaaaca gtattcttga atgttatacc ccagcccaaa ccatttcaac
2341 tgagtttgct gttaaattga aaattgactt agccaaccga gagacaagca tcttcagtta
2401 ccgtgaagat cccattgtct atgaaattca tccaaccaaa tcttttatta gtggtgggag
2461 cacaataaca ggtgttggga aaaacctgaa ttcagttagt gtcccgagaa tggtcataaa
2521 tgtgcatgaa gcaggaagga actttacagt ggcatgtcaa catcgctcta attcagagat
2581 aatctgttgt accactcctt ccctgcaaca gctgaatctg caactccccc tgaaaaccaa
2641 agcctttttc atgttagatg ggatcctttc caaatacttt gatctcattt atgtacataa
2701 tcctgtgttt aagccttttg aaaagccagt gatgatctca atgggcaatg aaaatgtact
2761 ggaaattaag ggaaatgata ttgaccctga agcagttaaa ggtgaagtgt taaaagttgg
2821 aaataagagc tgtgagaata tacacttaca ttctgaagcc gttttatgca cggtccccaa
2881 tgacctgctg aaattgaaca gcgagctaaa tatagagtgg aagcaagcaa tttcttcaac
2941 cgtccttgga aaagtaatag ttcaaccaga tcagaatttc acaggattga ttgctggtgt
3001 tgtctcaata tcaacagcac tgttattact acttgggttt ttcctgtggc tgaaaaagag
3061 aaagcaaatt aaagatctgg gcagtgaatt agttcgctac gatgcaagag tacacactcc
3121 tcatttggat aggcttgtaa gtgcccgaag tgtaagccca actacagaaa tggtttcaaa
3181 tgaatctgta gactaccgag ctacttttcc agaagatcag tttcctaatt catctcagaa
3241 cggttcatgc cgacaagtgc agtatcctct gacagacatg tcccccatcc taactagtgg
3301 ggactctgat atatccagtc cattactgca aaatactgtc cacattgacc tcagtgctct
3361 aaatccagag ctggtccagg cagtgcagca tgtagtgatt gggcccagta gcctgattgt
3421 gcatttcaat gaagtcatag gaagagggca ttttggttgt gtatatcatg ggactttgtt
3481 ggacaatgat ggcaagaaaa ttcactgtgc tgtgaaatcc ttgaacagaa tcactgacat
3541 aggagaagtt tcccaatttc tgaccgaggg aatcatcatg aaagatttta gtcatcccaa
3601 tgtcctctcg ctcctgggaa tctgcctgcg aagtgaaggg tctccgctgg tggtcctacc
3661 atacatgaaa catggagatc ttcgaaattt cattcgaaat gagactcata atccaactgt
3721 aaaagatctt attggctttg gtcttcaagt agccaaaggc atgaaatatc ttgcaagcaa
3781 aaagtttgtc cacagagact tggctgcaag aaactgtatg ctggatgaaa aattcacagt
3841 caaggttgct gattttggtc ttgccagaga catgtatgat aaagaatact atagtgtaca
3901 caacaaaaca ggtgcaaagc tgccagtgaa gtggatggct ttggaaagtc tgcaaactca
3961 aaagtttacc accaagtcag atgtgtggtc ctttggcgtg ctcctctggg agctgatgac
4021 aagaggagcc ccaccttatc ctgacgtaaa cacctttgat ataactgttt acttgttgca
4081 agggagaaga ctcctacaac ccgaatactg cccagacccc ttatatgaag taatgctaaa
4141 atgctggcac cctaaagccg aaatgcgccc atccttttct gaactggtgt cccggatatc
4201 agcgatcttc tctactttca ttggggagca ctatgtccat gtgaacgcta cttatgtgaa
4261 cgtaaaatgt gtcgctccgt atccttctct gttgtcatca gaagataacg ctgatgatga
4321 ggtggacaca cgaccagcct ccttctggga gacatcatag tgctagtact atgtcaaagc
4381 aacagtccac actttgtcca atggtttttt cactgcctga cctttaaaag gccatcgata
4441 ttctttgctc ttgccaaaat tgcactatta taggacttgt attgttattt aaattactgg
4501 attctaagga atttcttatc tgacagagca tcagaaccag aggcttggtc ccacaggcca
4561 cggaccaatg gcctgcagcc gtgacaacac tcctgtcata ttggagtcca aaacttgaat
4621 tctgggttga attttttaaa aatcaggtac cacttgattt catatgggaa attgaagcag
4681 gaaatattga gggcttcttg atcacagaaa actcagaaga gatagtaatg ctcaggacag
4741 gagcggcagc cccagaacag gccactcatt tagaattcta gtgtttcaaa acacttttgt
4801 gtgttgtatg gtcaataaca tttttcatta ctgatggtgt cattcaccca ttaggtaaac
4861 attccctttt aaatgtttgt ttgttttttg agacaggatc tcactctgtt gccagggctg
4921 tagtgcagtg gtgtgatcat agctcactgc aacctccacc tcccaggctc aagcctcccg
4981 aatagctggg actacaggcg cacaccacca tccccggcta atttttgtat tttttgtaga
5041 gacggggttt tgccatgttg ccaaggctgg tttcaaactc ctggactcaa gaaatccacc
5101 cacctcagcc tcccaaagtg ctaggattac aggcatgagc cactgcgccc agcccttata
5161 aatttttgta tagacattcc tttggttgga agaatattta taggcaatac agtcaaagtt
5221 tcaaaatagc atcacacaaa acatgtttat aaatgaacag gatgtaatgt acatagatga
5281 cattaagaaa atttgtatga aataatttag tcatcatgaa atatttagtt gtcatataaa
5341 aacccactgt ttgagaatga tgctactctg atctaatgaa tgtgaacatg tagatgtttt
5401 gtgtgtattt ttttaaatga aaactcaaaa taagacaagt aatttgttga taaatatttt
5461 taaagataac tcagcatgtt tgtaaagcag gatacatttt actaaaaggt tcattggttc
5521 caatcacagc tcataggtag agcaaagaaa gggtggatgg attgaaaaga ttagcctctg
5581 tctcggtggc aggttcccac ctcgcaagca attggaaaca aaacttttgg ggagttttat
5641 tttgcattag ggtgtgtttt atgttaagca aaacatactt tagaaacaaa tgaaaaaggc
5701 aattgaaaat cccagctatt tcacctagat ggaatagcca ccctgagcag aactttgtga
5761 tgcttcattc tgtggaattt tgtgcttgct actgtatagt gcatgtggtg taggttactc
5821 taactggttt tgtcgacgta aacatttaaa gtgttatatt ttttataaaa atgtttattt
5881 ttaatgatat gagaaaaatt ttgttaggcc acaaaaacac tgcactgtga acattttaga
5941 aaaggtatgt cagactggga ttaatgacag catgattttc aatgactgta aattgcgata
6001 aggaaatgta ctgattgcca atacacccca ccctcattac atcatcagga cttgaagcca
6061 agggttaacc cagcaagcta caaagagggt gtgtcacact gaaactcaat agttgagttt
6121 ggctgttgtt gcaggaaaat gattataact aaaagctctc tgatagtgca gagacttacc
6181 agaagacaca aggaattgta ctgaagagct attacaatcc aaatattgcc gtttcataaa
6241 tgtaataagt aatactaatt cacagagtat tgtaaatggt ggatgacaaa agaaaatctg
6301 ctctgtggaa agaaagaact gtctctacca gggtcaagag catgaacgca tcaatagaaa
6361 gaactcgggg aaacatccca tcaacaggac tacacacttg tatatacatt cttgagaaca
6421 ctgcaatgtg aaaatcacgt ttgctattta taaacttgtc cttagattaa tgtgtctgga
6481 cagattgtgg gagtaagtga ttcttctaag aattagatac ttgtcactgc ctatacctgc
6541 agctgaactg aatggtactt cgtatgttaa tagttgttct gataaatcat gcaattaaag
6601 taaagtgatg caacatcttg taaaaaaaaa aaaaaaaaaa a

作者: 小鼹鼠 时间: 2011-8-13 17:06

These primers are for PCR
Forward-Primer ACTGGCATTGCACCCTTCC Reverse-Primer GTTGCCAGAATTCTCTGCACG
Length: 19 Length: 21
Percent GC: 57 Percent GC: 52
Tm: 57 Tm: 57
Self-Anneal: 12 Self-Anneal: 20
End-Anneal: 8 End-Anneal: 8
Offset: 1 Offset: 353

Pair-Anneal: 20
Pair-End-Anneal: 6
Total valid primer pairs: 1
谢谢楼主，请问下设计出来的引物如上，Tm值是否偏低？

作者: 小鼹鼠 时间: 2011-8-13 17:07

楼主你好！这个在线软件看起来比Oligo6.72、primer等软件简单，但该软件似乎只考虑了引物的长度范围、引物的退火温度、引物的GC含量范围，而没有关于引物之间能否形成二聚体方面的信息。而Oligo6.72评价引物则采取了多方面的评价，包括二聚体等信息，但缺点是提供了很多对引物，没有提供最好的，选择哪一对都要靠自己把握。
比如我想设计wnt3a mRNA的引物，基因系列见：cuturl('http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/viewer.fcgi?val=NM_033131.2') 。我把该基因序列copy进去后，提示The GC range was too stringent, no primers were found in that range。按照楼主提供的方法降低minimum GC值但仍然出现该提示语，所以我将maximum GC改成90，此时出现The Tm range was too stringent, no primers were found in that range，故将Maximum Tm改成70，此时出现The end anneal range was too stringent, no primers were found in that range，一直找不到－－－

作者: 小鼹鼠 时间: 2011-8-13 17:07

我按你的方法，在Select YES to Amplify a region with EXACT endpoints of the DNA sequence entered NO YES这一项中，选择yes则得不到结果，但是选择no每次都能得到结果，选择no得到的结果有什么问题？

作者: 小鼹鼠 时间: 2011-8-13 17:08

你好：我是个新手打算做RT-PCR，前几天在上海生工设计了引物，但看诸多网友说那的设计很差，很是担心，想能否请你帮看看，万分感谢！！
序列是： 1 gctgccgcgc cccgcccttt ctcggccccc ggagggtgac ggggtgaagg cgggggaacc
61 gaggtgggga gtccgccaga gctcccagac tgcgagcacg cgagccgccg cagccgtcac
121 ccgcgccgcg tcacggctcc cgggcccgcc ctcctctgac ccctcccctc tctccgtttc
181 cccctctccc cctcctccgc cgaccgagca gtgacttaag caacggagcg cggtgaagct
241 catttttctc cttcctcgca gccgcgccag ggagctcgcg gcgcgcggcc cctgtcctcc
301 ggcccgagat gaatcctgcg gcagaagccg agttcaacat cctcctggcc accgactcct
361 acaaggttac tcactataaa caatatccac ccaacacaag caaagtttat tcctactttg
421 aatgccgtga aaagaagaca gaaaactcca aattaaggaa ggtgaaatat gaggaaacag
481 tattttatgg gttgcagtac attcttaata agtacttaaa aggtaaagta gtaaccaaag
541 agaaaatcca ggaagccaaa gatgtctaca aagaacattt ccaagatgat gtctttaatg
601 aaaagggatg gaactacatt cttgagaagt atgatgggca tcttccaata gaaataaaag
661 ctgttcctga gggctttgtc attcccagag gaaatgttct cttcacggtg gaaaacacag
721 atccagagtg ttactggctt acaaattgga ttgagactat tcttgttcag tcctggtatc
781 caatcacagt ggccacaaat tctagagagc agaagaaaat attggccaaa tatttgttag
841 aaacttctgg taacttagat ggtctggaat acaagttaca tgattttggc tacagaggag
901 tctcttccca agagactgct ggcataggag catctgctca cttggttaac ttcaaaggaa
961 cagatacagt agcaggactt gctctaatta aaaaatatta tggaacgaaa gatcctgttc
1021 caggctattc tgttccagca gcagaacaca gtaccataac agcttggggg aaagaccatg
1081 aaaaagatgc ttttgaacat attgtaacac agttttcatc agtgcctgta tctgtggtca
1141 gcgatagcta tgacatttat aatgcgtgtg agaaaatatg gggtgaagat ctaagacatt
1201 taatagtatc aagaagtaca caggcaccac taataatcag acctgattct ggaaaccctc
1261 ttgacactgt gttaaaggtt ttggagattt taggtaagaa gtttcctgtt actgagaact
1321 caaagggtta caagttgctg ccaccttatc ttagagttat tcaaggggat ggagtagata
1381 ttaatacctt acaagagatt gtagaaggca tgaaacaaaa aatgtggagt attgaaaata
1441 ttgccttcgg ttctggtgga ggtttgctac agaagttgac aagagatctc ttgaattgtt
1501 ccttcaagtg tagctatgtt gtaactaatg gccttgggat taacgtcttc aaggacccag
1561 ttgctgatcc caacaaaagg tccaaaaagg gccgattatc tttacatagg acgccagcag
1621 ggaattttgt tacactggag gaaggaaaag gagaccttga ggaatatggt caggatcttc
1681 tccatactgt cttcaagaat ggcaaggtga caaaaagcta ttcatttgat gaaataagaa
1741 aaaatgcaca gctgaatatt gaactggaag cagcacatca ttaggcttta tgactgggtg
1801 tgtgttgtgt gtatgtaata cataatgttt attgtacaga tgtgtggggt ttgtgtttta
1861 tgatacatta cagccaaatt atttgttggt ttatggacat actgcccttt catttttttt
1921 cttttccagt gtttaggtga tctcaaatta ggaaatgcat ttaaccatgt aaaagatgag
1981 tgctaaagta agctttttag ggccctttgc caataggtag tcattcaatc tggtattgat
2041 cttttcacaa ataacagaac tgagaaactt ttatatataa ctgatgatca cataaaacag
2101 atttgcataa aattaccatg attgctttat gtttatattt aacttgtatt tttgtacaaa
2161 caagattgtg taagatatat ttgaagtttc agtgatttaa cagtctttcc aacttttcat
2221 gatttttatg agcacagact ttcaagaaaa tacttgaaaa taaattacat tgccttttgt
2281 ccattaatca gcaaataaaa catggcctta acaaagttgt ttgtgttatt gtacaatttg
2341 aaaattatgt cgggacatac cctatagaat tactaacctt actgcccctt gtagaatatg
2401 tattaatcat tctacattaa agaaaataat ggttcttact ggaatgtcta ggcactgtac
2461 agttattata tatcttggtt gttgtattgt accagtgaaa tgccaaattt gaaaggcctg
2521 tactgcaatt ttatatgtca gagattgcct gtggctctaa tatgcacctc aagattttaa
2581 ggagataatg tttttagaga gaatttctgc ttccactata gaatatatac ataaatgtaa
2641 aatacttaca aaagtggaag tagtgtattt taaagtaatt acacttctga atttattttt
2701 catattctat agttggtatg acttaaatga attactggag tgggtagtga gtgtacttaa
2761 atgtttcaat tctgttatat tttttattaa gtttttaaaa aattaaattg gatattaaat
2821 tgtatggaca tcatttatta attttaaact gaatgccctc aataagtaat actgaagcac
2881 attcttaaat gaagataaat tatctccaat gaaaagcatg acatgtgttt caatagaaga
2941 atcttaagtt ggctaaattc aaagtgcttg acatcaaaat gttctagagt gattagctac
3001 tagattctga atcatacatc acatctgact agagaccagt ttctttcgaa tgattctttt
3061 atgtatgtag atctgttctt ctgaggcagc ggttggccaa ctatagccca aaggccaaat
3121 ttggacttct ttttataaat gcagattgtc tatggctgct ttcccactac tccagcctaa
3181 ggtaaacagc tgcaatagaa gccaaatgag aatcgcaaag cccaaaatgt ttattaacct
3241 gccctttaca caaaattaca caaaaagttt cctgatctct gttctaagaa aaggagtgtg
3301 ccttgcattt aaaaggaaat gttggtttct agggaaggga ggaggctaaa taattgatac
3361 ggaattttcc tcttttgtct tcttttttct cacttaagaa tccgatactg gaagactgat
3421 ttagaaaagt ttttaacatg acattaaatg tgaaatttta aaaattgaaa agccataaat
3481 catctgtttt aaatagttac atgagaaaat gatcactaga ataacctaat tagaagtgtt
3541 atcttcatta aatgtttttt gtaagtggta ttagaaagaa tatgtttttc agatggttct
3601 ttaaacatgt agtgagaaca ataagcatta ttcactttta gtaagtcttc tgtaatccat
3661 gatataaaat aattttaaaa tgatttttta atgtatttga gtaaagatga gtagtattaa
3721 gaaaaacaca catttcttca caaaatgtgc taaggggcgt gtaaagaatc aaaagaaact
3781 attaccaata atagttttga taatcaccca taattttgtg tttaaacatt gaaattatag
3841 tacagacagt attctctgtg ttctgtgaat ttcagcagct tcagaataga gtttaattta
3901 gaaatttgca gtgaaaaaag ctatctcttt gttcacaacc ataaatcagg agatggagat
3961 taattctatt ggctcttagt cacttggaac tgattaattc tgactttctg tcactaagca
4021 cttggtattt ggccatctcc attctgagca ccaaacggtt aacacgaatg tccactagaa
4081 ctctgctgtg tgtcaccctt aaatcagtct aaatcttcca gacaaaagca aatggcattt
4141 atggatttaa gtcattagat tttcaactga cattaattaa tccctcttga ttgattatat
4201 catcaagtat ttatatctta aataggaggt aggatttctg tgttaagact cttatttgta
4261 ccctataatt aaagtaaaat gttttttatg agtatccctt gttttccctt cttaaattgt
4321 tatcaaacaa tttttataat gaaatctatc ttggaaaatt agaaagaaaa atggcaaggt
4381 atttattgtt ctgtttgcca taatttagaa ctcacactta agtattttgt agttttacat
4441 tcctttttaa cccattcagt ggagaatgtc agcttttctc ccaagttgta tgttaagtct
4501 attctaatat gtactcaaca tcaagttata aacatgtaat aaacatggaa ataaagttta
4561 gctctattag tgaagtgtta aaaaaaaaaa aaa
生工设计的引物是：Forward Primer
  Predicted Melting Temperature: 50 degrees Celsius
  Start: 1531 End: 1551 Length: 21
  Bases: 5'GCCTTGGGATTAACGTCTTCA 3'

Reverse Primer
  Predicted Melting Temperature: 50 degrees Celsius
  Start: 2286 End: 2307 Length: 22
  Bases: 5'GGCCATGTTTTATTTGCTGATT 3'

作者: 小鼹鼠 时间: 2011-8-13 17:08

你好
我现在设计SMAD3的引物,用那个软件设计,改了很多参数还是不行,加1则多,减1收少,不知如何是好,请求援助,多谢!
序列: 1 ccgcgtggag ccgctcgggc gccgccgtgt tccggatccc cgcaactgca gtgccgctat
61 cctggccggg acgcctgggc aagttctcca gagttaaaag cgaagttcgg gcgcggcgca
121 ggccgagctg cctctgtgcg cccccggcgt ccccagtgcg tccagccccg ccgggggcgc
181 cggtgaccct tccgtgccag ccatgtcgtc catcctgccc ttcacccccc cgatcgtgaa
241 gcgcctgctg ggctggaaga agggcgagca gaacgggcag gaggagaagt ggtgcgagaa
301 ggcggtcaag agcttggtga agaagctcaa gaagacgggg cagttggacg agctggagaa
361 ggccatcacc acgcagaacg tgaacaccaa gtgcattacc atccccaggt cactggatgg
421 ccggctgcag gtatcccatc ggaaggggct cccccatgtc atctactgcc gcttgtggcg
481 gtggcccgac ctgcacagcc accatgagtt acgggccatg gagctctgtg agttcgcctt
541 caacatgaag aaggatgaag tgtgtgtaaa tccttaccac tatcagagag tagagacacc
601 agtgctacct ccagtgttgg tgccacgcca caccgagatc ccggccgagt tcccccctct
661 ggatgactac agccattcca tccccgagaa cactaacttc cccgctggca ttgaacccca
721 gagcaatatt ccagaaaccc cacctcctgg ctacctgagt gaagatggag aaactagcga
781 ccaccagatg aaccacagca tggacgcagg ctctccaaac ctctccccga atccgatgtc
841 cccagcacac aataacttgg acctacagcc agtcacctac tgtgagccgg ccttttggtg
901 ctccatctcc tactacgagc tgaaccagcg agttggggag acattccacg cttcacagcc
961 gtccatgaca gtagatggct tcactgatcc ctccaattca gagcgcttct gtctgggcct
1021 gctgtccaat gttaaccgga atgcagccgt ggagcttaca aggcggcaca ttgggagggg
1081 tgtgcggctc tactacattg gaggggaggt ctttgcagag tgcctcagtg acagtgctat
1141 tttcgtccag tctcccaact gcaaccagcg ctatggctgg caccctgcca ctgtctgcaa
1201 gataccccca ggctgcaacc tgaagatctt caacaaccag gaatttgctg ccctcctagc
1261 tcagtctgtc aaccagggct ttgaggctgt ctaccagttg actcgcatgt gcaccatccg
1321 catgagcttc gtcaaaggct ggggagccga gtacaggaga cagacagtga ccagcacccc
1381 ctgctggatc gagctacacc tgaatgggcc cttgcagtgg cttgacaagg tcctcaccca
1441 gatgggttcc cccagcatcc gctgttccag cgtgtcttag agacactggg agtaaaggga
1501 tcgggttggg gagggcgggc ttggggaaaa tgaccttgga agataactcc atccaacttg
1561 gtcttgtcaa agaacacaga ttctctcaac taaggcacta acctgtttct gaaaccacag
1621 aagatgccag cgatggactt tatgaacagc tgtgtctgct gcatatatgt gccccaggct
1681 gaaggccgag tgtgatggct tctgatctgg tggcttgagc taacaggtgg tgtgtcgcca
1741 cctgactcct tgtttagtga cagagatatg ggatgtcaca gtccaaaaag aaagtgcctt
1801 tctccaggac tggagtgtgg agttcacctt tggagaagaa cttttaatgg agcatgccct
1861 gtctccccac tctcacagag agggtctgtg tacctaggga actggatggc ctacgcaggt
1921 actttccccc acccccagaa tgcagatggg aacatgctgg agagtaaagc tggtgagaac
1981 cgcttcttcc ttggaaggac ctgctgaagc tcagccatgt atgtgatgtg tagttcctag
2041 tatcacatcg atctcaagag atacggatgt tcaagtgttc gcaacaaggg cagtcgtgga
2101 gtacatgtcc tgggtgaggt ggtaccacat tgaatgaata catctctgga agctggcacc
2161 actttctgat gtgtaggcca tgttggttta tggagacagc tgcattaatg aattcaccta
2221 gcacaggctc tttggatgtc ttctgtttga tgaaaacagt cctgggtaca tatgttggct
2281 ggaaaaccaa agaggaccca gtctctgctt cttgccctga ggtttggaaa ctgagagtta
2341 tagaagacac ttcaccagga ggttaagaca tcccaggctg acatgggcaa atgaaagggc
2401 tattaaagtt tttttacacc ttggaaaatt gcaggcttgg tgcagagacc tgtcatcttc
2461 accctgggat gtaagattac ctggctccgg taaaggattg ccaccaaaaa ctgctgcggt
2521 gatcctgtgt gatgagtact gttcgcagtg gcaatcacag agaaaatgag tataagttat
2581 ttcaactgga aaaagagtcc ctttcctggc tgttccagaa cagcacatag gatcccacct
2641 gcaactggta ctctcttctt ggctgctgtt tctgttgtga aatgaggagc ccatgttttc
2701 gcatggattt cccgtggaag tcctgtcctg ttccagaggg gacaaaagtg caccctccaa
2761 tgtgataaat cttctgatga tccagaggct ctggggcata tcctggtgcc tctcctgcag
2821 gagctgtgcc ctcagaagct ctgggcagga tgtttccagc taggcatgct gatcctcctt
2881 cagacacaga tgcctgtctg agtctctccc aggctgttga tacagaactc aaagacaatt
2941 ctgaacaacc cctcaggttc tctgaagggg cacagacccc gggtgtgaac attgtgccgg
3001 acttgacatg gtctgtggac tgctgcttca gacacaggaa gtcctcggaa ctgcctacct
3061 gttctgcatg ctctgagtca gaacacagag acactttggt gtggcttcta gtattcatgg
3121 tcctctcttc tcagccatgg cagagagaca agtagctcct gtgatgccat tctgaattcc
3181 gagtttaaaa tgagctatga gctgctgcct gattgaaatg tacatcaacc tcaggagatg
3241 tggatggaga tgaccaaaac accaaagaga ggcacaaatg gggcagaggg gacaggaagc
3301 cacctcacct gtcctgagga cttgctgcgc ccaacacctc ctgttgagtt aaatcaacgt
3361 ctcttccaat caacactgtt attctcataa gcacagaccc tggacatcag tgagctcaca
3421 ccgctgtagc agtaaagcca tcaggtgacc acttcttttg caaggacagc agaggctcct
3481 gagaagcaag ctgatcttga gtatctctgc ccaggttctt ggtggcaagg gaaggggaag
3541 agcaacaacc agaaccaagc aagatgcttc gtgacattgg aacctacttc cctcctagta
3601 aagacacaga gcagacctgt ggggagcatg agactggccc tctgctctgt gcgagcactt
3661 cacttcccag atggagcact gaagacagca gcatttaaac gtgggaaaag gaggagagcg
3721 gtcttgcaaa aacatgcaga agggaaatcg ggggatgctg tgctggtgag gggagagaca
3781 ctgcttcagt gacgcactgt ccacagtcct gaagattgct cagtcaagat gtggctggga
3841 aatactagtt agtggcacag aggtcgcagg tggcttccca catttgaatg tcagaatggg
3901 acacaaacaa gagaacgaag tacaaggaaa tgacagcagc agggacacta gtaagtgctg
3961 gagtgaacgt cctcctcctc ttgcgcacac acacagcctg aagattcaac ggaacttggg
4021 aatgagcacc atctttccca ccgtcatgaa ggagagctcc gcactactct aatgaaggct
4081 ctactgtggg tcctacctcc tcaacctgga gtgcgcgcca gaacagtctt ccaacagcag
4141 tgaggactcc aaggaggcgg ctctctgacg tggcctgtaa ccagctttgg caaccacagt
4201 ggaagagcag ggtggtcagc aacagtgcct ccagggtgcc taggagggag ctgcgagcag
4261 tgctgtgtgt gacactcctg aaggccatac ctgaaaggca tgtcgctgct tcctatcccc
4321 actaagtccc tacaatcctc tcccttacca tctactccta ctcactatgc ctaaatatgc
4381 atggaacagc caatgacatt cattcacagg taagggacag tctgagcgct cggggcatat
4441 cttgggttcc tgaatgttgt ttaaaggctg gactccagta cagctttatg ggaattaaat
4501 ggcatccatt tcagcggacg ctgcctctgc caagctccca aagttacaca ggtacaggca
4561 gactgactag aaccctcttt gttggccatt cttcctctca ctaatttgat gctttatttt
4621 cctgtcacat taaatttttt atttaataaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaa

作者: 小鼹鼠 时间: 2011-8-13 17:09

你好,我的引物设计用你教的软件改了好久,最后改到多一则多,少一则少,只好向你求救了,拜托
序列： 1 ccgcgtggag ccgctcgggc gccgccgtgt tccggatccc cgcaactgca gtgccgctat
61 cctggccggg acgcctgggc aagttctcca gagttaaaag cgaagttcgg gcgcggcgca
121 ggccgagctg cctctgtgcg cccccggcgt ccccagtgcg tccagccccg ccgggggcgc
181 cggtgaccct tccgtgccag ccatgtcgtc catcctgccc ttcacccccc cgatcgtgaa
241 gcgcctgctg ggctggaaga agggcgagca gaacgggcag gaggagaagt ggtgcgagaa
301 ggcggtcaag agcttggtga agaagctcaa gaagacgggg cagttggacg agctggagaa
361 ggccatcacc acgcagaacg tgaacaccaa gtgcattacc atccccaggt cactggatgg
421 ccggctgcag gtatcccatc ggaaggggct cccccatgtc atctactgcc gcttgtggcg
481 gtggcccgac ctgcacagcc accatgagtt acgggccatg gagctctgtg agttcgcctt
541 caacatgaag aaggatgaag tgtgtgtaaa tccttaccac tatcagagag tagagacacc
601 agtgctacct ccagtgttgg tgccacgcca caccgagatc ccggccgagt tcccccctct
661 ggatgactac agccattcca tccccgagaa cactaacttc cccgctggca ttgaacccca
721 gagcaatatt ccagaaaccc cacctcctgg ctacctgagt gaagatggag aaactagcga
781 ccaccagatg aaccacagca tggacgcagg ctctccaaac ctctccccga atccgatgtc
841 cccagcacac aataacttgg acctacagcc agtcacctac tgtgagccgg ccttttggtg
901 ctccatctcc tactacgagc tgaaccagcg agttggggag acattccacg cttcacagcc
961 gtccatgaca gtagatggct tcactgatcc ctccaattca gagcgcttct gtctgggcct
1021 gctgtccaat gttaaccgga atgcagccgt ggagcttaca aggcggcaca ttgggagggg
1081 tgtgcggctc tactacattg gaggggaggt ctttgcagag tgcctcagtg acagtgctat
1141 tttcgtccag tctcccaact gcaaccagcg ctatggctgg caccctgcca ctgtctgcaa
1201 gataccccca ggctgcaacc tgaagatctt caacaaccag gaatttgctg ccctcctagc
1261 tcagtctgtc aaccagggct ttgaggctgt ctaccagttg actcgcatgt gcaccatccg
1321 catgagcttc gtcaaaggct ggggagccga gtacaggaga cagacagtga ccagcacccc
1381 ctgctggatc gagctacacc tgaatgggcc cttgcagtgg cttgacaagg tcctcaccca
1441 gatgggttcc cccagcatcc gctgttccag cgtgtcttag agacactggg agtaaaggga
1501 tcgggttggg gagggcgggc ttggggaaaa tgaccttgga agataactcc atccaacttg
1561 gtcttgtcaa agaacacaga ttctctcaac taaggcacta acctgtttct gaaaccacag
1621 aagatgccag cgatggactt tatgaacagc tgtgtctgct gcatatatgt gccccaggct
1681 gaaggccgag tgtgatggct tctgatctgg tggcttgagc taacaggtgg tgtgtcgcca
1741 cctgactcct tgtttagtga cagagatatg ggatgtcaca gtccaaaaag aaagtgcctt
1801 tctccaggac tggagtgtgg agttcacctt tggagaagaa cttttaatgg agcatgccct
1861 gtctccccac tctcacagag agggtctgtg tacctaggga actggatggc ctacgcaggt
1921 actttccccc acccccagaa tgcagatggg aacatgctgg agagtaaagc tggtgagaac
1981 cgcttcttcc ttggaaggac ctgctgaagc tcagccatgt atgtgatgtg tagttcctag
2041 tatcacatcg atctcaagag atacggatgt tcaagtgttc gcaacaaggg cagtcgtgga
2101 gtacatgtcc tgggtgaggt ggtaccacat tgaatgaata catctctgga agctggcacc
2161 actttctgat gtgtaggcca tgttggttta tggagacagc tgcattaatg aattcaccta
2221 gcacaggctc tttggatgtc ttctgtttga tgaaaacagt cctgggtaca tatgttggct
2281 ggaaaaccaa agaggaccca gtctctgctt cttgccctga ggtttggaaa ctgagagtta
2341 tagaagacac ttcaccagga ggttaagaca tcccaggctg acatgggcaa atgaaagggc
2401 tattaaagtt tttttacacc ttggaaaatt gcaggcttgg tgcagagacc tgtcatcttc
2461 accctgggat gtaagattac ctggctccgg taaaggattg ccaccaaaaa ctgctgcggt
2521 gatcctgtgt gatgagtact gttcgcagtg gcaatcacag agaaaatgag tataagttat
2581 ttcaactgga aaaagagtcc ctttcctggc tgttccagaa cagcacatag gatcccacct
2641 gcaactggta ctctcttctt ggctgctgtt tctgttgtga aatgaggagc ccatgttttc
2701 gcatggattt cccgtggaag tcctgtcctg ttccagaggg gacaaaagtg caccctccaa
2761 tgtgataaat cttctgatga tccagaggct ctggggcata tcctggtgcc tctcctgcag
2821 gagctgtgcc ctcagaagct ctgggcagga tgtttccagc taggcatgct gatcctcctt
2881 cagacacaga tgcctgtctg agtctctccc aggctgttga tacagaactc aaagacaatt
2941 ctgaacaacc cctcaggttc tctgaagggg cacagacccc gggtgtgaac attgtgccgg
3001 acttgacatg gtctgtggac tgctgcttca gacacaggaa gtcctcggaa ctgcctacct
3061 gttctgcatg ctctgagtca gaacacagag acactttggt gtggcttcta gtattcatgg
3121 tcctctcttc tcagccatgg cagagagaca agtagctcct gtgatgccat tctgaattcc
3181 gagtttaaaa tgagctatga gctgctgcct gattgaaatg tacatcaacc tcaggagatg
3241 tggatggaga tgaccaaaac accaaagaga ggcacaaatg gggcagaggg gacaggaagc
3301 cacctcacct gtcctgagga cttgctgcgc ccaacacctc ctgttgagtt aaatcaacgt
3361 ctcttccaat caacactgtt attctcataa gcacagaccc tggacatcag tgagctcaca
3421 ccgctgtagc agtaaagcca tcaggtgacc acttcttttg caaggacagc agaggctcct
3481 gagaagcaag ctgatcttga gtatctctgc ccaggttctt ggtggcaagg gaaggggaag
3541 agcaacaacc agaaccaagc aagatgcttc gtgacattgg aacctacttc cctcctagta
3601 aagacacaga gcagacctgt ggggagcatg agactggccc tctgctctgt gcgagcactt
3661 cacttcccag atggagcact gaagacagca gcatttaaac gtgggaaaag gaggagagcg
3721 gtcttgcaaa aacatgcaga agggaaatcg ggggatgctg tgctggtgag gggagagaca
3781 ctgcttcagt gacgcactgt ccacagtcct gaagattgct cagtcaagat gtggctggga
3841 aatactagtt agtggcacag aggtcgcagg tggcttccca catttgaatg tcagaatggg
3901 acacaaacaa gagaacgaag tacaaggaaa tgacagcagc agggacacta gtaagtgctg
3961 gagtgaacgt cctcctcctc ttgcgcacac acacagcctg aagattcaac ggaacttggg
4021 aatgagcacc atctttccca ccgtcatgaa ggagagctcc gcactactct aatgaaggct
4081 ctactgtggg tcctacctcc tcaacctgga gtgcgcgcca gaacagtctt ccaacagcag
4141 tgaggactcc aaggaggcgg ctctctgacg tggcctgtaa ccagctttgg caaccacagt
4201 ggaagagcag ggtggtcagc aacagtgcct ccagggtgcc taggagggag ctgcgagcag
4261 tgctgtgtgt gacactcctg aaggccatac ctgaaaggca tgtcgctgct tcctatcccc
4321 actaagtccc tacaatcctc tcccttacca tctactccta ctcactatgc ctaaatatgc
4381 atggaacagc caatgacatt cattcacagg taagggacag tctgagcgct cggggcatat
4441 cttgggttcc tgaatgttgt ttaaaggctg gactccagta cagctttatg ggaattaaat
4501 ggcatccatt tcagcggacg ctgcctctgc caagctccca aagttacaca ggtacaggca
4561 gactgactag aaccctcttt gttggccatt cttcctctca ctaatttgat gctttatttt
4621 cctgtcacat taaatttttt atttaataaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaa
//多谢

作者: 小鼹鼠 时间: 2011-8-13 17:09

用了这个软件确实挺好用了,谢谢无私的奉献,但不知道能不能用它设计通用引物,怎样设计?能不能用文献的引物来验证一下引物的好坏?

作者: 小鼹鼠 时间: 2011-8-13 17:10

LZ真是太好了，非常谢谢。在哪可以找到原文序列，NCBI吗？

作者: 小鼹鼠 时间: 2011-8-13 17:11

我是初学者,自己还没有涉及到引物设计,但以后肯定会遇到这个问题,所以提前看看,谢谢楼主的网址,也谢谢大家的启发

作者: 小鼹鼠 时间: 2011-8-13 17:11

引物必须位于起始密码子与终止密码子之间，即CDS之间
楼主，您的意思是搜索目的基因时，要选择CDS限定的基因序列对吧，要是的话，我选了以后，把它考到您说的软件中，可总提示
ERROR
The Tm range was too stringent, no primers were found in that range
我修改了好多次参数，可还是不行，希望楼主能给予指导，因万事具备，只欠引物，以下是我要设计的人的因子和目的基因
HIF-1a
1 atggagggcg ccggcggcgc gaacgacaag aaaaagataa gttctgaacg tcgaaaagaa
61 aagtctcgag atgcagccag atctcggcga agtaaagaat ctgaagtttt ttatgagctt
121 gctcatcagt tgccacttcc acataatgtg agttcgcatc ttgataaggc ctctgtgatg
181 aggcttacca tcagctattt gcgtgtgagg aaacttctgg atgctggtga tttggatatt
241 gaagatgaca tgaaagcaca gatgaattgc ttttatttga aagccttgga tggttttgtt
301 atggttctca cagatgatgg tgacatgatt tacatttctg ataatgtgaa caaatacatg
361 ggattaactc agtttgaact aactggacac agtgtgtttg attttactca tccatgtgac
421 catgaggaaa tgagagaaat gcttacacac agaaatggcc ttgtgaaaaa gggtaaagaa
481 caaaacacac agcgaagctt ttttctcaga atgaagtgta ccctaactag ccgaggaaga
541 actatgaaca taaagtctgc aacatggaag gtattgcact gcacaggcca cattcacgta
601 tatgatacca acagtaacca acctcagtgt gggtataaga aaccacctat gacctgcttg
661 gtgctgattt gtgaacccat tcctcaccca tcaaatattg aaattccttt agatagcaag
721 actttcctca gtcgacacag cctggatatg aaattttctt attgtgatga aagaattacc
781 gaattgatgg gatatgagcc agaagaactt ttaggccgct caatttatga atattatcat
841 gctttggact ctgatcatct gaccaaaact catcatgata tgtttactaa aggacaagtc
901 accacaggac agtacaggat gcttgccaaa agaggtggat atgtctgggt tgaaactcaa
961 gcaactgtca tatataacac caagaattct caaccacagt gcattgtatg tgtgaattac
1021 gttgtgagtg gtattattca gcacgacttg attttctccc ttcaacaaac agaatgtgtc
1081 cttaaaccgg ttgaatcttc agatatgaaa atgactcagc tattcaccaa agttgaatca
1141 gaagatacaa gtagcctctt tgacaaactt aagaaggaac ctgatgcttt aactttgctg
1201 gccccagccg ctggagacac aatcatatct ttagattttg gcagcaacga cacagaaact
1261 gatgaccagc aacttgagga agtaccatta tataatgatg taatgctccc ctcacccaac
1321 gaaaaattac agaatataaa tttggcaatg tctccattac ccaccgctga aacgccaaag
1381 ccacttcgaa gtagtgctga ccctgcactc aatcaagaag ttgcattaaa attagaacca
1441 aatccagagt cactggaact ttcttttacc atgccccaga ttcaggatca gacacctagt
1501 ccttccgatg gaagcactag acaaagttca cctgagccta atagtcccag tgaatattgt
1561 ttttatgtgg atagtgatat ggtcaatgaa ttcaagttgg aattggtaga aaaacttttt
1621 gctgaagaca cagaagcaaa gaacccattt tctactcagg acacagattt agacttggag
1681 atgttagctc cctatatccc aatggatgat gacttccagt tacgttcctt cgatcagttg
1741 tcaccattag aaagcagttc cgcaagccct gaaagcgcaa gtcctcaaag cacagttaca
1801 gtattccagc agactcaaat acaagaacct actgctaatg ccaccactac cactgccacc
1861 actgatgaat taaaaacagt gacaaaagac cgtatggaag acattaaaat attgattgca
1921 tctccatctc ctacccacat acataaagaa actactagtg ccacatcatc accatataga
1981 gatactcaaa gtcggacagc ctcaccaaac agagcaggaa aaggagtcat agaacagaca
2041 gaaaaatctc atccaagaag ccctaacgtg ttatctgtcg ctttgagtca aagaactaca
2101 gttcctgagg aagaactaaa tccaaagata ctagctttgc agaatgctca gagaaagcga
2161 aaaatggaac atgatggttc actttttcaa gcagtaggaa ttggaacatt attacagcag
2221 ccagacgatc atgcagctac tacatcactt tcttggaaac gtgtaaaagg atgcaaatct
2281 agtgaacaga atggaatgga gcaaaagaca attattttaa taccctctga tttagcatgt
2341 agactgctgg ggcaatcaat ggatgaaagt ggattaccac agctgaccag ttatgattgt
2401 gaagttaatg ctcctataca aggcagcaga aacctactgc agggtgaaga attactcaga
2461 gctttggatc aagttaactg a
VEGF

1 ctgacggaca gacagacaga caccgccccc agccccagct accacctcct ccccggccgg
61 cggcggacag tggacgcggc ggcgagccgc gggcaggggc cggagcccgc gcccggaggc
121 ggggtggagg gggtcggggc tcgcggcgtc gcactgaaac ttttcgtcca acttctgggc
181 tgttctcgct tcggaggagc cgtggtccgc gcgggggaag ccgagccgag cggagccgcg
241 agaagtgcta gctcgggccg ggaggagccg cagccggagg agggggagga ggaagaagag
301 aaggaagagg agagggggcc gcagtggcga ctcggcgctc ggaagccggg ctcatggacg
361 ggtgaggcgg cggtgtgcgc agacagtgct ccagccgcgc gcgctcccca ggccctggcc
421 cgggcctcgg gccggggagg aagagtagct cgccgaggcg ccgaggagag cgggccgccc
481 cacagcccga gccggagagg gagcgcgagc cgcgccggcc ccggtcgggc ctccgaaacc
541 atgaactttc tgctgtcttg ggtgcattgg agccttgcct tgctgctcta cctccaccat
601 gccaagtggt cccaggctgc acccatggca gaaggaggag ggcagaatca tcacgaagtg
661 gtgaagttca tggatgtcta tcagcgcagc tactgccatc caatcgagac cctggtggac
721 atcttccagg agtaccctga tgagatcgag tacatcttca agccatcctg tgtgcccctg
781 atgcgatgcg ggggctgctg caatgacgag ggcctggagt gtgtgcccac tgaggagtcc
841 aacatcacca tgcagattat gcggatcaaa cctcaccaag gccagcacat aggagagatg
901 agcttcctac agcacaacaa atgtgaatgc agaccaaaga aagatagagc aagacaagaa
961 aatccctgtg ggccttgctc agagcggaga aagcatttgt ttgtacaaga tccgcagacg
1021 tgtaaatgtt cctgcaaaaa cacagactcg cgttgcaagg cgaggcagct tgagttaaac
1081 gaacgtactt gcagatctct caccaggaaa gactga

希望能得到楼主的回帖

作者: 小鼹鼠 时间: 2011-8-13 17:12

请楼主有空之余能阅读我的帖子

Primers for 1 (Entered)
These primers are for PCR
Forward-Primer ATGGAGGGCGCCGGCGGCGCGA Reverse-Primer TCAGTTAACTTGATCCAAAGCTCTGAGTAA
Length: 22 Length: 30
Percent GC: 81 Percent GC: 36
Tm: 80 Tm: 60
Self-Anneal: 32 Self-Anneal: 20
End-Anneal: 4 End-Anneal: 12
Offset: 1 Offset: 2481

Pair-Anneal: 14
Pair-End-Anneal: 6
Total valid primer pairs: 208

These primers will amplify a fragment of 2481 basepairs
The sequence of DNA that will be amplified by these primers is
1 atggagggcg ccggcggcgc gaacgacaag aaaaagataa gttctgaacg tcgaaaagaa
61 aagtctcgag atgcagccag atctcggcga agtaaagaat ctgaagtttt ttatgagctt
121 gctcatcagt tgccacttcc acataatgtg agttcgcatc ttgataaggc ctctgtgatg
181 aggcttacca tcagctattt gcgtgtgagg aaacttctgg atgctggtga tttggatatt
241 gaagatgaca tgaaagcaca gatgaattgc ttttatttga aagccttgga tggttttgtt
301 atggttctca cagatgatgg tgacatgatt tacatttctg ataatgtgaa caaatacatg
361 ggattaactc agtttgaact aactggacac agtgtgtttg attttactca tccatgtgac
421 catgaggaaa tgagagaaat gcttacacac agaaatggcc ttgtgaaaaa gggtaaagaa
481 caaaacacac agcgaagctt ttttctcaga atgaagtgta ccctaactag ccgaggaaga
541 actatgaaca taaagtctgc aacatggaag gtattgcact gcacaggcca cattcacgta
601 tatgatacca acagtaacca acctcagtgt gggtataaga aaccacctat gacctgcttg
661 gtgctgattt gtgaacccat tcctcaccca tcaaatattg aaattccttt agatagcaag
721 actttcctca gtcgacacag cctggatatg aaattttctt attgtgatga aagaattacc
781 gaattgatgg gatatgagcc agaagaactt ttaggccgct caatttatga atattatcat
841 gctttggact ctgatcatct gaccaaaact catcatgata tgtttactaa aggacaagtc
901 accacaggac agtacaggat gcttgccaaa agaggtggat atgtctgggt tgaaactcaa
961 gcaactgtca tatataacac caagaattct caaccacagt gcattgtatg tgtgaattac
1021 gttgtgagtg gtattattca gcacgacttg attttctccc ttcaacaaac agaatgtgtc
1081 cttaaaccgg ttgaatcttc agatatgaaa atgactcagc tattcaccaa agttgaatca
1141 gaagatacaa gtagcctctt tgacaaactt aagaaggaac ctgatgcttt aactttgctg
1201 gccccagccg ctggagacac aatcatatct ttagattttg gcagcaacga cacagaaact
1261 gatgaccagc aacttgagga agtaccatta tataatgatg taatgctccc ctcacccaac
1321 gaaaaattac agaatataaa tttggcaatg tctccattac ccaccgctga aacgccaaag
1381 ccacttcgaa gtagtgctga ccctgcactc aatcaagaag ttgcattaaa attagaacca
1441 aatccagagt cactggaact ttcttttacc atgccccaga ttcaggatca gacacctagt
1501 ccttccgatg gaagcactag acaaagttca cctgagccta atagtcccag tgaatattgt
1561 ttttatgtgg atagtgatat ggtcaatgaa ttcaagttgg aattggtaga aaaacttttt
1621 gctgaagaca cagaagcaaa gaacccattt tctactcagg acacagattt agacttggag
1681 atgttagctc cctatatccc aatggatgat gacttccagt tacgttcctt cgatcagttg
1741 tcaccattag aaagcagttc cgcaagccct gaaagcgcaa gtcctcaaag cacagttaca
1801 gtattccagc agactcaaat acaagaacct actgctaatg ccaccactac cactgccacc
1861 actgatgaat taaaaacagt gacaaaagac cgtatggaag acattaaaat attgattgca
1921 tctccatctc ctacccacat acataaagaa actactagtg ccacatcatc accatataga
1981 gatactcaaa gtcggacagc ctcaccaaac agagcaggaa aaggagtcat agaacagaca
2041 gaaaaatctc atccaagaag ccctaacgtg ttatctgtcg ctttgagtca aagaactaca
2101 gttcctgagg aagaactaaa tccaaagata ctagctttgc agaatgctca gagaaagcga
2161 aaaatggaac atgatggttc actttttcaa gcagtaggaa ttggaacatt attacagcag
2221 ccagacgatc atgcagctac tacatcactt tcttggaaac gtgtaaaagg atgcaaatct
2281 agtgaacaga atggaatgga gcaaaagaca attattttaa taccctctga tttagcatgt
2341 agactgctgg ggcaatcaat ggatgaaagt ggattaccac agctgaccag ttatgattgt
2401 gaagttaatg ctcctataca aggcagcaga aacctactgc agggtgaaga attactcaga
2461 gctttggatc aagttaactg a
这是我检索出的引物序列，麻烦楼主在有空之闲帮我看看设计出的引物是否合适，万分感激！

作者: 小鼹鼠 时间: 2011-8-13 17:12

看上去并不是很合适，因为两端的GC含量差别太大，退火温度差别也很大。
不过这个软件总是给要求给我们最合适的情况，理论上不合适，不代表一定p不出来。
你可以试试，我也没有把握。

作者: 小鼹鼠 时间: 2011-8-13 17:12

楼主，您好！
我看了您介绍的引物在线设计软件，的确好用，但是由于我要扩的部分GC含量相对较高，照您说的“在Select YES to Amplify a region with EXACT endpoints of the DNA sequence entered NO YES这一项中，一定要选择yes”，我点YES时，总提示我GC含量范围不对，一次误操作没点YES，默然的NO，竟然出了很多引物，我想问：为什么一定要点YES？是不是点YES，设计出的引物扩出来的是我输入的整个序列长？请解答一下，谢谢您了。

作者: 小鼹鼠 时间: 2011-8-13 17:13

选yes，设计出来的是确切的引物片段，p出来之后的序列也是对的。
具体的，你可以阅读网站的介绍。

作者: 小鼹鼠 时间: 2011-8-13 17:14

atataatttattccatatatatgggtagtccatatgcatatgggtatcttttgttattttttttatatggactagttgtacaatggtaataggtggctgaATGGAATATTCTATTGCTTATGGACTACTTTTACACCACATTGTGGATGCCCTGAGACATTTTTGCGACAGCAAACAGCATGTCATGTGTTTCCGGCAATTTTTCTTCTCTTGCAGGGAACATTCGACTCATTTTTACGGCTGCTTTCACATCGTCGAATCATTTGAAGGCAATCAGATAGTTGGGGTTTATATAGTTTTAGAGGGGGCACCTAGTCGGCGCGTGTGCGTCCCCGGTGCACGTTTTCCGGGACTAAAAGGGGATGCATCAACGATCTACGTTGTCAATACCCATATACATACATACGTTGGAACTTGCTGCTTGCATTATCGCATCAAGAACATCATATTGCAAAGTAGTACGCTGAGGCCGCGCACCACCACCGTACGCCGTCTCCGGCAAGGTTTGCTCTCGACAGTCTCTGCACGATCGCGGCTGCTGCTCGTCCGATCCAAGTACGGCAATTGCCGCGACCGATCAAACGAGCTAAACCGCTGCATTTGTGTAGGCCGTGGATCGGTGAAGGGCTGAcatgagccgtgatgcgtcggCAGGAGCCTCTACACGACATggtcgttcatctcgaattccctatgcatcccgttccagattgttacttataaccaaccatgcaccgagagacaacgtatatatgttctagttctacagttctactactgctgcatttccaacagaacagaggaaggggatggtttggttttccagttttctattttctgattctatacccagagttgtagcagcaacactagctagcttatttatatatatgggtacttggcgaggtactacctccatcctaaaatgttt
楼主：帮我设计这个序列的引物，我用你给的网址没有设计出来合适的。
感谢！！！！

作者: 小鼹鼠 时间: 2011-8-13 17:14

请问您知道突变引物设计的一些原则和软件吗？
谢谢哦

作者: 小鼹鼠 时间: 2011-8-13 17:15

请问版主,我刚用你介绍的软件设计了一下引物,得到了几对引物,但我想请教一下,你那方法是对PCR的,那realtime-PCR可以这样用吗,谢谢

作者: 小鼹鼠 时间: 2011-8-13 17:15

楼主你好！我的片断P很久了，都没有出来，估计就是属于那种极品，后来我按你的方法试了，但改了很多次参数都不行，楼主能否帮看看，要怎么改合适啊！万分感谢！
Get primers
Primers for PCR

There were 1 forward primers in the valid range for GC content.
There were 66 reverse primers in the valid range for GC content.
There were 0 forward primers in the valid range for melting temperature.

ERROR
The Tm range was too stringent, no primers were found in that range

我的片断是 GTTTATGTTAAAGATGATAAAATAAGATTGCTGGAAGAGCAACTACAACATGAAATTTCAAACAAAATGGAAGAATTTAAGATTCTAAATGACCAAAACAAAGCATTAAAATCAGAAGTTCAGAAGCTACAGACTCTTGTTTCTGAACAGCCTAATAAGGATGTTGTGGAACAAATGGAAAAATGCATTCAAGAAAAAGATGAGAAGTTAAAGACTGTGGAAGAATTACTTGAAACTGGACTTATTCAGGTGGCAACTAAAGAAGAGGAGCTGAATGCA

作者: 小鼹鼠 时间: 2011-8-13 17:16

我想P一个很长序列的其中含snp的一部分，应该怎么选择目的片段呢？

作者: 小鼹鼠 时间: 2011-8-13 17:16

楼主:
把cDNA全长放进去检索,行吗? 怎么总是说GC含量太低呀?

作者: 小鼹鼠 时间: 2011-8-13 17:17

先谢谢了，接下来订引物，P出结果的话就谢天谢地谢大家

作者: 小鼹鼠 时间: 2011-8-13 17:17

请楼主,我要扩增的是蓝藻中的微囊藻的g20蛋白基因序列。请问是不是把g20的基因序列贴入其中就行了呢，谢谢好心的楼主

作者: 小鼹鼠 时间: 2011-8-13 17:17

感谢楼主，可是我按照你的方法参数范围改得都不能再宽了，
还是出不来，我终于明白我为什么之前那么多引物都做不出了
能否帮我指条明路啊

这是我要扩增的序列，是牛的VDR
是不是也是个极品啊，应该怎样看呢
先谢过了
1 ccccgggcgc cgggagcgcg gagcagcgtg cccacccgca ggaccagagt ccttttggtt
61 ggaagcatct gcgaaccctc acagaagggc accccttggc ctgacttccc tgtccccctg
121 ctcctacagc tatggaggcg actgcggcca gcacttcctt acctgaccct ggcgactttg
181 accggaacgt gccccggatc tgtggggtgt gcggggaccg agccaccggc ttccatttca
241 acgctatgac ctgcgaaggc tgcaaaggct tcttcaggcg gagcatgaag cggaaggcgc
301 tgttcacctg tcccttcaat ggagactgcc gcatcaccaa ggacaaccgc cgccactgcc
361 aggcctgccg gctgaagcgc tgtattgaca tcggcatgat gaaggaattc atcctgactg
421 atgaagaagt gcagcggaag cgggagatga tcctcaagcg gaaggaggag gaggccttga
481 aggacagcct gcggccgaag ctgtcagagg agcagcagcg catcatcacc accctgctgg
541 aagcccacca caagacctac gacgacacct actccgactt cagccagttc cggcctccag
601 ttcgcaacag tgaggacgag gggaaccgtc ctttgaggtc gatactcacg cccagcttct
661 ctggaaactc atcctcctcc tgttcggatc actgtacctc ctctccagac acaatggagc
721 caaccagctt ctccaaccag gatctgaatg aagaagactc cgatgaccct tctgtgaccc
781 tggacctgtc ccagctctcc atgctgcccc acctggctga cctggtcagt tatagcatcc
841 agaaggtcat cggctttgcc aagatgatcc cagggttcag agacctcacc cctgaggacc
901 agatcgtgct gctgaagtcg agtgccattg aagtcatcat gcttcgctcc aaccagtcct
961 tcaccctgga cgacgacatg tcctggacct gtggcagccc ggactacaag taccaagtca
1021 gcgacgtgac cagagccgga cacagcctgg agctcattga gcccctcatc aagttccagg
1081 tggggctgaa gaagctgaat ttgcacgaag aggaacatgt cctgctcatg gccatctgca
1141 ttgtctcccc agaccgccct ggagtgcagg acgcagcact ggtcgaggcc atccaggacc
1201 gcctgtccaa cacgctgcag acctacatcc gctgccgcca cccgccccca ggcagccacc
1261 tgctctacgc caagatgatc cagaagctgg cggacctgcg cagcctgaac gaggagcact
1321 ccaagcagta ccgctgcctc tccttccagc ccgagtccag catgaagctc acacccctcc
1381 tgttcgaggt gtttggcaac gagatctcct ga

作者: 小鼹鼠 时间: 2011-8-13 17:18

楼主真的是好人啊！也帮我个忙，可以嘛？！
我要用RT-PCR的方法和基因克隆手段构建suPAR（人可溶性尿激酶型纤溶酶原激活物受体，soluble urokinase-type plasminogen activator receptor， suPAR）的重组表达质粒DNA。用真核表达载体如PCDNA3.1(+)来构建质粒嘛？请帮忙设计引物可以不？
模板序列如下：
gene="SUPAR"
ORIGIN
1 agagaagacg tgcagggacc ccgcgcacag gagctgccct cgcgacatgg gtcacccgcc
61 gctgctgccg ctgctgctgc tgctccacac ctgcgtccca gcctcttggg gcctgcggtg
121 catgcagtgt aagaccaacg gggattgccg tgtggaagag tgcgccctgg gacaggacct
181 ctgcaggacc acgatcgtgc gcttgtggga agaaggagaa gagctggagc tggtggagaa
241 aagctgtacc cactcagaga agaccaacag gaccctgagc tatcggactg gcttgaagat
301 caccagcctt accgaggttg tgtgtgggtt agacttgtgc aaccagggca actctggccg
361 ggctgtcacc tattcccgaa gccgttacct cgaatgcatt tcctgtggct catcagacat
421 gagctgtgag aggggccggc accagagcct gcagtgccgc agccctgaag aacagtgcct
481 ggatgtggtg acccactgga tccaggaagg tgaagaaggg cgtccaaagg atgaccgccc
541 actccgtggc tgtggctacc ttcccggctg cccgggctcc aatggtttcc acaacaacga
601 caccttccac ttcctgaaat gctgcaacac caccaaatgc aacgagggcc caatcctgga
661 gcttgaaaat ctgccgcaga atggccgcca gtgttacagc tgcaagggga acagcaccca
721 tggatgctcc tctgaagaga ctttcctcat tgactgccga ggccccatga atcaatgtct
781 ggtagccacc ggcactcacg aaccgaaaaa ccaaagctat atggtaagag gctgtgcaac
841 cgcctcaatg tgccaacatg cccacctggg tgacgccttc agcatgaacc acattgatgt
901 ctcctgctgt actaaaagtg gctgtaacca cccagacctg gatgtccagt ag

作者: 小鼹鼠 时间: 2011-8-13 17:18

我一直使用这个cuturl('http://mcl1.ncifcrf.gov/dnaworks/dnaworks2.html')
也非常不错！

作者: 小鼹鼠 时间: 2011-8-13 17:18

不过后面如果出现较多的特殊体系标志的话，建议多改几个参数，尝试一下。一年半多没用了，发现自己退化的厉害！！

作者: 小鼹鼠 时间: 2011-8-13 17:19

请问下：我怎么选择目的扩增序列?我先开始把整个基因序列都拷进去了,结果就出来一头一尾的引物!

那用这个软件的前提是我得选择一个好片段，这一步有又应该怎么做呢？

作者: 小鼹鼠 时间: 2011-8-13 17:19

The end anneal range was too stringent, no primers were found in that range

出现了这个提示之后我应该怎么调整呢？

Primer Annealing [info]
Self Anneal: 24 Self End Anneal:12 Pair Anneal: 24 Pair End Anneal: 12

我应该往哪个方向调呢？是往小还是往大呢？能给个具体的例子吗？

多谢！

作者: 小鼹鼠 时间: 2011-8-13 17:20

还有就是GC含量的问题，应该不能往下调吧？那最多和最少的参数调过之后是不是最适的也得调呢？

作者: 小鼹鼠 时间: 2011-8-13 17:21

还有就是这样设计出来的引物是适合所有PCR吗？实时定量？半定量？
我要做半定量的

作者: 小鼹鼠 时间: 2011-8-13 17:21

我也觉得设计出来的引物特异性比较高，但是有一个问题就是产物片段都是四五千，这样子的话是不是不能P出来啊？？怎样才能比较好的控制产物的长度呢？？上面都没有怎么说清楚？

作者: 小鼹鼠 时间: 2011-8-13 17:22

你好！上面的结果在第二步中没点yes得到的，点过yes就得到下面的结果，请帮忙分析一下，怎么改参数，谢谢！
Primers for PCR

There were 4 forward primers in the valid range for GC content.
There were 4 reverse primers in the valid range for GC content.
There were 1 forward primers in the valid range for melting temperature.
There were 0 reverse primers in the valid range for melting temperature.

ERROR
The Tm range was too stringent, no primers were found in that range

作者: 小鼹鼠 时间: 2011-8-13 17:22

如果做点突变的引物用这个设计可以吗？
如果设计的引物过长，要如何修改变短呢？
谢谢

作者: 小鼹鼠 时间: 2011-8-13 17:23

没有已知序列的怎么设计啊，谢谢

作者: 小鼹鼠 时间: 2011-8-13 17:23

请问您的目的基因是怎么获得的？谢谢！

作者: 小鼹鼠 时间: 2011-8-13 17:24

请问下楼主，我要做雄性大鼠Nrf2的RT-PCR，我现在不知道怎么找到他的基因序列，进而来设计引物，可否指点下？我是个新手，在此谢谢了

作者: 小鼹鼠 时间: 2011-8-13 17:24

有些ＧＣ含量是不是太低了啊

作者: 小鼹鼠 时间: 2011-8-13 17:25

可是有一个问题，就是PCR产物的长度没有办法设定，请赐教！

作者: 小鼹鼠 时间: 2011-8-13 17:25

我想问问你这个软件对荧光定量PCR，探针的引物能设计吗？

作者: 小鼹鼠 时间: 2011-8-13 17:25

感谢楼主，我也是按照你的方法将参数范围改得都不能再宽了，还是出不来，楼主能不能帮我个忙？帮我看看
这是我要扩增的序列，是人KIR3DL2基因3外显子

c cccaggtggt
caggacaaac ccttcctgtc tgcccggccc agcactgtgg tgcctcgagg aggacacgtg
gctcttcagt gtcactatcg tcgtgggttt aacaatttca tgctgtacaa agaagacaga
agccacgttc ccatcttcca cggcagaata ttccaggaga gcttcatcat gggccctgtg
accccagcac atgcagggac ctacagatgt cggggttcac gcccacactc cctcactggg
tggtcggcac ccagcaaccc cctggtgatc atggtcacag gtc

非常感谢楼主！

作者: 小鼹鼠 时间: 2011-8-13 17:26

楼主，我想问你一下，我用您教的这个方法设计了一个引物，然后在引物设计软件里查了查，竟然发现有那么多二聚体形成，而在那个软件里面就不会告诉我了，这样的引物能用吗？

作者: 小鼹鼠 时间: 2011-8-13 17:26

请问简并引物可以设计的吗？

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