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标题: Real time PCR经验从RNA的提取到PCR [打印本页]

作者: 红豆冰 时间: 2011-8-23 16:22 标题: Real time PCR经验从RNA的提取到PCR

Real time PCR经验从RNA的提取到PCR [转自丁香园论坛]

REAL TIME PCR
一：引物的设计
引物的设计对于这个实验至关重要，因为real time pcr的检测灵敏度比较高，所以相应的对引物设计的要求就很高。普通的要求规则大家都知道，还有几点必须注意：
1，引物的错配率（引物错配形成引物二聚体，但是SYBR照样能嵌入进去，结果导致实验结果的误差很大，重复性也不好）。
2，引物的特异性一定要高（不像常规PCR，引物同源性不高，只要两条产物的片段长度相差足够大，在电泳的时候能够区分开就可以。real time PCR只有在熔解曲线的时候能分开，所以这就造成整个实验结果误差很大，不可信）。
3，引物设计要跨内含子，不能在一个外显子上（我们的实验是以cDNA为模板来扩增的，如果有DNA污染的话，因为DNA上含有分子量很大的内含子，不可能完成扩增。这对我们消除整个实验的误差起很大的作用）。
4，引物设计的时候要尽可能设计在同一退火温度，方便于以后同时扩增很多不同的基因片段。但是如果相差比较大，就得分开做，浪费模板，浪费管家基因，所以每个实验室设计引物的时候要尽可能一致，这样就不用每次查退火温度，且对整个实验有利。
5，注意引物设计好后的产物长度。REAL TIME PCR的最佳产物长度在150-250kb左右（书上说这样可以增加荧光的敏感度，减少实验误差，但是我对这个说法持怀疑态度。产物长度越大，SYBR嵌入的越多，这样才能够保证最后的荧光值比较可信）。
6，不同的管家基因扩增效率不同。所以在做整个实验之前应该做一次检测扩增效率的实验。如果扩增效率相差太大，就不能使用delt，deltCt法来比较基因表达量的高低。
二：模板的要求
归根到底，REAL TIME pcr想要检测的是目的基因表达量的高低，所以对整个实验过程中模板的质量要求必然很高，我以自己的一些经验说一下操作过程中的一些关键点：
1，用TRIZOL提取RNA有范围要求。细胞数必须在一个范围之内才能提取出高质量的RNA，所以我们在提取前必须知道细胞数（一般6孔板中两个孔就可以提取出RNA）。
2，加入氯仿抽提过程中尽可能不要吸到中间层（中间层为基因组DNA，对上机做REAL TIME PCR很不利，会导致起始荧光值很高，无法跑出完整的扩增曲线）。
3，提取完后用乙醇溶解要尽可能使得乙醇挥发掉，但是不要过分挥发。（乙醇没有挥发干净会对后续的扩增效率有影响。在乙醇存在的情况下，DNA更加难溶，这就是醇沉的道理。但是过分挥发，RNA又不溶于水，会造成后续反转录量不高）。
4，反转录过程的操作尽可能在冰上。我们用的是OLIGO DT18，为了尽可能的消除RNA之间的二聚体，我们将RNA和OLIGO DT18在一起70度变性10分钟后，马上冰浴2分钟，再加入后续的MLV-BUFFER,DNTP,RNASE INHIBITOR,MLV。然后在37-40度下一个小时完成延伸过程（也有的步骤上将RNA先70度变性10分钟，再加入OLIGO DT18和MLV-BUFFER,DNTP,RNASE INHIBITOR,MLV。但是在变性完再加OLIGO DT18时，加的比较晚的管子有很大的可能RNA又重新形成二聚体，导致前面的变性没有意义）。
5，反转录完后将cDNA -20度保存，尽可能不要反复冻融（可以以10UL为一个单位来分装cDNA）。
6，在加样的过程中需要特别注意：（1）最好引物和水做MIX,且配置完后需要放置在冰上，这样可以消除不同管之间引物浓度的差异。（2）最后加模板的时候需要一把很准确的移液器，以便确保每次加进去的样一致，注意不要沾管壁（大部分人说需要混匀，但是我认为只要确保加入到体系中就可以，不用刻意混匀。因为我们在反应前有个95度变性，大家可以想象一下，在95度时候体系内的分子运动是很剧烈的，完全可以混匀），有条件的话可以加ROX,来消除不同的加样体系来造成的误差。（3）加样完毕后最好离心一下，防止沾璧。
三：上机操作
在做整个实验之前，应该对实验有个整体的计划，每个管中所加的物质要有计划。在程序上编好号码，选好需要进行的熔解曲线（因为机器刚开始是默认为不进行熔解曲线，切记）。可以选择两步法（产物长度较小，退火和延伸都在60度完成），也可以选择三步法（产物较大，只能分为3步，且应该根据产物的长度来确定延伸时间，因为TAQ酶的延伸速度最少也在50BP/S，因此可以换算出所需要的延伸时间）。扩增完毕后进行熔解曲线，这个是必须要有的，因为这样才能鉴定你产物的特异性和有无引物二聚体。如果前几次做的话最好在做完REAL TIME PCR后将产物在1%的琼脂糖凝胶上电泳，来确定自己的判断。
四：分析数据
用的比较多的是用双DELT法相对定量，而绝对定量则必须要进行标准曲线的制备，需要对这个基因构建质粒，克隆分离。所以我们对基因表达量高低用双DELT法（前提是扩增效率要一致）。熔解曲线观察，如果同一基因的熔解曲线不一样，则造成结果不一致，重复性很差，因此要多摸条件，尽可能使熔解曲线一致。

作者: 红豆冰 时间: 2011-8-23 16:22

实验步骤：
1.设计引物，溶解成为10mM的浓度。

2.提取RNA，反转录成CNDA

3.常规PCR以实验所得模板扩增看家基因40个循环，电泳看产物多少。如果少，则不能进行REAL TIME PCR操作。

4.编写好程序，加样，上机

5.分析结果

自己的水平很有限，希望能够得到园子里朋友的帮助，共同进步。

作者: 爱哭鬼 时间: 2011-8-23 16:23

正要学习这方面的资料，支持！

作者: 大仙 时间: 2011-8-23 16:24

我也要做，支持！谢谢！

作者: 冰激凌小姐 时间: 2011-8-23 16:24

很好的经验，感谢分享！支持！

作者: 跳跳糖 时间: 2011-8-23 16:25

非常感谢提供这么宝贵的经验!!!

作者: 不懂 时间: 2011-8-23 16:25

很实用的经验！

作者: @木木@ 时间: 2011-8-23 16:26

不胜感激~ ！！！！！

作者: 不懂 时间: 2011-8-23 16:26

请问双DELT法怎么操作？谢谢！

作者: 阿拉蕾 时间: 2011-8-23 16:27

非常好的贴子！顶一下

作者: 阿福 时间: 2011-8-23 16:28

3，引物设计要跨内含子，不能在一个外显子上（我们的实验是以cDNA为模板来扩增的，如果有DNA污染的话，因为DNA上含有分子量很大的内含子，不可能完成扩增。这对我们消除整个实验的误差起很大的作用）。
4，反转录过程的操作尽可能在冰上。我们用的是OLIGO DT18，为了尽可能的消除RNA之间的二聚体，我们将RNA和OLIGO DT18在一起70度变性10分钟后，马上冰浴2分钟，再加入后续的MLV-BUFFER,DNTP,RNASE INHIBITOR,MLV。然后在37-40度下一个小时完成延伸过程（也有的步骤上将RNA先70度变性10分钟，再加入OLIGO DT18和MLV-BUFFER,DNTP,RNASE INHIBITOR,MLV。但是在变性完再加OLIGO DT18时，加的比较晚的管子有很大的可能RNA又重新形成二聚体，导致前面的变性没有意义）。

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请问
1：怎样看出一个基因的内含子，针对mRNA设计引物是不是就没有内含子？
2：TAKARA的逆转录酶逆转时间才15min，我做过一次结果还可以，请问有没有别的战友用过，还有他们protoc上没有72度变性的步骤，迷惑中......

作者: 阿拉蕾 时间: 2011-8-23 16:28

Delta Delta Ct法根据公式推导——
终产物=初产物*2^N(cycle).

作者: 圆圆圈圈 时间: 2011-8-23 16:29

那个Ct值表示什么呀？

作者: 阿拉蕾 时间: 2011-8-23 16:30

QUOTE:

原帖由 圆圆圈圈 于 2011-8-23 16:29 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
那个Ct值表示什么呀？

Ct值是表示达到你设定荧光所需的PCR循环数，建议多看点资料。

作者: 红豆冰 时间: 2011-8-23 16:30

你好
双DELT法是相对定量表示GENE表达量的一种方法，与之对应的有绝对定量。

作者: HOT兔 时间: 2011-8-23 16:31

1：怎样看出一个基因的内含子，针对mRNA设计引物是不是就没有内含子？
2：TAKARA的逆转录酶逆转时间才15min，我做过一次结果还可以，请问有没有别的战友用过，还有他们protoc上没有72度变性的步骤，迷惑中

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1：一个基因的内含子和外显子在PUBMED上有详细的说明，对你的mRNA有详细的说明，如从203-450是外显子而从451-540是内含子，你可以看看。针对MRNA的引物设计要跨内含子设计，可以避免一些基因组的污染，所以养成一个习惯如果是批mRNA，则跨内含子。
2：我不太明白你的72度变性是什么意思，逆转录酶和TAQ酶的最佳作用温度不一样。

作者: 嗡嗡 时间: 2011-8-23 16:32

非常
有用的东西！

作者: 胖小妮子 时间: 2011-8-23 16:33

的确是新手，看见过别人操作，自己以后可能会做定量PCR

作者: +田田+ 时间: 2011-8-23 16:33

希望可以有更多的人提出一些问题或者RT-PCR高手提出一些质疑，能更好探讨RT-PCR，避免新手犯错误，而且也能加深对RT-PCR的理解。谢谢大家啦

作者: 阿拉蕾 时间: 2011-8-23 16:33

我个人认为应该做模版cDNA和水的MIX，这样可以消除cDNA的差异；因为我们的目的就是检测cDNA的不同；而引物浓度是有一个范围的，各管之间引物浓度的差异影响比cDNA的差异要小的多得多。

作者: @木木@ 时间: 2011-8-23 16:34

做标准曲线时梯度稀释很关键，虽然每次都用枪反复吹打好十几次再用手弹后离心，还是出现稀释的梯度不好，清高手多多指教。

作者: 阿拉蕾 时间: 2011-8-23 16:34

QUOTE:

原帖由 @木木@ 于 2011-8-23 16:34 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
做标准曲线时梯度稀释很关键，虽然每次都用枪反复吹打好十几次再用手弹后离心，还是出现稀释的梯度不好，清高手多多指教。

每次看见他们做的十倍稀释，还能做出很PERFECT的标准曲线，很是羡慕，但是在我周围没有人做的这么漂亮，所以一般以5倍或者2倍稀释，做出的图会好些，你可以试试。

作者: 阿拉蕾 时间: 2011-8-23 16:35

我个人认为应该做模版cDNA和水的MIX，这样可以消除cDNA的差异；因为我们的目的就是检测cDNA的不同；而引物浓度是有一个范围的，各管之间引物浓度的差异影响比cDNA的差异要小的多得多。

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实时和常规的不同，实时一般是最后加模板，而常规是最后加酶，要是做模板和水的MIX，个人认为要对整个体系的把握比较好，但是体系对荧光信号是有影响的。可以通过减少水的体积来稳定体系。

作者: 不懂 时间: 2011-8-23 16:35

谢谢楼主！还有一个问题想要请教，对于表达量的基因做标准曲线时有啥好的方法吗？

作者: 红豆冰 时间: 2011-8-23 16:36

目前都是一些常规的办法，遇到的问题基本都是在稀释完后做处的标准曲线不理想，还是上面的办法，不要用10倍的，可以用小倍数的。

作者: 不懂 时间: 2011-8-23 16:37

谢谢楼主！我打算试试2倍梯度稀释。

作者: 大猫 时间: 2011-8-23 16:38

很有用。占个位子，以后提问

作者: 菠萝菠萝蜜 时间: 2011-8-23 16:38

6，不同的管家基因扩增效率不同。所以在做整个实验之前应该做一次检测扩增效率的实验。如果扩增效率相差太大，就不能使用delt，deltCt法来比较基因表达量的高低。

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如何做检测目的基因和管家基因扩增效率的实验??有没有具体步骤?谢谢

作者: 阿拉蕾 时间: 2011-8-23 16:39

如果按照标准的步骤是得做两个基因的标准曲线来看两者之间的斜率，差异在可信范围之内就认为两者扩增效率是一样的，但由于标准曲线制备要求很高，有个比较野的办法就是看两个基因的扩增曲线，如果指数期的扩增曲线平行，则我们可以认为两者的扩增效率相同。

作者: 羊咩咩 时间: 2011-8-23 16:39

如何做检测目的基因和管家基因扩增效率的实验??有没有具体步骤?谢谢

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您好
做目的基因和看家基因的扩增效率试验，严格要求是应该做两个基因的标准曲线，但是由于标准曲线的制备比较困难（纯度高的基因比较难获得）。所以很多人看两个基因的扩增曲线，如果两者在指数期的曲线平行，我们可以认为两者的扩增效率相同，但是条件比较好的实验室还是应该做标准曲线。

作者: 微笑的海豚 时间: 2011-8-23 16:40

要做这个，谢谢LZ的分享，好经验啊

作者: 阿拉蕾 时间: 2011-8-23 16:40

关于引物设计：个人认为需要协调好内参基因和待测基因的扩增片段大小、引物的Tm、GC分布等，其次引物的级别必须要高，用HPLC级别的较好；最后就是要通过PCR来确定引物是否合适；其次还可以用相同的模板进行梯度稀释，来调整条件使他们的扩增效率达到一致（要满足Delta Delta CT法需要两者的扩增效率小于0.1）。

关于设计引物跨内含子的问题，我觉得如果引物跨越内含子那是最好不过，但是一般情况下，我们只是局限于知道部分基因的cDNA序列，对于DNA序列是不知道的，所以设计引物时跨越内含子与否只有运气一说；不过检验倒是可以通过同时以DNA和cDNA为模板PCR扩增来看产物的带大小就可以了，不过如果内含子序列很大的话，你可能根本就不会从DNA模板中扩出条带，所以一定要有准备啊！

对于DNA污染的取出我们还是有办法的，就是用DNaseI充分的消化DNA。
以上我的观点难免会有不足，期待大家的指正，非常感谢！

Analysis of Relative Gene Expression Data Using Real-Time Quantitative PCR and the 22DDCT Method这片文章详细的介绍了Delta Delta CT法的数学模型与应用，相信对于想采用比较定量法分析基因表达的朋友是非常有用的哦！
需要文章的可以发邮件给我。

祝大家实验顺利！

作者: 夕阳 时间: 2011-8-23 16:41

谢谢分享！辛苦了！

作者: 年轮 时间: 2011-8-23 16:42

您好
做目的基因和看家基因的扩增效率试验，严格要求是应该做两个基因的标准曲线，但是由于标准曲线的制备比较困难（纯度高的基因比较难获得）。所以很多人看两个基因的扩增曲线，如果两者在指数期的曲线平行，我们可以认为两者的扩增效率相同，但是条件比较好的实验室还是应该做标准曲线。

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您好，继续提问：
１．＂如果两者在指数期的曲线平行＂怎么理解？你看我做的以下这张图（图一）能说是指数期平行吗？图一和图二其实是一样的实验设计的不同重复，而且图一是刚刚做Ｒeal Time时的结果，而图二是钻研重复了Ｎ多次的结果，为何结果相差这么大，且越做越不如以前了？能做表达差异的相对定量分析吗？

２做完标准曲线，如何判断扩增效率是否相同？是看斜率吗？

作者: 阿拉蕾 时间: 2011-8-23 16:42

您好
我认为你的结果已经做的挺好的了，指数期可以认为是平行的，如果实验室条件有限的话可以计算结果了。
但是如果实验室条件比较好的话，最好还是做标准曲线，标准曲线的斜率相差0.1-0.3之间是可信的。是指斜率。

作者: 许愿精灵 时间: 2011-8-23 16:43

你好
RNA的变性是指在70度的时候有些RNA的结构，如二聚体等可以打开，有利于反转录酶进行反转录，我觉得这样做更保险一些，就象有的人跑MRNA胶的时候习惯先变性下，让RNA成为单链，这样跑出来的条带漂亮些，一个道理。

作者: 红豆冰 时间: 2011-8-23 16:44

谢谢,我做RT-PCR,怎么有时候能批出来,有时候又批不出来呢,跟RT试剂盒有关吗?

作者: 阿拉蕾 时间: 2011-8-23 16:45

谢谢,我做RT-PCR,怎么有时候能批出来,有时候又批不出来呢,跟RT试剂盒有关吗?

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批不出来有很多因素，既然你有时候能够批出来，证明你的试剂盒应该没有问题，你应该找其他的一些因素，你的问题说的不太详细。

作者: 嘉年华 时间: 2011-8-23 16:45

支持，赞一个

作者: 清风风铃 时间: 2011-8-23 16:46

您好
我认为你的结果已经做的挺好的了，指数期可以认为是平行的，如果实验室条件有限的话可以计算结果了。
但是如果实验室条件比较好的话，最好还是做标准曲线，标准曲线的斜率相差0.1-0.3之间是可信的。是指斜率。

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你好,
1.到底如何判断是否平行啊?我怎么感觉有交叉啊? 你觉得图片1和图片2哪个结果更好? 这两个结果差别原因可能是什么? 从扩增曲线能看出扩增效率吗?为什么你说可以计算结果了?你看出扩增效率一致了吗?请告诉我你的判断方法好吗?
2.标准曲线的斜率相差0.1-0.3之间就可认为扩增效率一致,对吗?
3.做标准曲线必须用很纯的DNA做吗?我用逆转录后的cDNA可以做吗?或者用PCR后的产物做标准曲线可以吗?

谢谢!!

作者: 橘子水儿 时间: 2011-8-23 16:47

谢谢楼主宝贵的经验

作者: 天蓝蓝 时间: 2011-8-23 16:47

非常感谢提供这么实用的经验!

作者: 小米虫子 时间: 2011-8-23 16:48

谢了先~有问题再来提问~

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