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标题: 有做LAMP环介恒温扩增反应的吗？希望可以交流 [打印本页]

作者: 椰子叶子 时间: 2011-8-23 12:44 标题: 有做LAMP环介恒温扩增反应的吗？希望可以交流

有做LAMP环介恒温扩增反应的吗？希望可以交流[转自丁香园论坛]

如题，我正在做LAMP，希望和有经验的朋友相互交流，感激不敬：）

作者: 椰子叶子 时间: 2011-8-23 12:45

自己顶。。。
希望有同道人啊

作者: 阿福 时间: 2011-8-23 12:45

你好，我也正打算做LAMP，不知道你的引物设计出来了吗？
是用什么软件啊？你要检测的是什么啊？

作者: 胖小妮子 时间: 2011-8-23 12:46

我们做LAMP，扩增的是细菌甲氧西林耐药基因mecA（检测MRSA），发现比常规PCR灵敏度高2~3个数量级，扩增时间短而且不用电泳可立即照相。不好的是太灵敏了容易污染！

作者: 不懂 时间: 2011-8-23 12:47

您好，我想问一下您们设计引物的时候是不是就是用官方网站上专门设计LAMP引物的软件来设计的啊？我看网站上说那个软件对计算机的要求很高是这样的吗？
还有我想问一下扩增产物怎么测序才能知道所扩增出的序列是不是目的序列啊？如何判断是否有非特异性扩增啊？
望指教，谢谢！

作者: 阿福 时间: 2011-8-23 12:48

官方网站上专门设计LAMP引物的软件是可以用的，不过它设计出来的太多，你要自己选择一个。

LAMP的扩增产物是片段长度不等的混合物，没有办法测序的。要判断所扩增出的序列是不是目的序列，有以下方法：

1. 电泳。LAMP有自己特征的电泳谱带，最小的条带是你扩增片段的大小；
2. 酶切。在你扩增片段内选择一个酶切位点，因为LAMP的扩增产物是一些重复序列，所以酶切后条带就很单一了。
3. Southern杂交。这个当然说明问题了。

LAMP非特异性扩增的机会很小，你想啊，四对引物，针对靶基因的6个区域，比PCR特异多了。

作者: 椰子叶子 时间: 2011-8-23 12:48

http://primerexplorer.jp/e/index.html
这是设计引物的在线软件地址，我当时就在这里用的，最近我好像用不了，你去试试看。该网上有附件说明怎样用这个软件的。有问题再联系

作者: 椰子叶子 时间: 2011-8-23 12:48

您说的那个可以立刻用肉眼看不知道是用什么？我看过一篇文献，说用SYBR Green I有这个效果，如果有扩增产物变绿色，没有扩增产物不变色，不知到是否是真的？

作者: 椰子叶子 时间: 2011-8-23 12:49

我想请教您几个问题：
1.LAMP引物必须要是HPLC级别的吗？引物定了后稀释为多少浓度比较合适啊？
2.我想做MgSO4的浓度，不知道用普通PCR的MgCL2溶液来做梯度行不行？
3.体系特别容易污染，不知您的实验里面做了什么特别的防护措施没？我的灭菌水好像每隔3天就得换
谢谢啊

作者: 阿福 时间: 2011-8-23 12:49

1. LAMP引物不一定要是HPLC级别的，我用的与普通PCR引物一样的PEAG纯化；引物浓度F3/B3 0.2uM，FIP/BIP 0.8uM；
2. 我就用普通PCR的MgCL2溶液，终浓度4mM，更少好像不行；
3. 这个是LAMP方法的大问题，因为太灵敏了。只换灭菌水好像不能解决问题的。严格分区。我准备加UNG了。

作者: 椰子叶子 时间: 2011-8-23 12:50

谢谢mylab答复啊，呵呵，我这个星期开始做，之前用PCR进行比较，PCR太容易污染了，加样我都跑到其他的房间里去还是不能避免污染，现在PCR老出一条比目的条带大很多的条带（刚开始半个月都只出目的条带，结果哭，没照相），排除了n多原因，都找不到正确原因，痛苦啊

作者: 阿福 时间: 2011-8-23 12:50

PCR如果出一条比目的条带大很多的条带，那就不一定是污染的问题。

作者: 大猫 时间: 2011-8-23 12:51

lamp的一个好网站,可以去看看.通过real-time 比浊仪,或者sybr-greenI可以定量.
cuturl('http://loopamp.eiken.co.jp/')

作者: 天蓝蓝 时间: 2011-8-23 12:51

因为在LAMP反应的过程中，会形成焦磷酸镁沉淀，肉眼观察是白色的混浊物，所以可以通过肉眼观察来判定是否发生扩增反应。
其次，我也在文献上看见有关添加SYBR Green I的报道，“添加稀释过的SYBR Green I到LAMP反应体系中，通过观察反应液中荧光强度变化来判断产物的产生，结果发现，反应结束时混合液的颜色由橙色变为绿色，而且伴有白色沉淀产生。”（文献中的原话）

作者: 麻瓜 时间: 2011-8-23 12:52

我想问一下您用的引物是用什么软件设计的啊?还有在做LAMP的时候,在优化的时候,都需要优化什么条件啊?谢谢!

作者: 花裙子 时间: 2011-8-23 12:53

最近在做lamp，实验结果可以用电泳检测得到，想试一下用SYBR Green I，请问如何使用？
用多少倍的dye？ dye该如何保存？
没用过SYBR Green I，所以请大家多多指教.

作者: 假小子 时间: 2011-8-23 12:53

有没有用羟基萘酚蓝显色的，讨论一下？

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