分析测试百科

标题: ※※※电泳讨论专区※※※ [打印本页]

作者: 阿拉蕾 时间: 2011-8-21 09:16 标题: ※※※电泳讨论专区※※※

开辟这个专区，希望大家多多交流。同时也希望大家以后关于电泳的帖子，都发到这里。
谢谢！

[ 本帖最后由 miracle 于 2011-9-5 15:16 编辑 ]

作者: 阿拉蕾 时间: 2011-8-21 09:18

非常高兴成立此版：发文庆祝：
基础知识讲座：

PCR扩增产物的电泳分析
　　凝胶电泳分琼脂糖电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳两种
.一、琼脂糖凝胶电泳:
　　琼脂糖凝胶电泳是一种非常简便、快速、最常用的分离纯化和鉴定核酸的方法.琼脂糖是从海藻中提取的一种线状高聚物.根据琼脂糖的溶解温度，把琼脂糖分为一般琼脂糖和低熔点琼脂糖.低熔点琼脂糖熔点为62～65℃，溶解后在 37℃下维持液体状态约数小时，主要用于DNA片段的回收，质粒与外源性DNA的快速连接等.
(一)凝胶浓度
　　凝胶浓度的选择依DNA分子的大小而定.琼脂糖凝胶的浓度与DNA分离范围
琼脂糖浓度(%)  线型DNA分子的分离范围(Kb)
0.3  5～60
0.6  1～20
0.7  0.8～10
0.9  0.5～7
1.2  0.9～6
1.5  0.2～3
12.0  0.1～2
(二)电泳缓冲液
　　核酸电泳缓冲液有三种，即Tris-硼酸(TBE)、Tris-乙酸(TAE)和Tris-磷酸(TPE).TBE 与TPE缓冲容量高，DNA分离效果好，但TPE在DNA片段回收时含磷酸盐浓度高，容易使 DNA沉淀.TAE缓冲容量低，但价格较便宜，因而推荐选用TBE.缓冲液中的EDTA可螯合二价阳离子，从而抑制DNA酶的活性，防止PCR扩增产物降解.
　　10XTBE缓冲液的配制
　　Tris硷，108克
　　EDTA，9.3克
　　硼酸，55克
　　H2O至，1000ul
　　(其PH应为8.0～8.2)
　　临用时用水稀至0.5XTBE(20倍稀释.

作者: 阿拉蕾 时间: 2011-8-21 09:18

(三)核酸电泳的指示剂与染色剂
　　1.指示剂:核酸电泳常用的指示剂有溴酚兰和二甲苯青及银染色.溴酚兰在碱性液体中呈紫兰色，在0.6%、1%、1.4%和2%琼脂糖凝胶电泳中，溴酚兰的迁移率分别与1Kb、 0.6Kb、0.2Kb和0.15Kb的双链线性DNA片段大致相同.二甲苯青的水溶液呈兰色，它在 1%和1.4%琼脂糖中电泳时，其迁移速率分别与2Kb和1.6Kb的双链线性DNA大致相似.
　　指示剂一般与蔗糖、甘油或聚蔗糖400组成载样缓冲液.载样缓冲液的作用有①增加样品密度，使其比重增加，以确保DNA均匀沉入加样孔内.②在电泳中形成肉眼可见的指示带，可预测核酸电泳的速度和位置.③使样品呈色，使加样操作更方便.
　　染色剂:核酸电泳后，需经染色后才能显现出带型，最常用的是溴化乙锭染色法，其次是银染色.
　　溴化乙锭(ethidium bromide，E B )是一种荧光染料，EB分子可嵌入核酸双链的碱基对之间，在紫外线激发下，发出红色荧光.根据情况可在凝胶电泳液中加入终浓度为 0.5ug/ml的EB，有时亦可在电泳后，将凝胶浸入该浓度的溶液中染色10～15min.琼脂糖凝胶EB染色，肉眼可见核酸电泳带，其DNA量一般>5ng，当溴化乙锭太多，凝胶染色过深，核酸电泳带看不清时，可将凝胶放入蒸馏水浸泡30min后再观察.
　　银染色:银染色液中的银离子(Ag+)可与核酸形成稳定的复合物，然后用还原剂如甲醛使Ag+还原成银颗粒，可把核酸电泳带染色黑褐色.主要用于聚丙烯酰胺凝胶电泳染色. 也用于琼脂糖凝胶染色.其灵敏度比EB高200倍.但银染色后，DNA不宜回收.
(四)电泳
　　1.电泳装置:
　　电泳装置主要有电泳仪，电泳槽及灌胶模具等.
　　2.电泳方法:
　　(1)用蒸馏水将电泳槽和梳子冲洗干净.放在水平桌面上，并架好梳子.
　　(2)根据核酸分子量的大小配制不同浓度的琼脂糖凝胶，一般200～400bp的DNA片段，可配制1.2～1.7%浓度的琼脂糖用于电泳.
　　3.配制0.5XTBE电泳缓冲液100ml于三角烧瓶中，称取一定量的琼脂糖粉放入后沸水锅或微波炉内加热熔化.冷却至60℃(需要时可加入溴乙锭)，倒入电泳槽中，待凝固.
　　4.向电泳槽中倒入0.5XTBE，其量以没过胶面2mm为宜，小心移去梳子.如样品孔内有气泡，应设法除去.
　　5.在DNA样品中加入0.2体积的载样缓冲液，混匀后，加入样品孔内.
　　6.接通电源，一般红色为正极黑色为负极，切记DNA样品由负极往正极泳动(靠近加样孔的一端为负).电压为1-5V/cm(长度以两个电极之间的距离计算).
　　7.根据指示剂泳动的位置，判断是否终止电泳.一般200～400bp的PCR产物50V电压，电泳20～40min即可.
　　(3)溴化乙锭染色后，紫外仪上观察电泳带及其位置，并与核酸分子量标准比较被扩增产物的大小.

二、聚丙烯酰胺凝胶电泳
　　聚丙烯酰胺凝胶电泳适宜分离鉴定低分子量蛋白质、小于1Kb的DNA片段和DNA序列分析.其装载的样品量大，回收DNA纯度高.长度仅相差0.2%(即500bp中的1bp)的核苷酸分子即能分离.
　　聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺单体，在催化剂TEMED(N，N，N，N'一四甲基乙二胺)和过硫酸铵的作用下，丙烯酰胺聚合形成长链，聚丙烯酰胺链在交联剂，N，N'一亚甲双丙烯酰胺参与下，聚丙烯胺链与链之间交叉联接而形成凝胶.
　　聚丙烯酰胺凝胶孔径的大小是由丙烯酰胺的浓度决定的，不同浓度丙烯酰胺和DNA的有效分离范围见表2.
丙烯酰胺(%)  有效分离范围(bp)  溴酚兰*  二甲苯青*
3.5  100～2000  100  460
5.0  80～500  65  260
8.0  60～400  45  160
12.0  40～200  30  70
15.0  25～150  15  60
20.0  10～100  12  45
　　*表中给出的数字为与指示剂迁移率相等的双链DNA分子所含碱基对数目(bp).
一)材料
　　1.电泳仪器:电泳仪，垂直电泳槽及其附件.
　　2.30%丙烯酰胺
　　丙烯酰胺，29克
　　N，N'一亚甲基双丙烯酰胺，1克
　　H2O，加至100ml
　　装于棕色瓶内，4℃可保存二个月.
　　3.10%过硫酸铵
　　过硫酰铵，1克
　　加水至，10ml
　　4℃可保存一周，-20℃可保存一个月.
　　4.1XTBE电泳缓冲液
　　5.TEMED(四甲基乙烯基二胺)

作者: 阿拉蕾 时间: 2011-8-21 09:18

(二)聚丙烯酰胺凝胶的制备与电泳
　　根据分离DNA片段的大小及需凝胶的容积，配制聚丙烯酰胺凝胶.
　　1.按要求装配好垂直电泳板，两块玻璃板的两侧及底部用1%的琼脂糖封边，防止封闭不严而使聚丙烯酰胺液漏出.
　　2.将装好的玻璃电泳板倾斜成45～60℃角.
　　3.按表3配制所需%浓度凝胶的毫升数.
　　4.加入TEMED后，立即混匀，缓缓倒入两玻璃板间的胶床中，直到液体接近溢出时为止.
　　5.立即插入适当的梳子，密切注意防止梳齿下产生气泡，用一有力的夹将梳子夹在一边的玻璃板上，然后将玻璃板斜靠在物体上，使成10°角，可减少液体泄漏的机会.
　　6.室温聚合一小时后，将玻璃板插入电泳槽中，上紧，倒入0.1XTBE 缓冲液.
　　7.小心取出梳子，立即用缓冲液冲洗加样孔，因为梳子取出后，梳子上吸附的及凝胶顶部未聚合的丙烯酰胺会流入加样孔内聚合，产生不规则的表面，将导致以后DNA电泳带型不规则.
　　8.将DNA样品与适量的载样缓冲液混匀后，加到样品孔内，加样时不要产生气泡.
　　9.接好电极，电压为1-8V/cm，进行电泳.
　　10.根据指示剂迁移位置来判定是否终止电泳.
　　11.电泳毕，切断电源，弃去电泳仪，取出胶床板，小心移去一块玻璃板，让凝胶吸附在另一块玻璃板上.浸入含0.5ug/ml的溴化乙锭溶液中，15～30min后取出水洗紫外仪下观察结果.
　　12.聚丙烯酰胺凝胶电泳只能检出>10ng以上量的DNA条带.要求更高的灵敏度，可用银染.

作者: 阿拉蕾 时间: 2011-8-21 09:19

琼脂糖凝胶电泳的优点
在凝胶电泳中，首先应用的是琼脂电泳，它具有下列优点：（1）琼脂含液体量大，可达98-99%，近似自由电泳，但是样品的扩散度比自由电泳小，对蛋白质的吸附极微。（2）琼脂作为支持体有均匀，区带整齐，分辨率高，重复性好等优点。（3）电泳速度快。（4）透明而不吸收紫外线，可以直接用紫外检测仪作定量测定。（5）区带易染色，样品易回收，有利于制止备。然而琼脂中有较多硫酸根，电渗作用大。琼脂糖是从琼脂中提取出来的，是由半乳糖和3.6-脱水-L- 半乳糖相互结合的链状多糖。含硫酸根比琼脂少，因而分离效果明显提高。　　琼脂（糖）电泳常用缓冲液的pH在6-9之间，离子强度为0.02-0.05。离子强度过高时，会有大量电流通过凝胶，因而产生热量，使凝胶的水份量蒸发，析出盐的结晶，甚至可使凝胶断裂，电流中断。常用的缓冲液有硼酸盐缓冲液与巴比妥缓冲液。为了防止电泳时两极缓冲液槽内pH和离子强度的改变，可在每次电泳后合并两极槽内的缓冲液，混匀后再用。
聚丙烯酰胺凝胶有以下优点：
①聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺和N，N'甲叉双丙烯酰胺聚合而成的大分子。凝胶有格子是带有酰胺侧链的碳-碳聚合物，没有或很少带有离子的侧基，因而电渗作用比较小，不易和样品相互作用。
②由于聚丙烯酰胺凝胶是一种人工合成的物质，在聚合前可调节单体的浓度比，形成不同程度交链结构，其空隙度可在一个较广的范围内变化，可以根据要分离物质分子的大小，选择合适的凝胶成分，使之既有适宜的空隙度，又有比较好的机械性质。一般说来，含丙烯酰胺7-7.5%的凝胶，机械性能适用于分离分子量范围不1万至100万物质，1万以下的蛋白质则采用含丙烯酰胺15-30%的凝胶，而分子量特别大的可采用含丙烯酰胺4%的凝胶，大孔胶易碎，小孔胶则难从管中取出，因此当丙烯酰胺的浓度增加时可以减少双含丙烯酰胺，以改进凝胶的机械性能。
③在一定浓度范围聚丙烯酰胺对热稳定。凝胶无色透明，易观察，可用检测仪直接测定。
④丙烯酰胺是比较纯的化合物，可以精制，减少污染。合成聚丙烯酰胺凝胶的原料是丙烯酰胺和甲撑双丙烯酰胺。丙烯酰胺称单体，甲撑双丙烯酰胺称交联剂，在水溶液中，单体和交联剂通过自由基引发的聚合反应形成凝胶。

作者: 阿拉蕾 时间: 2011-8-21 09:19

这几天跑电泳（2%琼脂糖）遇到一个问题：
除了模板DNA（双链）的浓度不一样（相差1个数量级）其他条件都一致，但是电泳结果却比较奇怪，浓度高的在前面约200BP，浓度小的在后面，大约300个BP（比较亮，模板DNA没有污染）！
请问原因何在？

作者: 阿拉蕾 时间: 2011-8-21 09:19

我个人认为，产物浓度大的话跑得会比较快。看起来好像和MARK比小了一点，你将他们都胶回收以后，各取少量，再做电泳，看是不是一致。另外顺便问一下，你的目的条带应该是多少？模板有多长？

作者: 阿拉蕾 时间: 2011-8-21 09:20

目的条带应该是200BP，而且加如的模板是同一种DNA，但跑出来的条带却是大小不一致（没有污染）！
我个人觉得这种情况应该和浓度没有关系吧！
切盼回复！

作者: 阿拉蕾 时间: 2011-8-21 09:20

模板是多长很有关系，量的多少也很有关系。应该指出：目的条带的扩增是指数扩增。如果模板量多，会存在一个几何倍数扩增，出现一些比目的条带长的片断（由一侧引物扩增得来的）。也会很亮的，看起来很乱。那样你就考虑减少模板，回收目的条带就好了，问题不就解决了。为什么加这么多模板的，模板量多了并不好。

作者: 阿拉蕾 时间: 2011-8-21 09:21

楼上的大侠，我问的是：模板量的多与少为什么会使P出来的目的条带大小相差100BP，即只是原因！

作者: 阿拉蕾 时间: 2011-8-21 09:22

难道我说得还不够清楚吗？都说两种可能了。不信的话，你有本钱，去测个序不就明白了。

作者: 阿拉蕾 时间: 2011-8-21 09:22

1. 取下凝胶,蒸馏水冼胶30秒.
2. 0.1% 硝酸银染色10分钟.
3. 弃去染色液,蒸馏水洗胶1分钟.
4.显色液显色15秒,换用新的显色液,显清条带为止.
显色液配方: 10克氢氧化钠+0.2克碳酸钠+2m甲醛溶液,定溶到500ml.

这个染色方法挺好的,我用过.注意染色时间不能长.

作者: 阿拉蕾 时间: 2011-8-21 09:22

电泳技术概述

　　电泳是指带粒子在电场中向与自身带相反电荷的电极移动的现象。例如蛋白质具有两性电离性质。当蛋白质溶液的pH在蛋白质等电点的碱侧时，该蛋白质带负电荷，在电场中向正极移动，相反则带正电荷，在电场中向负极移动，只有蛋白质溶液pH在蛋白质的等电点时静电荷是零，在电场中不向任何一极移动。
　　电泳现象早在1890年就被发现，1907年有人曾在琼脂中电泳，研究白喉毒素； 1937年由Tiselius制成界面电泳仪，并开始用于蛋白质的研究。从此，人们才逐渐认识到电泳技术对于生物科学研究是一种重要工具。然而，界面电泳结构复杂。价格昂贵难于普及。1940年左右。以纸为支持物的电泳问世后，电泳技术得到迅速发展。
　　电泳技术以支持物分，可分为纸电泳，醋酸纤维素薄膜电泳，淀粉凝胶电泳，琼脂（糖）凝胶电泳及聚丙烯酰胺凝胶电泳等。经凝胶形状分有水平平板电泳，园盘柱状电泳及垂直平板电泳。各种类型的电泳技术概括如表。
类别  名称
用支持体的电泳技术
1.纸上电泳
2.醋酸纤维薄膜电泳
3.薄层电泳
4.非凝胶性支持体区带电泳（支持体有：淀粉，纤维素粉，玻璃粉，硅胶等)
5.凝胶支持体区带电泳 ①淀粉液 ②聚丙烯酰胺凝胶 ③琼脂（糖）凝胶
不用支持体的电泳技术
1.Tiselius或微量电泳
2.显微电泳
3.等电点聚焦电泳技术
4.等速电泳技术
5.密度梯度电泳

作者: 阿拉蕾 时间: 2011-8-21 09:23

表电泳技术的种类
　　各类电泳技术已经广泛地用于基础理论研究，临床诊断及工业制造等方面。例如用醋酸纤维薄膜电泳分析血清蛋白，用琼脂对流免疫电泳分析病人血清，为早期诊断原发性肝癌提供资料：用高压电泳分离肽段，研究蛋白质一级结构：用高压电泳和层析结合研究核酸的一级结构。凝胶龟泳技术在分离分析酶。蛋白质，核酸等生物大分子方面具有较高的分辩力，为生物化学，分子生物学的发展作出了重大贡献。

作者: 阿拉蕾 时间: 2011-8-21 09:23

琼脂糖凝胶电泳
　　在凝胶电泳中，首先应用的是琼脂电泳，它具有下列优点：（1）琼脂含液体量大，可达98-99%，近似自由电泳，但是样品的扩散度比自由电泳小，对蛋白质的吸附极微。（2）琼脂作为支持体有均匀，区带整齐，分辨率高，重复性好等优点。（3）电泳速度快。（4）透明而不吸收紫外线，可以直接用紫外检测仪作定量测定。（5）区带易染色，样品易回收，有利于制止备。然而琼脂中有较多硫酸根，电渗作用大。琼脂糖是从琼脂中提取出来的，是由半乳糖和3.6-脱水-L- 半乳糖相互结合的链状多糖。含硫酸根比琼脂少，因而分离效果明显提高。　　琼脂（糖）电泳常用缓冲液的pH在6-9之间，离子强度为0.02-0.05。离子强度过高时，会有大量电流通过凝胶，因而产生热量，使凝胶的水份量蒸发，析出盐的结晶，甚至可使凝胶断裂，电流中断。常用的缓冲液有硼酸盐缓冲液与巴比妥缓冲液。为了防止电泳时两极缓冲液槽内pH和离子强度的改变，可在每次电泳后合并两极槽内的缓冲液，混匀后再用。

作者: 阿拉蕾 时间: 2011-8-21 09:23

醋酸纤维素薄膜电泳
　　醋酸纤维素薄膜是由醋酸纤维素加工制成的。醋酸纤维素薄膜作为是电泳支持体有以下优点：①电泳后区带界限清晰；②通电时间较短（二十分钟至一小时）；③它对各种蛋白质（包括血清白蛋白，溶菌酶及核糖核酸酶）都几乎完全不吸附，因此无拖尾现象；④对染料也没有吸附，因此不结合的染料能完全洗掉，无样品处几乎完全无色。它的电渗作用虽高但很均一，不影响样品的分离效果，由于醋酸纤维素薄膜吸水量较低，因此必需在密闭的容器中进行电泳，并使用较低有电流避免蒸发。
　　醋酸纤维素薄膜电泳已经广泛用于血清蛋白，血红蛋白，球蛋白，脂蛋白，糖蛋白，甲胎蛋白，类固醇及同工酶等的分离分析中，尽管它的分辨力比聚丙酰胺凝胶电泳低，但它具有简单，快速等优点。根据样品理化性质，从提高电泳速度和分辨力出发选择缓冲液的种类，pH和离子强度。选择好的缓冲液最好是挥发性强，对显色或紫外光等观察区带没有影响，若样品含盐量较高时，宜采用含盐缓冲液。例如血清蛋白电泳可选用pH8.6的巴比妥缓冲液或硼酸缓冲液；氨基酸的分离则可选用pH7.2的磷酸盐缓冲液等。电泳时先将滤膜剪成一定长度和宽度的纸条。在欲点样的位置用铅笔做上记号，点上样品，在一定的电压，电流下电泳一定时间，取下滤膜，进行染色。不同物质需采用不同的显色方法，如核苷酸等物质可在紫外分析灯下观察定位，但许多物质必须经染色剂显色。
　　醋酸纤维素薄膜电泳染色后区带可剪下，溶于一定的溶剂中进行光密度测定。也可以浸于折射率为1.474的油中或其他透明液中使之透明，然后直接用光密度计测定。它的缺点是厚度小，样品用量很小，不适于制备。
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作者: 阿拉蕾 时间: 2011-8-21 09:24

核酸凝胶电泳
自从琼脂糖（agrose）和聚丙烯酰胺（polyacrylamide）凝胶被加入核酸研究以来，按分子量大小分布分离DNA的凝胶电泳技术，已经发展成为一种分析鉴定重组DNA分子及蛋白质与核酸相互作用的重要实验手段。同时也是现在通用的许多分子生物学研究方法的技术移速度叫做电泳的迁移率，它同电场的强度和电泳分子本身所携带的净电荷数成正比，也与电泳分子的大小、构型、形状等因素有关。核酸分子的磷酸基团带有负电荷，因此，当核酸分子被放置在电场当中时，它们就会向正电极的方向迁移，大小、形状、构型不同的核酸分子迁移率不同，因而在电场中被分离。

作者: 阿拉蕾 时间: 2011-8-21 09:24

我提了质粒DNA，在PCR之前想看看分子量是否是我所要得，但出现一个问题，必须要和loading buffer按至少3：1，严重时1：1的比例上样才行，否则就会出现漂样。求助。
buffer没有问题，用来上marker5：1没问题。

作者: 阿拉蕾 时间: 2011-8-21 09:25

10XTBE缓冲液的配制
　　Tris硷，108克
　　EDTA，9.3克
　　硼酸，55克
　　H2O至，1000ul
　　(其PH应为8.0～8.2)
　　临用时用水稀至0.5XTBE(20倍稀释.
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请问：你是这样配制TBE的，如何溶解EDTA，我按照书上先配EDTA，确实需要调PH值，PH到达8，很快溶解。然后再将0.5M EDTA加入。

作者: 阿拉蕾 时间: 2011-8-21 09:25

我只用过TAE.。按分子克隆书来配的。上面的内容引子37℃网。

作者: 阿拉蕾 时间: 2011-8-21 09:26

我做变性PAGE，老出现这样问题，请指教：
（1）MARKER多出两条带，正常吗？
（2）带型弯曲，中间低，什么原因？
（3）有实验指导说，应该预电泳1小时后，温度达到55度，才可以，真的是这样吗？

作者: 阿拉蕾 时间: 2011-8-21 09:27

QUOTE:

原帖由 阿拉蕾 于 2011-8-21 09:26 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
我做变性PAGE，老出现这样问题，请指教：
（1）MARKER多出两条带，正常吗？
（2）带型弯曲，中间低，什么原因？
（3）有实验指导说，应该预电泳1小时后，温度达到55度，才可以，真的是这样吗？ ...

MARKER在上样前同样需要变性的。
带型弯曲也属正常，可能是胶面温度不均匀，可在高压电泳时加一块铝制保温板。如果拔梳子时注意使胶面平齐，带型会好些。
预电泳30分钟即可。

作者: 阿拉蕾 时间: 2011-8-21 09:27

想请教一下用TAE做缓冲液，配琼脂糖凝胶加多少TAE，跑胶时用1TAE吗？这时指示剂可用溴酚蓝吗？

作者: 阿拉蕾 时间: 2011-8-21 09:27

QUOTE:

原帖由 阿拉蕾 于 2011-8-21 09:27 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
想请教一下用TAE做缓冲液，配琼脂糖凝胶加多少TAE，跑胶时用1TAE吗？这时指示剂可用溴酚蓝吗？

看你配什么浓度的胶，例如配60ML 1%的胶，称0.6G AGOROSE，加 60ML 1*TAE，跑胶时电泳槽中加1*TAE。
加DNA进孔时需加加样BUFFER，其中有溴酚蓝，甘油等。

作者: 阿拉蕾 时间: 2011-8-21 09:29

聚丙烯酰胺测序凝胶的制备
[试剂]
（1）10％过硫酸胺
过硫酸胺 1.0g
加双蒸去离子水溶解后再定容至l0ml,4℃避光保存。
（2）40％丙烯酰胺
丙烯酰胺(Acrylamide) 76g
N,N'-甲叉双丙烯酰胺(Bisacrylamide) 4.0g
加双蒸去离子水至150ml，将溶液加热至37℃使试剂溶解，再用双蒸去离子水定容至200ml。过滤后，室温保存于棕色瓶中。注意丙烯酰胺是强烈的神经毒素，可经皮肤吸收，配制时需戴口罩，丙烯酰胺与N,N'-甲叉双丙烯酰胺配制比值为38:2。
（3）10×TBE
Tris 108g
硼酸 55g
0.5mmol EDTA(pH8.O) 40ml
调pH8.0,加双蒸去离子水至1L，高压灭菌后室温保存。
（4）尿素(超级纯)
（5）TEMED
[仪器]
（1）序列分析电泳槽：如GIBCO BRL和Bio Rad产品。
（2）高压电源：如GIBCO BRL和Bio Rad产品。
[测序板的处理与安装]
（1）用去污剂溶液清洗玻璃板和间隔条，用自来水彻底冲洗后，再用蒸馏水冲洗。用乙醇冲洗板并晾干。必须彻底洗净玻璃板，以确保灌胶时不会产生气泡。
（2）测序板的硅化处理:每块玻璃板的面都需硅化处理，以防止凝胶与两块玻璃板紧贴并减少电泳完毕后从胶模中取出凝胶时凝胶发生破裂的可能性。硅化方法为；将拟硅化的玻璃板置于通风橱中，并戴手套操作，在拟硅化板面上加2-3ml 5％二氯二甲基硅烷(二氯二甲基硅烷5％溶于氯仿中)，用纸巾将硅化液涂布均匀，然后用去离子水洗净玻璃板,再用乙醇冲洗后晾干。如需要从玻璃板上去除原有的硅，可用KOH-甲醇擦拭之。KOH-甲醇配制为100ml甲醇中加5g片状KOH即可。
（3）装板与封边:不同厂家的产品装板方法略有不同。但原则是将板的两侧及底边封严，在灌胶时不至于漏胶。以Bio Rad测序仪为例：将板的两侧放置好0.4mm的塑料间隔边条，安装固定用夹板，置于封胶底槽用,再用已配制好的测序胶25ml封底边(测序胶配制见下述)，待胶凝固后，用1.2％琼脂液(1.2％琼脂粉溶于l00ml 1×TBE中，加热溶解后用于封边)封2个侧边。

作者: 阿拉蕾 时间: 2011-8-21 09:29

[测序凝胶的灌制]
用于配胶的丙烯酰胺的浓度取决于待分析DNA片段的长短，如要读出引物5'端50个核苷酸以内的序列，应配制含高浓度(12％-20％)丙烯酰胺的凝胶。距离引物端25-400核苷酸之间的序列，可从含6％-8％聚丙烯酰胺的凝胶中读取，距离更远的序列，则可通过4％或5%的聚丙烯酰胺凝胶来测定。通常用的凝胶浓度为7％。胶量的大小根据所用测序板容积而定。
（1）取尿素42g，先用30ml双蒸去离子水加热溶解，溶解后迅速置冰浴中，摇动溶器避免尿素析出。
（2）加10×TBE llml。
（3）加40％丙烯酰胺溶液17.5ml。
（4）再加10%过硫酸胺1.33ml，混匀。
（5）用双蒸去离子水定容至100ml，混匀。
（6）取25ml配制的胶液，置于一小烧杯内，加TEMED 70ul，迅速混匀，倒入已装好的测序板的封底槽内，将底边封严。
（7）另外75ml胶液在倒胶前将TEMED 40ul加入。
（8）将配制的剩余75ml胶液加入40ulTEMED，迅速混合，并开始灌胶。
（9）用手托住制胶板，使之与水平面大约成45。角，用50ml的注射器吸取胶液，沿制胶板开放的顶端缓缓倒入胶液。为避免产生气泡，灌注胶液时应保持持续不断，必要时可将板自一侧向另一侧摆动以逐出注入胶液时可能产生的气泡。
（10）当胶将灌满时，将胶倾至几乎水平的位置，将鲨齿梳尖端朝上，平坦的—侧进入胶的混合物，将梳子紧紧地压入胶中以在胶顶端形成约0.4cm深的凹陷。
（11）待凝胶聚合后，将板两侧固定夹板取下并从底槽中取出，将两侧封边胶清除干净，重新装好固定夹板。
（12）将测序胶板安装于测序电泳槽的下槽中，将测序电泳槽的上下槽中加入约800ml1×TBE，翻转鲨齿梳，使齿在先前形成的凹沟中戳入胶顶部约3-5mm。
（13）预电泳，在50W恒定功率下，预热30min，待温度达55℃时开始上样电泳。加样前，拨出鲨齿梳，用缓冲液冲洗齿间间隔物以驱逐扩散出胶外的尿素和聚丙烯酰胺的碎片。

作者: 阿拉蕾 时间: 2011-8-21 09:30

我做变性PAGE，老出现这样问题，请指教：

（2）带型弯曲，中间低，什么原因？
（3）有实验指导说，应该预电泳1小时后，温度达到55度，才可以，真的是这样吗？

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(2)是因为电泳过程中产热所至。有两种方法解决：一是降低电压，延长电泳时间，使单位时间内的产热量减少；二是在电泳槽外放两个冰袋，物理降温，电泳过程中可更换冰袋，效果也是不错的。
(3)我做变性PAGE时没有做过预电泳，结果也很好。可能对实验影响不大吧。

作者: 阿拉蕾 时间: 2011-8-21 09:30

请问各位老师：这电泳是怎么回事？

0.6%胶，最左为HANDIII MARKERS
不知道为何还在往后跑的。60V,2h

图片附件: 90890607.jpg (2011-8-21 09:30, 23.41 KB) / 该附件被下载次数 13
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=8338

作者: 阿拉蕾 时间: 2011-8-21 09:31

QUOTE:

原帖由 阿拉蕾 于 2011-8-21 09:30 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
请问各位老师：这电泳是怎么回事？

0.6%胶，最左为HANDIII MARKERS
不知道为何还在往后跑的。60V,2h

楼上的兄弟，你的问题不太好回答，你应该把你的电泳的有关细节描述一下？

作者: 阿拉蕾 时间: 2011-8-21 09:31

请问各位战友测序胶中变性胶与非变性胶的区别有哪些，我不知道应不应该做变性胶。谢谢各位指点。

作者: 阿拉蕾 时间: 2011-8-21 09:32

在不含变性剂的中性聚丙烯酰胺凝胶中电泳时，DNA单链的迁移率除与DNA链的长短有关外，更主要的是取决于DNA单链所形成的构象。
变性聚丙烯酰胺凝胶电泳和测序仪器自动检测联合与可用于分离识别，辨读DNA而达到测序目的。

作者: 阿拉蕾 时间: 2011-8-21 09:32

非常感谢热情帮助，您的意思是如果做非变性胶，那么并不能判断DNA链的长短，还是做变性胶。能不能推荐一本关于这两者的详细区别的书，万分感谢。

作者: 阿拉蕾 时间: 2011-8-21 09:32

请问各位老师：这电泳是怎么回事？

0.6%胶，最左为HANDIII MARKERS
不知道为何还在往后跑的。60V,2h

0.5的TAE，琼脂糖也是用0.5TAE配成0.6的，3V/cm,2h

图片附件: 91523837.jpg (2011-8-21 09:32, 23.41 KB) / 该附件被下载次数 10
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=8339

作者: 阿拉蕾 时间: 2011-8-21 09:33

最近电泳老是不稳定，这次跑电泳有带，下次就没有。郁闷。
TBE缓冲液换了，还是老毛病。
难到是琼脂糖和EB的问题？？
不明白。
请教各位，谢了。

作者: 阿拉蕾 时间: 2011-8-21 09:33

请问大侠，做SSR时有人用变性电泳，有人说不用变性电泳也可以。上样时，有人说需要变性，有人说不变性。我不明白，这是为什么？按理说，SSR主要是长度的区别，不用变性样品，也不用作变性胶，就可区分长度的差异；况且样品变性后，成了单链，其迁移不是和SSCP一样，受构向的影响吗？请那位大侠指教，我最近一直为此问题睡不着觉。

作者: 阿拉蕾 时间: 2011-8-21 09:34

请教！
我是新手，同学给我一个质粒，是病毒骨架质粒30kb；我分别用1％、0.5%、0.3％琼脂糖胶200伏跑一个小时后，没有结果；
请问：对于大片段质粒（30kb），电泳配制多大浓度琼脂糖胶、电压多少合适和估计多长时间可以看到条带？还有其它方法可以鉴定这个质粒吗？

作者: 阿拉蕾 时间: 2011-8-21 09:34

看来大家遇到的问题都差不多！
关于，胶面不平，好像是由于电泳时电压的问题，或者是电泳仪本身的问题，呵呵，跟具体的操作好像没关系。

作者: 阿拉蕾 时间: 2011-8-21 09:34

请问老大，做SSR时，一般说需要做加尿素的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，并且，PCR产物也要变性后才上样。我想SSR－PCR扩增产物条带较短，用聚丙烯酰胺胶是为了提高分辨率，可是我不明白为什么要做变性胶，PCR产物变性后，不是呈单链了，且可能会出现单链的二级结构造成构向变化，结果间如何比较？

作者: 阿拉蕾 时间: 2011-8-21 09:36

我是个新手，也想请教高手们，是不是做微卫星多态性若要区分两个bp或四个bp就一定要把PCR产物也要变性后再加尿素的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，我现在没有这样就直接非变性PAGE，但一直也没结果，急盼高手指点，谢谢了！！

作者: 阿拉蕾 时间: 2011-8-21 09:36

我有一个问题请教：
我从同学那里得到一个30多Kb的病毒骨架质粒，但多次摇菌小抽后电泳（分别用1％、8％的胶，电压200 v,时间30~60分钟）都看不到条带;同学用该质粒已经构建成功了，应该不是质粒的问题；难道是我的操作或方法有问题吗？请高手指教！
万分感谢！
实验顺利！

作者: 阿拉蕾 时间: 2011-8-21 09:37

我说朋友们，你们都用什么软件分析凝胶结果啊？我的是核酸凝胶，不知道怎么分析，找了几个软件但是都不会用，强烈郁闷！！！

作者: 阿拉蕾 时间: 2011-8-21 09:37

我们常用的是smartview的图像软件分析系统，比较好用的。

作者: 阿拉蕾 时间: 2011-8-21 09:37

我今天用PCR产物跑胶，我的目的片段大约是300bp，但除了300bp处外，在约100bp处也出现一条带，请教各位高手这条带可能是什么原因造成的，多谢！

作者: 阿拉蕾 时间: 2011-8-21 09:38

QUOTE:

原帖由 阿拉蕾 于 2011-8-21 09:37 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
我今天用PCR产物跑胶，我的目的片段大约是300bp，但除了300bp处外，在约100bp处也出现一条带，请教各位高手这条带可能是什么原因造成的，多谢！

1 查一下你的引物扩出的基因是否有亚型，如VEGF常有3 个亚型
2 是否混有RNA
我也只是探讨，请不要见笑

作者: 阿拉蕾 时间: 2011-8-21 09:38

不过我不明白为什么混有RNA会出现这种情况，请指教，多谢！

作者: 阿拉蕾 时间: 2011-8-21 09:39

我有个问题想请教一下：

我在做RT-PCR，有5个目的基因，如何在一个泳道上把这些目的基因都跑出来？有人告诉我两种方法：

1 把5对引物在一个管内一起做PCR （我的目的基因反应条件一样，单独均可跑出），然后电泳。但我只跑出2个目的基因，这种方法是否可行？

2 将5个分别批出来后，将其混匀后再跑电泳，应该可行。能否告知如何混匀，如何上样？我想做半定量，所以请详细告知。

作者: 阿拉蕾 时间: 2011-8-21 09:39

请教不敢当，我也只是学习。不知你是否做的RT-PCR，我只是将我遇见过的这种情况说一下。
如果在做逆转录时加入的RNA量过大，逆转录后的cDNA可以不纯，电泳时可以出现约100bp的带
鉴别主要看带型：RNA带较宽，比较亮，一般不超过二、三百碱基；目的基因的带较窄，特异性较强，一般没有RNA带亮。
解决办法是逆转录时适当减少RNA 的量。不知对不对？

作者: 阿拉蕾 时间: 2011-8-21 09:39

QUOTE:

原帖由 阿拉蕾 于 2011-8-21 09:39 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
我有个问题想请教一下：

我在做RT-PCR，有5个目的基因，如何在一个泳道上把这些目的基因都跑出来？有人告诉我两种方法：

1 把5对引物在一个管内一起做PCR （我的目的基因反应条件一样，单独均可跑出），然后电泳。但我只跑出2个目的 ...

1.如果是同管扩增，因为引物之间有竞争，各基因的扩增效率不同，所以需要重新调整体系。你的基因比较多，都在一管里扩的话，估计调整会比较麻烦，所以不妨单扩每个基因，然后一起电泳。
2.等量混匀上样即可。

作者: 阿拉蕾 时间: 2011-8-21 09:40

麻烦推荐加样的量，如果4个基因混的话，每个5微升，即20微升。加样有些困难，但取少量，带会不会很弱？

作者: 阿拉蕾 时间: 2011-8-21 09:40

只能试一下了，胶灌的稍厚点，用宽齿的梳子。
是不是可以每个基因分别与看家基因比较，最后根据与看家基因比较的结果比较目的基因间的差异，这样电泳时只要两个基因就可以了，相对要容易多了。

作者: 阿拉蕾 时间: 2011-8-21 09:41

staircase electrophoresis梯度电泳是怎么回事？

作者: 阿拉蕾 时间: 2011-8-21 09:41

你要只区分几个碱基的话，恐怕只有做变性电泳了！

作者: 阿拉蕾 时间: 2011-8-21 09:41

我是个新手，做出来的条带总是有些模糊和拖尾，不知是什么原因。恳请指点。

作者: 阿拉蕾 时间: 2011-8-21 09:42

目的条带应该是200BP，而且加如的模板是同一种DNA，但跑出来的条带却是大小不一致（没有污染）！
我个人觉得这种情况应该和浓度没有关系吧！
切盼回复！

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有关系的。局部的离子浓度、电荷强度等都对电泳结果有影响。

作者: 阿拉蕾 时间: 2011-8-21 09:42

请问各位大侠,哪里可以下载软件分析EB电泳图?

作者: 阿拉蕾 时间: 2011-8-21 09:43

QUOTE:

原帖由 阿拉蕾 于 2011-8-21 09:42 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
请问各位大侠,哪里可以下载软件分析EB电泳图?

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这里有几个，可以看看cuturl('http://www.bioon.com/Article_Show.asp?ArticleID=5075')

作者: 阿拉蕾 时间: 2011-8-21 09:43

各位好，最近在中国生物信息网-CMBI的FOCUS NEWS有一篇文章提出了一种新的缓冲液SB，可以使凝胶在高电压下不融化，并且不用TRIS和EDTA，非常便宜。我试用了，如文献所说，但不知如何从胶中回收DNA。
Contact: Vanessa Wasta
wastava@jhmi.edu
410-955-1287
Johns Hopkins Medical Institutions

A common cleanser is cheaper and faster way to separate DNA for genetic analysis

作者: 阿拉蕾 时间: 2011-8-21 09:43

我们配胶时就加了少量的溴化乙锭，而没有在电泳液里加，请问这对结果有没有影响

作者: 阿拉蕾 时间: 2011-8-21 09:44

EB染色有两种方法：
1。配胶的时候加，终浓度在0.5ug/ml就可以了（100ml胶加10mg/mlEB 5ul）
2。电泳结束后在0.5ug/ml EB溶液中染色
电泳缓冲液是不需要加EB的

作者: 阿拉蕾 时间: 2011-8-21 10:33

我做的是RT-PCR,用的是bio-rad公司的凝胶分析系统，最后测出的亮条带volume值小，暗条带volume值却大，请问各位高人这是为什么？最后相对光密度比值是目的带的volume/内参照的volume吗？

作者: 阿拉蕾 时间: 2011-8-21 10:34

我是新手，PCR检测产物时做的琼脂糖电泳，条带总是很模糊，虽然是在目的带120bp作用，请问是什么原因？

作者: 阿拉蕾 时间: 2011-8-21 10:34

新手，请指教，为什么我的琼脂糖凝胶电泳的条带总是会斜，是缓冲液的问题还是电泳仪的问题？？？？

作者: 阿拉蕾 时间: 2011-8-21 10:37

一般不会是电泳仪的问题，但如果电泳仪中电极的分布布置不妥可能会出现这种情况；我认为：多半属于缓冲体系问题，可能在浇制凝胶时出现局部凝胶分布不均导致电泳条带跑偏。凝胶要充分化解后浇制。

作者: 阿拉蕾 时间: 2011-8-21 10:38

条带电泳时模糊原因：1凝胶浓度不合适，应根据片段大小选择合适的凝胶浓度，建议选择2％浓度；2缓冲体系陈旧，缓冲能力不够；3缓冲体系不合适，可更换其他缓冲液条带电泳时模糊原因：1凝胶浓度不合适，应根据片段大小选择合适的凝胶浓度，建议选择2％浓度；2缓冲体系陈旧，缓冲能力不够；3缓冲体系不合适，可更换其他缓冲液

作者: 阿拉蕾 时间: 2011-8-21 10:38

请问做pcr前DNA模板一定要测定浓度吗？

作者: 阿拉蕾 时间: 2011-8-21 10:40

最好是测定一下浓度，不过如果没有条件测，可以根据常规加样，然后再根据你的PCR电泳结果调整浓度。

作者: 阿拉蕾 时间: 2011-8-21 10:40

各位大哥，大姐，我今天PCR跑胶，好奇怪。我根本没跑多长时间MARK 的100 200 300BP都不见了，嗅芬兰还在。我的目的片断250多的怎越跑越弱，跑到后来也没看到了。大家帮帮忙。

作者: 阿拉蕾 时间: 2011-8-21 10:42

请教：
我最近在做电泳，使用的是PCR扩增的产物，出现了下列问题：
1，有脱尾现象
2。条带弯曲
3。产物在电泳30分钟之前是一条带，但之后就是两条带，而且两条带很接近
望多多指教

作者: 阿拉蕾 时间: 2011-8-21 10:43

各位大哥，大姐，我今天PCR跑胶，好奇怪。我根本没跑多长时间MARK 的100 200 300BP都不见了，嗅芬兰还在。我的目的片断250多的怎越跑越弱，跑到后来也没看到了。大家帮帮忙。

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你跑了多长时间，是不是和你跑胶时间有关，而且和胶的浓度有关。

作者: 阿拉蕾 时间: 2011-8-21 10:44

我要做5个目的基因,若内参单独加在一个泳道里,各目的基因分别加在每个泳道里.这样可以吗?

作者: 阿拉蕾 时间: 2011-8-21 10:44

请教：
我最近在做电泳，使用的是PCR扩增的产物，出现了下列问题：
1，有脱尾现象
2。条带弯曲
3。产物在电泳30分钟之前是一条带，但之后就是两条带，而且两条带很接近
望多多指教

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脱尾有可能是做PCR时模板过多所致.条带弯曲有两个可能性一是胶没做均匀,二是电泳缓冲液离子浓度高了.产物出现两条带,是因为本来就扩增出来了两条带,经过较长时间电泳分开了.

作者: 阿拉蕾 时间: 2011-8-21 10:46

由于每次样本量大，现在将电泳槽由原来的一次跑16个（共两排，每排8孔的）改为每排15孔一次两排的那种，还是用的一样的浓度的琼脂糖（3％）和电压（120V，1h），现在的电泳很难看见清楚的条带，常常是片状拖带，不知各位高手有没有什么好办法？
还有今天30多个样本的PCR后酶切的成果全毁了，除了上面的电泳原因，还有就是酶切后的片断是134，125，89，56，11，用了3％的琼脂糖也不能分开，我都快急死了，有谁支招没有？

作者: 阿拉蕾 时间: 2011-8-21 10:47

我想请教个问题，我用分子克隆上的碱裂解法提质粒后，跑电泳是经常是条带出不了孔，为什么？？

作者: 阿拉蕾 时间: 2011-8-21 10:48

我提了质粒DNA，在PCR之前想看看分子量是否是我所要得，但出现一个问题，必须要和loading buffer按至少3：1，严重时1：1的比例上样才行，否则就会出现漂样。求助。
buffer没有问题，用来上marker5：1没问题。

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可能是质粒DNA的纯度不够高。

作者: 阿拉蕾 时间: 2011-8-21 10:49

(2)是因为电泳过程中产热所至。有两种方法解决：一是降低电压，延长电泳时间，使单位时间内的产热量减少；二是在电泳槽外放两个冰袋，物理降温，电泳过程中可更换冰袋，效果也是不错的。
（3）我做变性PAGE时没有做过预电泳，结果也很好。可能对实验影响不大吧。

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预电泳的作用在于消除缓冲液前沿的影响。肯定有用。

作者: 阿拉蕾 时间: 2011-8-21 10:49

1.如果是同管扩增，因为引物之间有竞争，各基因的扩增效率不同，所以需要重新调整体系。你的基因比较多，都在一管里扩的话，估计调整会比较麻烦，所以不妨单扩每个基因，然后一起电泳。
2.等量混匀上样即可。

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这种方法并不可行，理论上可以。如果用EB显色，前面的条带对后面的有很大的影响，谈不上定量。分开电泳是可以的。

作者: 阿拉蕾 时间: 2011-8-21 10:50

我想请教个问题，我用分子克隆上的碱裂解法提质粒后，跑电泳是经常是条带出不了孔，为什么？？

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可能是操作有问题。找个有经验的老师带几次。没出孔的条带应该是细菌的基因组DNA.

作者: 阿拉蕾 时间: 2011-8-21 10:52

由于每次样本量大，现在将电泳槽由原来的一次跑16个（共两排，每排8孔的）改为每排15孔一次两排的那种，还是用的一样的浓度的琼脂糖（3％）和电压（120V，1h），现在的电泳很难看见清楚的条带，常常是片状拖带，不知各位高手有没有什么好办法？
还有今天30多个样本的PCR后酶切的成果全毁了，除了上面的电泳原因，还有就是酶切后的片断是134，125，89，56，11，用了3％的琼脂糖也不能分开，我都快急死了，有谁支招没有？

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这么短的片断最好用变性的12％的聚丙稀酰胺凝胶电泳。

作者: 阿拉蕾 时间: 2011-8-21 10:53

脱尾有可能是做PCR时模板过多所致.条带弯曲有两个可能性一是胶没做均匀,二是电泳缓冲液离子浓度高了.产物出现两条带,是因为本来就扩增出来了两条带,经过较长时间电泳分开了.

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先问清楚条带的位置再回答问题。这样说没有充分的依据。

作者: 阿拉蕾 时间: 2011-8-21 10:53

新手，请指教，为什么我的琼脂糖凝胶电泳的条带总是会斜，是缓冲液的问题还是电泳仪的问题？？？？

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我说一个别人没说的原因：电泳槽不是水平的，不信试试看。

作者: 阿拉蕾 时间: 2011-8-21 10:54

我是一名新手，可否告知将RNA提取出后进行RNA质量的检测所用的变性甲醛电泳该咋么做，所用的试剂该咋配，急！谢谢！

作者: 阿拉蕾 时间: 2011-8-21 10:54

看你配什么浓度的胶，例如配60ML 1%的胶，称0.6G AGOROSE，加 60ML 1*TAE，跑胶时电泳槽中加1*TAE。
加DNA进孔时需加加样BUFFER，其中有溴酚蓝，甘油等。

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我的意见和你略有不同：别人问的是TAE电泳缓冲液的问题。
现回答该问题如下：
1 一般情况下，TAE的储存液为50×的。
2 agrose胶和电泳缓冲液的应用浓度应该一致。
3 通常的应用浓度为0.5×。

作者: 阿拉蕾 时间: 2011-8-21 10:54

请教主任，模板量多的话产生的目的片断大，是不是看起来象脱尾呢？

作者: 阿拉蕾 时间: 2011-8-21 10:55

别人问的是TAE电泳缓冲液的问题。
现回答该问题如下：
1 一般情况下，TAE的储存液为50×的。
2 agrose胶和电泳缓冲液的应用浓度应该一致。
3 通常的应用浓度为0.5×。

个人观点:TAE的储存液为10×或5×都可以,怎么方便实验怎么配制.
2 做agrose胶的buffer浓度和电泳缓冲液的浓度应该一致,且最好是同一批次的溶液,以保证他们的离子浓度一致.
3 通常TBE的浓度为0.5×,TAE一般都用1×.最好与自己的实验匹配

作者: 阿拉蕾 时间: 2011-8-21 10:55

我是一名新手，可否告知将RNA提取出后进行RNA质量的检测所用的变性甲醛电泳该咋么做，所用的试剂该咋配，急！谢谢！

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《分子克隆》上有详细的介绍。

作者: 阿拉蕾 时间: 2011-8-21 10:56

别人问的是TAE电泳缓冲液的问题。
现回答该问题如下：
1 一般情况下，TAE的储存液为50×的。
2 agrose胶和电泳缓冲液的应用浓度应该一致。
3 通常的应用浓度为0.5×。
===============================================================================================================
个人观点:TAE的储存液为10×或5×都可以,怎么方便实验怎么配制.
2 做agrose胶的buffer浓度和电泳缓冲液的浓度应该一致,且最好是同一批次的溶液,以保证他们的离子浓度一致.
3 通常TBE的浓度为0.5×,TAE一般都用1×.最好与自己的实验匹配

TAE用1×，如果是做凋亡检测，没错，因为凋亡得检测要跑得时间久，如果用于PCR产物分析，我觉得还是用0.5×得好，因为只要跑半个小时就可以了，0.5×（离子强度低）跑电泳同样电压跑得速度快。我以前跑凋亡都要2个小时以上。后来用于PCR产物分析，发现速度太慢了，而且很容易超过电泳仪得电流上限。改用0.5×得之后一切问题就都解决了。

作者: 阿拉蕾 时间: 2011-8-21 10:57

我是RT的新手，想请教各位:
我跑的胶，看家基因全是字形，目的条带有好几个是条带中间有一个空洞，反正就是像被中间挖了一块一样，到底是怎么回事啊!^ _^

作者: 阿拉蕾 时间: 2011-8-21 10:57

请问我跑胶时，有时候会发现所有的条带在一定位置后就动不了了，不论大小是多少都在一条线上，是否是因为胶不匀啊？

作者: 阿拉蕾 时间: 2011-8-21 10:58

我是RT的新手，想请教各位:
我跑的胶，看家基因全是字形，目的条带有好几个是条带中间有一个空洞，反正就是像被中间挖了一块一样，到底是怎么回事啊!^ _^

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1 制胶时把胶混匀。
2 加样时要让各试剂完全融化后再加。各泳道的样先点在薄膜上，用加样枪混匀后再加到泳道里。
试试看能不能解决你的问题。

作者: 阿拉蕾 时间: 2011-8-21 10:58

我把胶的浓度从1.5%降为1.0%, 换成全新的西班牙胶，煮胶应该没问题，倒胶我趁它还轻微冒热气就倒了(我怕有团块，倒完了胶马上插梳子，至少等一小时拔梳子，应该也没错。上样把样加在光盘上和BUFFER混匀，应该也是常用的方法。但反复作还是一样。后来一个师兄说我的看家基因上样量大了，目的条带上样量少了，照此作还是没有改观。有人说是缓冲液的问题(跑出弓形的条带好像是电压高所致)，于是我换了缓冲液，也换了窄梳子，好像有上改观，但仔细看，看家基因还是有弓形的影子，而目的条带也隐约还有空洞。
再请问我下一步该如何作。

作者: 阿拉蕾 时间: 2011-8-21 10:58

请问我想用QUANTISCAN分析电泳图，说明书不是很看得明白，请问谁用过，还有没有简单好用的软件，谢谢!

作者: 阿拉蕾 时间: 2011-8-21 10:59

可否介绍一下凝胶阻滞电泳！

作者: 阿拉蕾 时间: 2011-8-21 10:59

96孔板PCR后，跑电泳，其中的好几个产物有双带，可是将这些有双带的产物挑出来放在小板里跑。居然有许多的产物又只有一个条带？？？不知为何原因？？？？？

胶的浓度是一样的。

作者: 阿拉蕾 时间: 2011-8-21 10:59

目的条带有好几个是条带中间有一个空洞，反正就是像被中间挖了一块一样，到底是怎么回事啊!^ _^
但反复作还是一样。后来一个师兄说我的看家基因上样量大了，目的条带上样量少了，照此作还是没有改观。有人说是缓冲液的问题(跑出弓形的条带好像是电压高所致)，于是我换了缓冲液，也换了窄梳子，好像有上改观，但仔细看，看家基因还是有弓形的影子，而目的条带也隐约还有空洞。
再请问我下一步该如何作。
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也是新手，讨论一下，个人认为楼主主要要改善的是操作的熟练和准确性
1楼主配胶似乎没有问题，倒胶温度可以掌握在50、60度，注意的是不要混有杂质，看家基因有弓形的影子，是否很亮，即是否与表达丰度有关？减少一下看家基因的模板量试试。
2至于“目的条带有好几个是条带中间有一个空洞”，您加样时是否枪头将胶给捅破了？操作时注意一下，加样尽量垂直，不要把枪头进孔太深。
个人意见，仅供参考！

作者: 阿拉蕾 时间: 2011-8-21 11:00

按你的意见，我减少了看家基因的量，跑的就比较漂亮了，看来确实是与量大了有关，至于目的基因，我认真操作了，空洞也有所改观，但仔细看还是有。
还有一点，我以前用的是双蒸水配的，就没发现有空洞，这次改用MINIQ的水配，空洞就很明显，所以我也怀疑了水的问题，难道我们这的MINIQ的水有问题，不过，我测了他的PH值，有8.0 ，因此，大家都不敢用他来作细胞培养了。
请指教，谢谢!

作者: 阿拉蕾 时间: 2011-8-21 11:00

刚做完PCR时电泳结果很好，但是PCR产物在－20度放了几天，再电泳时目的条带就暗得多，难道PCR产物这么容易降解吗？应该不是胶和缓冲液的问题。请教大侠可能的原因以及PCR产物到底如何保存比较好。

作者: 阿拉蕾 时间: 2011-8-21 11:01

请教一下，DNA模板的全长体外转录，得到的RNA的电泳位置是否与DNA模板处于同一个位置？？

转录的产物RNA是单链，它的电泳条带应该比DNA模板跑得快。

我的想法是否正确？？请指教！！

作者: 阿拉蕾 时间: 2011-8-21 11:01

请教一下，我的目的条带是272bp的，跑电泳的时候他总是在250bpMarker的前面一点，那条条带我肯定是我要的目的条带，请问有可能Marker的指示作用不对吗？见笑～

作者: 阿拉蕾 时间: 2011-8-21 11:02

不知道你的目的条带是不是p出来的，如果量比较大的话，可能会你的标准分子量要跑得快一些，这没什么奇怪！

作者: 阿拉蕾 时间: 2011-8-21 11:02

谢谢gulang100
按你的意见，我减少了看家基因的量，跑的就比较漂亮了，看来确实是与量大了有关，至于目的基因，我认真操作了，空洞也有所改观，但仔细看还是有。
还有一点，我以前用的是双蒸水配的，就没发现有空洞，这次改用MINIQ的水配，空洞就很明显，所以我也怀疑了水的问题，难道我们这的MINIQ的水有问题，不过，我测了他的PH值，有8.0 ，因此，大家都不敢用他来作细胞培养了。
请指教，谢谢!

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不会吧，MILLIPORE水的电导不是达到18.2M吗，这么高的电导如果PH=8.0的话，是不是你们的MILLIPORE 制水机有问题？？

作者: 阿拉蕾 时间: 2011-8-21 11:02

我的电泳出现从加样孔到目的片断（500bp)的弥散条带，请问何故？我已经更换了不同的退火温度了。

作者: 阿拉蕾 时间: 2011-8-21 11:03

PCR电泳时，连引物带都看不见。为什么？

作者: 阿拉蕾 时间: 2011-8-21 11:03

是不是引物太小，胶的浓度也小，结果就已经跑到外面去了？

作者: 阿拉蕾 时间: 2011-8-21 11:04

我的电泳出现从加样孔到目的片断（500bp)的弥散条带，请问何故？我已经更换了不同的退火温度了。

分子克隆上面讲过模板过量可以引起‘弥散条带’，你可以试试减少模板的量！另外，循环数、镁试试减少看看！

作者: 阿拉蕾 时间: 2011-8-21 11:04

请问page胶做完后放多长时间用最合适?是不是应尽量长一些,使其充分聚合?

作者: 阿拉蕾 时间: 2011-8-21 11:05

请教：我用聚丙烯变性胶分离200bp左右的片断,如果加非变性样,目的带在mark250以下,但两个等位基因拉开的距离不大;如果加变性样,如果加变性样,两个能拉开较大的距离,但老感觉有双带,两个等位基因有四条带.我要比较一个家系的等位基因,怎样能使两个等位基因拉开的距离较大,又不出现双带?请指教.谢谢!

作者: 阿拉蕾 时间: 2011-8-21 11:05

请问page胶做完后放多长时间用最合适?是不是应尽量长一些,使其充分聚合?

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我们用的是bio-rad的小板，做12%的胶室温（25度）一般要25分钟左右（分离胶和浓缩胶差不多）
判断胶是否聚合，有一些方法：如果是分离胶，一般有三种方法：1，看水和胶之间是否有一层明显的界限；2，分离胶灌入后，只放入1-2mm水，要判断是否聚合，只需稍微倾斜一下模具便知；3，保留分离胶剩余液于原来的烧杯中，通过检查烧杯中的胶是否凝固来判断模具中的胶是否聚合。
如果是浓缩胶，除了可以使用上述第3种方法之外，还可以通过观察，当浓缩胶聚合凝固后，会稍有收缩，能够看到在梳子的边缘和胶之间出现了间隙，由此判断。

作者: 阿拉蕾 时间: 2011-8-21 11:05

变性PAGE灌胶不均匀和预电泳胶面温度不均匀均可导致条带弯曲，两头高中间低，但一般不影响分析，点样时尽量在中间点，拔梳子后可对胶面做修整，预电泳30分钟即可。

作者: 阿拉蕾 时间: 2011-8-21 11:06

楼上的兄弟，你是不是加样时没有使用上样缓冲液呀？好像时在跑电泳时DNA没有完全沉降到加样孔底部。

作者: 阿拉蕾 时间: 2011-8-21 11:06

要是全是连带表现,会是什么原因啊
我的RAPD刚开始还有点表显好.到后面再来重复时,全成连带了
麻烦高手指导一下.75V,35MIN试过,95V 30min也是一样的
真是烦 ~~~~~

作者: 阿拉蕾 时间: 2011-8-21 11:07

我提了质粒DNA，在PCR之前想看看分子量是否是我所要得，但出现一个问题，必须要和loading buffer按至少3：1，严重时1：1的比例上样才行，否则就会出现漂样。求助。
buffer没有问题，用来上marker5：1没问题。

确保最后一步乙醇挥发完全.

作者: 阿拉蕾 时间: 2011-8-21 11:07

请问我跑胶时，有时候会发现所有的条带在一定位置后就动不了了，不论大小是多少都在一条线上，是否是因为胶不匀啊？

如果大于1Kbp的条带在胶上迁移率基本上是一样的

作者: 阿拉蕾 时间: 2011-8-21 11:08

请问我跑胶时，有时候会发现所有的条带在一定位置后就动不了了，不论大小是多少都在一条线上，是否是因为胶不匀啊？

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如果大于1Kbp的条带在胶上迁移率基本上是一样的

作者: 阿拉蕾 时间: 2011-8-21 11:08

我做的是琼脂糖凝胶电泳，跑出来的条带模糊，比正常的宽，以致有些条带叠加在一起，缓冲液配得没有问题，请问这是为什么？

作者: 阿拉蕾 时间: 2011-8-21 11:09

我做的是琼脂糖凝胶电泳，跑出来的条带模糊，比正常的宽，以致有些条带叠加在一起，缓冲液配得没有问题，请问这是为什么？

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一个可能是上样量大，或者是胶的浓度过大。

作者: 阿拉蕾 时间: 2011-8-21 11:09

请教;
我做琼脂糖凝胶电泳中发现不同泳道中相对应的相同条带不在一条直线上,也就是跑的速度不同,且总是向一个方向逐步偏移,不知是什么原因所致,如何解决?

作者: 阿拉蕾 时间: 2011-8-21 11:10

琼脂糖凝胶电泳PCR产物如何避免引物二聚体的存在,或尽量减弱其条带的亮度?

作者: 阿拉蕾 时间: 2011-8-21 11:10

胶是大家一起配的，上样量和别人的一样，而别人的都没有问题，做的是重组质粒的电泳，我是个新手，请大家多多赐教。

作者: 阿拉蕾 时间: 2011-8-21 11:11

琼脂糖凝胶电泳PCR产物如何避免引物二聚体的存在,或尽量减弱其条带的亮度?
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我做PCR的引物二聚体也是超亮，真是奇怪！！！而且目的基因也出不来，后来我一个同学也遇到这种情况，结果减少引物浓度一半，就改善了！！

作者: 阿拉蕾 时间: 2011-8-21 11:11

我有一个问题：做3%的琼脂糖凝胶电泳的分析胶的分辨率是多少？我有两个相差1bp的基因克隆，是不是不能用这种方法分离开？

作者: 阿拉蕾 时间: 2011-8-21 11:11

琼脂糖凝胶电泳PCR产物如何避免引物二聚体的存在,或尽量减弱其条带的亮度?

我认为这个与电泳没有必然的联系，我也遇到过这样的问题，引物二聚体是在PCR过程中形成的，除了引物浓度尚需斟酌外，有时也和手气有关哦。
琼脂糖凝胶的浓度与DNA分离范围

琼脂糖浓度(%) 线型DNA分子的分离范围(Kb)
0.3 5～60
0.6 1～20
0.7 0.8～10
0.9 0.5～7
1.2 0.9～6
1.5 0.2～3
12.0 0.1～2

作者: 阿拉蕾 时间: 2011-8-21 11:12

我有一个问题：做3%的琼脂糖凝胶电泳的分析胶的分辨率是多少？我有两个相差1bp的基因克隆，是不是不能用这种方法分离开？

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[color=Green]一般认为琼脂糖凝胶电泳分辨率大概是几十bp
分离1bp的，可以考虑SDS-PAGE.

作者: 阿拉蕾 时间: 2011-8-21 11:12

请教各位关于核酸的电泳速度问题，在相同条件（电压、缓冲液等）下进行相同片段长度（bp）琼脂糖凝胶电泳，单链DNA、双链DNA、单链RNA的电泳速度依次怎样？

作者: 阿拉蕾 时间: 2011-8-21 11:12

琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳是分离鉴定和纯化DNA片段的标准方法。该技术操作简便快速，可以分辨用其它方法（如密度梯度离心法）所无法分离的DNA片段。当用低浓度的荧光嵌入染料溴化乙啶(Ethidium bromide, E染色,在紫外光下至少可以检出1-10ng的DNA条带,从而可以确定DNA片段在凝胶中的位置。此外,还可以从电泳后的凝胶中回收特定的DNA条带,用于以后的克隆操作。
　　琼脂糖和聚丙烯酰胺可以制成各种形状、大小和孔隙度。琼脂糖凝胶分离DNA片度大小范围较广,不同浓度琼脂糖凝胶可分离长度从200bp至近50kb的DNA片段。琼脂糖通常用水平装置在强度和方向恒定的电场下电泳。聚丙烯酰胺分离小片段DNA(5-500bp)效果较好,其分辩力极高,甚至相差1bp的DNA片段就能分开。聚丙烯酰胺凝胶电泳很快,可容纳相对大量的DNA,但制备和操作比琼脂糖凝胶困难。聚丙烯酰胺凝胶采用垂直装置进行电泳。目前,一般实验室多用琼脂糖水平平板凝胶电泳装置进行DNA电泳。
　　琼脂糖主要在DNA制备电泳中作为一种固体支持基质,其密度取决于琼脂糖的浓度。在电场中,在中性pH值下带负电荷的DNA向阳极迁移,其迁移速率由下列多种因素决定:
　　1、 DNA的分子大小:
　　线状双链DNA分子在一定浓度琼脂糖凝胶中的迁移速率与DNA分子量对数成反比，分子越大则所受阻力越大，也越难于在凝胶孔隙中蠕行，因而迁移得越慢。
　　2、琼脂糖浓度
　　一个给定大小的线状DNA分子,其迁移速度在不同浓度的琼脂糖凝胶中各不相同。DNA电泳迁移率的对数与凝胶浓度成线性关系。凝胶浓度的选择取决于DNA分子的大小。分离小于0.5kb的DNA片段所需胶浓度是1.2-1.5%,分离大于10kb的DNA分子所需胶浓度为0.3-0.7%, DNA片段大小间于两者之间则所需胶浓度为0.8-1.0%。
　　3、 DNA分子的构象
　　当DNA分子处于不同构象时,它在电场中移动距离不仅和分子量有关,还和它本身构象有关。相同分子量的线状、开环和超螺旋DNA在琼脂糖凝胶中移动速度是不一样的,超螺旋DNA移动最快,而线状双链DNA移动最慢。如在电泳鉴定质粒纯度时发现凝胶上有数条DNA带难以确定是质粒DNA不同构象引起还是因为含有其他DNA引起时,可从琼脂糖凝胶上将DNA带逐个回收,用同一种限制性内切酶分别水解,然后电泳,如在凝胶上出现相同的DNA图谱,则为同一种DNA。
　　4、电源电压
　　在低电压时,线状DNA片段的迁移速率与所加电压成正比。但是随着电场强度的增加，不同分子量的DNA片段的迁移率将以不同的幅度增长,片段越大,因场强升高引起的迁移率升高幅度也越大,因此电压增加，琼脂糖凝胶的有效分离范围将缩小。要使大于2kb的DNA片段的分辨率达到最大,所加电压不得超过5v/cm。
　　5、嵌入染料的存在
　　荧光染料溴化乙啶用于检测琼脂糖凝胶中的DNA,染料会嵌入到堆积的碱基对之间并拉长线状和带缺口的环状DNA，使其刚性更强,还会使线状DNA迁移率降低15％。
　　6、离子强度影响
　　电泳缓冲液的组成及其离子强度影响DNA的电泳迁移率。在没有离子存在时(如误用蒸馏水配制凝胶),电导率最小,DNA几乎不移动,在高离子强度的缓冲液中(如误加10×电泳缓冲液),则电导很高并明显产热,严重时会引起凝胶熔化或DNA变性。
　　对于天然的双链DNA,常用的几种电泳缓冲液有TAE[含EDTA (pH8.0)和Tris-乙酸],TBE(Tris-硼酸和EDTA),TPE(Tris-磷酸和EDTA),一般配制成浓缩母液,储于室温。

作者: 阿拉蕾 时间: 2011-8-21 11:13

材料、设备及试剂
　　一、材料
　　λDNA: 购买或自行提取纯化; 重组pBS质料或pUC19质粒; EcoRI酶及其酶切缓冲液: 购买成品; HindⅢ酶及其酶切缓冲液: 购买成品;琼脂糖(Agarose): 进口或国产的电泳用琼脂糖均可。
　　二、设备
　　水平式电泳装置,电泳仪,台式高速离心机, 恒温水浴锅, 微量移液枪, 微波炉或电炉,紫外透射仪, 照相支架, 照相机及其附件。
　　三、试剂
　　1、 5×TBE电泳缓冲液：配方见第一章。
　　2、 6×电泳载样缓冲液：0.25％溴粉蓝，40％(w/v) 蔗糖水溶液，贮存于 4℃。
　　3、溴化乙锭(E溶液母液:将EB配制成10mg/ml,用铝箔或黑纸包裹容器,储于室温即可。

操作步骤
　　一、 DNA酶切反应
　　1、将清洁干燥并经灭菌的eppendorf管(最好0.5ml)编号,用微量移液枪分别加入DNA 1μg和相应的限制性内切酶反应10×缓冲液2μl,再加入重蒸水使总体积为19μl,将管内溶液混匀后加入1μl酶液,用手指轻弹管壁使溶液混匀,也可用微量离心机甩一下,使溶液集中在管底。此步操作是整个实验成败的关键,要防止错加，漏加。使用限制性内切酶时应尽量减少其离开冰箱的时间，以免活性降低。
　　2、混匀反应体系后,将eppendorf管置于适当的支持物上（如插在泡沫塑料板上）,37℃水浴保温2-3小时,使酶切反应完全。
　　3、每管加入2μl 0.1mol/L EDTA(pH8.0),混匀,以停止反应,置于冰箱中保存备用。
　　二、DNA分子量标准的制备
　　采用EcoRⅠ或HindⅢ酶解所得的λDNA片段来作为电泳时的分子量标准。λDNA为长度约50kb的双链DNA分子,其商品溶液浓度为0.5mg/ml,酶解反应操作如上述。HindIII切割 DNA后得到8个片段,长度分别为23.1, 9.4, 6.6, 4.4, 2.3, 2.0, 0.56和0.12kb。EcoRI切割lDNA后得到6个片段,长度分别为21.2, 7.4, 5.8, 5.6, 4.9和2.5kb。
　　三、琼脂糖凝胶的制备
　　1、取5×TBE缓冲液20ml加水至200ml,配制成0.5×TBE稀释缓冲液,待用。
　　2、胶液的制备：称取0.4g琼脂糖,置于200ml锥形瓶中,加入50ml 0.5×TBE稀释缓冲液,放入微波炉里(或电炉上)加热至琼脂糖全部熔化,取出摇匀,此为0.8％琼脂糖凝胶液。加热过程中要不时摇动,使附于瓶壁上的琼脂糖颗粒进入溶液。加热时应盖上封口膜,以减少水份蒸发。
　　3、胶板的制备：将有机玻璃胶槽两端分别用橡皮膏(宽约1cm)紧密封住。将封好的胶槽置于水平支持物上,插上样品梳子,注意观察梳子齿下缘应与胶槽底面保持1mm左右的间隙。
向冷却至50-60℃的琼脂糖胶液中加入溴化乙锭(E溶液使其终浓度为0.5μg /ml(也可不把EB加入凝胶中,而是电泳后再用0.5μg/ml的EB溶液浸泡染色)。用移液器吸取少量融化的琼脂糖凝胶封橡皮膏内侧,待琼脂糖溶液凝固后将剩余的琼脂糖小心地倒入胶槽内,使胶液形成均匀的胶层。倒胶时的温度不可太低,否则凝固不均匀,速度也不可太快,否则容易出现气泡。待胶完全凝固后拨出梳子,注意不要损伤梳底部的凝胶,然后向槽内加入0.5×TBE稀释缓冲液至液面恰好没过胶板上表面。因边缘效应样品槽附近会有一些隆起,阻碍缓冲液进入样品槽中,所以要注意保证样品槽中应注满缓冲液。
　　4、加样：取10μl酶解液与2μl 6×载样液混匀,用微量移液枪小心加入样品槽中。若DNA含量偏低,则可依上述比例增加上样量,但总体积不可超过样品槽容量。每加完一个样品要更换tip头,以防止互相污染,注意上样时要小心操作,避免损坏凝胶或将样品槽底部凝胶刺穿。
　　5、电泳：加完样后,合上电泳槽盖,立即接通电源。控制电压保持在60-80V,电流在40mA以上。当溴酚蓝条带移动到距凝胶前沿约2cm时,停止电泳。
　　6、染色：未加EB的胶板在电泳完毕后移入0.5μg/ml的EB溶液中,室温下染色20-25分钟。
　　7、观察和拍照：在波长为254nm的长波长紫外灯下观察染色后的或已加有EB的电泳胶板。DNA存在处显示出肉眼可辨的桔红色荧光条带。紫光灯下观察时应戴上防护眼镜或有机玻璃面罩,以免损伤眼睛。经照相机镜头加上近摄镜片和红色滤光片后将相机固定于照相架上，采用全色胶片，光圈5.6,曝光时间10-120秒(根据荧光条带的深浅选择)。
　　8、 DNA分子量标准曲线的制作：在放大的电泳照片上,以样品槽为起点,用卡尺测量λDNA的EcoRⅠ和HindⅢ酶切片段的迁移距离,以厘米为单位。以核苷酸数的常用对数为纵坐标,以迁移距离为横坐标,在坐标纸上绘出连结各点的平滑曲线,即为该电泳条件下DNA分子量的标准曲线。

作者: 阿拉蕾 时间: 2011-8-21 11:13

9、 DNA酶切片段大小的测定：在放大的电泳照片上,用卡尺量出DNA样品各片段的迁移距离,根据此数值,在DNA分子量标准曲线上查出相应的对数值,进一步计算出各片段的分子量大小(若用单对数坐标纸来绘制标准曲线,则可根据迁移距离直接查出DNA片段的大小)。反之,若已知DNA片段的大小亦可由标准曲线上查出它预计的迁移距离。
　　10、 DNA酶切片段排列顺序的确定：根据单酶切,双酶切和多酶切的电泳分析结果,对照DNA酶切片段大小的数据进行逻辑推理,然后确定各酶切片段的排列顺序和各酶切位点的相对位置。以环状图或直线图表示,即成该DNA分子的限制性内切酶图谱。
　　[注意] 1.酶切时所加的DNA溶液体积不能太大，否则DNA溶液中其他成分会干扰酶反应。
　　2、酶活力通常用酶单位（U）表示，酶单位的定义是：在最适反应条件下，1小时完全降解1mg lDNA的酶量为一个单位，但是许多实验制备的DNA不象lDNA那样易于降解，需适当增加酶的使用量。反应液中加入过量的酶是不合适的，除考虑成本外，酶液中的微量杂质可能干扰随后的反应。
　　3、市场销售的酶一般浓度很大，为节约起见，使用时可事先用酶反应缓冲液（1×）进行稀释。另外，酶通常保存在50%的甘油中，实验中，应将反应液中甘油浓度控制在1/10之下，否则，酶活性将受影响。
　　4、观察DNA离不开紫外透射仪,可是紫外光对DNA分子有切割作用。从胶上回收DNA时,应尽量缩短光照时间并采用长波长紫外灯(300-360nm）,以减少紫外光切割DNA。
　　5、 EB是强诱变剂并有中等毒性,配制和使用时都应戴手套,并且不要把EB洒到桌面或地面上。凡是沾污了EB的容器或物品必须经专门处理后才能清洗或丢弃。
　　6、当EB太多,胶染色过深,DNA带看不清时,可将胶放入蒸馏水冲泡,30分钟后再观察。

作者: 阿拉蕾 时间: 2011-8-21 11:14

电泳技术的现状和发展

早期的电泳技术是由瑞典Uppsala大学物理化学系Svedberg教授提出了荷电的胶体颗粒在电场中移动的现象称其为电泳（electrophoresis）。于1937年，收Arne Tiselius教授---诺贝尔奖金获得者，利用些电泳现象，发明了最早期的界面电泳（moving boundary），用于蛋白质分离的研究，开创了电沪泳技术的新纪元。此后，各种电泳技术及仪器相继问世，先进的电泳仪和电泳技术的不断发展，使它在生物化学实验技术中占重要地位，按电泳的原理有三种形式的电泳分离系统：原则上按电泳的原理来分，即移动界面电泳（moving boundary ek|lectrophoresis）、区带电泳（zone electrophoresis）和稳态电泳（steady state electrophoresis）或称置换（排代）电泳（displacement electophoresis）。在自由移动界面电泳，是带电分子的移动速率通过观察界面的移动来测定，该方法已成为历史。代之以采用支持介质的区带电泳。

区带电泳因所用支持体的种类、粒度大小和电泳方式等不同，其临床应用的价值也各有差异。固体支持介质可分为两类：一类是滤纸、醋酸纤维素薄膜、硅胶、矾土、纤维素等；另一类是淀粉、琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶。由于它们具微细的多孔网状结构，故除能产生电泳作用外，还有分子筛效应，小分子会比大分子跑得快而使分辨率提高。它的最大优点是几乎不吸附蛋白质，因此电泳无拖尾的现象。低浓度的琼脂糖电泳相当于自由界面电泳，蛋白质在电场中可自由穿透，阴力小，分离清晰，透明度高，能透过200~7000nm波长的着色区带的检测敏感性，为此第一类支持介质现已被第二类支持介质所替代。

稳太电泳或称置换电泳的特点是分子颗粒的电泳迁移在一定时间后达到稳态，如等电聚焦和等速电泳。

区带电泳是临床检验领域中应用最广泛的技术，有重要临床意义，尤其是其他新技术，更扩大了其应用范围，提高了检测技术，现对该技术的现状与发展作一评述。

一、正确解释电泳结果，有助于临床疾病判断的参考

新鲜血清经电泳后可精确地描绘出患者蛋白质的全貌，一般常见的是白蛋白降低、某个球蛋白区域升高，提示不同的临床意义。如急性炎症时，可见a1，a2区百分率升高；肾病综合征、慢性肾小球肾炎时呈现白蛋白下降，a2球蛋白升高，β球蛋白也升高；缺铁性贫血时可由于转铁蛋白的升高而呈现β区带增高，而慢性肝病或肝硬变呈现白蛋白显著降低，r球蛋白升高2-3倍，示免疫球蛋白多克隆增高，甚至可见β-r融合的桥连现象，还可在r区呈现细而密的寡克隆区带；对单一克隆浆细胞异常增殖所产生的无抗体活性均一的免疫球蛋白称M蛋白（monoclonal protein）的检测，血清蛋白电泳是其首选的实验诊断方法。可在电泳区带的a2-r区呈现致密而深染，高度集中的蛋白克隆增生区带，称其为m蛋白区带，扫描后形成高而狭窄的单株峰，若些峰在r区其峰高与峰底宽之比>2：1，而由于正常免疫球蛋白合成限制造成背景染色浅。由M蛋白所导致的一组疾病如：多发性骨髓瘤、巨球蛋白血症、重链病、游离轻链病、半分子病、良性单株丙球血症和双M蛋白血症等，目前这类疾病已不属罕见。血清蛋白电泳对这类疾病的早期诊断，疗效观察和预后判断均有十分重要的意义。

作者: 阿拉蕾 时间: 2011-8-21 11:14

二、电泳技术与免疫技术相结合，大大扩大了其临床应用的范围
让电流来加速抗原与抗体的扩散并规定其运行方向、从而加快了沉淀反应速度。免疫
电泳技术的种子类很多，如：对流免疫电泳（CIEP）、火箭免疫电泳（RIE）、电免疫扩散（EID）。在种免疫电泳方法牟基础上，又不断地派生出一些新的技术，如：免疫电泳（IEP）技术，1969年Alper与Johnson推荐免疫固定电泳（IFE）是一种包括琼脂糖凝胶蛋白电泳和免疫沉淀两个过程的操作，是免疫沉淀反应的一种混合技术，检测标本可以是血清、尿、脑脊液或其他体液。1976年血清免疫固定电泳（IF）技术再次被推荐，用于M蛋白的分型。血清蛋白质在琼脂糖凝介质上经电泳分离后，应用固定剂和各型免疫球蛋白及轻链抗血清，加于凝胶表面的泳道上，经孵育让固定剂和抗血清的在凝胶内渗透并扩散后，若有对应的原存在，则在适当位置形成抗原抗体复合物。经染色后蛋白质电泳参考泳道和抗原抗体沉淀区带被氨基黑着色，根据电泳移动距离分离出单克隆组分，可对各类免疫球蛋白及其轻链进行分型。该技术的最大优势是敏感性达50-150mg/dl，操作周期短，仅需数小时，分辨率高，结果易于分析。现最常用于M蛋白的分型与鉴定，已列入临床实验室的常规检测工作。

三、电泳技术进行同工酶谱分析，提高诊断率

1、血清乳酸脱氢酶同工酶（iso-LDH）：测定LDH同工酶有电泳法、离子交换柱层析法、免疫法、抑制剂法和酶切法，但迄今用得取多的仍是琼脂糖凝胶电泳法。经电泳分离后要分离出五种同工酶区带，急性必肌梗塞发病后平均6h LDH1即开始升高，LDH1/LDH2≥1为心肌损伤的阳性决定性水平，肝癌时可见LDH5明显升高，各区带含量的确定，将经电泳分离后的同工酶谱采用扫描予以定量，其精确度明显高于用肉眼判断。

2、血清肌酸激酶同工酶（ISO-CK）；测定CK和CH-MB仍是目前用于证实急性心肌梗塞的道选指标。近年来国内一些单位用免疫抑制法测CK=MB，其原理为抗M亚单位的酶活性，因为正常血清中几乎无CK=BB，故将此值乘以2可以认为大致代表CK-MB的活性。此法简单迅速，缺点是特异性差，如患者血清中存在CK-BB或者异常CK时，都将出现假性增高。不少作者报道异常CD-同工酶，一条称巨CK（Maxro-CK），它是CK-BB与免疫球蛋白的复合物，有IgG亦有IgA，在正常血清中Marco-CK仅占0.8%-1.6%.另一条称线粒体CK(CK-MT),CK-MT是结合在肌肉、脑、肝内的线粒体表面，可能是线粒体膜的碎片，在正常血清中CK-MT是不出现的，在心梗时亦不出现，只有当组织极度损伤，由于线粒体和细胞壁极度破坏，方可在血清中检出。由于Macro-CK和不典型的CK-MT均不能被M抗体所抑制，故当它们出现时，会导致CK-MB高于CK总活力的假性升高。使用电泳方法分离CK-MB，是根据CK-同工酶分子结构不同，在电泳缓冲液中，所带电荷各异，可以从阴极到阳极将CK不同组份予以分离，其分别为CK-MM，CK-MB和CK-BB。电泳特点是当出现异常2同工酶如巨CKⅠ、巨CKⅡ等，从电泳图谱上很容易发现，由扫描仪对各条酶进行扫描，报告各条区带所占百分比，结合总酶活力，求得区带的酶省略定值结果。Macro-CK在CK-MM和CK-MB中间，而CK-MT位置靠近阴极端，在CK-MM后面。这样不会将CK-BB和各种异常同工酶误认为是CK-MB而误诊，也可解决CK-MB假性增高的错误原因所在。为此，CK同工酶电泳是项非常实用的检验技术，具有十分重要的临床意义。

3、CK亚型同工酶：此外，CK-MB和CK-MM亚型测定常采用琼脂糖凝胶等电聚焦电泳或高压电泳，由于操作比一般电泳麻烦，故常规常测定尚无法普及。目前引进的自动电泳仪，有试剂盒提供，可作CK亚型分析，参考值：CK-MM1（57.7±4.7）%;CK-MM2为(26.5±5.3);CK-MM3为(15.8±2.5)%;CK-MM3/CK-MM1比值为0.28±0.05(范围0.15-0.39),阳性决定性水平>0.5 。AMI第一天血中以MM3为主，但第二天以后则以MM1为主。采用电泳法分离CKMB，CKMB1和CKMB2在正常人血中CK-MB2极微，一般比值近似是而非，在急性心肌梗塞后4-6h CKMB2亚型即在血循环中可被检测到，故MB2/MB1的比例明显升高，并早于总CK-MB片段的增高。当心肌梗塞缓解后此比便也逐渐下降。也可用于溶栓治疗后的病情观察。

作者: 阿拉蕾 时间: 2011-8-21 11:14

四、结合酶免疫标记抗体技术，检测脑脊液内寡克隆区带

曾有作者报道采用二维电泳和银染进行CSF蛋白质的分离与鉴定，方法繁复，耗时，
现采用高分辨率琼脂糖凝胶电泳分离CSF中的蛋白质，并经抗原和辣根过氧化物酶标记的特异性IgG抗体进行反应来鉴定“寡克隆区带”（OCB），经此酶免疫标记放大技术和显色步骤，蛋白质浓度达31-125ul/L即可予以检测，可使检测灵敏度提高了100倍，这样脑脊液无须浓缩，避免了在浓缩过程中蛋白质的丢失。可用于证实和分辨OCB免疫球蛋白及其型别。若在脑脊液标本中检出OCB，而其相应标本中未能检出区带，则为阳性，真实地反映是由中枢神经系统本身合成的免疫球蛋白，具有重要临床意义。它是一种定性检测，在多发性硬化症时，OCB是一个十分重要的标志物。但须将患者血清和CSF在同一天同步进行分析，以认证不同来源的免疫球蛋白。中枢合成免疫球蛋白是中枢神经系统疾患的一个重要信号，主要用于诊断的鉴别诊断中枢神经系统疾患如：多发性硬化症、痴呆、脊髓炎、付肿瘤性脑炎、神经性梅素等。

五、利用固相内抗原、抗体反应分离脂蛋白（a），用于心、脑知管独立的危险因子的检测

该技术是利用抗原、抗体反应将电泳分离的脂蛋白予以鉴别。血清经琼脂糖凝胶电泳，再经染色后可出现不同脂蛋白的条带。由于凝胶中脂蛋白等电点不同，不仅可区分a、前β和β区带，又因介质中含有抗脂蛋白（a）[LP（a）]抗体及阳离子存在，抗LP（a）与患者血清中LP（a）结合形成复合物，阳离子则抑制其他脂蛋白的泳动速度，LP（a）便与其他脂蛋白分离开来，使分辨十分清晰的LP（a）条带呈现在前β与γ区域之间，将阳性条带扫描后，可获得区带的面积及其百分含量，该方法使电泳技术趋于完美，大大减少了手工操作的弊端，既可予以半定量，又能将胶片保存，便于比较。提高对心、脑血管独立的危险因子----LP（a）检测的敏感性和特异性。

作者: 阿拉蕾 时间: 2011-8-21 11:15

六、按分子量大小进行非浓缩尿蛋白电泳，区分尿蛋白类型

尿蛋白电泳可将尿液中各种蛋白质分离用于区分尿蛋白类型，可在无操作的情况下，
协助临床判断肾脏损伤的部位。国内部分实验室采用SDS-PAGE盘状电泳进行尿蛋白分离，该法具有局限性，耗时，操作繁琐，标本要求高，尿液需预浓缩，不适于临床实验室广泛开展。SDS=AGE电泳不需预浓缩，尿蛋白电泳后呈现出中、高分子量蛋白区，带主要反应肾小球病变；呈现出低分子量蛋白区带，可见于肾小管病变及溢出性蛋白尿；混合性蛋白尿则可见到大、中、小各种分子量区带，示肾小球及肾小管均受累及。扫描仪可对电泳后尿液中蛋白质剖象进行扫描，求出百分比，以显示肾小球或肾小管损伤程度，其电泳图谱及扫描图形可作国资料永载，利于分析比较。该技术的最大进步是尿液不需预浓缩，操作简便，结果清晰，仅需三小时即可完成试验，还备有完整的定性标准，易于量化，便于分析，对肾脏疾的诊断，鉴别诊断，指导治疗和判断愈合颇有价值。

近期发展起来的毛细管电泳是一种新型的区带电泳，又称毛细管带电泳。它是在毛
细管中装入缓冲液，在其一端注入样品，在毛细管两端加直流高电压实现对样品的分离，他离后的样品依次通过设在毛细管一端的检测器检出。毛细管电泳在检验医学中的应用也十分广泛，从所检测样品的来源看可分为尿样、血浆、血清、脑脊液、红细胞、其他体液或组织，以及实验动物活体等。从分离对象看包括蛋白质、多肽、氨基酸、糖、酶、DNA、寡核苷酸、病毒、小和生物活性分子、离子、药物及其代谢产物等。根据用途可分为临床疾病诊断、临床蛋白质分析、临床药物分析、代谢研究、病理研究、同工酶分析、PCR产物分析、DNA片段及序列分析等。由于它具有无法比拟的高效和快速性，因而受到越来越多科学家们的重视。

中国的电泳技术起步不算太晚，但由于种种原因，大多数实验室仍采用较落后的电
泳设备。随着国际、国内科技发展的日新月异和检验医学发展的突飞猛进，电泳技术也在不断发展和更新，其在临床医学和分子生物学领域中有着极其广泛的应用价值，相信随着该技术的不断发展必将越来越受到同道们的青睐。

摘自：《中华检验医学杂志》2001年9月第24卷第5期

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作者: 阿拉蕾 时间: 2011-8-21 11:15

请问：有人做等电聚焦电泳吗？我有很多问题请教各位

作者: 阿拉蕾 时间: 2011-8-21 11:16

请问：有人做等电聚焦电泳吗？我有很多问题请教各位

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此地高手如云（not me），有问题只管问，大家互相交流，互相学习嘛！

作者: 阿拉蕾 时间: 2011-8-21 11:16

我做PCR的引物二聚体也是超亮，真是奇怪！！！而且目的基因也出不来，后来我一个同学也遇到这种情况，结果减少引物浓度一半，就改善了！！

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多谢赐教!!!

作者: 阿拉蕾 时间: 2011-8-21 11:17

最近我在跑电泳时遇到这样一个问题：带跑不开，上样缓冲液总是在离加样孔1cm左右就不动了。不知道这是怎么回事。
我跑的是2%的琼脂糖。150v。

作者: 阿拉蕾 时间: 2011-8-21 11:18

我最近作DNA电泳时，总在溴酚兰后面出现铁锈色弯曲的线状物，颜色就象制胶板时加到琼脂糖里的EB替代染料。怎么回事啊，请各位高手指教。

作者: 阿拉蕾 时间: 2011-8-21 11:19

各位高手：
菜鸟这厢有礼，请原谅小妹问一些菜鸟问题。书上都写100－1000bp的片断一般用聚丙烯酰胺，我要扩增的片断是160bp是不是一定要用聚丙烯酰胺电泳，能不能用琼脂糖，如果能一般用多少浓度。另外，我作的是RT-PCR，请问提取的RNA应该用哪种浓度的琼脂糖。还有一个问题，由于小妹实验经费确实有限，琼脂糖能不能用国产的，国产和进口的琼脂糖会不会影响电泳结果。谢谢。焦急等待各位伸出援手。

作者: 阿拉蕾 时间: 2011-8-21 11:19

主任，各位高手：
菜鸟这厢有礼，请原谅小妹问一些菜鸟问题。书上都写100－1000bp的片断一般用聚丙烯酰胺，我要扩增的片断是160bp是不是一定要用聚丙烯酰胺电泳，能不能用琼脂糖，如果能一般用多少浓度。另外，我作的是RT-PCR，请问提取的RNA应该用哪种浓度的琼脂糖。还有一个问题，由于小妹实验经费确实有限，琼脂糖能不能用国产的，国产和进口的琼脂糖会不会影响电泳结果。谢谢。焦急等待各位伸出援手。

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可以用琼脂糖。2％即可。
提取的RNA应该用哪种浓度的琼脂糖什么意思？

作者: 阿拉蕾 时间: 2011-8-21 11:19

最近两次电泳时遇到这样一种情况，PCR产物大部分都集中在加样孔附近。不知是何原因？是不是引物降解，没有扩增出目的产物，加样孔处为模板啊？

作者: 阿拉蕾 时间: 2011-8-21 11:20

小妹的意思是从组织中抽提的RNA需要p电泳观察有没有3条带，如果这样，跑RNA的琼脂糖需要那个浓度。
还有一个问题希望各位告知能否，国产琼脂糖与进口琼脂糖对跑电泳影响大不大。

作者: 阿拉蕾 时间: 2011-8-21 11:21

诸位高手好
我做rt-pcr时有时有目的基因条带有时又没有
内参条带却还较清楚
我想请教一下各位这其中的原因

作者: 阿拉蕾 时间: 2011-8-21 11:22

最近两次电泳时遇到这样一种情况，PCR产物大部分都集中在加样孔附近。不知是何原因？是不是引物降解，没有扩增出目的产物，加样孔处为模板啊？

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这种情况我也碰到过,其实是琼脂糖倒胶后放置较久特别是没有被缓冲液浸没致孔径缩小,所以产物根本跑不动,再大电压也没用,只有重新倒胶就可解决.

作者: 阿拉蕾 时间: 2011-8-21 11:22

我在做微卫星多态性分析实验。两个微卫星标记经PCR扩增后的长度分别为
96～112，337bp。此实验已有文献，电泳方法为变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，采用6％测序胶（含4mol/L脲）。我已查阅多种实验技术指导，其配胶方法各不同。
请教：
1、我是否可以参照《分子克隆》第十三章变性聚丙烯酰胺凝胶制备
2、此方法需制备顶层和底层溶液，含尿素、TBE、蔗糖、溴酚蓝，是不是相当于加样缓冲液的成分
3、我所做的实验文献中提到加样缓冲液为甲酰胺、溴酚蓝、二甲苯青，是否必须全加

多谢指点！（急用）

作者: 阿拉蕾 时间: 2011-8-21 11:23

电泳时，跑出目的带了，但是在加样孔处有很亮的带，而且前面有拖尾。
请问这是怎么回事？

作者: 阿拉蕾 时间: 2011-8-21 11:23

请教一问题：
琼脂糖电泳最多可以重复跑几次？跑的次数多时（如3-4次，总时间约200分钟），EB会不会跑到胶外去？还有一问题，我用的DL2000的MARKER，在电泳时总是出现两条显色带，第一条和Loading Buffer的显色带位置一样（2%的凝胶中约在〈100BP处），还有一条显色带约在800BP的位置，这是怎么回事啊？

作者: 阿拉蕾 时间: 2011-8-21 11:24

请教一问题：
琼脂糖电泳最多可以重复跑几次？跑的次数多时（如3-4次，总时间约200分钟），EB会不会跑到胶外去？还有一问题，我用的DL2000的MARKER，在电泳时总是出现两条显色带，第一条和Loading Buffer的显色带位置一样（2%的凝胶中约在〈100BP处），还有一条显色带约在800BP的位置，这是怎么回事啊？

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你用刀子将胶切开，分开用不就可以了。跑几份就用几个加样孔。这样就不会浪费了！
你的第二个问题什么意思？是说普通光线下可以看见两个显色带吗？

作者: 阿拉蕾 时间: 2011-8-21 11:25

一般TAE缓冲液配制成50倍的母液保存，工作浓度为1*。很经典的。当然使用溴酚兰了，不过配制方法也要注意了，不小心的话也会闹出笑话的阿

作者: 阿拉蕾 时间: 2011-8-21 11:29

我每次做胶时放四排梳子,我也用刀子切开了,但是它们都得在电泳槽里泡着。在我跑电泳时,那些闲置不用的凝胶也会同样跟着电泳.这样对于留到最后才用的凝胶，它里边的EB会不会跑到胶外去（我的问题说白了就是：在电泳时EB会不会也跟着泳动?）？
我的第二个问题是在普通光线下就可以看见两条染料显色带。一条显色带在约100bp的位置，另一条约在800bp的位置？这是怎么会事阿？

作者: 阿拉蕾 时间: 2011-8-21 11:29

你不用的部分可以用保鲜膜包起来放在冰箱里面。这样就可以了。
那两条显色带是上样缓冲液的两种成分，好象一种是二甲苯青，一种是溴酚蓝。

作者: 阿拉蕾 时间: 2011-8-21 11:30

我们配胶时就加了少量的溴化乙锭，而没有在电泳液里加，请问这对结果有没有影响

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在核酸凝胶电泳中使用溴化乙锭（EB）的目的是使DNA染色（在紫外线下可见，与加示踪剂溴酚蓝在普通光线下可见不同）。

一般有两种方法：
1，将EB按使用浓度加入凝胶中，电泳结束后即可观察，但对NDA的电泳行为有影响：EB带正电荷，嵌入碱基后增加线状和开环DNA的长度，使其刚性更强，并会使线状DNA的迁移率降15％，故此方法不宜用于测定核酸分子量的大小，可采取下面第二种方法。
2，电泳后，将凝胶置于EB染液中，室温下浸泡30～45分钟。

作者: 阿拉蕾 时间: 2011-8-21 11:45

2%的琼脂糖能将450bp 与510bp的片段分开吗？

作者: 阿拉蕾 时间: 2011-8-21 11:45

最近跑电泳遇到个问题，原来用1.5％胶跑0.6微升的MARKER 40分钟 120V 条带很清楚，现在用2％胶 20V 110分钟跑0.6微升的MARKER 只出现部分条带，小片段的几条 100， 250， 500bp都看不到了，请问这是怎么回事？是加样少了还是EB跑出来了？（EB加在胶里了）还是别的什么原因？

作者: 阿拉蕾 时间: 2011-8-21 11:46

那天我问试剂公司了，他们的答复和你的一样，也是一条为溴酚蓝，一条为二甲苯青蓝，但是具体那一条在前面，那一条在后面，我倒给忘了。关于你建议我将不用的凝胶用保鲜膜包好，放入冰箱，那倒是个好主意，但是却不适合我，因为我和别人共用一个冰箱，我的凝胶还有EB。

作者: 阿拉蕾 时间: 2011-8-21 11:46

哪怕什么，我们都是这样做的。我们也是公用冰箱。难道就没有一块属于自己的小空间吗：）

作者: 阿拉蕾 时间: 2011-8-21 11:47

溴酚蓝在前，二甲苯青蓝在后。

作者: 阿拉蕾 时间: 2011-8-21 11:47

想请教一下用TAE做缓冲液，配琼脂糖凝胶加多少TAE，跑胶时用1TAE吗？这时指示剂可用溴酚蓝吗？

补充一点：如配1.5%的琼脂糖凝胶，跑胶时用1TAE，溴酚蓝作指示剂，效果更好。P出的代分隔开些，且清楚。
谢谢！

作者: 阿拉蕾 时间: 2011-8-21 11:48

目的条带应该是200BP，而且加如的模板是同一种DNA，但跑出来的条带却是大小不一致（没有污染）！
我个人觉得这种情况应该和浓度没有关系吧！
切盼回复！

我有几个想法想和大家讨论一下（pcr产物电泳出现多条带、拖带的情况）：
1.检测一下酶和模板是否有降解，如有讲解也可能出现多条非目的带，或拖带。
2.适当减少循环次数，可以减少非特异带的出现。
3.考虑一下梯度pcr的使用。
4.制胶也是一个很重要的因素，特别是EDTA的PH值。

作者: 阿拉蕾 时间: 2011-8-21 11:48

最近跑电泳遇到个问题，原来用1.5％胶跑0.6微升的MARKER 40分钟 120V 条带很清楚，现在用2％胶 20V 110分钟跑0.6微升的MARKER 只出现部分条带，小片段的几条 100， 250， 500bp都看不到了，请问这是怎么回事？是加样少了还是EB跑出来了？（EB加在胶里了）还是别的什么原因？

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可能是跑的时间长了吧，因电泳时DNA与EB跑的方向是相反的。所以当跑的时间久了后，跑在前面的小片段的DNA处已没EB。

作者: 阿拉蕾 时间: 2011-8-21 11:48

我遇到了更严重的问题，PCR完毕后，琼脂糖可以看到阳性条带，随后将10ulDNA（大概150bp）加入PAGE（8%）中电泳，120v，3小时，EB泡20分钟，结果什么也没看到，Marker长链可看到，短链也无法看到，能否帮我分析一下原因，万分感谢！

作者: 阿拉蕾 时间: 2011-8-21 11:49

2%的琼脂糖能将450bp 与510bp的片段分开吗？

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对于琼脂糖凝胶浓度和分离DNA分子的有效范围，我可以例张表如下，你可以参考一下：
胶浓度线性DNA分子大小（bp)
0.3 5.0-60
0.6 1.0-20
0.7 0.8-10
0.9 0.5-7
1.2 0.4-6
1.5 0.2-4
2.9 0.1-3

作者: 阿拉蕾 时间: 2011-8-21 11:54

各位大侠，为了区分不同的等位基因，我采用了聚丙烯酰胺凝胶电泳方法，浓度为8%，加入了尿素（15%），电泳500v2分钟，之后电泳100v4小时，结果一片空白，在此之前，我曾做过琼脂糖凝胶电泳，可以确定为阳性结果，但为什么在PAGE电泳中却看不到结果呢，还请各位高人多多指教，万分感谢！

作者: 阿拉蕾 时间: 2011-8-21 11:55

有做过DGGE的吗？有没有好的聚丙烯酰胺凝胶中目的条带的回收方法？
谢谢

作者: 阿拉蕾 时间: 2011-8-21 11:55

楼上的，是不是胶没有凝固好的原因？

作者: 阿拉蕾 时间: 2011-8-21 11:56

我想问一下:20%的PAGE胶的配置方法?
我在配制20%的胶的时候,拔除梳子的时候,齐梳子处,胶总是断裂,为了分辨率更高一些,有谁能告速我怎么配制更好一些呢?

作者: 阿拉蕾 时间: 2011-8-21 11:57

希望各位把自己的实验心得体会公布一下，如是转载的话请务必注明。因为我这样的新手会以前辈的留言为准的，我们来的目的就是学习的，诚信为先啊

作者: 阿拉蕾 时间: 2011-8-21 11:57

有谁做基质金属蛋白酶（MMP）及其抑制剂(TIMP)啊？

作者: 阿拉蕾 时间: 2011-8-21 11:58

请问高手，我的PCR产物电泳，在一条泳道里怎么会跑出来几条条带呀，而且每条都挺清楚的？我要的是一条呀！

作者: 阿拉蕾 时间: 2011-8-21 11:58

[求助]偶是分生的菜鸟。昨天，第一次提RNA（人宫颈癌），跑变性胶后，只在溴酚蓝的前面发现一条带。不知是何原因，本来想做RT，结果也没敢。我电泳槽的长是14.5厘米，我用50伏，跑了15分钟。是不是时间太短？我查书真核生物28S为4718个核苷酸，18S为1874，尽管是单链是不是也应比溴酚蓝跑得慢呀？急求各位大侠帮助！谢谢！

作者: 阿拉蕾 时间: 2011-8-21 11:59

只跑15分钟，也太短了吧

作者: 阿拉蕾 时间: 2011-8-21 11:59

这个小图有意思，不过我也看到过，好像是一个MM把什么东西加到胶里面了。

作者: 阿拉蕾 时间: 2011-8-21 12:07

请教前辈一个问题：作PAGE用的MARKER和作琼脂糖的一样吗？？？我作琼脂糖跑的很好的MARKER，跑PAGE却总没有区带（用6UL和10UL都没有）我做的是8%的中性PAGE，想做SSCP，但确定不了双链DNA的位置，请问应该用什么MARKER，万分感谢！

作者: 阿拉蕾 时间: 2011-8-21 12:08

我的目的条带是120BP,在2％的琼脂糖胶中跑出来总是有些模糊,请教各位有何良策？我还遇到一个怪现象,有些模版目的基因扩出来了可β-ACTIN就是不出来,请各位帮我分析一下。

作者: 阿拉蕾 时间: 2011-8-21 12:08

请教前辈一个问题：作PAGE用的MARKER和作琼脂糖的一样吗？？？我作琼脂糖跑的很好的MARKER，跑PAGE却总没有区带（用6UL和10UL都没有）我做的是8%的中性PAGE，想做SSCP，但确定不了双链DNA的位置，请问应该用什么MARKER，万分感谢！！！！！！！！！！！！

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请问你现在SSCP做的怎么样了？email联系rootlet@126.com
怎么可以交流一下。

作者: 阿拉蕾 时间: 2011-8-21 12:09

小弟想做差异显示，进口电泳设备太贵，想买国产的，哪位大哥能否给小弟介绍几个电泳槽和电泳仪，不胜感激！！！

作者: 阿拉蕾 时间: 2011-8-21 12:10

朋友，我想问你们一个问题！
我做12％的PAGE。，180V，20H.变性跑AG染色显影后得结果：出现宽1cm宽的带，却看不到特异的条带。请问为什么呢？

再，有时候会出现一条很粗的亮带在后面，前面的带却模糊不清。请问为什么？
再请问，大家12％的胶是怎样配的！

作者: 阿拉蕾 时间: 2011-8-21 12:11

小弟想做差异显示，进口电泳设备太贵，想买国产的，哪位大哥能否给小弟介绍几个电泳槽和电泳仪，不胜感激！！！

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国产的，六一，君意的电泳槽，电泳仪都挺好用的，简单方便
北京的

作者: 阿拉蕾 时间: 2011-8-21 12:13

请问做PAGE的朋友们：
你们显影两次的道理是什么？我们都是用一批显影液的！

作者: 阿拉蕾 时间: 2011-8-21 12:15

我做变性PAGE，老出现这样问题，请指教：

（3）有实验指导说，应该预电泳1小时后，温度达到55度，才可以，真的是这样吗？

预电泳是相对做预变性胶而言的，因为这种胶里有尿素

作者: 阿拉蕾 时间: 2011-8-21 12:15

我今天用PCR产物跑胶，我的目的片段大约是300bp，但除了300bp处外，在约100bp处也出现一条带，请教各位高手这条带可能是什么原因造成的，多谢！

=============================================================================================================

有可能是引物二聚体

作者: 阿拉蕾 时间: 2011-8-21 12:17

有以下几个建议:
1样品不存或污染,解决方法重新做一边样品
2胶换到0.8%试试
3缓冲液换成1TAE或换成0.5TBE

作者: 阿拉蕾 时间: 2011-8-21 12:18

偶做RT想把目的基因和内参分开泳道跑可以吗有4个目的一个内参哦

作者: 阿拉蕾 时间: 2011-8-21 12:21

最近做了很多琼脂糖凝胶电泳，也有点小心得和大家交流一下．
有段时间ＰＣＲ产物总是跑不好，经常出现怪异带，把体系都检查了一边，东西浪费了不少，也花了不少工夫，但还是不见好转．向师姐请教，师姐也说可能是体系的事，我告诉她都换了，还是白搭．师姐说拿我的产物跑一个看看，灌胶时师姐发现了根源所在，原来我灌的胶不平．师姐灌了一块，也是不很平．仔细看看梳子和模子，原来如此，长时间的使用，模子已经很脏了，我一直很懒，没刷过一次，并且梳子和模子都有不同程度的老化．换了一套新的，再去跑，紫外灯下一看，多么美妙整洁的线条啊！
建议大家以后在遇到类似的问题，不仅只从反应体系中找原因，也要考虑一下容易被人忽视的灌胶问题！

作者: 阿拉蕾 时间: 2011-8-21 12:21

变性的PAGE为什么要求尿素超纯的？不超纯有什么影响？会不会导致带显不出来？

作者: 阿拉蕾 时间: 2011-8-21 12:22

据以前战友的帖子所述，琼脂糖凝胶凝胶范围：
琼脂糖浓度(%) 线型DNA分子的分离范围(Kb)
0.3 5～60
0.6 1～20
0.7 0.8～10
0.9 0.5～7
1.2 0.9～6
1.5 0.2～3
12.0 0.1～2

拿12%胶来说，可不可以理解为欲分离大小相差100bp的片段可以用12%的琼脂糖凝胶？如果大小相差几十bp的片段，琼脂糖凝胶能用吗？一定要用聚丙烯酰胺？

作者: 阿拉蕾 时间: 2011-8-21 12:22

向各位高人请教一个困扰小妹多时的问题：
DNA page胶染色以前一直很漂亮，条带也很清楚，可是最近染色完毕放到ddH2O里胶面一直在变黑，以致于很多目的条带都被掩盖了，所有的试剂都换过了，没有什么明显的改观。
银染方法：硝酸银染10min，然后放入清水，再放入甲醛，硼砂，NaOH配置的显色液显色，有条带出现之后放入清水。
谢过啦！

作者: 阿拉蕾 时间: 2011-8-21 12:23

我跑琼脂糖凝胶电泳时，分别加了2000bp和15000bp的marker，但是跑出来的两个marker的1000bp的条带不在同一水平线上。我用的是1％的琼脂糖，电压是100V,缓冲液是1×TAE，缓冲液是新配的。请各位支支招，到底是哪里出了问题？

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很有可能是2000bp和15000bp两个marker的缓冲液离子强度不一样.
有时候上样量不一致时也会出现这种现象,但缓冲液离子强度不一样所致的可能性要大一些.

作者: 阿拉蕾 时间: 2011-8-21 12:24

为什么琼脂糖凝胶电泳跑完后,其背景比较亮.是由于琼脂糖质量还是由于其他原因.

作者: 阿拉蕾 时间: 2011-8-21 12:24

最近用了一种新的核酸染料，可以检测到60bp的条带！叫gelred，可以免费试用，对敏感度要求高的实验可以考虑这个东西

作者: 阿拉蕾 时间: 2011-8-21 12:25

新手，紧急求助：请问制胶的时候琼脂糖融于1×还是0.5×的TBE？我之前用的是1×的，缓冲液也是可用1×的，这对结果有什么影响吗？谢谢

作者: 阿拉蕾 时间: 2011-8-21 12:25

我的目的基因是400bp，内对照是500bp，请问用多大浓度琼脂糖、多大电压电泳能分得比较好？谢谢！

作者: 阿拉蕾 时间: 2011-8-21 12:26

我是个新手，今天跑胶的时候发现紫外照的时候胶前一半发亮的但是后一般很暗，跑了两次都是这样。求解？

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