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标题: 荧光定量PCR:从标准曲线的制作到基因表达分析 [打印本页]

作者: 白鸟之翼 时间: 2011-8-24 13:47 标题: 荧光定量PCR:从标准曲线的制作到基因表达分析

荧光定量PCR:从标准曲线的制作到基因表达分析[转自丁香园论坛]

定量PCR定量的基本原理就是用已知拷贝数梯度稀释的样品作出标准曲线，未知样品和标准曲线相比较从而得到未知样品的量。无论是在基因表达分析实验还是在病原微生物检测应用中都有可能要做标准曲线，分别用于绝对定量和相对定量。
标准样品的准备
1、绝对定量。绝对定量就是要确定未知样品的拷贝数。对于这类实验标准品是通过某种方法制备得到的已知拷贝数的含有目标片段的核苷酸序列。最常见的是插入有目标序列的质粒，因为质粒是环状DNA有较强的稳定性，而且分子量比较大定量的时候比较准确。也有用线状的PCR产物作为标准品的，通常要比扩增的目标片段要大一些，这也是为了获得分子量比较大的片段，提高拷贝数的准确性。标准品的拷贝数是通过紫外定量的方法来确定，先得到标准品的浓度C(ng/uL)，因为无论是质粒还是PCR产物它们的序列都是已知的，这样通过通过核苷酸的相对分子量和标准品序列信息估算出标准品的分子量B，这样标准品的拷贝数A(copy/uL) 为：
A=C/B×6.02E+14
2、相对定量。主要是针对基因表达分析实验而来的，因为要知道都是相对的数值（对照样品和实验样品中基因表达的比值），这样就不需要知道精确的拷贝数，所以标准品也就无须知道精确的拷贝数，只需知道稀释的倍数就可以了。
实验中的标准品可以是来源比较丰富的细胞或组织的RNA转录得到的cDNA。将这种cDNA进行梯度的稀释，可以是稀释10倍，100，1000，10000等倍（具体实验要根据具体的情况来调整稀释倍数。最好能作一个预实验来看看什么样的稀释倍数比较适合这种基因的扩增）。而对于各个稀释倍数要对它的拷贝数进行赋值，这个值当然不是标准品中真实含有的基因数量，当然在基因表达分析中也不需要，而是要求根据稀释倍数给每一个稀释度人为赋予的拷贝数，这只是为了方便实验最终结果的计算而已。比如可以把前面稀释十倍的样品赋值为10000个拷贝，100倍的赋值为1000个拷贝依次类推把10000倍的赋为10等。要注意，赋值的数目的倍数差异和稀释的倍数应该是一样的，比如前面是10稀释，后面赋值也是10倍变化。

作者: 白鸟之翼 时间: 2011-8-24 13:48

如何做标准曲线
在定量实验中标准品是要和未知样品一起进行定量实验的，这样在实验结束，无论是标准品还是未知样品都将跑出曲线，获得了Ct值。那么先可以把未知样品放到一边，对于标准品来说，既获得了Ct值，还知道他们的拷贝数（虽然对于相对定量来说这个拷贝数是我们自己赋予的）。这样可以通过标准品的Ct值和拷贝数做一条标准曲线（以拷贝数为横坐标，而Ct值为纵坐标）。一旦作出了标准曲线，而未知样品的Ct值知道（通过实验求得的），这时候就在标准曲线上进行定位，就可以得到未知样品的拷贝数了。
事实上，操作起来没有那么复杂，只需要告诉软件哪个孔是标准品，哪个是未知样品，以及标准品的拷贝数等必要信息，软件会自动帮把标准曲线和未知样品的拷贝数计算出来了。
举例来说如何进行设置
1、先进入软件，在板设置中选择所放样品的位置，并标上unknow或standard等信息。

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2. 选择要使用的荧光染料。

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显示如下：

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作者: 白鸟之翼 时间: 2011-8-24 13:49

显示如下：

作者: 白鸟之翼 时间: 2011-8-24 13:50

3、设置复孔。
如果有些孔有重复就用用样的数字标明，这样仪器就知道哪些是重复，最终结果处理的话也可以取平均等操作。

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作者: 白鸟之翼 时间: 2011-8-24 13:50

结果如下：

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作者: 白鸟之翼 时间: 2011-8-24 13:51

4、标准品赋值
接下来要给标准品赋上值，系统要知道按照什么去计算
标准品赋值要先选上要赋值的标准品，然后在工具面板中输入相应的值。

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作者: 白鸟之翼 时间: 2011-8-24 13:51

为了方便设置系统有一个自动增加稀释倍数的设置，点开后就可以选择你的稀释倍数，然后用鼠标去选择孔的时候会自动增加

选择稀释倍数
每次选择不同的孔，在里面赋的值会自动按照倍数增加

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作者: 白鸟之翼 时间: 2011-8-24 13:52

显示如下：

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作者: 白鸟之翼 时间: 2011-8-24 13:53

5、设置温度
在这里提供一个对于SYBR染料常用的温度的控制模板，可以参考。注意最后的溶解曲线制作过程在升温的过程中选择标有all的放大镜，代表从55℃到95℃逐渐升温的过程中不停的检测荧光信号。

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作者: 白鸟之翼 时间: 2011-8-24 13:53

6、设好了之后可以运行程序了，最后的标准曲线和扩增曲线系统会自动给出，也会算出未知样品的拷贝数。

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作者: 白鸟之翼 时间: 2011-8-24 13:54

标准曲线

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作者: 白鸟之翼 时间: 2011-8-24 13:54

基因表达分析
基因表达分析中常见到的问题
1、采用什么样的荧光标记方法？
荧光标记方法一般有两种，一种是探针法，另一种是染料法，即使用SYBR Green染料。由于探针合成的成本比较高，探针设计也有一定的难度，所以在基因表达分析中经常采用SYBR Green染料法进行荧光定量检测。检测的原理是SYBR GreenI游离状态下不发荧光，但当反应体系中有双链DNA存在的情况下SYBR GreenI就可以非特异性的结合到DNA双螺旋的小沟处，发出很强荧光。这样随着PCR反应的进行，产物也在不断积累，结合到双链PCR产物上的荧光也就越来越多。通过检测荧光信号强度就可以反映出反应体系中产物的积累变化情况。
这种SYBR GreenI染色法的优越性是使用方便，不需要针对不同的基因专门设计探针。想检测不同的基因只用在PCR体系中加入同一种荧光物质就可以。而且价格非常便宜。但它主要的缺点是灵敏度不够，如果PCR反应中产生了引物二聚体也同样会造成荧光信号的积累，因此在做实验前往往需要对实验条件进行摸索。
2、要检测的基因有哪些？
基因表达分析的目的就是检测某种我们感兴趣的基因在不同组织或细胞中的表达差异。荧光定量PCR技术可以对核酸物质的含量进行精确的定量，也就成了研究基因表达差异的一把利器。
在基因表达分析实验中要检测两个基因，一个是目的基因和另一个是看家基因。之所以要引入看家基因最主要是由于不能确定要比较的样品所用的组织起始量相同。就是说比如提取正常样品的基因时用了100个细胞，而提取病变样品时只用了10个细胞，这时候的基因表达差异可能是由于提取时候的样品细胞数不同引起的。为了纠正这种误差，选用认为在两个样本中表达量不变的看家基因作为内参照，来去除样品细胞数不同而带来的干扰。例如，要研究某个基因在肿瘤样品和正常样品中的基因表达差异。在实验中发现要研究的正常样品中的看家基因的表达量是肿瘤样品中的10倍，就认为正常样品的细胞数就是肿瘤样品细胞数的10倍，那么在肿瘤样品中目的基因的基因表达量应该乘以10倍，才能和正常样品进行比较。
3、什么是扩增效率？
从理论上来说PCR的扩增应该按照2的倍数向上递增，这样的扩增效率我们认为是100%，但是实际上的实验不能保证扩增效率是100%，甚至有时因为实验条件、选用试剂、稀释等存在的问题扩增效率还有可能高过100%。扩增效率可以通过标准曲线来计算出来，它只和标准曲线的斜率有关。
PCR扩增效率 = 10(-1/slope) – 1
4、基因表达差异如何计算？
基因表达差异的计算是通过所得到的Ct值来计算的，要计算两个样品（待测样品和对照样品）的目的基因的表达差异必须检测得到4个Ct值：待测样品和对照样品中目的基因和看家基因的Ct值。

作者: 白鸟之翼 时间: 2011-8-24 13:55

那么基因表达差异应该计算为

基因表达差异=2（△Ct1-△Ct2）
这是公式的推导过程是根据PCR的基本原理而来的。PCR每次循环的产物量的积累过程应该是以2的倍数进行增长，即下一次循环是上一次循环产物量的2倍。如果正常样本的起始模板数是X，待测样本的起始模板数是Y，那么当两个样本都达到域值时，它们的产物量应该是一样的，如果这个时候两个样本的Ct值分别为Ct1和Ct2，则有：
X×2Ct1=Y×2Ct2
待测样本和对照样本起始模板数之比应为：
Y/X=2 Ct1/2 Ct2=2△Ct1
同理待测样品和对照样品中看家基因的起始模板的比就应该是：
Y’/X’=2 Ct1/2 Ct2=2△Ct2
这样经过看家基因纠正的基因表达差异应该是：
基因表达差异=2（△Ct1-△Ct2）
这个公式的前提是看家基因和目的基因的扩增效率相同并且都为100%，因为只有这个时候产物的增长速度才有2倍的关系，否则就要引入目的基因和看家基因的扩增效率E1和E2来修正这个公式。

5、标准品如何准备？
从理论上说基因表达分析实验是不需要标准品的，因为无需精确定出研究的组织或细胞中的某种基因的真实拷贝数，感兴趣的只是目标实验组和对照组的某种基因表达量的比值，也就是说想要得到的只是一个相对的数值和真实的拷贝数没有直接的关系。
那么在一些实验中为什么还要做标准曲线呢？这是为了纠正扩增效率不同的问题。从理论上来说PCR的扩增应该按照2的倍数向上递增，这样的扩增效率我们认为是100%，但是实际上的实验不能保证扩增效率是100%，尤其在不同的基因的扩增中间。因为基因表达分析实验用到了目的基因和看家基因两种基因，这样这两种基因的扩增效率会有所不同。那么如果用看家基因来校正目的基因就会带来误差，刚才的公式也就不再适用了。这样考虑到看家基因和目的基因不同的扩增效率，就需要做标准曲线来精确反应样品管中基因的相对含量。
基因表达分析标准品的准备相对比较简单，因为要知道的都是相对的数值（对照样品和实验样品中基因表达的比值），这样就不需要知道精确的拷贝数，所以标准品也就无须知道精确的拷贝数，只需知道稀释的倍数就可以了。
实验中的标准品可以是来源比较丰富的细胞或组织的RNA转录得到的cDNA。将这种cDNA进行梯度的稀释，可以是稀释10倍，100，1000，10000等倍（具体到你的实验要根据具体的情况来调整稀释倍数。最好能作一个预实验来看看什么样的稀释倍数比较适合你的这种基因的扩增）。而对于各个稀释倍数我们要对它的拷贝数进行赋值，这个值当然不是标准品中真实含有的基因数量（在基因表达分析中也不需要），而是根据稀释倍数给每一个稀释度人为赋予的拷贝数，这只是为了方便实验最终结果的计算而已。比如把前面稀释十倍的样品赋值为10000个拷贝，100倍的赋值为1000个拷贝依次类推把10000倍的赋为10等。要注意，赋值的数目的倍数差异和稀释的倍数是一样的，比如前面是10倍稀释，后面赋值也是10倍变化。
最后的实验结果可以得到样品的拷贝数，再通过拷贝数来分析不同样品中基因表达的倍数差异。
需不需要作标准曲线要根据实验的具体情况来定，假如通过实验的验证，发现目的基因和看家基因的扩增效率基本一致并都接近1，并且对实验的精度要求不高的情况下就可以不用做标准曲线，直接通过公式来计算基因的表达差异。但是如果研究的样本本身的基因表达差异就不大，如果进行忽略就可能造成较大误差，这样就需要做标准曲线来纠正这种误差了，作到较为精确的定量。

作者: 白鸟之翼 时间: 2011-8-24 13:56

Stratagene荧光定量PCR仪基因表达分析解决方案
Stratagene荧光定量PCR仪和配套的Mxpro软件在处理基因表达分析方面的功能比较强大，下面简要说明如何使用该软件来进行基因表达分析。
例如要分析IL1基因的表达情况，用看家基因GAPDH作为内参，采用的是SYBR GreenI染料法。
1、板设置
1.1、专门的基因表达分析实验模式。打开Mxpro程序操作窗口，首先弹出的对话框是要用户选择要进行的实验类型，做基因表达分析可以选择第二项Comparative Quantitation (Calibrator)。

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作者: 白鸟之翼 时间: 2011-8-24 13:56

1.2、类型选择和孔设定。在板设置中选择样品的类型，可以将样品的名称写成GAPDH和IL1，并将GAPDH设为看家基因（NORM），这样设置非常清晰，有利于分析结果。如果实验中使用了复孔，则在复孔上标上相同的数字，代表这些样品是重复，下图中每个样品重复三次。

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作者: 白鸟之翼 时间: 2011-8-24 13:57

基因表达分析实验同一个cDNA既要做目的基因，也要做看家基因。看家基因和目的基因来自同一样本的用相同的字母来标记，如果是对照样品则标上Calibrator。

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作者: 白鸟之翼 时间: 2011-8-24 13:58

1.3、反应条件设定。可以设定扩增反应条件和熔解曲线条件。

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作者: 白鸟之翼 时间: 2011-8-24 13:58

2、结果分析
2.1、多种分析结果可供选择
扩增曲线，其中红色表示目的基因，绿色表示看家基因（和板设置中选择的颜色相同）

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作者: 白鸟之翼 时间: 2011-8-24 13:59

标准曲线，看家基因和待测基因的标准曲线都能被作出来，并显示出分别的扩增效率。

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作者: 白鸟之翼 时间: 2011-8-24 14:00

熔解曲线，其中红色表示目的基因，绿色表示看家基因，峰代表产物的Tm值的温度，图中可以看到看家基因和待测基因的产物基本具有相似的Tm值。

图片附件: 33357717.jpg (2011-8-24 14:00, 23.87 KB) / 该附件被下载次数 14
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作者: 白鸟之翼 时间: 2011-8-24 14:00

基因表达差异柱壮图显示，程序可以自动计算出基因表达的差异，并用柱壮图显示出来，每一个柱表示一个样本，基因表达的趋势清晰可见，对照样本被算为1。

图片附件: 44915579.jpg (2011-8-24 14:00, 17.32 KB) / 该附件被下载次数 17
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=8431

作者: 白鸟之翼 时间: 2011-8-24 14:01

柱壮图还可以表示成Log的形式，这样可以清楚分开上调和下调的样本。

图片附件: 37091019.jpg (2011-8-24 14:01, 15.79 KB) / 该附件被下载次数 7
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作者: 冰激凌小姐 时间: 2011-8-24 14:02

建议楼主再发一些

作者: 糊涂虫 时间: 2011-8-24 14:04

太有用了，理论还有实际操作都讲得很明白，搂主继续发吧。

作者: 果冻也酸 时间: 2011-8-24 14:04

恩　是的　　多发些！
很有用的！

作者: 不懂 时间: 2011-8-24 14:05

很好的东东，楼主多发些有用的资料来！
谢谢！

作者: 白鸟之翼 时间: 2011-8-24 14:06

恩，谢谢！
不过不知道这个是什么型号和牌子的。不一样的话。设置和界面也是不一样的阿。

作者: 嘉年华 时间: 2011-8-24 14:07

非常感谢搂主的指点！

作者: 如影随形 时间: 2011-8-24 14:07

楼主辛苦啦！谢谢！

作者: 开心蔬菜帮 时间: 2011-8-24 14:07

楼主分享的太有用了，正需要加强这方面的知识，谢谢楼主！

作者: 章鱼小丸子 时间: 2011-8-24 14:08

非常实用，多谢分享！

作者: 红豆冰 时间: 2011-8-24 14:08

找了半天才找到这个，非常感激

作者: HOT兔 时间: 2011-8-24 14:09

楼主的讲解非常有明白，谢谢！

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