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标题: RT-PCR摸索条件个人经验总结[转自丁香园论坛] [打印本页]

作者: 不懂 时间: 2011-8-20 11:34 标题: RT-PCR摸索条件个人经验总结[转自丁香园论坛]

RT-PCR摸索条件个人经验总结[转自丁香园论坛]

个人感觉做RT-PCR重要性排序:排第一的是引物,第二的是退火温度,第三才是模板.
(1)引物
引物可以自己设计或者参考自名牌期刊如5分以上的或本专业排名前四的期刊.因为这发表在这些期刊上文章的作者没有必要在方法学上造假,所以他们提供的引物序列是可信的.建议大家针对同一基因设计或者查找2对不同引物序列,合成一对引物时最好找2家不同的生物公司合成此物,如英俊(invitrogen),上海生工等.具体原因是,引物合成不可避免有一定的错误率,国际上公认的是0.3%到0.5%,在中国大陆的生物公司由于偷工减料,错误率更有可能达到1%！既然我们选择了化学合成法合成引物,就要承担这个错误率.这就好比青霉素是治疗感染的好药,既便宜又管用,但只要注射青霉素,就存在过敏性休克的可能性.但2家不同的生物公司合成同一对引物出错的概率那几乎可以说是0了,这就是为什么要找2家生物公司合成引物的原因节省了时间,加快了实验进度,表面上看浪费了钱,考虑摸索条件时其它试剂的开销其实节省了钱,总的来说既节省了钱又节省了时间.
(2)退火温度
若有梯度PCR仪摸索条件方便多了，一次可以摸索10个退火温度，一天就能摸索好条件，若一种引物摸索了10个退火温度还没有看见目的条带的话，那应该果断地放弃这个引物，采用其它引物,千万不要在一条引物上吊死,那样会浪费很多时间和金钱，那怕它的序列出自于nautre,science,原因可能是引物合成时的突变。我一般采用的反应如下
10X Taq buffer 5ul
10mM dNTP 1ul
25mM MgCl2 3ul
Taq酶(1u/ul) 1ul
正义引物 1.5ul
反义引物 1.5ul
模板 2ul
超纯水 35ul
本人用的试剂除了引物、dNTP外全部是fermentas(MBI)品牌的，原因很简单，fermentas(MBI)质量很好，价格又便宜，500U的Taq酶才卖130元，和国产试剂差不多，但发文章尤其是SCI期刊时写fermentas(MBI)的名字很有面子的；引物是英俊(invitrogen)合成的；dNTP是promega品牌大陆分装的，很便宜1 ml 的10mM dNTP才130元。10X Taq buffer我一般用fermentas(MBI) Taq酶(货号EP0404，cuturl('http://www.fermentas.com/catalog/modifyingenzymes/taqdnapolymeraserecomb.htm'))附带的硫酸铵((NH4)2SO4)，氯化钾没有用过。
预变性94度3分钟;然后变性94度30 秒，退火做从50度到60度的10个梯度30秒，延伸72度45秒共35个循环;最后总延伸72度10分钟。摸索条件时一般用8ul产物上样电泳。
只要有目的条带可以说就已经成功了90%，至于什么引物二聚体，非特异性扩增，可以通过调整引物的量、模板的量、镁离子来解决。若没有目的条带，调整引物的量、模板的量、镁离子纯属瞎闹。
(3)模板
提取总RNA和逆转录时大家只要严格按照试剂盒的说明书操作就行了，没什么技巧。提取总RNA我用英俊(invitrogen)的Trizol，量一定要够。逆转录我用fermentas(MBI)的逆转录试剂盒(RevertAid™ First Strand cDNA Synthesis Kit,cuturl('http://www.fermentas.com/catalog/kits/kitrevertftstrand.htm'))，货号K1622，很好用，加好样后，按42度60分钟、70度5分钟反应就行了。这个试剂盒还提供了一对人、大鼠、小鼠通用的GAPDH内参，496bp，58度退火温度。序列如下：
正义5-CAAGGTCATCCATGACAACTTTG-3
反义5-GTCCACCACCCTGTTGCTGTAG-3
注：本人提到的上述品牌绝对不是在给该品牌打广告，而是本人亲自使用该品牌产品后的心得，该品牌也没有向本人提供任何赞助。

作者: 不懂 时间: 2011-8-20 11:36

不错。下载打印之。千万不要在一条引物上吊死这句话非常好，本人就是吃过这个亏。感觉这篇文章很贴近实际，不象有些教科书那样泛泛而谈。

作者: 不懂 时间: 2011-8-20 11:37

fermentas(MBI) Taq酶本人也在用，感觉确实便宜又好用。不象罗氏等品牌卖得死贵。

作者: 不懂 时间: 2011-8-20 11:37

正在做RT-PCR，借鉴

作者: 不懂 时间: 2011-8-20 11:38

我的逆转录酶是买的PROMEGA的，本来打算买试剂盒的，发现太贵了，作罢。还没开始做，等开始了再回来汇报效果。摸索中~~~

作者: 不懂 时间: 2011-8-20 11:49

我也在做细胞因子的RT-PCR，我做好几种细胞因子，可是除了内参，其它的不好啊，偶尔出来带，有得做梯度都没有目的带。请问是怎么回事？非特异带很多

作者: 不懂 时间: 2011-8-20 11:50

先重新合成引物看看吧.

作者: 不懂 时间: 2011-8-20 11:50

若没有目的条带，调整引物的量、模板的量、镁离子纯属瞎闹。

那弥散带很严重怎么解决呢

作者: 不懂 时间: 2011-8-20 11:53

谢谢分享，非常受益，我的pcr一直都跑不出来目的条带，开始还没怀疑引物有问题，由此看来引物有问题的可能性还是很大的了。

作者: 不懂 时间: 2011-8-20 11:54

我也是跑不出条带，也不知道是为什么。
G3PDH的跑出来了，可能是什么方面的问题啊？？？？
急死我了~~~~~~~~~

作者: 不懂 时间: 2011-8-20 11:54

fermentas(MBI)的逆转录试剂盒(RevertAid™ First Strand cDNA Synthesis Kit)这个我也用过，感觉还可以。

作者: 不懂 时间: 2011-8-20 11:54

我现在正在做RT-PCR，引物退火温度我已经摸好，能P出比较亮的条带，当时是用的33个循环摸的，请问平台期前的最佳循环数是不是也必须要摸啊？

作者: 不懂 时间: 2011-8-20 11:55

马上要做了，谢谢分享！

作者: 不懂 时间: 2011-8-20 11:55

学习了，我也刚做RT-PCR

作者: 不懂 时间: 2011-8-20 11:56

我居然和楼主用的是同一家公司的逆转录试剂盒。我也才开始做RT-PCR，我觉得我在逆转录环节应该没问题，问题应该出现在引物或者是PCR体系里

作者: 不懂 时间: 2011-8-20 11:56

我用的也是fermentas的！要扩3000bp的目的基因片段，用的是加好MgCl2的buffer,酶用的也是该公司的长片段扩增的taq酶，每次用推荐的体系配方以10微升体系pcr,做10个温度梯度，但做了6.7次了还是没有目的条带出来，只能看到引物二聚体，着急啊！
已经跑了内参，证明模板没有问题，不知楼主可能指点一二，看看哪些地方还需调整

作者: 不懂 时间: 2011-8-20 11:58

另外我的引物是上海生工合成的，在冰箱里冻了快1年才拿出来用，因为是我师姐还在做实验的时候合成的，不知道这么长时间可有什么问题

作者: 不懂 时间: 2011-8-20 11:59

我的PCR是六个样品两个跑出目的条带，其余四个没有，应该不是引物的问题吧？

作者: 不懂 时间: 2011-8-20 12:00

我想请教一下，RT的体系可以扩大到40uL么，效果会怎么样？谢谢。

作者: 不懂 时间: 2011-8-20 12:00

我现在就正在吊死在一个一个引物上

作者: 不懂 时间: 2011-8-20 12:01

楼主说的那家牌子没听说过我用的TAKARA的，别人推荐的不知道效果怎么样呵呵

作者: 不懂 时间: 2011-8-20 12:01

非常感谢楼主，很实在的经验指导

作者: 不懂 时间: 2011-8-20 12:01

我也买了他家的试剂盒，还没开始用，希望如推荐的一样好。

作者: 不懂 时间: 2011-8-20 12:02

正在做RT-PCR，借鉴中，感谢ing

作者: 不懂 时间: 2011-8-20 12:02

楼主威武

我现在也是进到一个死胡同了。

作者: 不懂 时间: 2011-8-20 12:02

马上要做RT-PCR，学习一下

作者: 不懂 时间: 2011-8-20 12:03

我每次做梯度的时候，就是没有目的条带，要么什么都没有，要么就是小于100bp的，问题出在哪呢？用的是天根的试剂盒

作者: 不懂 时间: 2011-8-20 12:03

我要做人全血的RT-PCR 没有白细胞裂解液能不能用水代替，比例应加多少？

作者: 不懂 时间: 2011-8-20 12:04

正准备做RT-PCR。为引物设计发愁呢，谢谢分享，借鉴中。

作者: 不懂 时间: 2011-8-20 12:04

在学习RT-PCR，很好

作者: 不懂 时间: 2011-8-20 12:05

我们在用康为的MIX，觉得还好，请问各位做RT－PCR一般把循环次数调到多少？

作者: 不懂 时间: 2011-8-20 12:05

学习了，我们都是用TAKALA 和promega的，还没有用过MBI的

作者: 不懂 时间: 2011-8-20 12:05

非常感谢！我马上就做了，谢谢分享。

作者: 不懂 时间: 2011-8-20 12:06

我也开始要做白细胞因子的RTPCR，就是发现引物设计要包含能扩增特定区段有疑问，还有退火稳定怎么摸最合理，还有循环次数怎么掌握呢，新手，请各位不吝指教，谢谢

作者: 不懂 时间: 2011-8-20 12:07

如果是用Primer 3 或者文献的引物，P后没有条带
RT-PCR则最容易在以下环节出问题
1.RNA的质量
2.cDNA的质量（主要是试剂盒的问题)
3.PCR反应体系（酶，mg离子，模版量，）
4.PCR程序设定（最主要是变性和退火的温度、时间）
5.目的片段高GC的话（70%以上），要优化反应体系和PCR程序（降落PCR等）
6.其他还没想到

作者: 不懂 时间: 2011-8-20 12:07

我想请问一下，我用的是Fermentas的PCR试剂盒，25ul体系的，mix加了12.5ul，上下游引物各加1微升，cDNA浓度1024ul/l，加了0.9ul。解链温度是95°C，5分钟。为什么没有目的条带出现呢？另外，我的管家基因有条带。会不会是引物有问题？引物是从影响因子较高的文献上找的。

作者: 不懂 时间: 2011-8-20 12:07

跑了两次梯度，昨天几乎全都有条带（内参跟目的都有），今天却全没有条带（只有内参），最可能的问题是什么啊？为这实验很崩溃啊！

作者: 不懂 时间: 2011-8-20 12:08

正准备做实验，学习了！谢谢

作者: 不懂 时间: 2011-8-20 12:08

最近要做RT-PCR，刚接触这个技术，在文献里找不到引物，看来需要自己设计了，不知道引物设计具体需要要注意哪些细节啊，请楼主或其他大侠们指点指点，少走点弯路，多谢了！

作者: 不懂 时间: 2011-8-20 12:09

新手在纠结中。。努力学习之。。。

作者: 不懂 时间: 2011-8-20 12:09

如下~~~~~~~~~~~~~~~：

若没有目的条带，调整引物的量、模板的量、镁离子纯属瞎闹。

那弥散带很严重怎么解决呢

图片附件: 96564361.png (2011-8-20 12:09, 17.43 KB) / 该附件被下载次数 6
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=8309

作者: 不懂 时间: 2011-8-20 12:10

我最近也遇到这种问题，以前可以扩出的条带现在扩不出来了，就像上面的图，因为该cDNA可以扩出其他片段，所以考虑应该不是RNA，cDNA的问题，酶也试了三种，结果一样，现在不清楚到底哪个环节出了问题，主要是以前扩出来过，现在怎么也扩不出了

作者: 不懂 时间: 2011-8-20 12:10

很有指导意义，谢谢楼主

作者: 不懂 时间: 2011-8-20 12:11

留记号 ~~~~~~~~~~~~~~~~

作者: 不懂 时间: 2011-8-20 12:11

请教楼主：你P的片段是多大的？我做的是5、6kb的片段，但是条带模糊，有非特异性扩增，这如何解决？

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