分析测试百科

标题: 求助：为什么我抽提的全血DNA浓度这么低？ [打印本页]

作者: 小鼹鼠 时间: 2011-8-19 15:23 标题: 求助：为什么我抽提的全血DNA浓度这么低？

求助：为什么我抽提的全血DNA浓度这么低？ [转自丁香园论坛]

最近在提全血DNA，准备PCR后测序用。结果很让人苦恼。
买了一个小剂量的试剂盒。是北京艾德莱的。每次用300UL新鲜全血标本。
步骤如下：1.加入红细胞裂解液，2.细胞核裂解液，3.蛋白沉淀液，4，异丙醇，5，乙醇，6.DNA溶解液。
我是认真按说明书上做的。但是不知道为什么，最后总是有些沉淀，呈白色和浅棕色的絮状。量很少。
不知道是没有溶解的DNA还是蛋白。我怕没有溶解，还65℃温育半小时，然后4℃放置过夜。但是第2天依然存在沉淀。我在蛋白沉淀后提上清的时候，还特别小心。
最后用分光光度计测，浓度在28ng/ul左右，OD值1.75-1.92之间。电泳跑出来也是单一的条带。
我现在就想弄清楚原因。这么低的浓度。实在担心会影响下步的PCR.
恳请大家提出宝贵的意见，不胜感激！

作者: 小鼹鼠 时间: 2011-8-19 15:24

注意乙醇浓度啊没，有可能洗的时候溶解了。

作者: 小鼹鼠 时间: 2011-8-19 15:27

28的浓度也不是说不过去，不过应该更高。注意乙醇浓度，我们用的是70%的乙醇，乙醇洗脱的时候时间不要太长，闻到刚好没有乙醇的味道就加溶解液。
测浓度前，轻弹试管，彻底溶解。

作者: 小鼹鼠 时间: 2011-8-19 15:28

还有一般说明书中有几部要求用涡旋混匀器，这几步一定要彻底。否则白细胞没有充分裂解，DNA释放不充分，也可以导致浓度低

作者: 小鼹鼠 时间: 2011-8-19 15:29

PCR反应应该不会有影响。模板浓度不高也可以做出来的。
如果买的是试剂盒，乙醇的浓度应该没问题。
你看看加入细胞核裂解液的时候，是不是裂解完全了。

作者: 小鼹鼠 时间: 2011-8-19 15:29

我是北京艾德莱生物科技有限公司的技术人员，如果您有问题，可以直接找本公司的技术人员，难道有问题不找厂家的啊？今天要不是我看到，我们是国内核酸分离NO.1的名声就坏了。闲话少说。我来分析一下你的问题。因为你提供信息不多。我只能就你写出来的分析。

最近在提全血DNA，准备PCR后测序用。结果很让人苦恼。
买了一个小剂量的试剂盒。是北京艾德莱的。每次用300UL新鲜全血标本。
步骤如下：1.加入红细胞裂解液，2.细胞核裂解液，3.蛋白沉淀液，4，异丙醇，5，乙醇，6.DNA溶解液。
我是认真按说明书上做的。但是不知道为什么，最后总是有些沉淀，呈白色和浅棕色的絮状。量很少。

作者: 小鼹鼠 时间: 2011-8-19 15:30

从你的这个来看有写沉淀和棕色，可能原因分析如下：1.红细胞裂解液裂解完红细胞后，上清有破裂后释放的血红蛋白，如果不尽可能的把上清吸弃干净，那么就会残留较多量的血红素，导致后面棕色的残留，实际上是血红素的残留。解决办法就是裂解颠倒混匀保证裂解完全，如果是冻存的血，可以用红细胞裂解液裂解液两遍，就象洗衣服漂洗一样，多漂洗一遍，水就会干净。再仔细弃上清，就可以干净了。
2.有沉淀，典型的涡旋振荡不完全，导致蛋白和细胞杂质碎片的残留，一定要充分的连续高速涡旋振荡25秒，效果需要象龙卷风一样，涡旋旋转上升起来，才能力度达到。实践中，我们发现，很多客户以为把离心管子放到涡旋振荡器上，就以为是涡旋振荡了，它确实也在振荡，却只是上下轻微的振荡，不只真正的，涡旋旋转上升，液体象从离心管底顺管壁龙卷风一样振荡起来的涡旋振荡。这才是真正的涡旋振荡，只有这个力度才能重复将蛋白和DNA解离，然后离心将蛋白去除。此外，涡旋振荡充分后，一定要最大速度离心，将杂质多去除，否则，杂质蛋白残留在上清，最后加异丙醇沉淀，就会出现你说的总有写沉淀，这些蛋白杂质或者细胞碎片的沉淀，和残留的血红素掺杂在一起被异丙醇和DNA一道沉淀下来。就会形成你说的总有些沉淀，呈白色和浅棕色。

作者: 小鼹鼠 时间: 2011-8-19 15:31

不知道是没有溶解的DNA还是蛋白。我怕没有溶解，还65℃温育半小时，然后4℃放置过夜。但是第2天依然存在沉淀。我在蛋白沉淀后提上清的时候，还特别小心。
最后用分光光度计测，浓度在28ng/ul左右，OD值1.75-1.92之间。电泳跑出来也是单一的条带。
我现在就想弄清楚原因。这么低的浓度。实在担心会影响下步的PCR.
恳请大家提出宝贵的意见，不胜感激！

浓度低的原因很多，但是，上面完全可能导致DNA浓度低了，因为DNA和蛋白质，没有通过告诉涡旋振荡充分解离开，然后，离心取上清的时候，没有解离的DNA，随着蛋白质沉淀一起被沉淀丢失，就会导致DNA产量低。

你给我的信息，暂时我只能分析到这样的程度。其它分光光度计不准确，起始DNA含量是否因为血液保存反复冻融本身就低等等，都是可能。但是，目前，我只指出你最可能的原因。如果有兴趣，可以进一步沟通。

这个产品和qiagen的PUREgene原理，配方，说明书完全一样。我们大量著名大学，医院，研究院所的例子。全部有联系方式可以证明。而且，我们有大量帮助医院提取全血DNA技术服务的例子可以咨询。产品有问题，还是要找厂家，我们才是experts，提取全血DNA, piece of cake而已。

请参考，这不是广告，请不要删除。是事实而已，为了说明产品没有问题。如果需要具体老师联系方式，包括我们经常做技术服务提取全血DNA的各大医院老师的联系方式来求证的。都找我们好了。qq：328153626
cuturl('http://www.aidlab.cn/news_view.asp?id=81')
艾德莱喜获协和医院全血DNA提取大单

作者: 小鼹鼠 时间: 2011-8-19 15:32

艾德莱喜获协和医院全血基因组DNA 提取大单

凭借北京第一个研发出和qiagen，roche ，proemga完全原理，配方，说明书一致的大量全血基因组DNA提取的技术人员和多年积累的深厚技术功底，艾德莱生物的全血DNA提取技术在全血DNA提取市场上攻城掠地，进入各大医院包括，北医三院，北大医院，回龙观医院，人民医院，协和医院，湘雅医院，复旦大学等著名医院和大学。国庆节前最后一天，经过严格测试和艾德莱生物技术人员现场现场技术演示，艾德莱生物优质的大量全血基因组DNA提取试剂盒又一次获得著名协和医院的青睐，产品优异的各项指标例如操作简捷性，时间，纯度，产量以及价格的综合优势，击败同时竞争的包括Qiagen等多家国内外公司一举获得大单。首批订单，为7000人份血液，总血液处理量达到40000毫升。客户表示，昂贵的国外产品价格要比艾德莱的价格高5倍以上，而质量一致。经过测试，艾德莱产品完全可以达到甚至超过质量要求。没有理由不选择优质的国产艾德莱生物产品。同时艾德莱的技术支持的本土响应沟通速度和研发技术人员的亲自上场指导演示，那是只把中国当做销售市场，没有本土研发技术人员的国外巨头无法复制的优势。

作者: 小鼹鼠 时间: 2011-8-19 15:32

有技术问题，欢迎拨打北京艾德莱生物免费400电话交流。

作者: 小鼹鼠 时间: 2011-8-19 15:32

28也可以了。血中基因组浓度就不是很高的。应该对您的下步实验影响不大。

作者: 小鼹鼠 时间: 2011-8-19 15:33

28ng/ul这个浓度还是偏低了，我们的盒子做成成这样，肯定哪里出问题了。这个要澄清一下，如果确定是正常人新鲜全血，小量提取比如300ul，排除操作问题，用个我们盒子至少50-100ng/ul，这还算正常。

作者: 小鼹鼠 时间: 2011-8-19 15:33

没用过这个盒子，但是全血的话这个浓度肯定是低了，100ng/ul没问题

作者: 小鼹鼠 时间: 2011-8-19 15:34

有没有可能lz的血来自用了免疫抑制剂的病人
淋巴细胞不多，浓度也就不会高了

作者: 小鼹鼠 时间: 2011-8-19 15:34

没用过这公司的，不过我提人全血200ul能提出50-100ng/ul（50ul洗脱液）。所以我觉得艾德莱的那个技术支持没有吹嘘，还是打他们的技术支持电话吧。

作者: 小鼹鼠 时间: 2011-8-19 15:35

去年我提了大量的DNA,摸索出一点经验，用的试剂盒跟你不一样，但是原理是一样的

根据自己的经验，你说的沉淀不溶解，肯定是蛋白沉淀了，不是DNA

用了300ul全血的量是不是足够，在裂解完红细胞后，离心看沉淀就知道了，如果在管底能看到一点白色的细胞沉淀就行了，下一步加核裂解液的时候一定要充分裂解白细胞层，我一般加的时候先用枪头捣捣，再加下去，充分吹打，一般不会产生大凝块堵住枪头，裂解的也比较充分

特别强调一点，有时候细胞量太多了，反而不是好事，裂解不充分，下一步离心的时候，DNA与蛋白沉淀离心分离不完全，反而会导致DNA提取量的低。

只要细胞量适中，核裂解完全，DNA与蛋白充分分离，基本就算DNA提取成功了

祝好运，多练习几次就能摸出经验了

作者: 小鼹鼠 时间: 2011-8-19 15:35

我用酚，氯仿法提取全血DNA，冻存的血，操作Protocol经过自己优化后，产率基本上不低于20微克/ml全血，OD260/280值大部分分布在1.80-1.85之间，没有低于1.80的，也没有高于1.89的；OD260/OD230不低于2.20。

欢迎光临分析测试百科 (http://bbs.antpedia.com/)