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标题: 求助：Taqman 探针 PCR 扩增曲线 [打印本页]

作者: 饭团团 时间: 2011-8-23 12:12 标题: 求助：Taqman 探针 PCR 扩增曲线

求助：Taqman 探针 PCR 扩增曲线 [转自丁香园论坛 ]

大家好，我是用taqman real-time PCR方法研究SNP与疾病的相关性。
有个疑问，为什么我的ROX曲线是漂在最上面的？？？？？？？？96孔全都是这样的，每板都是这样。。。真懊恼。实在找不出原因？然而，别人帮我做的同一个位点，ROX曲线就不是漂在最上面。请大侠们，帮我分析一下，是哪个环节出了问题？？？不甚感激！

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http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=8360

作者: 饭团团 时间: 2011-8-23 12:13

再如下图：

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http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=8361

作者: 阿拉蕾 时间: 2011-8-23 12:14

这个图谱到没有注意过，重要的是你的扩增曲线怎么样？如果扩增曲线正常可以不必考虑。

作者: 饭团团 时间: 2011-8-23 12:14

QUOTE:

原帖由 阿拉蕾 于 2011-8-23 12:14 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
这个图谱到没有注意过，重要的是你的扩增曲线怎么样？如果扩增曲线正常可以不必考虑。

您好，感谢你的回复。从我传的两个图，可以看出来，ROX曲线漂在最上面的，扩增曲线并不好。。。没有下面那个图扩增的好~~~~~能帮忙分析一下原因吗？

作者: 阿拉蕾 时间: 2011-8-23 12:16

ROX是一个参比荧光，主要用来消除管间差异。一般是参入mix中。我不知道你rox是如何添加的。上面的图rox特别高，就会造成你的扩增曲线的deltRn很低，看似没有扩增一样。我觉得注意加样方式或许能改变。

作者: HOT兔 时间: 2011-8-23 12:17

不好意思，没能帮助你！我也准备用这种方法检测SNP分型呢，请问你的引物和探针是在哪家公司合成的啊？

作者: 饭团团 时间: 2011-8-23 12:17

我是5ul的反应体系。加样顺序为 H2O 1.275ul，MIX 2.5ul，ROX 0.1ul，taqman 0.125ul，*100份，混匀后，分装到96孔板里，最后加DNA。您看，有什么问题吗？或者有什么需要特别注意的？

作者: 饭团团 时间: 2011-8-23 12:18

ABI公司

作者: 阿拉蕾 时间: 2011-8-23 12:18

ABI的是不是很贵？我找国内的公司合了两条，5000块，效果还可以。

作者: 阿拉蕾 时间: 2011-8-23 12:19

5ul的体系是不是太小了？我想至少做到20ul吧。我用的ABI7500。

作者: 饭团团 时间: 2011-8-23 12:19

我们实验室的同学，都是用的5ul体系。下面那个图就是其他同学做的，同一个位点。我也怀疑和我的操作有关系，可是就加样那几步，我实在想不出问题出在哪。。。我也用的ABI7500

ABI公司的探针一个3000多~我也没用出啥好来。。。。。。

作者: 阿拉蕾 时间: 2011-8-23 12:20

5ul的体系，我觉得实在太省了。至少也要20吧。扩增过程中蒸发都要多少?5ul出来的结果能准确吗？

作者: 细水长流 时间: 2011-8-23 12:20

如果你觉得ROX信号太高的话，你反应体系中少加点ROX就行了，我就是这样做的，我将反应体系的ROX浓度降到0.25X，效果还更好，你也可试试，另做SNP分型应是用MGB探针的吧，这家公司探针合成性价比较高，4000元/两条，保证质量，我也是它那合成的，cuturl('www.rainbio.com')。

作者: 小荷尖尖 时间: 2011-8-23 12:21

5ul体系太小了，很容易产生误差，建议加大体系实施。ABI质量还是不错的。

作者: 饭团团 时间: 2011-8-23 12:21

嗯，我们实验室的人，都是用的5ul。结果都还好~

另外，我找到我的原因了，是因为马虎~~~~~加错浓度了。。。。真羞愧啊~~~

给你附张我今天做的

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作者: 饭团团 时间: 2011-8-23 12:22

ROX曲线还是在上面，不过扩增的还好。是不是不用管ROX在上，还是在下了？不过，实验室其他同学的ROX都没有像我这么高的。。。

另，还有个问题请教~~~先附图

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作者: 饭团团 时间: 2011-8-23 12:23

这是我另一个位点。ROX浓度，没加错。我非常确定。可是还是扩增不出来。应该从哪方面找原因呢？是探针的问题？？？等待回复~

作者: 饭团团 时间: 2011-8-23 12:23

您好~多谢您的回复。确实就是因为ROX的浓度太高了~ 确切的说，应该是我马虎了。购买的MIX里有两种浓度的ROX，我用的时候没看清楚。。。。。。做实验，马虎不得啊。都是金钱的代价。

另外有个问题想请教。我另一个位点，先附图

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作者: 饭团团 时间: 2011-8-23 12:24

我用的是7500.按要求，应该使用低浓度的ROX，这次我确定没加错。可是扩增的还是不理想，还需要再稀释ROX？还是探针本身合成的有问题？请指教~

作者: 爱哭鬼 时间: 2011-8-23 12:26

我想问问你的探针和引物的终浓度是多少啊？

作者: 饭团团 时间: 2011-8-23 12:27

QUOTE:

原帖由 爱哭鬼 于 2011-8-23 12:26 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
我想问问你的探针和引物的终浓度是多少啊？

5ul反应体系里，就是0.125ul。ABI合成的探针和引物是在一起的。

作者: 爱哭鬼 时间: 2011-8-23 12:27

QUOTE:

原帖由 饭团团 于 2011-8-23 12:27 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

5ul反应体系里，就是0.125ul。ABI合成的探针和引物是在一起的。

谢谢。

作者: 爱哭鬼 时间: 2011-8-23 12:27

QUOTE:

原帖由 饭团团 于 2011-8-23 12:27 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

5ul反应体系里，就是0.125ul。ABI合成的探针和引物是在一起的。

谢谢。

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