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标题: 环介导等温扩增技术专题讨论 [转自丁香园论坛] [打印本页]

作者: 嘉年华 时间: 2011-8-13 17:30 标题: 环介导等温扩增技术专题讨论 [转自丁香园论坛]

环介导等温扩增技术(Loop-Mediated Isothermal Amplification, LAMP)专题讨论

所以想借PCR技术区的宝地，新开辟“环介导等温扩增技术(Loop-Mediated Isothermal Amplification, LAMP)专题讨论”。我做LAMP一年多了，有些经验。而最近，和我谈起LAMP的朋友明显增多。所以在这方面大家有什么心得、体会、资料和实验困难，希望能一起交流讨论。谢谢支持！

作者: 嘉年华 时间: 2011-8-13 17:31

您好！我最近用官方软件设计了一套引物做LAMP，跑出了梯形条带，但是LAMP的最小条带比用外引物跑出来的条带要小这是什么原因啊？望指教！

作者: 嘉年华 时间: 2011-8-13 17:37

LAMP的大多数产物，是FIP和BIP扩增出来的，最小条带应该比用外引物跑出来的条带要小。如果用了环状引物，应该更加明显一些。但差别应该不明显，如果您的最小条带是<100bp，应该是引物多聚体。

如何分析条带是否是目的条带还是非特异性扩增。LAMP的扩增，是4或6对引物针对靶序列的6或8个区域，特异性是非常的好。一般只要能跑出梯形条带就能证明试验成功了。如果不放心，可在F1和B1之间选择一个内切酶酶切，能够得到特定大小条带；更保险的办法就是做个Southern杂交了。

建议再好好学习一下第一篇LAMP的文章，见NAR, 2000, 28(12):e63。

作者: 嘉年华 时间: 2011-8-13 17:39

还是有一点疑问,我指的最小条带在100bp以上,应该不是您所说的引物二聚体.不知道这样还正常吗？
另外，我看资料上的电泳图有的最前面是2条带有的是1条带，这是什么原因阿？望指教！

作者: 嘉年华 时间: 2011-8-13 17:40

应该是正常的。

电泳图有的最前面是2条带有的是1条带，这可能与电泳胶浓度有关。如果你配>2%的胶，应该看到更多条带。

作者: 嘉年华 时间: 2011-8-13 17:40

您好：
针对同一序列用官方软件设计引物的话，可以出上千条引物，请问选择引物有什么标准吗？还有我们自己选择的引物总是会出现非特异性扩增，而且不是污染造成的，请问这种情况正常吗？多谢！

作者: 嘉年华 时间: 2011-8-13 17:41

您好,我想问一下你怎么知道你的条带是非特异性扩增的条带啊?

作者: 嘉年华 时间: 2011-8-13 17:41

LAMP的扩增，是4或6条引物针对靶序列的6或8个区域，特异性是非常的好。所以出现非特异扩增的机会比PCR还要小很多，一般情况几可不考虑。

但是，LAMP的扩增效率超强，表现在两个方面：1）灵敏度比PCR高出的是数量级的差异；2）扩增产物的DNA数量，也比PCR产物高出太多，能够达到几个ug！这也是LAMP产物可以用荧光染料进行终点检测的基础。然而，优点有时候可以是缺点，太过于灵敏和产物量的巨大，使得LAMP及其容易污染！1个扩增的LAMP产物，往往又是同一片段的重复序列，因此，如果实验室一旦遭到气溶胶污染（包括实验人员！），假阳性率会很高而且难于去除！

所以，在任何进行LAMP实验前，一定就要关注污染问题。实验室分区应该比PCR更加严格！我想，LAMP最终的应用方向，应该是不开盖的检测。

作者: 嘉年华 时间: 2011-8-13 17:42

有战友PM我：

“博士您好,我今天做LAMP 的时候,反应体系中只添加内引物就能跑出梯形条带,内引物是我今天刚从原来的母液中重新稀释的.不知道这是不是说明我设计的引物有问题,跑出的是非特异性条带啊?
我的反应体系中只要内引物都加,无论外引物加一条还是两条都不加,都能跑出梯形条带,但是不加内引物,只加外引物就不能产生条带.
请博士帮我分析一下吧,谢谢了!
还有如果不是污染了,有没有可能设计的内引物就能跑出这样的梯形条带呢?很困惑,如果LAMP有非特异性扩增应该是什么样的啊? ”

我的实验结果表明，如果使用环状引物，外引物的作用就基本可被替代，尽管外引物可以加快反应速度。
“只加外引物就不能产生条带”，因为不能成环自身作为引物和模板扩增。

因此，外引物的作用相对较小。

如果是实验室污染了，只有内引物当然可以环状扩增了。我还听说过做病毒RNA的RT-LAMP，不用AMV反转录酶都扩的很好——结论只有是：扩增产物污染！

作者: 嘉年华 时间: 2011-8-13 17:42

1、针对上面的回答,我有一些疑问,如果没有使用环状引物,再出现上述情况("只要内引物都加,无论外引物加一条还是两条都不加,都能跑出梯形条带"),是不是就只有一种可能就是污染啊?
2、有没有可能在没有污染的情况下,只加内引物就能产生梯形条带啊?

3、另外,什么叫"气溶胶污染（包括实验人员！)",实验室没有条件严格分区,只是我加体系的时候在超净台中操作.这样能避免污染吗?

谢谢了

作者: 嘉年华 时间: 2011-8-13 17:42

如果没有使用环状引物,再出现上述情况("只要内引物都加,无论外引物加一条还是两条都不加,都能跑出梯形条带")，可能性最大就是污染！因为没有环状引物或外引物，反应效率比较低，要达到同样效果的时间延长不少。

“气溶胶污染”，还真不好解释，应该是扩增产物在开盖后，挥散在空气、尘埃中和器皿、衣物、工作台、和耗材等表面。因此实验人员也是污染源之一。加体系的时候在超净台中操作，这样不能完全避免污染。至少，检测的地方要与其它实验区完全分开、扩增产物绝对不要在核酸提取和体系配制的房间开盖。

作者: 嘉年华 时间: 2011-8-13 17:43

我想问一下，要是已经出现这样的情况有什么解决的办法吗？每天用紫外灯照射房间能有效吗？

作者: 嘉年华 时间: 2011-8-13 17:43

要是已经出现污染的情况，解决办法真是不多了，可以采取：

1. 更换所有的的相关试剂；
2. 每天用紫外灯照射房间，能有一定的帮助；
3. 加强房间通风、一段时间里不要做相同的这个LAMP扩增实验；
4. 最好的办法，是更换LAMP扩增的目标区域（换引物）。

作者: 嘉年华 时间: 2011-8-13 17:44

您好!我今天拿我的菌和其它两种菌做实验都产生了梯形条带,看样子,我的实验真的是被污染了,因为我原来用外引物跑这两种菌的PCR是阴性结果的.
看了上边的讨论,很困惑.
1 把所有的相关试剂都换了,但是再操作的时候还是有可能再次被污染吧.因为空气中已经有污染源了.
2 如果污染那么容易的话,不在一屋做实验,来回走动的时候是不是也有可能被污染啊?还有白大褂是不是也要经常换啊?可是实验室没有那么好的条件,做分子的一共就一个屋,我应该怎么注意啊 ?
3 像您说的一段时间不做相同的LAMP实验,是指多长时间啊.一段时间后,污染源会自己降解吗?
望赐教

作者: 嘉年华 时间: 2011-8-13 17:45

做分子的一共就一个屋，这样的条件实在是不适合做LAMP。来回走动的时候也有可能被污染，白大褂也要经常换，不同的房间穿不同的。

你可以考虑在体系中加UNG和dUTP防污染。但对反应效率有影响。

最好考虑不开盖的检测方式。

作者: 嘉年华 时间: 2011-8-13 17:45

lamp扩增仪用普通PCR仪和水浴锅即可。浊度计目前国内好象没有。这个反应体系并不那么节省，因为酶比PCR用的贵很多。

在普通诊所里面作常规检测，主要还是防污染的问题。

作者: 嘉年华 时间: 2011-8-13 17:46

您好,我想问一下你怎么知道你的条带是非特异性扩增的条带啊?

我们想尽了一切办法尽量排除了污染，可还是能出来梯形条带，很郁闷，没找到原因，所以就认为是
非特异性扩增

作者: 嘉年华 时间: 2011-8-13 17:46

您好，我查了一些有关ＵＮＧ方面的资料，说ＵＮＧ能消除dU化的PCR产物，可是如果像我这种情况，空气中已经存在以前未用dＵＴＰ时的扩增产物了，再使用是否还有效呢？

作者: 嘉年华 时间: 2011-8-13 17:46

空气中已经存在以前未用dＵＴＰ时的扩增产物了，再使用无效的。

不过可以控制接下来的可能产物污染。

作者: 嘉年华 时间: 2011-8-13 17:47

你好，看到你说防止污染可以用UNG酶，但是要使UNG酶的失活，温度需要多少？因为BST酶80度左右就很容易失活，是否会受到影响呢？

作者: 嘉年华 时间: 2011-8-13 17:48

我从事这项技术两年多,发现该技术也存在很多缺点,虽然原理上特意性很高,但假阳性也很多.

作者: 嘉年华 时间: 2011-8-13 17:49

我就在这里抛个砖~
（1),它的扩增产物不能够进行测序，克隆，表达。
（2），其实2000年的那篇文献也没有把最基本的扩增机理说清楚，酶切固然可以说明一定的问题，但是金标准还是测序，个人觉得应该把在F3和B3之间的扩增条带切胶回收，连入载体，然后再去测序，看是不是这些是重复序列。这样才更具说服力。
（3)特异性的问题，我同意zzzshandong的观点，因为你很难判断你的扩增是特异的还是非特异的，理论上说识别6或8个区域，但是需要用实验去证实一下。
（4）灵敏度，我不知道楼主怎么和PCR做的比较，你能用什么证明你的PCR已经达到最好的扩增能力，也可以换个角度去想，你怎么知道LAMP扩增的是特异性的？因此我觉得从这个角度去看，二者比较的可行性值得商酌。个人觉得应该有个标准的东西。

我个人觉得helix dependent amplification 这个技术更好一点（不是做广告），它有明确的扩增条带，引物只需要一对，机理比较简单，容易去验证。而且是最模仿生物体内的DNA复制。唯一的缺点就是引物设计要求非常高，常常需要去设计一大批引物，然后去賽选。

呵呵，个人观点，仅供参考~

作者: 嘉年华 时间: 2011-8-13 17:50

helix dependent amplification 和LAMP我都尝试过，helix dependent amplification在中国还没有成型产品，购买国外进口试剂又很贵，不过该技术发展前景广阔。LAMP技术我做了两年多，做的比较成功，但其灵敏度和特意性还有待确证。呵呵（个人意见）。恒温扩增试剂盒的开发应该是一个比较有前途的思路，但是开发出价格低廉和傻瓜式操作的恒温扩增试剂盒还需要一段路要走，否则无法超出PCR的局限。

作者: 嘉年华 时间: 2011-8-13 17:50

1）的确，LAMP扩增产物不能够进行测序，克隆，表达。这不是它的长处，它的最大优点是：时间快、等温和高产量，因此最大的用途就是病原微生物的快速检测等。如果要做测序，克隆，表达，您根本就不用考虑它。

（2）把在F3和B3之间的扩增条带切胶回收，连入载体，然后再去测序，这也只能说明您切下来的条带是什么，还有太多的条带你切不下来。所以，更具说服力的是，用F1和B1之间的序列做探针去杂交。

（3）特异性的问题，PCR仍然存在，不过LAMP更加复杂一些。当然用酶切、杂交及您说的测序可以作出初步的判断。我想，用F1和B1之间的序列做TaqMan探针荧光定量，应该能够知道是否特异扩增了。

（4）灵敏度。二者比较的可行性的确值得商酌。标准的东西，是很难的。但是，不管PCR是否已经达到最好的扩增能力，但扩增方案一旦确定（尤其对于病原微生物检测的试剂盒），您就一般不会变更它。反过来，你也不用证明LAMP已经达到最好的扩增能力。从理论上看，LAMP的后续扩增可以不依赖引物和模板，因此，它的扩增能力比PCR强是可能的。

最后，我想说，没有十全十美的技术。每一种方案都有它的优缺点，关键是看您需要做什么。没有最好的，只有相对更合适的。

作者: 嘉年华 时间: 2011-8-13 17:51

您说的很中肯。的确还需要一段路要走。如果完全成熟了，也就没有太多讨论的必要了。就向N年前，我们需要讨论PCR的引物浓度、dNTP浓度、Mg浓度、循环参数设置等问题，现在这些问题都成定论了。

作者: 嘉年华 时间: 2011-8-13 17:52

防止污染可以用UNG酶，温度只能是65度，30min可基本灭活。所以，如果用了UNG，LAMP前段的扩增产物会部分被消化。解决办法是：延长反应时间至90min。

作者: 嘉年华 时间: 2011-8-13 17:52

杭州某公司开发出的切口酶扩增技术是在SDA技术的基础发展起来的，已经申请了专利，不知道您对该技术了解多少？

作者: 嘉年华 时间: 2011-8-13 17:54

请问您做过helix dependent amplification 那方面的工作？结果怎么样？最重要的事情是您是怎么设计引物的？因为这是该技术的核心，谢谢~

作者: 嘉年华 时间: 2011-8-13 17:55

heliX酶哪里可以购买？

作者: 嘉年华 时间: 2011-8-13 17:55

请教一下大家：
我去试过官方网站上的引物设计软件，但是怎么都用不了，是否需要进行一些设置呢？“activate Java and Javascript”，网站原话，什么意思？。
哪位用过的能否指点一下？

作者: 嘉年华 时间: 2011-8-13 17:56

您好：
我有一个问题想请教一下：
你们最后检测时用过 SYBR GREEN I 吗？它的终浓度是多少？有直接加到体系里的吗？像实时定量PCR那样.

有兴趣的同行也可以加QQ联系：32371003

作者: 嘉年华 时间: 2011-8-13 17:56

大家有没有遇到过引物失活的问题？
好像保存2、3个月后扩增效果就会慢慢减弱。是否是因为引物片段过长比较难以保存所致？

作者: 嘉年华 时间: 2011-8-13 17:57

我做灵敏度实验，从十的负五次方稀释到十的负十次方，结果只有十的负八次方和没加模板的阴性对照跑出来了。我的操作是在超净台中进行，带手套，也很注意防污染。这两个能跑出来的条带的带型一样，是特征性带。
具体操作是分装7管，前边6管加稀释好的模板，最后一管我偷懒，连2ulDEPC水阴性模板都没加。但出现带。怎么会出来！污染的话，前边加模板的5管怎么又没出来？！

作者: 嘉年华 时间: 2011-8-13 17:57

补充一下，我把体系中的各种试剂先加在一个指行管里，再用200UL枪头调50UL吹打50次，是绝对混匀后分装的。
稀释的RNA没扔掉，在做完LAMP 后我用普通RT-PCR检测。引物是我以前做普通PCR检测时设计的引物，和LAMP无关。结果十的负三到十的负五都有特异性带。LAMP加模板是绝对加进去的。我很仔细的观察过枪头，确认无误后再加入分装后的前6个PCR管。是没有任何问题的。
现在的问题是LAMP前3管应该跑出来的，但结果就是没有。阴性对照应该没却是有！

作者: 嘉年华 时间: 2011-8-13 17:58

如果有前边所说那么容易污染的话，我放弃了。因为这么容易污染，根本没有任何应用前景。还能指望能做检测么。灵敏度虽重要，但正确率更重要。它设计的初衷就是给条件简陋的环境使用的。开下PCR管盖，空气就污染了，以后都假阳性了，那还有毛用啊。现在根本没条件不开盖检测。就看那个什么白色反应产物，是很难区别有没有反应的，在我的实验中，即使你扩的产物很多，管壁也不一定很白。

作者: 嘉年华 时间: 2011-8-13 17:58

我很理解您的心情，我也深有同感。我的实验现在阳性污染的问题就一直没有解决，东西都换了，加样也跑到别的实验室了，枪也用的别的实验室的，但是还是会出现阴性跑出阳性条带，要是这样的话特异性，灵敏性根本没法进行。

作者: 嘉年华 时间: 2011-8-13 17:58

我之前灵敏度也做过一次。模板从十的负5到十的负7，条带却越来越亮，负8无，负9又出现，但比负5弱，负9是能扩出的四条带中最弱的。我们实验室的成像系统是BIO-RAD，文件格式为1SC 文件。不能转换，上传也不支持。请各位高手指教，我感激不尽。
有条件的话请大家M我,我把图片传给您分析。QQ 331589418

作者: 嘉年华 时间: 2011-8-13 17:59

只要读懂原理，就自然明白最小条带比外引物的小了的原因。

作者: 嘉年华 时间: 2011-8-15 15:51

请大家在购买试剂一定要注意，不要随意购买无专利无授权无保障的产品，请认准LAMP发明人日本荣研公司“loopamp”商标产品！正品试剂是实验准确客观的保障！

作者: 嘉年华 时间: 2011-8-15 15:52

希望今后大家可以使用正规LAMP试剂，早日发表高水平的文章，并转化成果。

作者: 嘉年华 时间: 2011-8-15 15:52

我想请教一下有什么方法可以检验设计的引物是否正确，从全基因组数据上对照看是完全没有问题的，可是已经按照文献上的方法尝试着做了很多遍根本就跑不出结果，从电泳图上分析像是根本没有进行扩增，最上面有一段全基因组，最下面是一段引物二聚体，温度和反应时间已经变换着都试过了，试剂也是按很多文献上说的公司买的，我自己实在找不出原因了，请帮忙分析一下，谢谢！

作者: 嘉年华 时间: 2011-8-15 15:53

LAMP 扩增前后浊度变化明显吗? 是否可以根所它的浊度变化做个标准曲线?

作者: 嘉年华 时间: 2011-8-15 15:53

LAMP 扩增结果是否确实可以用浊度仪检测?

作者: 嘉年华 时间: 2011-8-15 15:53

我想问各位高手！内引物在设计的时候~是否必须用TTTT连接F2和F1C，B2和B1C！具体有什么特殊的意义吗

作者: 嘉年华 时间: 2011-8-15 15:54

我想问的一个问题是FIP引物内的连接子是不是固定的TTTT？还是说根据片段来变化选择的？

作者: 嘉年华 时间: 2011-8-15 15:54

您好，
在LAMP方面我是个初学者，现在最棘手的问题是设计引物，关于设计引物方面4条引物6个特异区域还有上面说的环状引物都不太明白，您能给些建议吗？另外在LAMP方法中引物设计软件业用primer和oligo吗？

作者: 嘉年华 时间: 2011-8-15 15:54

excuse me , but how to design a loop primer? I have done it according the manual, but most of the time the system said "Filtering by dimer -dG" can anyone analyse it? Thank you so much.

作者: 嘉年华 时间: 2011-8-15 15:55

如果不解决LAMP开盖检测的问题，推广起来永远都是个难题。另外我也看不到这项技术的应用价值和前景，现在好多实验室连PCR检测的结果都怀疑，更何况是这个高扩增的LAMP检测？
请大家赐教!

作者: 嘉年华 时间: 2011-8-15 15:55

Betaine 可以设计为0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0.
另外模板浓度作稀释，确实有不少报道也许10-5能跑出来，但是10-4就跑不出来的。试试看吧~~

作者: 嘉年华 时间: 2011-8-15 15:55

您好，我做LAMP时，一开始我是按照创立这项技术的那个人所给的体系和条件做的，没做出来，摸了很多条件，也都没做出来（dNTP浓度我从0.4-1.4mM，镁离子6mM和8mM，引物从1：4-10（外引物0.2没变，内引物从0.8-2），甜菜碱1M）。我验证了一下引物，用普通PCR分别以B3和F3为上下游引物，FIP和BIP为上下游引物，均扩增出预期大小的片段，证明引物没问题，但就是LAMP扩不出梯状条带，我很是困惑，希望您给解答一下。

作者: 嘉年华 时间: 2011-8-15 15:56

LAMP针对靶序列上6个区段，设计四条特异性引物，利用具有链置换活性的聚合酶,在65℃左右对核酸进行扩增。短时间（0.5～1h）扩增效率可达到10e9个拷贝。LAMP反应中，产生副产物焦磷酸镁乳白色沉淀，利用浊度仪可定量检测，或结合荧光染料实现或定量或肉眼判读结果。不需要PCR仪和检测仪器，仅水浴锅即能完成反应。

滚环DNA 扩增(RCA) 是一种等温信号扩增方法,既可进行靶核酸扩增，也可进行信号放大扩增。RCA有线性与指数两种形式。线性RCA是引物结合到环状DNA上后，在DNA聚合酶作用下被延伸，产物是具有大量重复序列（与环状DNA完全互补）的线状单链。线性RCA用于靶核酸扩增仅限于一些具有环状核酸的病毒、质粒和环状染色体，线性扩增倍数为10e5。指数RCA原理与线性RCA相同，采用与环状DNA序列完全一致的第二种引物，该引物与第一次线性RCA产物结合并酶促延伸，其产物又作为第一种探针的模板，这样一来在很短的时间内（1h），产物呈指数递增。指数RCA可用于非环状DNA的扩增，设计一引物，其两端可结合到一段连续的序列上，并形成缺口，在连接酶作用下，引物被连接成环状。此环状引物可作为RCA的模板，进行指数扩增。指数扩增倍数能达10e7。RCA 是一种适合在芯片上进行信号扩增的技术,它既能提供研究分析的敏感性和特异性,又能保持立体分析的多元性。RCA 亦是一种痕量的分子检测方法,可用于极其微量的生物大分子和生物标志的检测与研究，也可用于突变与SNP的检测。

解链酶扩增技术（HDA）则是解旋酶解开双链DNA，单链DNA结合蛋白与单链结合,使模板处于单链状态并保护其完整性，引物与模板结合,然后在DNA 聚合酶作用下扩增。生成的dsDNA作为底物进入下一轮扩增。恒温扩增温度取决于所用的酶，可以60～65℃，也可以是37℃。

作者: 嘉年华 时间: 2011-8-15 15:57

体系和模板都没问题的情况下，就是引物问题
模板验证可以用其他方法验证
体系的话如果你检测其他东西能行，体系就ok

作者: 嘉年华 时间: 2011-8-15 15:57

请教各位LAMP酶切位点如何选择，片段大小如何计算谢谢各位了！

作者: 嘉年华 时间: 2011-8-15 15:58

你好，老板让我做一种病原物的检测，我想采用LAMP，但是实验室里的师兄师姐对这个都不知道，老板的分子生物学水平也有限而且很忙，我有这个想法，但不知道从何下手。从理论上看这个方法是行得通的，但是如果出现什么假阳性，以及目的基因扩不出来，老板一定会很不高兴，她对我们的要求是不能浪费钱。我现在多郁闷，可不可以帮帮我啊，真的非常感谢！

作者: 嘉年华 时间: 2011-8-15 15:58

如何用LAMP检测单核苷酸多态性啊，最近一直迷惑，但确实看到可以检测，但不知道原理。

作者: 嘉年华 时间: 2011-8-15 15:58

我设了一组LAMP引物，最先可以扩到很好的目的带，后来总是阴性对照被扩成阳性，就停了一段时间没做，过年来了以后就怎样都无法扩到目的带。引物换用了新和成的，其他试剂全换过了，还是没有办法扩到任何条带，仅有很亮的引物二聚体，有时候连二聚体都没有，请问各位有谁知道是为什么，请指教，先谢了！

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