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标题: 针对外显子设计PCR测序引物教程[转自丁香园论坛] [打印本页]

作者: 蓝蜗牛 时间: 2011-8-20 12:13 标题: 针对外显子设计PCR测序引物教程[转自丁香园论坛]

针对外显子设计PCR测序引物教程[转自丁香园论坛]

在园子搜索后，没有看到长基因（大与1000base)最简洁方法，而我现在欧洲实验室里从事这方面工作，作了大量这方面的工作。自乐不如同乐，愿将我们设计引物技巧与大家分享，敲字很辛苦，请斑竹给点分。
可能有战友说了，我们的长基因都是交给测序公司用鸟枪法来测全基因的。当然，您有钱当然可以这样做。我们的方法适用于基因测序筛查突变，步骤相对简便，比较经济。另外，本实验室最近的一偏文章采用该法发在了NEMJ上，可见该法已经是经典成熟的。
（1）基础知识
我们知道gDNA由非编码区，外显子，内含子构成。我们关心的基因是否突变在非编码区，外显字以及临近外显子的一小段内含子上。至于其他的内含子（gDNA中的大头），发生突变与否并不是我们关心的，其临床意义也相当小。因此我们只要设计引物来PCR上面三个重点区域就可以了。
（2）设计软件
在线设计软件 exon primer
cuturl('http://ihg2.helmholtz-muenchen.de/ihg/ExonPrimer.html')

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http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=8310

作者: 蓝蜗牛 时间: 2011-8-20 12:14

大家从上图可以看到，网页提示我们现在需要输入两个序列，一个是cDNA，一个是gDNA。
由于我们还要考虑非编码区，而CDNA是没有非编码区UTR的。因此，我们必须要用mRNA 输入网页中的cDNA栏。否则我们得到的引物不会包含UTR。要是有看官还看不懂的话，建议看下分子生物学教材关于cDNA和mRNA的区别。
下面我们以smurf2基因来说明如何设计针对外显子的测序引物。
（2）找到smurf2 mRNA
打开gene bank
cuturl('http://www.ncbi.nlm.nih.gov/'),注意要在database中选nucleotide
如下图

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http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=8311

作者: 蓝蜗牛 时间: 2011-8-20 12:15

蹦出一大串序列。找到我们要的人类的smurf2
Homo sapiens SMAD specific E3 ubiquitin protein ligase 2 (SMURF2), mRNA

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http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=8312

作者: 蓝蜗牛 时间: 2011-8-20 12:16

直接点我们要的序列名字，就得到了mRNA了，Format:GenBank FASTA Graphics More Formats选项中当然要求点选FASTA形式了
把mRNA序列拖选，拷贝下来

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http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=8313

作者: 蓝蜗牛 时间: 2011-8-20 12:16

再拷贝入在线设计软件 exon primer （见第一贴）
cuturl('http://ihg2.helmholtz-muenchen.de/ihg/ExonPrimer.html')

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http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=8314

作者: 蓝蜗牛 时间: 2011-8-20 12:17

好了。下面就要找gDNA了。
（3）ensembl在线查找gDNA
cuturl('http://www.ensembl.org/Homo_sapiens/Info/Index')
进入人类基因序列库

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http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=8315

作者: 蓝蜗牛 时间: 2011-8-20 12:18

输入smurf2
得到下面的信息
点击Ensembl protein_coding Gene: ENSG00000108854 (HGNC (automatic): SMURF2

图片附件: 15061876_snap.jpg (2011-8-20 12:18, 56.28 KB) / 该附件被下载次数 15
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=8316

作者: 蓝蜗牛 时间: 2011-8-20 12:19

得到两段序列,201和202,其实两段序列是不同机构作出来的,大同小异.点第一个

图片附件: 86531350_snap.jpg (2011-8-20 12:19, 51.86 KB) / 该附件被下载次数 16
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=8317

作者: 蓝蜗牛 时间: 2011-8-20 12:20

得到如下页面

图片附件: 94669704_snap.jpg (2011-8-20 12:20, 54.56 KB) / 该附件被下载次数 12
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=8318

作者: 蓝蜗牛 时间: 2011-8-20 12:21

在线看呢,楼主还没介绍完?

作者: 蓝蜗牛 时间: 2011-8-20 12:21

非常有意思，希望楼主继续，把故事讲完，谢谢！

作者: 蓝蜗牛 时间: 2011-8-20 12:22

点页面里的supporting evidence,再点 exon,就得到了smurf2的全基因序列,我们可以看到大写的碱基为外显子,小写的碱基为内含字.其实ensembl不同于ncbi的最大优势在于分开了外显字和内含字.我们设计的引物就知道是在外显子还是内含子上了.

图片附件: 97582258_snap.jpg (2011-8-20 12:22, 62.07 KB) / 该附件被下载次数 11
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=8319

作者: 蓝蜗牛 时间: 2011-8-20 12:22

太好啦

请楼主务必继续

谢谢！

作者: 蓝蜗牛 时间: 2011-8-20 12:23

我也非常喜欢用ensembl 对于测序很方便

作者: 蓝蜗牛 时间: 2011-8-20 12:23

现在将全部的gDNA用鼠标拖选起来,大家注意到两点(1)务必使内涵子全部显示,我们在页面左下角的Configure this page里有这个选项.(2)鼠标拖选后,里面会有一些页面里的单词,比如ENSE00001331843什么的,必须把这类字母过滤掉.

图片附件: 70639733_snap.jpg (2011-8-20 12:24, 55.88 KB) / 该附件被下载次数 7
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=8320

作者: 蓝蜗牛 时间: 2011-8-20 12:24

可以用DNA-Star 工具软件里的Editseq(网上有下),将序列过滤,仅保留ATCG字母.或者用下列在线过滤工具
cuturl('http://www.bio-soft.net/sms/index.html')

作者: 蓝蜗牛 时间: 2011-8-20 12:24

将过滤后的ATCG拷入
在线设计软件 exon primer 的gDNA栏中(见第一贴)
cuturl('http://ihg2.helmholtz-muenchen.de/ihg/ExonPrimer.html')
默认的参数不变. done!
就得到了我们要的外显子引物了.大家可以发现我们的引物cover了非编码区，外显字以及临近外显子的一小段内含子.大功告成!(全文完)

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http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=8321

作者: 蓝蜗牛 时间: 2011-8-20 12:25

非常好，大家赶紧来学习，谢谢了！！！

作者: 蓝蜗牛 时间: 2011-8-20 12:25

虽然有很多地方看不懂（由于基础知识太差），但是能感觉是好东西，而且楼主也很非常的辛苦的把图片都给截下来了。激动感谢楼主~~~！！！！！祝楼主一切顺利~

作者: 蓝蜗牛 时间: 2011-8-20 12:26

Thx so much, not only for exon primer designing, also for real-time PCR primers.

Really appreciated your kind share with us, hopefully, could see your work again...

Good luck with ur research...:p

作者: 蓝蜗牛 时间: 2011-8-20 12:26

很有意思，我学习了。

作者: 蓝蜗牛 时间: 2011-8-20 12:26

讲的很详细呀，很受用！谢谢楼主！

作者: 蓝蜗牛 时间: 2011-8-20 12:27

楼主很有心啊，谢谢楼主！

作者: 蓝蜗牛 时间: 2011-8-20 12:27

强帖无敌！

作者: 蓝蜗牛 时间: 2011-8-20 12:27

这种好帖子怎么也不能沉下去，顶起来！

多谢楼主的无私奉献。

作者: 蓝蜗牛 时间: 2011-8-20 12:28

感谢，真的很好的东西~~~ 不过我最后出现的网页面怎么跟楼主的不一样啊？？？是不是改版了？？？好象楼主的内含子显示的是全部，而我显示的是省略号。。。。为什么啊

图片附件: 13681068_snap.jpg (2011-8-20 12:28, 66.19 KB) / 该附件被下载次数 5
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=8322

作者: 蓝蜗牛 时间: 2011-8-20 12:28

原因找到了。。我贴出来让大家也不用花时间找了。呵呵

就在左边，configure this page

图片附件: 77085687.jpg (2011-8-20 12:29, 19.72 KB) / 该附件被下载次数 5
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=8323

作者: 蓝蜗牛 时间: 2011-8-20 12:29

我在用这个引物设计网站时候，出了点问题，我的基因有16个外显子，结果第14个外显子没有提供有用的序列。是不是这就需要我自己设计引物了？需要注意哪些地方呢？用什么软件设计呢？
还有，我发现在结果里面，往往是出现EXON 1 没结果，重新设定参数。但是紧接着就会出现EXON1 。。。引物序列也出现了。这是怎么回事啊？问题比较菜，盼楼主不吝赐教！！！

作者: 蓝蜗牛 时间: 2011-8-20 12:30

请问，设计出来的引物为什么和内含子是一样的而不是互补的呢？

作者: 蓝蜗牛 时间: 2011-8-20 12:31

非常透彻，谢谢 ~~~~~~~~~~~~

作者: 蓝蜗牛 时间: 2011-8-20 12:31

非常感谢楼主的介绍！领教了 ******************************

作者: 蓝蜗牛 时间: 2011-8-20 12:32

汗，太强大了@@@@@@@@@@@

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