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标题: 求助：限制酶SexAI的保护碱基和定向克隆问题 [打印本页]

作者: 阿福 时间: 2011-8-23 10:34 标题: 求助：限制酶SexAI的保护碱基和定向克隆问题

求助：限制酶SexAI的保护碱基和定向克隆问题 [转自丁香园论坛]

大家好：
请问限制酶SexAI的保护碱基怎么加？我打算加4个“Gs”，这样可以么？SexAI的识别序列是ACCWGGT(W=A/T)。我准备用SexAI做定向克隆，所用载体上游SexAI序列是5‘-ACCAGGT-3’;，下游SexAI序列是5‘-ACCTGGT-3’;(同一条链上的序列，即都在sense strand上，即：5‘-ACCAGGT-------------ACCTGGT-3‘;)，那么我的上下游引物的酶切位点怎么加啊？是5’-ACCAGGT-3‘+上游引物，5’-ACCTGGT-3‘+下游引物？这样的话插入片段就有可能以任意一个方向插入，即有两种方向的插入片段。还是上下游引物用一样的SexAI序列即：5’-ACCAGGT-3‘+上游引物，和一样的5’-ACCAGGT-3‘+下游引物？这样好像又无法连接到载体上，只能连接一头。
谢谢！

作者: 果冻也酸 时间: 2011-8-23 10:35

无论是上下游用不同序列的SexAI，还是用相同的SexAI，直接进行连接都可以，不过只有50%的机会得到顺序正确的序列。可以设计一对引物用于鉴定连接顺序。

这个酶切位点没有用过，你可以查一下公司的操作手册，会对这种酶有明确的解释。

PS：不能换别的酶切位点么

作者: 阿福 时间: 2011-8-23 10:36

QUOTE:

原帖由 果冻也酸 于 2011-8-23 10:35 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
无论是上下游用不同序列的SexAI，还是用相同的SexAI，直接进行连接都可以，不过只有50%的机会得到顺序正确的序列。可以设计一对引物用于鉴定连接顺序。

这个酶切位点没有用过，你可以查一下公司的操作手册，会对这种酶有明确 ...

这个酶是为我的载体特意添加的，为的就是方便，不过我发现可能存在两种任意方向的连接，所以比较困惑，这样就会大大降低后面的转化效率，而我后面要用的转化方法是改进的方法，这样不就有影响了么。

作者: 阿福 时间: 2011-8-23 10:36

用不同序列的SexAI可以直接进行连接么？因为质粒双酶切（质粒上有两个不同序列的SexAI位点），酶切后形成的质粒两头的黏性末端是相同的（对么？原来这两个SexAI位点之间的序列就丢失了？），所以插入基因可以以任意一种方向连接，都会出现方向不正确和方向正确的序列。我有点陷进去了，大家帮我看是不是会产生两种方向的插入序列啊。

说明：两个SexAI位点分别位于质粒的两个MCS上，具体序列如下图所示：

图片附件: 87594389.jpg (2011-8-23 10:37, 34.88 KB) / 该附件被下载次数 8
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=8354

作者: 阿福 时间: 2011-8-23 10:37

再如下：

图片附件: 18684468_snap.jpg (2011-8-23 10:37, 110.67 KB) / 该附件被下载次数 15
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=8355

作者: 果冻也酸 时间: 2011-8-23 10:38

我是这么认为的，你觉得呢，咱们可以讨论一下，避免我误导了LZ，嘿嘿

作者: 阿福 时间: 2011-8-23 10:39

怎么设计一对引物鉴定连接顺序啊？即使鉴定出正确的连接顺序，又怎么从重组质粒里面把方向正确的和不正确的分开啊？是回收鉴定后插入基因方向正确的重组质粒么？请不吝赐教，稍微详细一点。呵呵，谢谢！

作者: 阿福 时间: 2011-8-23 10:40

是用基因插入质粒的位置的前端一段序列设计一个引物，然后分别以原来设计的上、下游引物来确定真确的连接方向么？

作者: 果冻也酸 时间: 2011-8-23 10:41

是用基因插入质粒的位置的前端一段序列设计一个引物，作为上游：

原来设计的下游引物，作为下游，进行PCR，就OK了

作者: 阿福 时间: 2011-8-23 10:43

是用基因插入质粒的位置的前端一段序列设计一个引物，作为上游：

原来设计的下游引物，作为下游，进行PCR，就OK了

作者: 果冻也酸 时间: 2011-8-23 10:44

1 and 2. 只要比你目的序列长一些，而且跑胶结果很明显能看出，PCR结果比目的片段还要长就行。

3. 连接产物转化感受态，长出的单菌落只含有一种重组质粒。如果你得到鉴定正确的结果了，就提取正确的质粒就可以了。后面你想怎么做都可以了。

不知道你看明白了么？

作者: 阿福 时间: 2011-8-23 10:44

恩。大体思路都清楚了。只是还没有做过心理有点虚。另外还有：

1：新的上游序列到底比插入位点多出多少bp比较合适呢？因为我克隆的基因本来就比较长（近3kb），200-300bp怎么样啊？200多bp的差距在电泳图片上是不是有点小了，太大的话又会不会影响pcr扩增，不易扩增？

2：用来鉴定方向的新上游引物是不是就不需要加酶切位点和保护碱基了？

谢谢您的回答。

作者: 阿福 时间: 2011-8-23 10:45

另外，我在设计引物的时候，下游引物模板GC含量很低（<20%），这样设计出来的上下游引物Tm值相差较大（5摄氏度多），要想让Tm值接近，上下游引物的长度要差6、7个bp，而引物设计原则中建议上下游引物长度不要相差4bp，我想这样关系不大吧。同时，要克隆表达一个基因，设计下游引物的时候必须包括终止密码子TAA么？还是可以从TAA开始向5'方向设计，或者从TAA下游3'开始向5‘方向设计下游引物，只要把TAA包括进去就可以了，又或者只要是TAA下游3’方向任意一段设计，哪怕不到，即不包括TAA，只要不让基因短了就Ok。

作者: 果冻也酸 时间: 2011-8-23 10:46

1. 你的目的片段是3Kb，那么100-200bp的差距就没什么意思了。这样吧，你重新设计一对引物，上游引物在目的片段起始密码子ATG上游200bp，下游引物在起始密码子ATG之后200bp。这样的话，只要重组质粒PCR的结果在400bp左右有带，就说明连接正确了。而且这样PCR的时间会很短。

2. 用于鉴定的PCR引物不需要加酶切位点和保护性碱基。

3. 原则重要，但是要联系到自己的客观实际，如果上下游相差6-7bp能扩增出目的片段，何乐而不为呢？

4. 关于终止密码子的问题。不知道你是想进行原核表达还是真核表达呢，这里需要明确一下，因为二者有一点点不同。

作者: 果冻也酸 时间: 2011-8-23 10:47

你想进行何种表达，细节详细一些

作者: 阿福 时间: 2011-8-23 10:48

我要做的是进行原核表达。对于下游引物的设计在TAA上我还是比较混乱。因为我克隆后还要表达。请您在这里稍微说详细一点。另外，我在设计引物的时候，对怎么会造成移码突变而影响后续表达方面还是理解得比较混乱，也请你解释一下。再次感谢你的回答。

作者: 阿福 时间: 2011-8-23 10:48

如果下游引物必须从TAA开始，那么怎么解决GC含量低的问题？只要Tm值合理就可以了么，哪怕GC含量很低？引物上下游差6、7个bpTm值是接近了，但下游引物的GC含量还是很低。

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