标题:
求助:PCR电泳结果包括阴性对照都拖带
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作者:
夕阳
时间:
2011-8-22 17:35
标题:
求助:PCR电泳结果包括阴性对照都拖带
求助:PCR电泳结果包括阴性对照都拖带,同时没有出现目的条带[转自 丁香园论坛]
我做的是巢式PCR,第一套用的退火温度是55,第二套是58,模板加1微升,35个循环,预变性94°5min,94°45s,55°45s,72°1min,延伸10min.
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作者:
阿拉蕾
时间:
2011-8-22 17:37
很可能是模板加的太多了,完全过量了的结果
作者:
细水长流
时间:
2011-8-22 17:38
模板加了一微升,并且是五倍稀释过的DNA,应该不算多吧?
作者:
细水长流
时间:
2011-8-22 17:38
QUOTE:
原帖由
阿拉蕾
于 2011-8-22 17:37 发表
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很可能是模板加的太多了,完全过量了的结果
模板加了一微升,并且是五倍稀释过的DNA,应该不算多吧?
作者:
嗡嗡
时间:
2011-8-22 17:39
如果不是模板多,那很可能是电泳本身的问题,找一个肯定有条带的样本做对照,注意不是用LADDER,比如染色剂与DNA量的问题,电泳缓冲液等
作者:
阿拉蕾
时间:
2011-8-22 17:40
多谢,我再试试,呵呵
作者:
蓝蜗牛
时间:
2011-8-22 17:41
我也是相同的情况,模板稀释过了,也尝试了多个上样量,还是不行。
引物重新稀释后,第一次PCR后电泳是成功的,但第二次又是拖带,师姐说是PCR条件不好,体系不稳定,让我重新摸条件,可是我做的是GAPDH,退火范围应当很宽,用的又是同一实验室成功扩增的条件。很困惑啊:P
作者:
飞天小鹿
时间:
2011-8-22 17:41
阴性对照用水也拖尾,那就真的是总体条件不好了,PCR条件,所有东西都是。混合液的任一成分,反应程序,后期电泳。期间试剂储存混合使用等等。阴性对照是你的已知阴性样本的话再加上模版问题。总之一个一个试。要不就找做得熟的人做做。更换试剂。
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