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标题: 一本待出版的有关PCR技术的新书[转自丁香园论坛] [打印本页]

作者: 荷塘青蛙！ 时间: 2011-8-24 16:10 标题: 一本待出版的有关PCR技术的新书[转自丁香园论坛]

一本待出版的有关PCR技术的新书[转自丁香园论坛]

这是一本有关PCR技术的新书，希望会为你的PCR试验提供帮助！

作者: 荷塘青蛙！ 时间: 2011-8-24 16:13

上篇
PCR的基本理论与技术

第一章聚合酶链式反应
分子克隆(molecular cloning)、DNA测序(DNA sequencing)和聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)是当今现代分子生物学的三大主流技术。在这三种技术中，PCR技术在实践中的应用日益广泛并随着分子生物学实验技术的成熟而不断的创新和拓展。早在二十世纪七十年代初期H.Ghobind Khorana和他的同事就提出了用PCR技术以减少基因的化学合成中的工作量的想法。然而由于当时技术条件的限制，基因测序、引物合成等方面的研究都存在一定的局限性，特别是还没有发现稳定的耐热DNA聚合酶(thermostable DNA polymerase)等诸多因素，使得Khorana的想法在当时看来还不可能实现，并且很快就被人们所遗忘。然而，随着耐热DNA聚合酶的发现，十五年后美国PE.Cetus公司的Kary Mullis和他的同事通过使用E.coli DNA聚合酶I的Klenow片段成功的在体外扩增了哺乳动物的基因(Saiki等，1985；Mullis等，1986；Mullis和Faloona，1987)，从而实现了Khorana的设想，并将这一技术命名为聚合酶链式反应(PCR)。随着从耐热菌Termus aquaticus中提纯的耐热DNA聚合酶的发现和应用(Saiki等，1988)，大大的提高了PCR的效率并推动了其向PCR自动化技术的发展。此后，通过PCR技术，人们能在数小时内通过试管中的反应将特定的DNA片断扩增数百万倍。PCR技术成为生物科学研究的一种重要方法，为医学、遗传学和考古学等学科的研究提供了新的技术手段。目前，与PCR相关的技术已经不断的被开发应用。
第一节 PCR技术的原理
聚合酶链式反应(PCR)是一种选择性体外扩增DNA或RNA片段的方法，即通过试管中进行的DNA复制反应使极少量的基因组DNA或RNA样品中的特定基因片段在短短几小时内扩增上百万倍。其反应原理与分子克隆技术的细胞内的DNA复制相似，但PCR的反应体系要简单的多，主要包括DNA靶序列、与DNA靶序列单链3’末端互补的合成引物、4种dNTP、耐热DNA聚合酶以及合适的缓冲液体系。
与细胞内的DNA复制相似，PCR反应也是一个重复地进行DNA模板解链、引物与模板DNA结合、DNA聚合酶催化形成新的DNA链的过程，这些过程都是通过控制反应体系的温度来实现的。PCR包含下列三步反应：

① 变性(denaturation)：将反应体系混合物加热到95℃，维持较短的时间(大约15~30秒)，使目标DNA双螺旋的氢键断裂，形成单链DNA作为反应的模板。
OptionsEmail RepliesDisable J② 退火(annealing)：将反应体系冷却至特定的温度(引物的Tm值左右或以下)，引物与DNA模板的互补区域结合，形成模板?引物复合物。必须精确的计算退火的温度以保证引物只与模板相对应的序列结合。由于模板链分子较引物复杂的多，加之引物量大大超过模板DNA的数量，因此DNA模板单链之间互补结合的机会很少。
③ 延伸(elongation)：将反应体系的温度提高到72℃并维持一段时间，引物在耐热DNA聚合酶的作用下，以引物为固定起点，通过复制单链模板DNA沿5’→3’方向延伸，合成新的DNA链。因此，在这一阶段的末期，两条单链模板DNA又形成了新的双链，且双链中的新生DNA单链具有各种不同的延伸长度。

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以上三步作为一个循环重复的进行，每一循环的产物作为下一循环的模板。因此，在第二轮循环中通过变性产生的4条DNA单链结合引物并延伸(如图1-1)，在第三轮及更多的循环中重复进行变性、退火、延伸这三步反应。如此循环20次，原始DNA将扩增约106倍，而循环30次后将达109倍。而所有上述过程将在1~2小时内完成。经过扩增后的DNA产物大多为介于引物与原始DNA相结合的位点之间的片断，而在反应前几轮循环产生的超过引物结合位点的较长链的DNA的比例将随着循环的不断地进行稀释到可以忽略的程度。
第二节 PCR反应体系
PCR的基本反应体系包括需要扩增的模板(template)、一对寡核苷酸引物(primers)、维持pH值的反应缓冲系统(buffer system)、一价或二价阳离子(monovalent or divalent cations)、4种三磷酸脱氧核糖核苷酸(dNTP)、催化依赖模板的DNA合成的耐热DNA聚合酶(thermostable DNA)以及PCR促进剂等。
一、模板(template)
PCR反应的模板可以是DNA，也可以是RNA。当用RNA作模板时，先经过逆转录生成cDNA然后再进行PCR反应。PCR反应体系中，对模板的要求如下：
(一) 纯化的模板
DNA模板的来源广泛(可以从纯培养的细胞或微生物中提取，也可以从临床组织标本、犯罪现场标本、病理标本和考古标本中提取)，无论来源如何，待扩增的核酸模板都需要经过纯化处理以除去DNA聚合酶抑制剂。
(二) 模板的形式
含有目标靶序列的模板DNA可以通过单链或双链的形式加入PCR反应体系中。
(三) 线性DNA
由于环状DNA复性太快使其扩增效率略低于线性DNA，故常用线性DNA分子。若模板为环状质粒，最好先用酶将其切开成线性分子。
(四) 小片段模板DNA
尽管PCR对模板大小的要求不是十分严格，但是通常小片段模板DNA的扩增效率要高于大分子。因此，建议在PCR反应前使用机械剪切或者限制性内切酶消化基因组DNA以提高产量。
(五) 适宜的模板量
理论上PCR反应的最佳工作条件需要目标靶序列的单一拷贝作为模板，然而实际工作中常常在反应体系中存在数千拷贝的目标DNA。在哺乳动物基因组，通常每次PCR最多取1µg的基因组DNA作为模板，而这已含有多达3×105常染色体基因的拷贝。而对于简单得多的酵母、细菌及质粒基因组，每次反应的模板最大加入量分别为10ng，1ng和1pg。
二、引物 (primers)
PCR扩增产物的大小以及扩增靶序列在基因组中的位置是由引物限定的，因此，引物的选择与序列关系到PCR的特异性。
(一) 引物的质量
一旦确定引物的序列，就可以用核苷酸合成仪合成引物。由于合成的引物中可能含有相当数量的“错误序列”，其中包括不完整序列和脱嘌呤产物以及可以检测到的碱基修饰的完整链和高分子量产物。这些序列可以导致非特异扩增和信号强度的降低。因此，PCR反应所用的引物必须是高质量的引物，且需要纯化。通常可通过聚丙烯酰胺凝胶电泳法、离子交换法、高效液相层析法或寡聚核苷酸纯化柱法纯化。然而，使用自动DNA合成仪合成的寡聚核苷酸引物通常可以直接用于标准 PCR而不需要纯化。引物不使用时应在-20℃保存。在-20℃下，冻干引物至少可以保存12~24个月，液体状态则可以保存6个月。
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((二) 引物的设计原则
在影响扩增反应的各种因素中，寡聚核苷酸引物的设计最为重要。为了抑制不需要的序列的扩增而获得大量的预期的产物，我们需要精心的设计引物。
当需要同时扩增靶DNA上的许多片段，即多重PCR(multiplex PCR)时，需要在反应体系中加入一对以上的引物。
PCR反应中有两种引物，即5’端引物和3’端引物。在扩增基因片段或cDNA片段时，通常以信息链为基准，5’端引物与位于待增片段5’端上游的一小段DNA序列相同，引导信息链的合成；3’端引物与位于待增片段3’端的一小段序列互补，引导互补链的合成，PCR反应的扩增产物就是这一对引物之间的双链DNA片段。
不同的PCR反应体系，由于模板的组成、待增片段的长度及其使用目的的不同，对引物的要求也不相同。引物设计的基本原则是最大限度的提高扩增效率和特异性，同时尽可能地抑制非特异扩增。引物设计的基本要求如下：
1. 引物的长度：设计引物的目的是要提高PCR的特异性。因此，这就要求引物与模板DNA中的靶序列以较稳定的形式互补结合。寡聚核苷酸的长度越长，获得的特定靶序列的特异性就越好，引物过短则会影响PCR的特异性。然而，引物过长会使延伸温度超过耐热DNA聚合酶的最适温度，也会影响产物的特异性。因此，引物的长度应适宜，一般要求18~25bp，一对引物中两个引物之间的长度差异应小于3bp。
2. 基本成分：G+C的含量一般为40%~60%。四种碱基应随机的分布，避免碱基堆积的现象。尤其引物的3’端，不应有连续的3个G或C，否则会使引物与核酸的G或C富集区互补从而影响PCR的特异性。
3．引物自身：引物自身不应有反向重复序列或者大于3bp的自身互补序列，否则引物自身会折叠形成发夹结构，将影响引物与待增DNA中的靶序列的杂交结合。
4. 引物之间：引物之间不应存在互补序列，尤其应避免3’端的互补重叠以免形成引物二聚体。由于PCR反应体系中含有高浓度的引物，即使引物之间存在极为微弱的互补作用也会使引物相互杂交，最终得到引物二聚体的扩增产物。若引物二聚体在PCR反应的早期形成，它们将通过竞争DNA聚合酶、引物及四种单核苷酸从而抑制待增DNA的扩增。通过精心设计引物、应用热启动PCR(hot start PCR)或者降落PCR(touch down PCR)及特制的DNA聚合酶，可以减少引物二聚体的生成。
5. 3’末端：引物的3’端是引发延伸的起点，因此一定要与模板准确配对。四种碱基引起的错配有一定的规律，以引物3’端A的影响最大；另外，引物3’末端碱基错配时，不同碱基的引发率存在很大差异，当末位碱基为A时，错配的引发率大大降低，而当末位碱基为T时，错配的情况下也能引发链的合成。因此，应尽量避免在引物3’端的第一位碱基是A。引物3’端最佳碱基的选择是G和C，因为他们形成的碱基配对比较稳定。
6. 5’末端：引物的5’端并无严格的限制，在与模板结合的引物的长度足够的前提下，其5’端碱基可不与模板DNA互补而成游离状态。通常这些序列对寡聚核苷酸引物与模板的结合的影响并不显著。因此，引物的5’端可以被修饰，如附加限制酶酶切位点、引入突变位点、标记生物素、荧光物质、地高辛等，加入其它短序列包括起始密码子、终止密码子等。在后续的扩增循环中，这些与模板未配对的序列将被带到PCR产物的双链中，故在其PCR产物中，既含有目的扩增片段又含有两侧引入的核苷酸序列。

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7. 溶解温度：3’端引物和5’端引物应有相似的Tm值，其差别不应大于5℃。扩增产物与引物的Tm值的差别应小于10℃，以确保PCR循环中的扩增产物有效的变性。
8. 引物的特异性：引物与非特异扩增序列的同源性不要超过70%或有连续8个碱基同源。
9．引物的简并性：引物的3’端应为保守的氨基酸序列，即采用简并密码较少的氨基酸如Met、Trp，且要避免三联体密码第三个碱基的摆动位置位于引物的3’端。
引物的设计要考虑多方面的综合因素，依据实际情况具体分析，应尽量遵循上述原则。现在有许多设计引物的计算机软件，能综合分析优化组合引物的各种参数，对引物设计具有指导作用。
(三) 引物的用量及其计算
在PCR反应体系中，引物的浓度一般要求在0.1~0.5µM之间，这一引物浓度足以使1kb的DNA片段在PCR反应体系中循环扩增30次。引物浓度过低，则产物量低；引物浓度过高则会促进引物二聚体的形成以及非特异性产物的形成。非特异性产物和引物二聚体都可以作为PCR反应的底物，与靶序列竞争DNA聚合酶和dNTP底物，从而抑制靶序列的扩增。
引物浓度的计算可按下面的方法进行：摩尔猝灭系数(EM)是1cm光程比色杯中测定1mol/L寡核苷酸溶液在UV260nm下的光密度(OD)值。EM可按下式计算：
EM=a(16000)+b(12000)+c(7000)+d(9600)
其中，a、b、c和d分别代表寡核苷酸引物中的A、G、C和T的个数。
例如：一纯化的24bp寡核苷酸溶于0.1ml水中，取10μl稀释至1ml，测其OD=0.76，原液OD为0.76×100=76，若此寡核苷酸的碱基组成为A=G=C=T=6，其EM=6×16000+6×12000+6×7000＋6×9600=267600，故原液中的寡核苷酸浓度为76÷267600=3.4×10-4mol/L=340nmol/L。
三、反应缓冲系统(reaction buffer system)
反应缓冲系统提供PCR反应所必需的合适的酸碱度和某些离子。目前最常用的缓冲液是10~50mmol/L的Tris-HCl (pH8.3~8.8，20℃)，在72℃(通常PCR反应延长阶段的温度)时，其pH值为7.2左右，故在实际的PCR反应体系中，其pH值变化于6.8~7.8之间。
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反应缓冲系统中还含有KCl，50mM以内的KCl有利于引物的退火，而50mM以上的KCl则抑制Taq DNA聚合酶的活性。然而，也有人认为含有50mM KCl的缓冲系统有利于大于500bp的DNA片段的扩增，然而将缓冲系统中的KCl浓度提高到70~100mM则有利于提高较小的DNA片段的扩增产量。
此外还可以向反应缓冲系统中加入Taq酶保护剂，如小牛血清白蛋白(100µg/ml)、明胶(0.01%)、Tween-20(0.05%~0.1%)或二硫基苏糖醇(DTT，5mmol/L)等。
四、二价阳离子(divalent)——Mg2+
所有耐热的DNA聚合酶的活性都需要二价阳离子(通常是Mg2+)。虽然使用含有Mn2+的缓冲溶液也可以使一些聚合酶具有催化活性，但其效率要比加入Mg2+低得多；而Ca2+则不能活化DNA聚合酶。因此，PCR反应中耐热DNA聚合酶的活性与反应体系中游离Mg2+浓度直接相关。反应体系中Mg2+浓度低时，酶的活力显著降低；过高时，酶则催化非特异性扩增。此外，Mg2+浓度还影响引物的退火、模板与PCR产物的解链温度、产物的特异性、引物二聚体的生成等。值得注意的是，由于PCR反应体系中的DNA模板、引物和dNTP磷酸基团均可与Mg2+结合从而降低Mg2+的实际浓度，因此Mg2+的总量应比dNTP的浓度高0.2~2.5mmol/L。如果可能的话，制备DNA模板时尽量不要引入大剂量的螯合剂(如EDTA)或负离子(如PO43-)，因为它们会影响Mg2+的浓度。
五、三磷酸脱氧核苷酸(deoxynucleotide triphosphates,dNTPs)
四种三磷酸脱氧核苷酸(dNTP)为PCR反应的合成原料。在标准的PCR反应中各种dNTP的浓度应相等，若任何一种浓度明显不同于其它几种时，会诱发聚合酶的错误掺入从而降低链合成的速度。dNTP的浓度直接影响到PCR反应的速度和特异性，因此应严格的控制PCR反应体系中dNTP的浓度，具体要求详见第四节。
许多厂商出售专门用于PCR的dNTP储存液。这种储存液具有较强的酸性而不含焦磷酸盐，其目的是保护dNTP在储存液的冷冻和加热期间受到破坏。因此在使用前应用NaOH将pH值调至7.0~7.5。无论是自配的还是购买的dNTPs溶液在储存前都应分成较小的几份，然后在-20℃下储存，经过两次冷冻-加热循环后储存液就必须丢弃。若长期在-20℃下冻存，储存液中的少量的水分会蒸发而后凝结在储存容器上，因此储存dNTP液的容器在加热后应在微型离心机中离心数十秒以减少dNTP浓度的变化。
六、耐热DNA聚合酶(thermostable DNA polymerase)
1983年美国PE Cetus公司的Kary Mullis使用大肠杆菌DNA聚合酶I的Klenow片段首先建立了PCR技术，其延伸温度为37℃，然而由于Klenow片段在95℃的DNA变性温度下完全失活，因此在每轮循环步骤之后都需要再添新酶，操作十分繁琐，并导致反应体系中形成快速沉积变性的酶蛋白。此外，由于Klenow片段聚合反应温度偏低，引物与模板的非特异性结合增加，导致非特异性产物增多；同时，由于受到某些DNA二级结构的影响，聚合反应不完全，得不到完整的PCR扩增产物。直到1987年，发现了热稳定的Taq DNA聚合酶(Taq pol)等耐热的DNA聚合酶后，才使PCR技术有了重大的发展并逐步实现了自动化。
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耐热DNA聚合酶能经受95℃以上的高温而不失活，因而无需在每轮循环中添加新酶；同时它催化的聚合反应的最适温度为70~80℃，此时引物与模板结合的特异性好，故产物的纯度高。现在已发现多种耐热DNA聚合酶，其共同特点是在高温下仍保持一定的酶活性，但各耐热DNA聚合酶的性能尚有一定的差别。目前在PCR反应中应用最多的是Taq pol。
(一) Taq DNA聚合酶
天然的Taq pol是从嗜热水生菌thermus aquatics YT-1菌株中分离获得的。该菌株在1969年就从美国黄石国家公园的温泉中分离出来，能在70~75℃生长。现已克隆出该酶的基因，全长2499个碱基，编码分子量为94kD、长度为832个氨基酸的蛋白质。现将Taq pol的特点叙述如下：
1. 高热稳定性：Taq pol在92.5℃、95℃、97.5℃的半衰期分别为130min、40min和5~6min。在PCR反应中DNA变性时间通常为30~60s，若总共进行30轮循环累计热变性时间为15~30min，此时该酶仍然保持相当高的活性，完全可以保证PCR反应的需要。
2. 高催化活性：在已发现的耐热DNA聚合酶中，Taq pol的活性最高，达200,000U/mg。实验证明Taq pol的活性有明显的温度依赖性，Taq pol催化DNA合成的最适温度为75-80℃，此时延伸速率达150~300个核苷酸/秒/酶分子；70℃时为60个核苷酸/秒/酶分子；55℃时为22个核苷酸/秒/酶分子；37℃和22℃时分别为1.5个和0.25个核苷酸/秒/酶分子。当温度超过80℃时，几乎没有DNA的合成，可能与高温下引物和模板结合的稳定性遭到破坏有关。
3. 忠实性：序列分析表明Taq pol与Ecoli pol I N端区域(此区域与该酶具有5’→3’外切酶活性有关)高度同源，因此Taq pol亦有5’→3’端的外切酶活性。然而由于Taq pol没有E coli pol I的3’→5’外切酶活性区的同源序列，故Taq pol无3’→5’外切酶活性。因此，Taq pol不具有Klenow酶的校对功能，在其催化的PCR扩增过程中引起碱基错配的机率大大增加。通常，Taq pol在PCR反应出现碱基错配的机率为1/300~1/18000，在经过25轮扩增后，扩增产物的序列中每400个碱基就有一个与原始序列不同。
4. 逆转录活性： Mg2+在2~3mmol/L的浓度下，68℃时使该酶出现类似逆转录酶的活性。若有Mn2+存在时，其逆转录活性更佳。有报道，若反应体系中没有Mn2+，则不能进行150~250个核苷酸以上核酸的逆转录反应。利用这一特性，可以直接用于RT-PCR，尤其是短片段的扩增。
5. 非模板依赖的聚合活性：Taq pol具有类似脱氧核糖核酸末端转移酶(TdT)的活性，可在新合成的双链产物的3’端加上一个非模板依赖的碱基。在四种dNTP中，该酶对dATP的聚合能力最高。所以，在标准PCR反应条件下，PCR产物的3’端的非模板依赖的碱基几乎总是A。利用这一特性，我们可以构建dT-载体来克隆带dA尾的产物。用Klenow酶可以将3’端的非模板依赖的聚合碱基去掉，即在PCR反应后，先加热至99℃10min灭活Taq pol，然后调整Mg2+浓度至5~10mmol/L，加入1~2U大肠杆菌DNA聚合酶I Klenow片段，室温下作用15~20min。
作者: 荷塘青蛙！ 时间: 2011-8-24 16:19

耐热DNA聚合酶能经受95℃以上的高温而不失活，因而无需在每轮循环中添加新酶；同时它催化的聚合反应的最适温度为70~80℃，此时引物与模板结合的特异性好，故产物的纯度高。现在已发现多种耐热DNA聚合酶，其共同特点是在高温下仍保持一定的酶活性，但各耐热DNA聚合酶的性能尚有一定的差别。目前在PCR反应中应用最多的是Taq pol。
(一) Taq DNA聚合酶
天然的Taq pol是从嗜热水生菌thermus aquatics YT-1菌株中分离获得的。该菌株在1969年就从美国黄石国家公园的温泉中分离出来，能在70~75℃生长。现已克隆出该酶的基因，全长2499个碱基，编码分子量为94kD、长度为832个氨基酸的蛋白质。现将Taq pol的特点叙述如下：
1. 高热稳定性：Taq pol在92.5℃、95℃、97.5℃的半衰期分别为130min、40min和5~6min。在PCR反应中DNA变性时间通常为30~60s，若总共进行30轮循环累计热变性时间为15~30min，此时该酶仍然保持相当高的活性，完全可以保证PCR反应的需要。
2. 高催化活性：在已发现的耐热DNA聚合酶中，Taq pol的活性最高，达200,000U/mg。实验证明Taq pol的活性有明显的温度依赖性，Taq pol催化DNA合成的最适温度为75-80℃，此时延伸速率达150~300个核苷酸/秒/酶分子；70℃时为60个核苷酸/秒/酶分子；55℃时为22个核苷酸/秒/酶分子；37℃和22℃时分别为1.5个和0.25个核苷酸/秒/酶分子。当温度超过80℃时，几乎没有DNA的合成，可能与高温下引物和模板结合的稳定性遭到破坏有关。
3. 忠实性：序列分析表明Taq pol与Ecoli pol I N端区域(此区域与该酶具有5’→3’外切酶活性有关)高度同源，因此Taq pol亦有5’→3’端的外切酶活性。然而由于Taq pol没有E coli pol I的3’→5’外切酶活性区的同源序列，故Taq pol无3’→5’外切酶活性。因此，Taq pol不具有Klenow酶的校对功能，在其催化的PCR扩增过程中引起碱基错配的机率大大增加。通常，Taq pol在PCR反应出现碱基错配的机率为1/300~1/18000，在经过25轮扩增后，扩增产物的序列中每400个碱基就有一个与原始序列不同。
4. 逆转录活性： Mg2+在2~3mmol/L的浓度下，68℃时使该酶出现类似逆转录酶的活性。若有Mn2+存在时，其逆转录活性更佳。有报道，若反应体系中没有Mn2+，则不能进行150~250个核苷酸以上核酸的逆转录反应。利用这一特性，可以直接用于RT-PCR，尤其是短片段的扩增。
5. 非模板依赖的聚合活性：Taq pol具有类似脱氧核糖核酸末端转移酶(TdT)的活性，可在新合成的双链产物的3’端加上一个非模板依赖的碱基。在四种dNTP中，该酶对dATP的聚合能力最高。所以，在标准PCR反应条件下，PCR产物的3’端的非模板依赖的碱基几乎总是A。利用这一特性，我们可以构建dT-载体来克隆带dA尾的产物。用Klenow酶可以将3’端的非模板依赖的聚合碱基去掉，即在PCR反应后，先加热至99℃10min灭活Taq pol，然后调整Mg2+浓度至5~10mmol/L，加入1~2U大肠杆菌DNA聚合酶I Klenow片段，室温下作用15~20min。
作者: 荷塘青蛙！ 时间: 2011-8-24 16:20

(二) 其它耐热DNA聚合酶
目前已经发现了多种耐热DNA聚合酶，并对它们的特性进行了研究，同时人们还致力于对现有的耐热DNA聚合酶的修饰改造，以获得更好的性能，从而提高PCR的产量和质量。目前，主要有从嗜热栖热菌(T. thermophilus)中分离的Th DNA聚合酶、从litoralis栖热球菌(T. litoralis)中分离的Vent DNA聚合酶、从酶热硫化裂片菌中分离出的Sac DNA聚合酶以及修饰Taq DNA聚合酶等。现将其特点分述如下：
1. 修饰Taq DNA聚合酶：常见的有重组Taq pol(rTaq pol.)和Stoffel片段。重组Taq pol为Letus公司利用基因工程在大肠杆菌中表达的Taq pol，其热稳定性比天然Taq pol要好，97.5℃时的半衰期达10min，此外Taq pol的热稳定性还与KCl的浓度有关，KCl的浓度分别为50mmol/L、25 mmol/L和10 mmol/L时，97.5℃保温10min后，Taq pol的活性分别下降50%、70%和80%。Stoffel等人首先通过除去Taq pol N端的289个核苷酸得到一种无5’→3’外切酶活性的61000的酶蛋白，故将其称为Stoffel片段。Stoffel片段的热稳定性极佳，97.5℃的半衰期达到了20min，比Taq pol延长了两倍多，利用此酶可以提高PCR反应中的变性温度，这对于扩增GC丰富的模板及具有二级结构的模板极为有利。同时由于Stoffel片段的Mg2+浓度作用范围增大为2~10mmol/L，故运用Stoffel片段可以改善复合PCR的反应结果。
2. Th DNA聚合酶：该酶从嗜热栖热菌(T. thermophilus)中分离得到，在高温和MnCl2存在的条件下，能有效的转录RNA。当螯合了Mn2+后再加入Mg2+，则可以使该酶的聚合活性增加，因此cDNA的合成与扩增可以用同一种酶催化。此外该酶对抑制Taq pol的血液成份的耐受力较强。
3. Vent DNA聚合酶：New England Biolabs公司从海底火山口 98℃水中生长的Litoralis栖热球菌中分离提纯得到Vent DNA聚合酶，并在大肠杆菌中成功的表达了该酶。此酶的热稳定性极好，97.5℃下的半衰期长达130min。此外Vent DNA聚合酶还具有3’→5’外切酶的活性，因此在催化DNA合成时具有校正功能，从而有效的降低碱基错误掺入率，提高扩增的忠实性。其碱基错误掺入率为1/31000，扩增产物的忠实性比Taq pol提高5~10倍。
4. Sac DNA聚合酶：该酶是从酶热硫化裂片菌中分离纯化得到的，其Mg2+的浓度作用范围较大，为2~8mmol/L，故有利于复合PCR反应的进行。此外，Sac DNA聚合酶也可用于DNA测序，但测序中ddNTP/dNTP的比率要高。此外，该酶还可以用于基因的定点融合等。
5. Pfu DNA聚合酶：Pfu DNA聚合酶是从Pyrococcus furisus菌体中提纯的，该酶具有5’→3’聚合酶活性及3’→5’外切酶活性，故此酶具有校正功能，其催化DNA合成的忠实性要比Taq pol高12倍。此外，Pfu DNA聚合酶的耐热性极好，97.5℃的半衰期大于3小时。由于在无dNTP存在时Pfu DNA聚合酶会降解模板DNA，故在反应时此酶一定要最后加到反应体系中。然而，由于该酶采用低盐缓冲溶液(20mmol/L Tris-HCl，pH 8.2，10 mmol/L KCl，6mmol/L (NH4)2SO4，1.5mmol/L MgCl2，0.1% Triton x-100，10ng/ul BSA)，故退火温度较低，在37℃~45℃之间。
我国的PCR技术发展和应用十分迅速，现在复旦大学、中国医科院、华美公司均能生产耐热DNA聚合酶，耐热DNA聚合酶的国产化对推动我国PCR技术的发展、普及起着极其积极的作用。
作者: 荷塘青蛙！ 时间: 2011-8-24 16:21

七、 PCR促进剂
据报道通过向PCR反应体系中加入助溶剂和添加剂，可以降低碱基错配水平，提高富含GC模板的扩增效率。助溶剂包括甲酰胺(formamide)、二甲基亚砜(dimethylsulfoxide，DMSO)和甘油(glycerol)；添加剂包括氯化四甲基铵(tetramethylammonium chloride，TMAC)、谷氨酸钾(potassium glutamate)、硫酸铵(ammonium sulfate)、离子化及非离子化的除垢剂等。目前关于PCR反应促进剂对扩增效率的影响机制尚不清楚，可能是添加剂消除了引物和模板的二级结构，降低了DNA的解链温度使双链DNA变性完全。同时PCR反应促进剂还增进DNA复性时的特异性配对，增加或改变DNA聚合酶的稳定性等，提高PCR的扩增效率。下面介绍一下几种常见的PCR促进剂：
(一) DMSO
反应体系中加入5~10%的DMSO有利于DNA的变性。使用DMSO对大肠杆菌的DNA聚合酶的Klenow片段是有益的，但是对Taq DNA聚合酶具有抑制作用。
(二) 甘油
反应体系中加入5%~20%的甘油有利于DNA的复性，尤其是对富含G+C的二级结构以及长片段的靶序列的扩增更适用，但需要注意甘油并非对所有的PCR都有益。
(三) TMAC
在反应体系中加入1×10-4~1×10-5mol/L的TMAC可以去除非特异扩增，不抑制Taq DNA聚合酶活性，促进PCR。
大多数PCR促进剂在浓度较高时对PCR反应起抑制作用，故在实验中应根据具体的情况选用适当浓度的PCR促进剂。
第三节 PCR的反应温度和循环参数
PCR反应是一个重复的循环过程，每一循环包括三个阶段的反应，加热而导致模板的变性，变性后寡聚核苷酸引物和与它互补的单链靶序列杂交而退火以及由热稳定DNA聚合酶的介导使已杂交的引物的延伸。
一、变性温度与时间
在PCR反应中，能否成功的使模板DNA和PCR产物变性是反应成败的关键。只有当模板DNA和PCR反应产物完全变性成为单链后，引物才能在退火过程中与模板结合。变性通过加热来实现。变性所需的加热温度取决于模板及PCR产物双链DNA中的G+C含量。双链DNA中的G+C的比率越高，则双链DNA分离变性的温度也就越高。变性所需的时间与DNA分子的长度相关，DNA分子越长，在特定的变性温度下使双链DNA分子完全分离所需的时间就越长。若变性温度太低或变性时间太短，则只能使DNA模板中富含AT的区域产生变性，当PCR循环中的反应温度降低时，部分变性的DNA模板又重新结合成双链DNA，从而导致PCR的失败。
二、退火的温度与时间
退火的温度决定着PCR反应的特异性。引物与模板复性所需的退火温度与时间取决于引物的碱基组成、长度和浓度。引物长度越短、G+C的比率越低，所需的退火温度就越低。一般来说，降低退火温度可提高扩增产量，但引物与模板间错配现象会增多，导致非特异性扩增上升；若提高退火温度可减少引物与模板间的非特异性结合从而提高反应的特异性，但扩增效率下降。退火温度确定后，退火的时间并不是关键性的因素，但也应加以控制。退火时间过短，会导致延伸失败；而退火时间太长会增加引物与模板间的非特异性结合。
作者: 荷塘青蛙！ 时间: 2011-8-24 16:21

三、延伸温度与时间
延伸的温度取决于所使用的DNA聚合酶的最适温度，一般延伸的温度设定在所用的DNA聚合酶的最适温度附近以获得最大的扩增效率。不合适的延伸温度不仅影响扩增产物的特异性，也会影响其产量。延伸的时间视待扩增DNA片段的长度而定。在最适温度下，核苷酸的掺入率为35~100个核苷酸/秒，故延伸1min对于2kb的扩增片段已经足够，延伸时间过长会导致非特异性扩增带的出现。
四、循环次数
循环次数决定着扩增的程度。在其它参数都已优化的前提下，循环次数取决于最初靶分子的浓度。循环次数过多会增加非特异性产物量及碱基错配数，此外还会导致PCR反应“平台效应”的出现；循环数太少会影响正常的PCR产物量。
第四节 PCR反应条件的优化
特异性、有效性和忠实性是检验PCR扩增效率的三个指标。PCR的高特异性是指PCR反应只产生预期的靶序列。PCR的有效性是指经过相对较少的PCR循环能获得更多的产物。而PCR的忠实性则是指PCR反应的精确性，其产物中几乎没有由DNA聚合酶诱导的碱基错配。理想的PCR反应应该体现高度特异、高效和忠实。研究表明这三个参数都受到PCR反应体系中的众多成分及反应参数的影响，并且使PCR反应获得高度特异性、高度忠实性、高产量的条件并不一致。因此，我们在建立PCR反应时，必须明确哪一个参数对于预期的扩增是最为重要的，并据此优化反应条件。本节将讨论如何根据预期的指标优化PCR反应体系的各参数以及如何评价PCR反应的忠实性。
一、 PCR反应条件的选择
(一) PCR反应体系成分
1. 模板核酸：模板核酸可以为多种形式的DNA，但是必须预先纯化以除去蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制剂以及能与DNA结合的蛋白质。理论上，要获得最好的特异性及忠实性的扩增最好只向反应体系中加入单一拷贝的靶序列DNA作为模板，但其PCR产量较低。实验表明，在一定范围内PCR的产量随模板的浓度的升高而显著升高。为了获得较高的产量同时保证较高的反应特异性，通常PCR反应的模板加入量为102~105拷贝的靶序列。需要指出的是，扩增相同拷贝数的靶序列时，向PCR反应体系中加入的含靶序列的模板核酸的量是不同的。例如，3×105单拷贝的靶分子相当于1µg人基因组DNA、10g酵母DNA和1ng大肠杆菌DNA，而1% M13噬菌体相当于106靶分子。
以质粒DNA和以染色体DNA为模板时的扩增最适条件是不同的。前者在PCR反应中所需要的酶量少，循环数少，温度也不如染色体DNA要求严格。
扩增靶序列的长度根据不同的目的而不同。例如，用于检测目的基因的扩增片断长度一般在500bp以内，一般100~300bp为最佳，然而，在适当的条件下，例如使用较长的延伸时间，可扩增长达10~20kb的片段。
2. 引物：PCR反应所需的引物质量要高，且需纯化，否则引物中相当数量的“错误序列”将导致非特异性扩增和信号强度降低。通常引物设计应与模板精确互补，然而少数情况下在另外一些扩增中，如等位基因PCR、突变工程或在基因组的特定区引入新的限制性内切酶核酸酶切位点以及序列不清楚地同源基因的克隆，需要有目的的或是不可避免的引入错配碱基。由于引物与模板的结合不可能是完全特异性的，为了减少引物与模板的非特异性结合、提高PCR的特异性，引物序列应该从基因的内含子区域选择。引物的设计要遵循一定的原则，具体可参见第二节。PCR反应体系中引物的浓度一般为0.1~0.5µmol/L，在此范围内，PCR的产物量基本相同。若引物量过低会导致PCR产物量降低，而如果引物量过高，则会引起碱基错配和非特异性的扩增、生成引物二聚体，从而使目的DNA片段的扩增量下降。通常引物应当10倍量于靶序列。此外，引物的Tm值与退火温度相关，故引物的Tm最好在55℃~80℃的范围，以接近72℃为最佳。
作者: 荷塘青蛙！ 时间: 2011-8-24 16:22

3. 反应缓冲系统：目前最为常用的缓冲体系为Tris-HCl缓冲液。通常在缓冲液中加入50mmol/L以内的KCl以利于引物的退火，高于此浓度的KCl或NaCl会抑制Taq pol的活性，在有些缓冲系统中可以用16.6mmol/L的NH4+代替K+。此外还可向反应体系中加入小牛血清白蛋白(100µg/L)或明胶(0.01%)或Tween-20(0.05~0.1%)或二硫基苏糖醇(DDT，5mmol/L)等以保护Taq pol。尽管上述缓冲液适用于大多数的模板和寡核苷酸引物，但对于特定PCR的最佳缓冲条件还是随着模板、引物及反应液中其他成分的不同而不同。因此这里所谓的标准缓冲条件只能作为探索进一步的改进PCR反应体系的基础。
4. 二价阳离子(Mg2+)：耐热DNA聚合酶的活性依赖于反应体系中的二价阳离子。已经表明，对于提高耐热DNA聚合酶的活性，Mg2+优于Mn2+，而Ca2+则无效。研究表明，若反应体系中Mg2+浓度过低会显著降低酶的活性，而Mg2+浓度过高时又使酶催化非特异性扩增增强。此外Mg2+浓度还会影响引物的退火、模板与PCR产物解链的温度，从而影响扩增片段的产率。由于在PCR反应体系中的模板DNA、dNTP、引物中的磷酸基团均可与Mg2+结合从而降低反应体系中的游离Mg2+的浓度，而耐热DNA聚合酶需要的是游离的Mg2+，因此一般Mg2+的加入量应比dNTP的总浓度高0.2~2.5mmol/L。在不同的反应体系中模板DNA、引物以及dNTP的量各不相同，因此应根据具体的情况来确定特定PCR反应体系中的Mg2+的最适浓度。例如，虽然通常使用的Mg2+浓度为1.5mmol/L，然而也有报道使用高达4.5 mmol/L或6 mmol/L的Mg2+以降低某些情况下的非特异性的扩增。现在很多公司(例如Invitrogen、Peikin-Elmer和Stratagence)出售缓冲系统优化工具包，这些工具包含有各种各样的缓冲系统组合以方便实验者能迅速的找出对于特定的模板核酸和引物组合的最佳缓冲系统。此外我们还可以用下面的方法优化Mg2+浓度。在确定模板DNA的量、引物、dNTP的浓度以及PCR的循环参数的前提下，从10mmol/L的Mg2+储存液中，将Mg2+的加入量以0.5mmol/L递增，逐一加入10支反应管中，即每支反应管中的Mg2+浓度分别为0.5、1.0、1.5、2.0、2.5~5.0mmol/L。根据比较这10支含有不同浓度的Mg2+的反应管的PCR产物的产量，来确定反应体系所需的Mg2+浓度。有时，还可在此基础上，在初步选定的Mg2+浓度范围上下进一步缩小Mg2+浓度范围以0.2mmol/L递增，进一步筛选以获得最佳Mg2+浓度。
5. 三磷酸脱氧核苷酸：PCR反应体系中的四种dNTP的浓度应当相等，以使错误掺入率降至最低。适宜浓度的dNTP对于获得理想的PCR反应尤为重要。dNTP的浓度过高可加快反应速度，同时也增加了碱基错配率和实验成本；降低浓度可导致反应速度下降，但可提高反应的特异性。通常的PCR反应体系中，dNTP的浓度应在20~200µmol/L之间，在此范围内，PCR的产量、特异性和忠实性之间的平衡最佳。dNTP的浓度取决于PCR反应体系中的特定靶序列的长度，据此我们可以确定反应体系中的dNTP的最低适宜浓度。如在100µl反应液中，当每种dNTP的浓度为20µmol/L时，理论上可以扩增出2.6µg的400bp的DNA。有报道，应用每种浓度低至2µmol/L的dNTP可以成功的检出107拷贝的DNA分子中的一个ras点突变。但如此低浓度的dNTP在常规的PCR反应中应当避免，因为保持四种dNTP的浓度在其Km值(10~15µmol/L)以上，对保持碱基掺入的忠实性是极为重要的。当dNTP的浓度大于50mmol/L时会抑制Taq pol的活性。需要注意的是dNTP与Mg2+之间的浓度关系。因为dNTP中的磷酸基团可与Mg2+结合，使反应体系中游离Mg2+浓度下降从而影响DNA pol的活性。
作者: 荷塘青蛙！ 时间: 2011-8-24 16:22

6. 耐热DNA聚合酶：耐热DNA聚合酶在PCR反应中起着关键的作用，因此PCR反应体系中耐热DNA聚合酶的选择及其用量显得尤为重要。目前用于PCR的耐热DNA聚合酶已有多种，其中最常用的仍然是Taq DNA聚合酶。下面讨论的情况将以美国PE-Cetus公司生产的Taq DNA聚合酶为依据。Taq pol的活性对Mg2+、K+、NH4+等离子的浓度较敏感。Taq pol是Mg2+依赖性酶因而对Mg2+的浓度最为敏感。以蛙鱼精DNA为模板，dNTP的总浓度在0.7~0.8mmol/L，使用不同浓度的Mg2+进行反应10min，结果表明，Mg2+浓度在2.0mmol/L时酶的活性最高，若Mg2+浓度偏高时，则酶的活性将受到抑制。需要注意的是由于PCR反应体系中的模板DNA、引物以及dNTP均可与Mg2+结合，因此Mg2+浓度在不同反应体系中应适当调整。K+的最适浓度为50mmol/L，高于75mmol/L时PCR反应明显受到抑制。50mmol/L的NH4Cl对Taq pol的活性中等抑制。50mmol/L的NaCl可以提高Taq pol的活性20%~30%。由于Taq pol没有校正阅读功能，在扩增过程中可引起碱基错配，通常可应用低浓度的dNTP(各20µmol/L)、1.5mmol/L的Mg2+浓度、高于55℃的复性温度，可提高Taq pol的忠实性。此时的平均错配率仅为5×10-6次/核苷酸循环(通常30次循环的Taq pol的错配率约为0.25%)。Taq pol在PCR反应体系中的加入量也很重要，若酶量过少会影响靶序列扩增产量，而过多则会导致非特异性的扩增。在其它参数最佳的时候，每100µl反应液中加入1~2.5U的Taq pol为最佳。然而，酶的需要量可根据不同的模板分子或引物而变化。此外不同的变性剂对Taq pol的影响不同(如表1-1)，由于有时需要向PCR反应体系中加入一定浓度的DMSO、甲酰胺等作为PCR反应促进剂，以改善反应的扩增效率及特异性，因此，当PCR反应体系中存在Taq pol的抑制剂时，应适当的调整Taq pol的用量。另外不同厂家生产的酶的性能及质量也有所不同，因此在实际情况下应当根据PCR反应体系中特定的模板分子和引物、反应体系中的Taq pol抑制剂对不同厂家生产的不同批次的Taq pol进行优化。通常在100µl的反应体积中加入0.5~5U酶的范围内试验酶的最佳浓度。
目前，Taq pol仍然是常规扩增小片段DNA首选的耐热DNA聚合酶。然而在其它一些特殊情况下(例如当要求较高的PCR反应忠实性时，当待增模板DNA的长度超过数千碱基对时，或当使用RT-PCR技术克隆mRNA时)，其它耐热DNA聚合酶与Taq pol相比具有显著的优点。因此，我们应当根据具体实验的目的来选择特定的耐热DNA聚合酶。例如，当实验的目标是获取一个目的基因的真实拷贝时，就需要选择具有校正阅读功能的聚合酶；然而当实验的目标是克隆一个扩增产物时，能够产生平端切口的聚合酶也许是最佳的选择。然而，当两种或者更多的DNA聚合酶混合在一起使用时能够显著的提高PCR反应的扩增产量，尤其当反应模板核酸为长链DNA时更为明显。这可能是由于各种聚合酶功能上的互补作用使其能够更加容易的使引物延长链顺利地通过模板链上的各种潜在的障碍(包括模板链上的高度二级结构、缺乏末端转移酶活性的聚合酶无法连接的模板链缺口以及使无校正阅读活性的聚合酶停滞并与引物模板杂交链脱离的错配碱基对)。现在许多厂商出售混合配方的耐热DNA聚合酶，以获得在特定的反表(1-1) 变性剂对Taq pol活性的影响
作者: 荷塘青蛙！ 时间: 2011-8-24 16:23

变性剂  浓度  活性（%）
乙醇  ≤3%10%  100110
尿素  ≤0.5mol/L1.0mol/L1.5mol/L2.0mol/L  10011810782
DMSO  ≤1%10%20%  1005311
DMF  ≤5%10%20%  1008217
甲酰胺  ≤10%15%20%  1008639
SDS  0.001%0.01%0.1%  10510<0.1

应体系中所需要的性能。例如，Tbr和Taq聚合酶混合制剂(商品名为DyNA酶(MJ Research Inc.)，同时具有Tbr聚合酶的校正阅读功能和Taq聚合酶的高扩增效率的特性。相似的还有Taq和Pfu聚合酶的混合剂(商品名为Stratagene和Boehringer Mannheim)，能使长达35kb的长链模板核酸的PCR反应获得高产量的扩增产物。(表1-2)总结了几种常见的商品化的耐热DNA聚合酶的性能，以利于我们根据具体需要选择适合的聚合酶。
7. PCR反应促进剂：在有些情况下，可以向PCR反应体系中加一些助溶剂：例如甲酰胺(formamide)、二甲基亚砜(dimethylsulfoxide，DMSO)、甘油(glycerol)和一些添加剂：如氯化四甲基铵(tetramethylammonium chloride，TMAC)、谷氨酸钾(potassium glutamate)、硫酸铵(ammonium sulfate)、离子化及非离子化的除垢剂等，以降低碱基错配率或提高PCR反应的扩增效率。这些助溶剂和添加剂即为PCR反应促进剂。大多数的PCR反应促进剂在高浓度时将会抑制PCR反应，见(表1-3)。因此在具体实验中应根据PCR反应体系中特定的模板DNA和引物的结合情况来决定PCR反应促进剂的最适浓度。通常在优化PCR反应体系时，应当首先考虑优化反应体系中的常规组成成分，尤其要考虑Mg2+和K+的浓度。
下面简要介绍几种常见的PCR反应促进剂的优化使用：
(1) DMSO：DMSO有变性DNA的作用，使用10%的DMSO对大肠杆菌DNA聚合酶Klenow I片断是有益的，但是对Taq DNA聚合酶有抑制作用，因此在一般反应中应尽量不用DMSO。然而，在复合PCR中可以用。
(2) 甘油：在反应体系中加入5%~20%的甘油有利于PCR反应中的复性，尤其对GC含量高和二级结构多的靶序列以及扩增片段较长的PCR反应中更为适用。但DMSO和甘油并非对所有的PCR反应都有益，应当根据实验的具体情况确定是否在反应体系中加入这些试剂。
(3) TMAC：在反应体系中加入1×10-4~1×10-5mol/L的TMAC可促进PCR反应，去除非特异性扩增而不抑制Taq DNA聚合酶。
(4) T4噬菌体基因32蛋白质(gp32)：向PCR反应体系中加入0.5~1µl的gp32(1mmol/L)可改善DNA聚合酶对长片段DNA的扩增。
(二) 循环参数
1. 变性：变性的温度取决于模板DNA分子的G+C含量和DNA聚合酶的热稳定性，而变性的时间与模板DNA链的长度及DNA聚合酶的热稳定性有关。在90℃~97℃的温度范围内，即使再复杂的DNA分子也可以变性成为单链。通常的变性温度和时间分别为95℃、30秒，有时用97℃、15秒。温度过高且时间
过长，Taq DNA聚合酶易失活且dNTPs破坏增多，从而对PCR反应产生不良影响。尽管DNA在其链分解温度(strandseparation temperature，Tss)时的变性只需几秒钟，然而要使反应管内部达到Tss还需要一定的时间，因此需要延长变性时
作者: 荷塘青蛙！ 时间: 2011-8-24 16:24

表(1-2)常见耐热DNA聚合酶的性能和使用条件
DNA聚合酶  供应商  来源  最适温度(℃)  外切酶活性  忠实性  稳定性(特定温度下活性保留时间)  缓冲液/pH(mmol/L)  盐浓度(mmol/L)  二价阳离子浓度(mmol/L)  其他附加成分
Taq DNA聚合酶  BM,LT,Pro,Start,P-E,T  T.aquaticus  75~80  5'→3'  低  97.5℃，9min  10 Tris-HCl/8.3  50 KCl  1.5~5.0MgCl2  BSA,NP-40,Tween20
Stoffel片段  P-E  T.aquaticus  75~80  无  低  97.5℃，21min  10 Tris-HCl/8.3  10 KCl  2.0~10.0MgCl2  BSA,Tween21
rTth DNA聚合酶  BM,ET,P-E  T.thermophilus  75~80  5'→3'  低  95℃，20min  10 Tris-HCl/8.3  90 KCl  -
Tfl DNA聚合酶  Pro  T.flavus  70  无  低  70℃，120min  50 Tris-HCl/9.0或20 Tris-醋酸/9.0  20（NH4）2SO4,70 醋酸钾  DNA合成1.5~5..0 MgCl2，反转录酶活性1.5~5.0MnSO4  0.5%Tween20在Mn存在时有较强的反转录酶活性
Hot Tub DNA聚合酶  Amr  T.ubiquitus 无  低 50 Tris-HCl/9.0  20（NH4）2SO4,  0.7~2.0MgCl2
Tbr DNA聚合酶  Amr,Finnz  T.brockianus  75~80  5'→3'  低  96℃，150min  10 Tris-HCl/8.8  50 KCl  1.5~5.0MgCl2  Triton X-100
UlTma DNA聚合酶  P-E,Roche  Thermotoga maritima  75~80  3'→5'  高  95℃，50min  10 Tris-HCl/8.8  10 KCl  1.5~5.0MgCl2  Tween20
rBst DNA聚合酶  ET  Bacillus sterothermophilus  60~65  5'→3'，3’→5’
Isotherm Bst大片段  ET,Bio-Rad  Bacillus sterothermophilus  60~65 低
Pwo DNA聚合酶  BM  Pyrococcus woesei  60~65  3'→5'  高  100℃，>2小时  10 Tris-HCl/8.85  20（NH4）2SO4,  1.5~4.0MgSO4  BSA,不能用dUTP
Tli DNA聚合酶  Pro  Thermococcus litoralis  70~80  3'→5'  低  100℃，100min  10 Tris-HCl/9.0  50 KCl  1.5~5.0MgCl2  Triton X-100
Deep Vent DNA聚合酶  NEB  Pyrococcus strain GB-D  70~80  3'→5'  高  100℃，480min  20 Tris-HCl/8.8  10 KCl，10（NH4）2SO4,  1.5~5.0MgSO4  Triton X-100
Pfu DNA聚合酶  Start  Pyrococcus furiosus  72~78  3'→5''  高  95℃，240min  20 Tris-HCl/8.2  10 KCl，6（NH4）2SO4,  1.5~2.5MgCl2  BSA,Triton X-100
酶供应商：BM：Boehinger Mannheim，ET：Epicenter Technologies，LT：Life technologies，Pro：Promega，NEB：New England Biolabs，P-E：Perkin-Elmer，T：TaKaRa，Start：Stratagene，Amr：Amresco，Finnz：Finnzymes OY

表(1-3) 影响PCR反应的PCR反应促进剂的浓度
名称  抑制  促进
DMSO  >10%  5%
PEG  >20%  5~15%
甲酰胺  >10%  5%
甘油  >20%  10~15%
Tween 20  未测定  0.1%~2.5%
作者: 荷塘青蛙！ 时间: 2011-8-24 16:25

间。通常在加入耐热DNA聚合酶之前先使模板在97℃下变性7~10min，再按94℃或95℃的温度进入循环。通常G+C含量约为55%的线性模板DNA分子的变性温度和时间为94~95℃45秒。此外在实际情况下，应根据模板DNA分子中的G+C的含量，耐热DNA聚合酶(表1-2)以及模板链的长度适当的调整变性的温度和时间。例如，当待增靶序列中的GC含量较高时，可以适当的提高变性温度或延长变性时间以利于模板DNA充分变性；当扩增较长的模板DNA时应当适当延长变性时间以保证模板DNA彻底变性；而扩增100~300bp的短片段时，可用简便、快速的两步PCR法，同时在5~10个循环后，可将变性温度降至87℃~90℃以改善PCR的产量。此外，由于环状DNA复性太快，通常待扩增的环状质粒DNA模板在扩增前最好先酶切线性化。为防止PCR反应液在变性温度下蒸发，可在反应管中加入1~2滴液体石蜡。
2. 退火：退火的温度取决于引物的碱基组成、长度和浓度。合适的退火温度对于PCR的特异性尤为重要。一般来说，较低的退火温度可提高PCR反应的敏感性但其特异性较差，而较高的退火温度则可提高PCR反应的特异性但却降低了其扩增效率。合适的退火温度应低于引物Tm值5℃左右。通常引物与模板的退火温度在45~55℃之间，一般情况下在Tm值允许的范围内选择偏高的退火温度以提高PCR反应的特异性。PCR反应体系的实际退火温度应根据所要求的PCR反应的特异性和灵敏度做出相应的调整。尽管有很多的公式可以用于计算引物的Tm值，然而这些公式并不是对所有长度的引物都适用，即对于每一特定引物我们并不能精确的计算出其Tm值。因此，优化退火温度的最理想的方法是设置一系列的对照反应。即通过在低于计算出的引物Tm值2℃到10℃的温度范围内进行退火的一系列平行反应来确定最佳退火温度。此外我们还可以通过在低于计算出的引物Tm值2℃到10℃的范围内由高到低的设定同一反应体系中连续的不同循环的退火温度从而确定最佳退火温度，这种方法避免了同时作多个平行实验的繁琐操作，并且避免了由于各平行实验中实验条件的差异带来的误差。在实际应用中不少研究者使用降落PCR的方法来确定最佳退火温度。退火温度一旦确定，退火的时间并不是关键性的因素，但退火时间太长会增加非特异性的复性从而降低反应的特异性，此外退火时间也不能太短，否则将导致引物模板复性不完全。
3. 延伸：尽管耐热DNA聚合酶可在较宽的温度范围内催化合成DNA，但是不合适的延伸温度仍可对扩增产物的特异性和产量造成影响。延伸温度取决于所使用的耐热DNA聚合酶的最适作用温度，一般为70~75℃。耐热DNA聚合酶在最适作用温度下可以获得最大的碱基掺入率，然而DNA聚合酶的碱基掺入率还受到所用的缓冲溶液、pH值、盐浓度、模板DNA性质的影响。当使用Taq DNA聚合酶时，通常延伸温度设定为72℃。延伸时间取决于待扩增DNA片段的长度，在72℃时，Taq DNA聚合酶的碱基掺入率为35~100bp/秒，因此延伸速率为1kb/分。通常扩增1kb以内的DNA片段延伸1min即可，而当待增序列长达3~4kb时，则需延长3~4min；然而当扩增小于150bp的片段时则可以省略延伸步骤，因为在退火温度下Taq DNA聚合酶的活性已足以完成靶序列的合成。通常在PCR的最后一轮循环中可以适当的将延伸时间延长至4~10min，以使PCR反应完全提高扩增产量。此外在实际操作中，应注意在前几轮循环中的延伸时间要足够，以使靶序列延伸完全从而提高PCR反应的特异性。此外当待扩增DNA的浓度较低时，由于碱基掺入率较低，可适当的延长反应延伸时间。
作者: 荷塘青蛙！ 时间: 2011-8-24 16:26

4. 循环次数：PCR反应的循环次数和引物延伸效率决定着PCR反应的扩增程度。在其它条件已经优化的前提下，PCR反应的循环次数取决于待增靶序列的初始浓度。例如，当待增靶序列数分别为3×105、1.5×104、1×103和50拷贝分子时，最适循环数分别为25~30、30~35、35~40和40~45次。在PCR反应中，当扩增双链DNA中的一个小片段时，从第三次循环中扩增所需要的平端片段第一次出现开始，扩增产物依公式Nf=No(1+Y)n呈指数的形式积累，即PCR反应指数期。公式中Nf是靶序列的最终拷贝数，No 是最初拷贝数，Y是每轮循环的引物的延伸效率，n是扩增条件下的PCR循环数。在大多数情况下，一旦目的片段的最终拷贝数达到1012后，每次循环的效率就开始急剧的降低，此后产物不再以指数形式积累，PCR反应指数期终止。由于每一循环引物的延伸效率取决于反应体系中的耐热DNA聚合酶的性质，因此效率降低表明DNA 聚合酶已成为反应的限制因素。在PCR反应指数期内待扩增序列得到了最大限度的扩增，并且此期内靶序列的非特异性扩增极少并几乎可以忽略，而在此期以外的非指数期的PCR常常会导致非特异扩增、小的缺失或突变体的出现。因此PCR的许多应用都严格要求在PCR的指数期完成。一般情况下循环次数在25~40次之间，循环次数过多将导致非特异性扩增产物的增加，降低PCR反应的特异性；而循环数过少又会使PCR反应产量过低。在实际应用中，1012拷贝的特定序列足以满足分子生物学的绝大多数应用。同时，许多的实验室研究了PCR所用的不同的DNA聚合酶的效率(表1-4)，故只要知道反应体系中靶序列的最初拷贝数，就可以根据上述的公式计算出使最终拷贝数达到1012所需要的循环数。
(三) 其他因素
1. 热起动(hot start)：在PCR反应的第一次循环时，反应体系从较低的温度开始升温，由于耐热DNA聚合酶具有较广的作用温度范围，即在较低的温度下耐热DNA聚合酶仍然具有活性，而在反应体系加热的过程中，可能发生模板与引物的非特异性配对，这些非特异性配对可能在较低的温度下由耐热DNA聚合酶在其3’端加上几个碱基形成相对稳定的非特异性引物，在其后的扩增反应中，这些非特异性产物反复大量扩增，最终导致PCR反应严重失败。为了消除这种非特异性的扩增，可以采用热启动的方式，使耐热DNA聚合酶仅在反应体系达到较高的温度(>70℃)时才发挥作用。这种方法可以大大的提高PCR反应的特异性和敏感性。此外，由于在扩增前加热可以促进引物特异性复性和延伸从而增加了有效引物的长度，故可以减少引物二聚体的形成和引物的自我复性。热起动的方法有几种：一种方法是在PCR反应系统中加入抗耐热DNA聚合酶抗体。抗体与耐热DNA聚合酶结合后，抑制耐热DNA聚合酶的活性。因此，在反应开始时，在较低温度下，虽然可能发生引物和模板的错配，但由于DNA聚合酶没有活性，不会引起非特异性的扩增。此后反应体系温度继续升高，当模板核酸热变性时，抗体在高温下失活，此后耐热DNA聚合酶释放，并在后续的延伸反应中发挥作用，介导特异性的DNA聚合反应。另一种方法使用石蜡将耐热DNA聚合酶与PCR反应系统分隔，因此在较低温度下也不会发生非特异性扩增。当反应体系升温达到热变性温度时，石蜡融化，耐热DNA聚合酶与PCR反应体系混合，从而在以后的步骤中发挥作用。
作者: 荷塘青蛙！ 时间: 2011-8-24 16:27

2. 石蜡油：向反应体系中加入石蜡油的目的是防止反应液蒸发后引起反应体系的体积和成分的改变。石蜡油必须是高质量、无菌的，不能含有抑制PCR反应的成分和污染物。加入的石蜡油的体积要求不太严格，通常以盖住反应液液面为度。
(四) 反应体系中各因素间的相互作用
PCR的循环参数、反应体系中各组分及其它反应条件都是相互影响的，任何因素的改变都将引起其它反应条件的变化，从而直接影响PCR反应的结果。因此PCR反应的结果是以各种反应条件为自变量的多元函数。由于各种不同反应体系都有其最适反应条件，故只有PCR反应体系在最适反应条件下，方能达到最佳扩增结果。

表(1-4) 常见耐热DNA聚合酶不同条件下的效率、错误率和最适循环数
酶  dNTP(mmol/L)  pH  Mg2+(mmol/L)  每循环的效率(%)  错误率(错误/掺入碱基对)  PCR引起的突变  需要的循环数
pfu  0.1  8.4  1.5  60  7×10-7  0.3  30
Vent  0.5~1.5  85  75  70  4.5×10-5  16  26
Taq  0.5~1.5  8.0  5  36  7.2×10-5  25  45
Taq  16.6  8.8  10  88  2×10-4  56  22

二、 PCR反应的忠实性
PCR反应的忠实性即PCR扩增反应的产物的核酸序列应当与待增靶DNA分子的序列高度一致。PCR反应的忠实性是衡量一个PCR反应体系的扩增效率的重要指标之一，因此了解PCR反应的忠实性的特点及其影响因素是极其重要的。
(一) PCR反应的特异性、忠实性和扩增效率的关系
特异性、有效性和忠实性是检验PCR扩增效率的三个指标。特异性指PCR反应的扩增产物之间的一致性，即反应扩增产物的序列是相互一致的。高度特异的PCR反应要求扩增产物中可以检测到的非特异性扩增尽可能少。忠实性指扩增产物的序列与模板DNA的序列相符合的程度。高度的忠实性即PCR扩增产物中几乎没有由DNA聚合酶引起的碱基错配。理想的PCR反应应当是高度特异和忠实的。然而，由于常用的耐热DNA聚合酶没有Klenow片段的校正阅读功能，因此虽然在合理控制反应条件的前提下可以使PCR反应获得高度特异性却不能避免由于耐热DNA聚合酶的特性决定的碱基错配，故有高度特异性的PCR反应的忠实性不一定高。此外，PCR反应体系中的各种成分、循环参数等众多因素都影响着PCR反应的忠实性、特异性和扩增效率，并且使PCR反应获得高度特异性、高度忠实性以及高产量所需要的反应条件并不一致，因此在具体的PCR反应中应优先考虑对预期结果最为重要的参数，在此前提下优化反应条件。例如，在对细胞的均一群体的直接序列分析中，PCR反应的产量和特异性比忠实性更重要，而在研究个别DNA分子或者不均一群体中的稀有突变中，PCR反应的忠实性就显得比其他两个参数重要的多了。
(二) 影响PCR反应的忠实性的因素
PCR反应体系中的各种组成成分以及循环参数等诸多因素对PCR反应的忠实性都有不同程度的影响，其中最为显著的是模板数、dNTP浓度以及聚合酶的种类等。
1. 模板核酸浓度：由于一旦由聚合酶引起的碱基错配被引入，这些错误序列将随着模板的“正常序列”一起呈指数形式扩增。因此，由聚合酶引起的错误序列所占的比例将随着扩增循环数的增加而增大。当使用微量模板DNA进行PCR反应时，将大大的增加由聚合酶引起的错配序列的比例从而影响PCR反应的忠实性。例如，使用Taq pol进行PCR反应，Taq pol的碱基错配率约为10-4。当进行PCR反应的模板数仅为10个拷贝时，虽然碱基错配的发生概率并不高(10-3)，然而一旦发生碱基错配，这种错配将占PCR终产物的10%。而使用大量的模板DNA(105)后，虽然在PCR的第一个循环中将可能引起10个碱基错配(聚合酶仍为Taq pol)，而这些错配只占PCR终产物的1/105。因此，通常在反应体系中加入的模板数应为102~105拷贝。
2. dNTP浓度：研究表明，当反应体系中的dNTP浓度明显低于Km值(dNTP<1µmol/L)或者某一dNTP的浓度低于其它三种的浓度时会增加错配碱基的掺入。由于聚合酶对错误终端的延伸主要依赖于Km值的识别，因此这些错误掺入的碱基有利于链的终止从而有助于保持反应的忠实性。然而，当dNTP浓度过高(>1mmol/L)时则会促进错配碱基的延伸。因此，在PCR反应体系中应采用较高浓度的dNTP，且四种dNTP的浓度应相同。通常，当每种dNTP浓度为10~50µmol/L时，能够最大程度的保持PCR反应的忠实性。
作者: 荷塘青蛙！ 时间: 2011-8-24 16:27

3. 耐热DNA聚合酶：尽管通过优化反应体系中的缓冲液、靶序列等反应条件可以大幅度的提高由Taq、T7和Vent DNA聚合酶介导的PCR反应的忠实性，但是其忠实性还是远差于pfu和T4聚合酶的水平，且聚合酶的一些内在性质对PCR反应的忠实性也有较大影响。因此当对PCR反应的忠实性要求较高时，最好应用具有校正阅读活性的聚合酶。
此外反应体系中的缓冲液等其它反应条件也对PCR反应的忠实性有着较大的影响。在具体的反应中，应根据具体情况优化模板DNA、dNTP、耐热DNA聚合酶和缓冲体系等反应条件，力求最大程度的保持PCR反应的忠实性。
三、平台效应
在PCR反应的后期扩增产物的增加因呈指数方式而变成平坦的曲线，同时出现大量的非特异性扩增，这种现象称为平台效应。平台效应可能与下列因素有关：
1.  随着反应的进行，dNTP和引物的浓度不断的降低。
2.  随着产物的增加，酶对模板的比率降低。
3.  由于变性温度较高，多次循环后酶的活力和dNTP的稳定性逐渐降低。
4.  反应体系中产生的非特异性产物或引物二聚体与反应底物竞争聚合酶。
5.  反应产物在高浓度时变性不完全，影响引物的延伸。
6.  当产物浓度高于10-8mol/L时，可能降低Taq聚合酶的延伸加工能力或引起产物链的分支迁移和引物转换。
7.  酶与PCR的产物结合，使酶分子减少。
因此我们应当控制PCR的循环次数在合理的范围，使反应在指数扩增期内完成。
第五节 PCR产物的检测
PCR反应完成后，必须通过严格的检测分析以确定是否得到准确可靠的特定扩增产物。目前已经发展了许多检测分析PCR扩增产物的方法，在具体实验中我们可以根据具体研究对象和研究目的以及具体实验条件而采用不同的检测法。常见的PCR产物的检测分析法有凝胶电泳法、核酸探针杂交法、酶谱分析法、DNA酶免疫试验法、PCR-酶联免疫吸附法(PCR-ELISA)、颜色互补分析法、序列分析法、PCR-HPLC法、单一核苷酸引物延伸法(SNUPE)、PCR-寡核苷酸连接检测法(PCR-OLA)和单链构型多肽性分析法等。
作者: 荷塘青蛙！ 时间: 2011-8-24 16:28

续上

一、凝胶电泳检测
凝胶电泳是检测PCR产物最常用、最简便的方法。通过凝胶电泳检测，我们可以判断PCR反应扩增产物的大小。根据检测的目的基因不同，PCR扩增后可产生不同大小的扩增片断，如大片断的扩增产物其分子量大，在凝胶电泳中的泳动速度就慢，而小片断的扩增产物在电泳中的泳动速度则快，因此，通过凝胶电泳判断扩增片段的大小就可以满足检测的需要。常用的凝胶电泳有琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳，前者主要用于检测大于500bp的DNA片段，而后者则主要用于检测小片段的DNA。
(一) 琼脂糖凝胶电泳
琼脂糖凝胶电泳是实验室中最常用的PCR产物检测方法，操作简便易行，仅需要少量的扩增产物即可进行检测。其原理是在琼脂糖凝胶电泳时，由于不同大小的DNA分子所带电荷的差异而具有不同的电泳速度，从而在琼脂糖凝胶中分离，然后经溴化乙锭(E染色后在紫外光照射下使其发射荧光从而确定其在凝胶中的位置。与聚丙烯酰胺凝胶电泳相比，虽然琼脂糖凝胶电泳的分辨率较低，但其分离范围较广，从100bp~50kbp。琼脂糖凝胶电泳的检出率在1~10ng DNA以上。
(二) 聚丙烯酰胺凝胶电泳
聚丙烯酰胺凝胶电泳的原理与琼脂糖凝胶电泳相同。与琼脂糖凝胶电泳相比，聚丙烯酰胺电泳具有如下的优点：①分辨率很强，长度仅相差0.2%(即500bp中的1bp)的DNA分子即可分开；②能装载的DNA量远远大于琼脂糖凝胶，多达10µg的DNA可以加样于聚丙烯酰胺凝胶的一个标准样品槽(1㎝×1㎝)而不致显著影响分辨力；③从凝胶中回收的DNA纯度很高。
凝胶电泳检测法，扩增产物显示的方法主要有溴化乙锭(E染色和银染法两种。
二、核酸探针杂交检测
(一) 核酸探针杂交检测法是鉴定PCR扩增产物特异性的一种重要手段，常用的方法有：
1. 点杂交：其基本过程是：首先将扩增的DNA固定到尼龙膜或硝酸纤维膜上，再用放射性或非放射性的标记物标记的探针杂交。
作者: 荷塘青蛙！ 时间: 2011-8-24 16:28

2. 反向斑点杂交：将不同的探针先固定到膜上，然后使用标记的扩增产物杂交。
点杂交在当扩增出现多条带或者存在非特异性扩增掩盖作用时，可用来鉴定扩增产物的特异性，有助于产物的分型方法及法医学鉴定，可以同时检测多个突变位点或多种病原体。
3. Southern杂交：首先从被扩增的DNA片段的中间区域设计一个特异性的DNA探针，并用同位素或生物素等标记。然后采用常规的Southern杂交法，将PCR扩增产物经常规的琼脂糖凝胶电泳后转移到硝酸纤维膜或尼龙膜上，然后与探针进行特异性杂交。该法可以鉴定产物的大小及产物的特异性并且其检测灵敏度可达10ng。
4. 微孔板杂交法：将与PCR产物互补的DNA探针固定于微孔板上作为捕获探针，然后与标记的PCR扩增产物杂交。
5. 微孔板夹心杂交：通过一固定于微孔板的捕获探针与PCR扩增产物的某一区域的特异杂交使产物间接的固定于微孔板上，然后再用另一标记的检测探针与PCR扩增产物的另一区域杂交。这种方法使用两个杂交过程检测一个PCR产物，因此其特异性较一次杂交的强。
(二) 核酸探针的标记可分为放射性标记和非放射性标记两类。
1．放射性标记：常见的放射性核素标记物有P32、H3和S35。放射性核素标记的探针具有高度的特异性和敏感性，可以检出1~10µg的高等生物基因组DNA中的单拷贝基因，然而由于放射性污染限制了其应用。
2. 非放射性标记：常用的非放射性标记物有下述几类：⑴半抗原，例如生物素(biosin)、地高辛等；⑵配体，例如生物素不仅是半抗原，它还是亲和素(avidin)的抗体，故可以使用生物素-亲和素反应进行杂交信号的监测；⑶荧光素，例如异硫氰酸荧光素(FITC)和罗丹明类，可以在紫外光的照射下激发产生荧光；⑷化学发光标记物，即一些可以通过与某种物质反应产生化学发光现象的一类标记物。由于非放射性标记物具有稳定性较好、安全性强的特点，因此通常的核酸探针标记采用非放射性标记物。
三、酶谱分析法
酶谱分析法是鉴定PCR扩增产物特异性的一种简便方法。其原理是首先根据已知的PCR扩增靶序列查出序列中所含有的限制性内切酶的酶切位点，然后选择合适的限制性内切酶消化PCR扩增产物后进行电泳分析，分析比较PCR酶切产物的电泳图谱与已知的序列资料，从而判定PCR扩增产物的特异性。
四、 DNA酶免疫试验法(PCR-EIA)
DNA酶免疫试验法是一种以特异杂交的双链DNA为抗原，与一般标记的抗体进行显色反应从而检测PCR反应扩增产物的技术。其结合了PCR反应扩增的敏感性及酶联免疫反应的简便性的特点，特别适用于同时对大量扩增产物的分析。通常的方法是：将扩增产物与一特异ssRNA探针杂交，通过包被于微孔板内的抗DNA-RNA双链特异的单克隆抗体将杂交体固定于微孔板上，然后再用酶标抗DNA-RNA双链抗体进行酶联显色。
作者: 荷塘青蛙！ 时间: 2011-8-24 16:29

五、 PCR-酶联免疫吸附法(PCR-ELISA)
本法避免了电泳和杂交的步骤，适于常规的ELISA计数仪检测。首先对PCR反应的引物5’端进行修饰，使一个引物的5’端携带便于PCR产物固定的功能基因，如生物素等，而另一个引物的5’端则携带便于酶联免疫检测的功能基因，如酶或抗原、抗体等。通过包被于微孔板中的活性基团(如亲和素)将PCR反应产物固定于微孔板上，然后进行酶联显色检测。该法不仅可以鉴定PCR产物的特异性，而且可以用于PCR产物的定量分析。
六、颜色互补分析法
颜色互补分析法利用三原色原理，当不同的DNA片断同时扩增时，用不同的荧光染料标记不同引物的5’端，经过PCR反应扩增后，带有不同染料的DNA片段由于颜色互补而易于区分。此法简便，可以自动化。可用于检测基因缺失、染色体转位和病原微生物。
七、序列分析法
即将PCR的产物直接进行测序分析，该法是PCR产物分析最精确的方法，但也是最繁琐的方法，最常用的是Sanger双脱氧链终止测序法。本法可以精确的检测基因突变。
八、 PCR-HPLC法
将PCR反应扩增产物通过高效液相色谱(HPLC)仪自动分析，其原理是利用异源双链与同源双链的解链特征不同，在部分热变性的条件下，通过异源双链与同源双链在DNA色谱柱中保留的时间差异，检测DNA的突变，与传统检测基因突变的方法相比，该法具有经济、高效、高通量和自动化的优点，该法还可用于PCR反应产物的分离制备。
九、单一核苷酸引物延伸法(SNUPE)
SNUPE(也可称为引物指导的核苷酸掺入试验)是用于检测PCR扩增产物是否存在已知点突变的一种方法。该法依赖于DNA聚合酶的忠实性，即在引物与模板复性后，DNA聚合酶仅在引物的3’端加上一个与模板正常配对的碱基。因此，可以设计一种引物，使其在与PCR扩增产物杂交后，其3'端紧邻突变位点上游。在SNUPE反应中止后，加入一种已知的放射性或非放射性标记的核苷三磷酸，仅当引物3’端的模板碱基与加入的dNTP 完全配对时，DNA聚合酶才催化延伸一个核苷。然后反应产物可经过电泳分离，就可以很容易的识别延伸的碱基，从而判断碱基的突变情况。此外，也可以向反应体系中加入不同标记的碱基，延伸反应后，可以根据碱基标记物的不同来识别突变的种类。
十、 PCR-寡核苷酸连接检测法(PCR-OLA)
该法用于检测PCR扩增产物中的点突变。其原理是设计两个可与靶序列DNA精确并列杂交的寡核苷酸，使其与PCR反应产物杂交后，用DNA连接酶使其正常配对的相邻的碱基共价连接，而通过调节连接酶和NaCl的浓度可防止错配碱基之间的连接，连接产物可用凝胶电泳鉴定。
十一、单链构型多态性分析法(PCR-SSCP)
该法用于分析PCR产物中的突变和序列多态性。其原理是双链DNA变性后(甲酰胺处理)，单链DNA通过分子内碱基配对重新折叠，单链核苷酸序列的微小变化，包括点突变、缺失和掺入都会影响单链分子的终构象，在非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳时引起电泳迁移率的改变。
作者: 荷塘青蛙！ 时间: 2011-8-24 16:29

第六节 PCR产物的纯化
使用PCR反应完成目标DNA的扩增后，PCR反应的扩增产物可以用于进一步的研究，例如用于DNA测序、PCR产物的克隆、分析基因的功能和表达等。然而，通过PCR反应后反应体系中仍然存在着具有活性的DNA聚合酶，剩余的dNTP、引物以及反应缓冲体系中的各种金属离子等，因此我们必须通过一定的方法从反应体系中提纯PCR反应的扩增产物，才有利于进一步的分析研究。然而，实验表明使用常规的酚∶氯仿、乙醇沉淀等提取法并不能分离和灭活耐热DNA聚合酶。而这些存活的DNA聚合酶对后续的PCR产物的克隆等研究造成不同程度的影响，例如DNA聚合酶会使由限制性内切酶消化产生的3’末端凹陷被重新填充，因此耐热DNA聚合酶的灭活分离一度成为多个实验室克隆PCR扩增产物中遇到的一大难题。常规的PCR产物纯化的基本过程如下：首先使用琼脂糖凝胶电泳分离除去反应体系中靶序列的非特异性扩增片断，然后使用蛋白酶K灭活耐热DNA聚合酶，此后使用常规的酚∶氯仿抽提法除去剩余的dNTP，离心、乙醇洗脱后干燥，最后使用高效液相色谱或者凝胶电泳分离反应体系中剩余的引物和引物二聚体。通过琼脂糖凝胶电泳-溴化乙锭染色可以鉴定所提纯的PCR反应产物的纯度。

(邓兴力王廷华)

参考文献
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作者: 荷塘青蛙！ 时间: 2011-8-24 16:30

第二章 DNA模板的制备及PCR技术
中常见问题的处理
PCR反应体系包括DNA模板、反应缓冲液、dNTP、引物和酶等。为了获得满意的结果，DNA模板的数量和质量都直接影响到PCR的扩增结果。因此从生物标本中提取DNA要尽可能选择快速有效地能使DNA游离出来的方法。人类基因组DNA98%以上以染色质的形式存在于细胞核内，少量存在于线粒体内。从人体组织的有核细胞中均可提取到DNA，提取DNA主要是通过低渗或高渗的方法使细胞裂解，加入适量去垢剂(SDS)或煮沸使核模破裂，核内DNA释放，再采用化学方法除去蛋白质、RNA及其它大分子，获得纯化的DNA。
不同的分析技术对DNA样本的要求是不同的，如DNA指纹图分析要求DNA量要达到μg水平，而PCR技术因其灵敏度高，DNA量只要达到ng甚至pg水平就可满足分析的要求。不管DNA样本量要求是多少，任何DNA分析技术，都需要高质量的DNA样本。因为任何非DNA物质都会影响酶的作用，引起DNA降解。
较理想的DNA样本应达到以下三点基本要求：(1)最大限度地除去样品DNA溶液中的RNA、蛋白质、多糖和脂类分子成份；(2)尽可能保持DNA分子结构的完整性；(3)尽可能除去对酶有抑制作用的物质，如有机溶剂、去污剂、金属离子、染料等。
第一节 DNA模板的制备
提取DNA的基本原理是利用DNA和蛋白质对提取过程中各种试剂如蛋白酶、有机溶剂等不同的反应和溶解性来达到分离的目的。目前常用的方法有：(1)有机提取法；(2)Chelex-100提取法；(3)无机提取法；(4)其他提取方法。
一、有机提取法
苯酚/氯仿提取DNA是最经典的有机提取方法，该方法适宜于所有生物样本的DNA提取。
(一) 原理
苯酚/氯仿提取DNA是利用酚是蛋白质的变性剂，反复抽提，使蛋白质变性，SDS(十二烷基磺酸钠)将细胞膜裂解，在蛋白酶K、EDTA 的存在下消化蛋白质或多肽或小肽分子，核蛋白变性降解，使DNA从核蛋白中游离出来。DNA易溶于水，不溶于有机溶剂。蛋白质分子表面带有亲水基团，也容易进行水合作用，并在表面形成一层水化层，使蛋白质分子能顺利地进入到水溶液中形成稳定的胶体溶液。当有机溶液存在时，蛋白质的这种胶体稳定性遭到破坏，变性沉淀。离心后有机溶剂在试管底层(有机相)，DNA存在于上层水相中，蛋白质则沉淀于两相之间。酚-氯仿抽提的作用是除去未消化的蛋白质。氯仿的作用是有助于水相与有机相分离和除去DNA溶液中的酚。抽提后的DNA溶液用2倍体积的无水乙醇在1/10 3mol/LNaCl存在下沉淀DNA，回收DNA用70%乙醇洗去DNA沉淀中的盐，真空干燥，用TE缓冲液溶解DNA备用。
(二) 基本试剂
1. TES：10mol/L Tris-HCl pH8.0，10mmol/L NaCl，1mmol/L EDTA。
EDTA是一种螯合剂，可抑制金属离子的酶激活作用，在碱性条件下可以抑制核酸内切酶，保护DNA分子的完整性。
2.  SDS：10%(W/V)SDS.
SDS(十二烷基磺酸钠)是一种阴离子去垢剂，其主要作用是增加细胞膜、核膜的通透性；促进DNA分子与核蛋白分离并游离出来；促使核酸酶及蛋白质变性。
3.  蛋白酶K：2mg/ml或10mg/ml。
蛋白酶K的主要作用是酶解与核酸结合的组蛋白，是DNA提取的关键试剂。
4.  苯酚
市售的苯酚在使用前需按下述步骤制成饱和酚。
(1) 用专门的蒸馏装置将苯酚加热蒸馏，分装于棕色瓶中，冷却后–20℃保存。
(2) 使用前将重蒸酚置于水浴溶化，取250ml加入500ml棕色瓶中，加入1mol/L pH8.0的Tris-HCl，间断振荡。24h后弃上清，再加入0.1mol/L pH8.0的Tris-HCl，0.25g的8-羟基喹啉，使终浓度达0.1%。加巯基乙醇使终浓度达0.2%。平衡使上层水相pH 达8.0，4℃避光保存。
苯酚的pH6.0，呈酸性，在酸性环境下DNA可溶于有机溶剂，且酸性条件可使DNA变性降解，因此在提取DNA前，苯酚需用Tris-HCl平衡至pH8.0，以防酸性苯酚溶解DNA。
作者: 荷塘青蛙！ 时间: 2011-8-24 16:30

5.  氯仿、异戊醇
氯仿的作用是使蛋白变性，除去蛋白酶、去垢剂及残留蛋白。其次氯仿的另一作用是有助于水相与有机相分离及除去酚抽提后水相中残留的酚。异戊醇的作用主要是消除在抽提过程中产生的泡沫。
用酚/氯仿抽提DNA配制的比例为：酚:氯仿:异戊醇=24:23:1。
6.  细胞裂解液
0.64mol/L蔗糖，0.01mol/L MgCl，20mmol/LTris-HCl(pH7.6)，1%TritonX-100，4℃保存。
(三) 提取步骤
各种生物样本(血液、组织、骨、牙齿等)的预处理不尽相同，而预处理后，提取DNA的过程则是相同的，现在将各种常见生物样本的DNA提取方法分述如下。
1.  血液DNA的提取
(1) 预处理
将抗凝血2000r/min离心5min，弃上清，加2倍体积红细胞裂解液，置室温或37℃水浴1h，离心2000r/min，5min，弃上清，如此反复2次。
(2) 于上述沉淀物中加适量TES液洗涤一次，2000r/min，离心5min，弃上清，加TES 400µl，1/10体积10%SDS，10mg/ml蛋白酶K至终浓度为100µg/ml。上下转动混匀后置37℃-42℃水浴保温过夜。温浴过程中，可反复混匀反应液几次，以使细胞充分裂解，消化蛋白质。
(3) 抽提DNA
1) 取出温浴消化后的细胞处理液加等体积苯酚氯仿抽提液(苯酚:氯仿:异戊醇=24:23:1，v/v/v)，上下颠倒离心管5-10min，使水相与酚充分混合呈乳状悬液，10000r/min离心5min，将上层水相移至另一离心管，如此反复抽提二到三次。
2) 于水相抽提液中再加入氯仿、异戊醇(氯仿:异戊醇=24:1，v/v)上下翻转抽提一次，10000r/min离心5min，将上清液取出至另一离心管中。
(4) 沉淀DNA
于上述抽提液中加入1/10体积的3mol/L NaCl及2倍体积冰乙醇，缓慢上下翻转离心管，观察有无絮状DNA沉淀出现，用牙签小心挑出沉淀置0.5ml离心管中，加入70%乙醇，10000r/min离心5min，弃上清，置真空干燥箱中干燥。如无明显絮状沉淀出现，直接离心10000r/min，5min，弃上清，加入200ml70%乙醇洗涤1次，10000r/min，离心5min，弃上清，去除残留的盐。真空干燥。
(5) 溶解DNA
于干燥的DNA中加入适量TE 10mmol/L Tris-HCl pH8.0，1mmol/L EDTA或pH8.2的水溶解DNA备用。
作者: 荷塘青蛙！ 时间: 2011-8-24 16:31

DNA含量的检测
取2-5µl DNA溶解液与0.4µl 6×载样缓冲液混合，用0.75%琼脂糖凝胶(含EB 0.5µg/ml)检测。溴化乙锭可迅速嵌于DNA双螺旋结构中，嵌入DNA中的溴化乙锭受紫外光激发而发出荧光，这种荧光强度与DNA总质量数成正比，通过比较样品与标准品的荧光强度，对样品中的DNA进行定量。
检测DNA含量的另一方法是分光光度法，组成DNA的碱基，具有一定的吸收紫外线的特性，其最大吸收值在波长250-270之间。这些碱基与戊糖、磷酸形成核苷酸后，其吸收紫外线的特性没有改变，核酸的最大吸收波长为260nm，利用DNA的这个物理特性来测定DNA的浓度。
分光光度法的具体方法是：1、取两只清洁的比色杯，各加入2ml 0.1mol/L NaOH校正零点。2、以其中的一只比色杯作为空白对照，在另一只比色杯中加入4µlDNA溶液，再加入0.1mol/L NaOH至2ml混匀。3、测定波长为260nm时的OD值，再将波长调至280nm测其OD值。4、根据OD260=1时，双链的DNA浓度为50µg/ml，单链DNA或RNA浓度为40µg/ml，按计算公式：样品DNA浓度(µg/ml)=OD260×40µg/ml×稀释倍数，计算样品的DNA浓度。
(7) 提取DNA的注意事项
1) 在抽提过程中如果水相和有机层的界面不太清楚，说明其中蛋白质含量较高，可增加酚/氯仿抽提的次数或适当延长离心的时间。
2) 酚抽提时如果上清液太粘稠，无法进行水相转移时，可加入适量TES稀释后再抽提。
3) DNA提取过程中，DNA分子失去了核蛋白的保护，易受物理性外力作用而断裂。因此，在抽提DNA的过程中均忌动作粗暴，以免将DNA分子打断。
4) 提取DNA过程中所用到的试剂和器材要通过高压烤干等办法进行无核酸酶化处理。
5) 苯酚具有高度腐蚀性，飞溅到皮肤、粘膜和眼睛会造成损伤，因此应注意防护。氯仿易燃、易爆、易挥发，具有神经毒作用，操作时应注意防护。
2. 石蜡包埋组织、固定组织的DNA提取
石蜡包埋组织和固定组织是分子生物学研究的重要材料来源。经甲醛固定的组织，组织中的核酸与甲醛反应，早期在碱基中出现快速可逆转的羟甲基化；数天后在碱基对间，核酸与蛋白质之间缓慢地形成不可逆转的亚甲基交联。甲醛固定的时间、温度和酸碱度等均对核酸有影响，一般来说，强酸可导致DNA完全解聚而弱酸也能引起DNA结构的改变。当pH值低于2.5时，几乎所有的碱基之间氢键解离，DNA双链断裂产生不可逆的变性。经限制性内切酶消化后，乙醇固定组织DNA显示重复DNA序列的特异性内切酶的酶切点和特异性卫星带，说明DNA被完全消化。因此，不同固定剂对DNA的固定是有差异的，福尔马林类固定剂影响最大，而乙醇或含乙醇类固定剂的影响较小。
(1) 甲醛固定组织DNA的提取
剪取甲醛固定的组织，用蒸馏水冲洗2－3次，剪碎或匀浆，用2×蔗糖－Triton X-100裂解液(0.6mol/L蔗糖，0.02mol/L Tris-HCl pH8.0，0.01mol/L MgCl2，2%Triton X-100)清洗，3000r/min离心15min，收集沉淀，在沉淀中加入1.5ml　TES混匀，加入10%SDS和蛋白酶K，使终浓度分别为1%和200µg/ml，50℃水浴保温48－60小时，如果溶液仍有许多不溶物可增加SDS和蛋白酶K的浓度或延长消化时间。苯酚氯仿的提取步骤同血液DNA的提取。
作者: 荷塘青蛙！ 时间: 2011-8-24 16:32

(2) 石蜡包埋组织DNA提取
1) 将石蜡包埋的组织切片，置于1.5ml离心管中，加入500-1000ul二甲苯旋涡混匀，置室温脱蜡30min，2000r/min离心5min弃上清，再用二甲苯重复处理一次。
2) 于离心管中加入1000ul无水乙醇洗涤沉淀，12000r/min 离心5min，弃上清，重复一次，再用70%乙醇洗涤一次，10000r/min离心5min，弃上清。
3) 加TES100-200ul，加蛋白酶K至终深度为300μg/ml，42℃水浴过夜。
4) 苯酚/氯仿抽提同血液DNA提取。
(四)注意事项：
1.  取材时应避免出血坏死的组织，尽可能选用新鲜的标本。
2.  消化时应不时震摇离心管，使酶与组织充分接触。
3. 福尔马林固定和石蜡包埋使组织变得坚韧，匀浆的效果往往不理想，可将组织切成10um的薄片进行消化。
4. 消化不完全，可采用高浓度蛋白酶K及延长消化时间。
二、 Chelex-100提取DNA
(一)原理
Chelex-100是一种化学螯合树脂，由苯乙烯、二乙烯共聚体组成。含有成对的亚氨基二乙酸盐离子，对高价金属离子有很高的亲合力和螯合作用。在低离子强度、碱性及煮沸条件下，可以使细胞膜破裂，并使蛋白质变性，DNA游离。
(二)基本操作方法
Chelex-100特别适用于微量生物样本的处理，方法简便快速，提取过程始终在同一管中进行，不用转移，可减少DNA的损失，操作步骤简化，减少了污染的机会。以血液为例将基本操作步骤叙述如下：
1. 取血液1-3µl，置1.5ml离心管中，加灭菌双蒸水1ml，振荡混匀，室温30min，或置冰箱-20℃ 5min。
2.  10000r/min离心5min，弃上清，反复2-3次。
3. 于沉淀中加入200µl悬浮好的5%的Chelex-100溶液，56℃水浴2h或37℃水浴过夜。
4.  振荡5-10秒，置100℃ 5-10min，取出振荡溶液5-10s。
5.  10000r/min 5min，上清液即可作为PCR反应的DNA模板。
(三)注意事项
1. Chelex-100处理模板仅适用于PCR反应，处理液不宜长期保存，如果保存的时间稍长，可将上清液转移至另一管中保存备用。一般在一周内使用，如果保存时间过长则会影响PCR扩增结果。
2. 在处理模板的各个步骤中，振荡要充分。
3. 煮沸的温度、时间要充分，否则将影响扩增。
4. 使用前要混匀离心，取上清液作为模板，如果PCR反应体系中含有Chelex-100，Mg2+会被螯合，降低酶活性，使PCR扩增失败。
三、无机法提取DNA
无机提取法是利用6mol/L NaCl或醋酸钠沉淀蛋白质代替酚氯仿抽提去除蛋白质。基本方法是：在消化的DNA溶液中加入3倍体积6mol/L NaCl，剧烈振荡混合，10000r/min离心10min，去沉淀，上清液用无水乙醇沉淀DNA，此方法得到的DNA盐浓度较高。
四、差异裂解提取法
差异裂解提取法，主要是用于对涉及法医物证鉴定的生物样本提取，如阴道液与精液的混合，在提取精液中精子的DNA时，由于精子细胞膜和核膜含有大量的硫醇蛋白，具有丰富的二硫键，在处理中，精子的细胞膜和核膜不如脱落上皮细胞、血细胞膜那么容易破膜，因此，利用精子的这种特性，在处理精液与其它成份混合的样本时，可以先除去其他成份，再加特殊的化学试剂二硫代苏糖醇(DTT)使精子细胞的二硫键打开从而提取精子的DNA。这种处理过程就是差异裂解提取法。具体的操作方法同血液DNA的提取。
作者: 荷塘青蛙！ 时间: 2011-8-24 16:37

五、其他方法提取DNA
(一) 硅珠法提取DNA
1. 原理
在高浓度的硫氰酸胍存在的条件下，DNA能够被二氧化硅特异性吸附，当没有硫氰酸胍存在时，DNA又可从二氧化硅中释放出来。硫氰酸胍是一种高性能的蛋白变性剂，可以使蛋白质与DNA充分分离，在硅珠吸附前高速离心可以将变性的蛋白质及一些不溶的物质除去。吸附后的漂洗过程则可将溶液中的PCR抑制物洗去。
2. 试剂
吸附剂：12g GuSCN溶于10ml 0.1mol/L Tris-HCl(pH6.4)，0.8ml 0.5mol/L EDTA，0.5ml TritonX-100。
漂洗剂：12g GuSCN溶于10ml 0.1mol/LTris-HCl(pH6.4)。
硅珠悬浮液：0.06g Silica溶于1ml灭菌超纯水。
TES：1ml1mol/L Tris-HCl pH8.0，2ml 5mol/L NaCl，2ml 0.5mol/L pH8.0 EDTA，95ml灭菌超纯水。
3. 方法
取1.5ml离心管1支，加入TES200ul，10%SDS40µl再加入血液2-4µl，混匀，煮沸5min，振荡混匀，加入300-600µl吸附液，混匀，加入20-40µl硅珠悬浮液，振荡混匀，置室温15min，振荡5s，10000r/min离心2min，除去上清，于沉淀中加入200-400µl漂洗液，充分悬浮沉淀物，10000r/min离心1min，去上清液，重复漂洗一次，去上清后沉淀物用70%乙醇漂洗1－2次。10000r/min 5min，去乙醇，置56℃　10min，于沉淀中加入50-100µlTES，旋涡混合30s，56℃保温10min，10000r/min离心10min，上清液可直接用于PCR反应。
(二) 固相吸附法提取DNA
1. 原理
硫氰酸胍具有溶解细胞和灭活核酸酶的性质，利用当硫氰酸胍存在时硅藻颗粒能特异性吸附DNA，而当去除硫氰酸胍时，DNA又能从硅藻上释放出来的特性，来提取样本中的DNA。该方法尤其适用于临床标本的DNA提取。
2. 试剂
裂解液：12g GuSCN，10ml 0.1mol/L Tris-HCl pH6.4，2.2ml 0.2mmol/L EDTA pH8.0，0.3ml TritonX-100。
洗涤液：12g GuSCN，10ml 0.1mol/L Tris-HCl pH6.4。
3. 方法
(1) 取100µl样品加900ul裂解液，20µl硅藻液，振荡混合，10000r/min离心1min，去上清。
(2) 加1ml洗涤液，悬浮沉淀洗涤，10000r/min离心1min，再重复一次。加1ml 70%乙醇洗一次，1ml丙酮洗一次，去上清，56℃　10min。
(3) 加60µl TE缓冲液混匀，56℃　10min，10000r/min离心5min，上清液备用。
(三) 磷酸缓冲液法
作者: 荷塘青蛙！ 时间: 2011-8-24 16:38

1. 原理
细胞在含非离子去垢剂和蛋白酶K的溶液中消化后，高温加热使蛋白质、酶类及蛋白酶K失活，离心沉淀分离蛋白质。
2. 试剂
(1) 细胞缓冲液：0.85% NaCl，66mmol/L Na3PO4 pH7.0。
(2) 蛋白酶K 10mg/ml。
(3) 10%SDS
(4) PCR缓冲液：50mmol/L KCl，10mmol/L Tris-HCl pH8.3，2.5mmol/L MgCl2，0.1mg/L白明胶, 0.45%NP-40, 0.45% Tween-20。
3. 方法
(1) 取10-20ul血液加500ul(1)液，10000r/min离心1min，去上清液，反复2-3次。
(2) 于沉淀中加入(4)液400-500ul，10% SDS20ul，蛋白酶K 0.06μg/μl。混旋，56℃温浴1h。
(3) 100℃煮沸10min，10000r/min离心5min，上清液备用。
本方法只适用于提取新鲜样本如血液、痰液等。
第二节 PCR常见问题及处理
PCR反应受到DNA模板、引物、dNTP、Taq聚合酶、反应缓冲液等诸多因素的影响。
一、 PCR扩增参数对扩增目的基因的影响
(一) PCR缓冲液
PCR缓冲液浓度改变可影响PCR扩增，一般标准的缓冲液成份为10-50mmol/L Tris-HCl pH8.3，50mmol/L KCl，1.5mmol/L MgCl2，1% TritonX-100或0.001%白明胶。Tris是一种双极性离子缓冲液，改变反应液的缓冲能力，会引起PCR扩增效率的改变。反应液中的KCl浓度在50mmol/L下有利于引物的退火，如果超过50mmol/L的KCl则抑制TaqDNA聚合酶的活性，Mg2+浓度不仅影响酶活性，同时也影响着引物的退火、模板与PCR产物解链温度、产物的特异性及引物二聚体的形成。Mg2+浓度过高时会导致非特异性扩增产物增加，而Mg2+浓度过低，则会限制聚合酶的活性。
(二) 引物浓度
引物浓度的改变会影响扩增的产量。
(三) 四种三磷酸脱氧核苷酸
在PCR反应中，四种三磷酸脱氧核苷酸(dNTP)的终浓度为20-200μmol/L，在此范围内，PCR特异性和PCR产物的量可以达到最佳状态。如果dNTP的终浓度大于50mmol/L，DNA聚合酶的活性会被抑制。
(四) Taq聚合酶浓度
Taq聚合酶是PCR反应的关键因素之一，PCR反应要求Taq酶具有良好的热稳定性。一般50μl反应体系中Taq酶的用量为1-2.5u，当反应体系中Taq酶量大于5u，非特异性扩增产物会增加。
(五) 温度循环参数
变性和退火温度与时间，延伸温度与时间以及循环参数都决定着PCR扩增产物的量和特异性。
二、 PCR常见问题及处理
(一) 没有扩增产物
1. 循环温度特别是解链温度是否正确，对于富含G+C的目的基因97℃的温度可以使解链更加有效，但过高的温度会影响酶的活性，有效的解决方法是在加Taq聚合酶前先使模板在97℃-95℃变性5-10min。有的PCR仪由于长期使用，其所显示的温度与实际温度不一致，应定期对仪器进行维护及测试。
2. 引物的组成是否正确，有无二级结构的形成。
3. 聚合酶的活性是否正常。
4. 反应系统有无蛋白酶或核酸酶的存在，使聚合酶或模板及产物的降解。将模板置95℃以上处理，可以抑制蛋白酶和核酸酶的活性。
作者: 荷塘青蛙！ 时间: 2011-8-24 16:39

5. 某一些样本，蛋白质成份除去不完全，这样可以抑制PCR反应，再用蛋白酶K重新处理样本，可提高扩增效率。
(二) 有非特异性产物形成或产物在电泳凝胶中呈涂布状
1. 提高退火温度，缩短退火及延伸时间。选择合适的退火温度可以提高PCR反应的效率，大大减少引物与模板的非特异性结合，提高PCR反应的特异性。引物的退火温度与时间取决于引物的碱基组成(G+C的含量)、长度和浓度。
2. 调整引物、TaqDNA聚合酶或模板用量。PCR反应中引物的终浓度一般为0.1-1μmol/L，如果引物浓度低于0.1μmol/L时，PCR产物产量降低。引物浓度过高会促进引物的错误引导合成非特异产物，增加引物二聚体的形成，如果引物二聚体出现在早期的循环中，可成为PCR反应的模板，与靶序列竞争DNA聚合酶、dNTP底物，从而使靶序列的扩增量降低。TaqDNA聚合酶在70-75℃时具有最高的生物学活性，75-80℃条件下每一个酶蛋白分子每秒可延伸约150个核苷酸。温度降低时，TaqDNA聚合酶延伸速度明显下降。
3. 调整Mg2+用量。Mg2+影响着TaqDNA聚合酶的活性，同时还影响着引物的退火、模板与PCR产物的解链温度、产物的特异性和引物二聚体的形成。Mg2+浓度过低时，酶活力显著降低，过高时，则酶催化非特异性扩增。
4. 减少循环次数。循环次数决定着扩增程度，过多的循环会增加非特异扩增产物，过少的循环次数，PCR产物量就会极低。
(三) 引物二聚体的形成
1. 检查引物的序列，特别在3'端是否有互补区。
2. 提高退火温度。
3. 调整引物与模板浓度，使模板比例增高。
4. 增加引物长度。
5. 减少循环次数。
第三节 PCR技术中污染问题
一、污染原因
(一) 样品间交叉污染
样品污染主要有收集样品的容器被污染，或样品放置时，由于密封不严溢出容器外，或容器外粘有其他样品而造成相互间交叉污染；样品DNA在提取过程，由于微量移液器(加样枪)污染导致样品间污染；有些微生物标本尤其是病毒可随气溶胶或形成气溶胶而扩散，导致彼此间的污染。
(二) PCR试剂的污染
主要是由于在PCR试剂配制过程中，由于吸样枪、容器、双蒸水及其它溶液被其它样品污染。
(三) PCR扩增产物污染
这是PCR反应中最主要、最常见的污染问题。因为PCR产物拷贝量大(一般为1013拷贝/ml)，远远高于PCR检测数个拷贝的极限，所以极微量的PCR产物污染，就可造成假阳性；还有一种容易忽视，最可能造成PCR产物污染的形式是气溶胶污染，在空气与液体面摩擦时就可形成气溶胶，在操作时比较剧烈地摇动反应管，开盖时、吸样时及污染进样枪的反复吸样都可形成气溶胶而污染。据计算一个气溶胶颗粒可含48000拷贝，因而由其造成的污染是一个值得特别重视的问题。
(四) 实验室中克隆质粒的污染
在分子生物实验室及某些用克隆质粒做阳性对照的检验室，这个问题比较常见，因为克隆质粒在单位容积内含量相当高，另外在纯化过程中需要较多的用具及试剂，而且在活细胞内的质粒，由于活细胞的生长繁殖的简便性及具有很强的生命力，其污染可能性也很大。
作者: 荷塘青蛙！ 时间: 2011-8-24 16:39

二、污染的监测
一个好的实验室，要时刻注意污染的监测，考虑有无污染或是什么原因造成的污染，以便采取措施，防止和消除污染。
1. 阳性对照：在建立PCR反应实验室及一般的检验单位都应设有PCR阳性对照，它是PCR反应是否成功、产物条带位置及大小是否合乎理论要求的一个重要的参考标志，阳性对照要选择扩增度中等、重复性好，经各种鉴定是该产物的标本，如以重组质粒为阳性对照，其含量宜低不宜高(100个拷贝以下)，但阳性对照尤其是重组质粒及高浓度阳性标本，其对检测或扩增样品污染的可能性很大，因而当某一PCR试剂经自己使用稳定，检验人员心中有数时，在以后的实验中可免设阳性对照。
2. 阴性对照：每次PCR试验务必做阴性对照，它包括①标本对照：被检标本是血清就用鉴定后的正常血清做对照；被检的标本是组织细胞就用相应的组织细胞作对照；②试剂对照：在PCR试剂中不加模板DNA或RNA，进行PCR扩增，以检测试剂是否污染。
3. 重复性试验
4. 选择不同区域的引物进行PCR扩增
三、防止污染的方法
(一) 合理分隔实验室
将样品的处理、配制PCR反应试剂、循环扩增及PCR产物的鉴定等步骤分区或分室进行，特别注意样本处理及PCR产物的鉴定应与其他步骤严格分开，最好能划分①标本处理区；②PCR反应液制备区；③PCR循环扩增区；④PCR产物鉴定区。其实验用品及吸样枪应专用，试验前应将试验室用紫外线消毒以破坏残留的DNA或RNA。在DNA模板和多聚酶加入前，紫外线照射反应管内容物，一般选用波长254nm照射30min。
(二) (微量移液器)吸样枪
吸样枪污染是一个值得注意的问题，由于操作时不慎将样品或模板核酸吸入枪内或粘上枪头是一个严重的污染源，因而加样或吸取模板核酸是要十分小心，吸样要慢，吸样时尽量一次性完成，忌多次抽吸，以免交叉污染或产生气溶胶污染。
(三) 预混和分装PCR试剂
使用预先混合的反应成分，而不是每个反应的每个试剂单独加入。所有的PCR试剂都应小量分装，如有可能，PCR反应液应预先配制好，然后小量分装，-20℃保存，以减少重复加样次数，避免污染机会，另外，PCR试剂、PCR反应液应与样品及PCR产物分开保存，不应放于同一冰盒或同一冰箱。
(四) 防止操作人员污染
使用一次性手套、吸头、小离心管应一次性使用。
(五) 设立适当的阳性对照和阴性对照
阳性对照以能出现扩增带的最低量的标准病原体核酸为宜，并注意交叉污染的可能性，每次反映都应由一管不加模板的试剂对照及相应不含有被扩增核酸的样品作阴性对照。
(六) 减少PCR循环次数，PCR产物达到检测水平就适可而止
(七) 选择质量好的Eppendorf管
以避免样本外溢及外来核酸的进入，打开离心管前应先离心，将管壁及管盖上的液体甩至管底部。开管动作要轻，以防管内液体溅出。
(八) 使用尿嘧啶DNA糖基化酶(UDG)
也称为尿嘧啶-N-糖基化酶(UraciI N-glycosylase,UNG)可移除DNA中的尿嘧啶，在扩增过程中将脱氧尿嘧啶替换为胸腺嘧啶，可以把前面的扩增产物同模板DNA区分开来。因为前面的扩增产物对UDG敏感，所以在PCR扩增前对新配制的反应物用UDG处理以降解交叉污染的PCR产物，而不降解要扩增的基因组DNA模板，然后热灭活此酶，再进行扩增反应。
第四节 PCR技术实验室的质量控制
一、设备条件
(一) 实验室条件
PCR实验室通常分为四个区，现分述如下：
1. 样品处理区：主要用于样本的处理，如记录、分类等。
2. DNA提取区：该区主要用于样本的DNA提取。
3.  PCR扩增区：该区用于PCR反应的加样和扩增。
4.  检测区：该区主要用于检测PCR的扩增产物。
作者: 荷塘青蛙！ 时间: 2011-8-24 16:39

(二) 设备条件
1. 样品处理区应具有普通离心机、水浴箱、恒温箱、烤箱等基本设备。
2. DNA提取区的设备主要是台式高速离心机、漩窝振荡器、干热器、反转摇床、恒温水浴箱、磁力搅拌器、潜水式凝胶电泳装置、微量移液器
3. PCR扩增区的主要设备应具有超净工作台、漩涡振荡器、小型台式离心机、20-200μl移液器一套，低温冰柜、冰箱、扩增仪等。
4. 检测区主要有电泳仪、电泳槽(潜水、垂直)，紫外透射仪、干胶系统、图像分析系统等。
二、人员条件
具备相应理论基础知识和相应操作技能的人员，是开展DNA实验技术的基本条件。实验人员应具备熟练技术操作，正确分析判断试验结果，因此对实验技术人员的要求应当是具备一定的资历，如熟悉生物化学、分子生物学等学科的相关理论和技术，具有一定的实际工作或实验操作经历的专业技术人员。对从事该项技术的人员应定期培训、定期考核。
三、操作标准问题
1. PCR实验室应有完整的规章制度，包括各类仪器设备的正确使用维护及使用纪录。各类标准实验操作程序。
2. 试验试剂的配置，各类试剂瓶上应标有试剂名称、成份、浓度配制的时间。
3. 设置阴性、阳性对照，以及空白对照。
4. 完整实验纪录，实验纪录应包括实验日期、实验样本、实验操作、实验结果、实验小结。

(景强)

1  K.B穆里斯,F.费里,K.赫斯等著.聚合酶链式应.北京:科学出版社,1998,第一版.
2  迪芬巴赫,德维克斯勒著.黄培堂等译.PCR技术实验指南.北京:科学出版社,1998,第一版.
3  任新尧,罗超敏,马涧泉主编.分子遗传学与基因工程.河南:河南医科大学出版社,1999,第一版.
4  郑秀芬主编.法医DNA分析.北京:中国人民公安大学出版社,2000,第一版.
5  郭景元,李佰龄主编.中国刑事科学技术大全.法医物证学.北京:中国人民公安大学出版社,2002,第一版.
6  贺林主编.解码生命.北京:化学工业出版社,1999,第一版.
7  林万明.PCR技术操作和应用指南.北京:人民军医出版社,1993,第一版.
8  杨庆恩.DNA在法庭学中的应用.北京:中国人民公安大学出版社,2000,第一版.
作者: 荷塘青蛙！ 时间: 2011-8-24 16:39

第三章原位PCR相关技术
第一节原位PCR
自上世纪50年代初发现DNA双螺旋结构至今，已有无数科学家对如何检测特异的靶序列做了大量工作。原位杂交(in situ hybridization,ISH)是一种常用的分子生物学方法，可定位检测原位基因，具有良好的组织原位定位能力，它的诞生使得靶DNA或RNA的细胞定位成为可能，缺点是敏感性较低。虽然在过去的一段时间里该技术的灵敏度有了极大的改进，尤其是非放射性同位素标记探针的使用使其意义更大，但原位杂交敏感性的高限也只能达到mRNA10~20拷贝/细胞，因此，该技术的应用有一定的局限性。如果细胞中靶片段的拷贝数低于10，原位杂交方法就很难检测出。尽管对特定细胞增殖期病毒DNA的检测不是一个问题，但对晚期病毒感染或点突变的检测就有困难。尤其是在石蜡切片中难以用此方法研究低含量的DNA序列。
1990年由Haase等建立了一种把PCR 和原位杂交结合起来的新方法——原位多聚酶链式反应技术(In Situ PCR,IS-PCR)，简称原位PCR。原位PCR可应用于多种类型的研究材料(组织切片、离心细胞、悬浮细胞等)的不同拷贝数目的序列(病毒的或基因组的DNA或RNA)，扩增方法可分为单个或多个引物对，检测系统也分为直接和间接两种。与其它PCR方法不同的是，原位PCR不必从组织细胞中分离模板DNA或RNA，即该法在不破坏细胞的前提下利用原位的完整的细胞作为一个微反应体系来扩增细胞内的靶片段并进行检测，从而综合了PCR和原位杂交各自的优点，既有高度的敏感性，又有精确的定位，使得靶基因的检测技术有了极大的飞跃。虽然原位PCR技术刚刚开始，但许多研究小组已相继发表了有关原位PCR技术的数据和手册，目前原位PCR技术已成为靶基因序列的细胞定位、组织分布和靶基因表达检测的重要手段，广泛用于肿瘤发生学、胚胎学、RNA转录和病毒学检测等方面，该技术具有良好的应用前景。
在上述工作的基础上，1989年，由Koch 等创建了寡核苷酸启动的原位DNA合成技术(oligonucleotide primed in situ synthesis,PRINS)。该技术是通过退火一个寡核苷酸DNA引物到制备在载玻片上的染色体的变性DNA，用掺入的标记核苷酸在原位进行酶促延长并检测的染色体标记技术。此技术的可靠性、敏感性和分辨率较高，现已成为一个替代荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization,FISH)的常规方法。该技术在转移组织和产前诊断中鉴定非整倍体染色体以及人体杂交细胞系染色体分析方面具有不可替代的优势。下面内容主要介绍原位PCR及PRINS技术以及由这两种技术衍生而来的新技术，并对目前常用的有关PCR扩增的细胞内DNA 和mRNA的原位检测技术进行了介绍和比较。
一、原位PCR的基本原理
原位PCR(In Situ PCR,IS-PCR)是一种把原位杂交的细胞定位技术与PCR的高灵敏度相结合的技术，即通过PCR技术以DNA为起始物，对靶序列在染色体上或组织细胞内进行原位扩增，使其拷贝数增加，然后通过原位杂交方法检测，从而对靶核酸进行定性定量定位分析。随着PCR技术的发展，出现了以mRNA为起始物，通过反转录合成靶序列的cDNA，然后以cDNA为模板进行PCR扩增，以检测细胞内mRNA靶序列的原位反转录PCR。
原位PCR的大致流程主要包括：(1)染色体、细胞及组织切片样品的制备。此阶段中固定很重要，因为并非所有的固定剂都有利于PCR及原位PCR 反应。(2)PCR前处理，包括石蜡切片、去石蜡、染色体变性和细胞穿透，此步既可有利于PCR反应试剂到达靶目标，又可防止扩增后产物漏出，蛋白酶和胰酶是常用的消化膜试剂，不同材料处理的时间和所用酶的浓度有所不同。(3)PCR扩增，一般采用热启动PCR，病毒RNA的扩增需用逆转录PCR。(4)原位杂交及检测。
原位PCR按检测方法不同分为：直接原位PCR；间接原位PCR；原位反转录PCR；原位再生式序列复制反应。
作者: 荷塘青蛙！ 时间: 2011-8-24 16:40

二、原位PCR的方法和原则
试剂：DEPC处理水、硅化的载玻片、地高辛标记的dUTP、抗地高辛缀合物、常用固定剂(1%～4%多聚甲醛、10%缓冲甲醛液、酒精、丙酮、醋酸/乙醇混合液、Bouin氏液等)、常用酶(蛋白酶、胰酶和用于原位PCR中逆转录过程的无RNA酶的DNA酶)、原位杂交试剂盒(包括蛋白酶、缓冲液、洗液、生色剂、探针和复染剂)RT-PCR试剂盒(包括缓冲液、核苷酸、MgCl2、Taq DNA聚合酶和RT-PCR的对照引物)、原位PCR仪
方法和步骤:
(一) 样品制备
样品保持完好的形态学特征，以利于PCR试剂到达细胞内，尽量减少和避免扩增产物扩散或漏出细胞。
具体操作如下:
1. 用10%甲醛固定组织8～48h，然后用石蜡包埋。
2. 对于培养细胞，用PBS直接清洗培养皿中的细胞一次，加10%甲醛固定液静置过夜，用橡胶刮下细胞，DEPC处理水洗细胞两次，2000r/min离心3min，再用5ml DEPC处理水重悬细胞，吸50µl点在载玻片上。
3. 取几片石蜡组织切片或载有细胞悬液的载玻片，载玻片进行硅化处理。
4. 将组织切片放入新鲜的二甲苯中处理5min，去除石蜡，放入乙醇中浸泡5min后取出凉干。
(二) PCR前处理
1. 蛋白酶消化
胃蛋白酶、胰蛋白酶或蛋白酶K均可使用，胃蛋白酶和胰蛋白酶更好。因为它们比蛋白酶K易失活，在以后的洗涤步骤通过提高pH即可抑制其活性。胃蛋白酶的浓度为2mg/ml其配制过程是：称取20mg胃蛋白酶，加9.5ml水和0.5ml 2mol/L盐酸。
注意：对于原位PCR，蛋白酶消化时间主要取决于甲醛缓冲液的固定时间， (表3-1)列出了两者的对应关系。
载玻片用DEPC水洗1min使蛋白酶失活，再用无水乙醇洗1min，室温干燥。此简单步骤即可去除/灭活蛋白酶，不需加热灭活。
原位PCR对标本处理要求较高，不同固定液、不同固定时间对原位PCR的结果影响很大，固定的温度对原位PCR的结果亦有影响。一般认为，室温或37℃固定24～48h可获得最强信号。固定后的细胞膜起一个半透膜的作用，PCR扩增试剂如引物、dNTPs、缓冲液和Taq DNA聚合酶可穿入细胞和核内，而PCR扩增产物则难以外泄从而能进行原位检测。临床标本以及病理档案的石蜡包埋标本比冰冻切片的处理要复杂一些，这些标本固定的时间一般较长，这可降低细胞的通透性从而减少了PCR产物的扩散，但同时也使足量PCR试剂到达核DNA或胞浆cDNA的可能性降低。因此，除选择合适的消化方案外，应先检查档案样品中核酸保存的完整性。方法是用原位PCR同样的引物做液相PCR，检测该样品提取的DNA或RNA是否有足够的靶DNA/RNA存在。固定后常用蛋白激酶K或胃蛋白酶等对细胞或组织进行轻微的消化，这样可增加细胞的通透性，有利于PCR反应的进行。蛋白酶消化的程度是原位PCR成功的一个关键点。过度消化使扩增的产物漏出致假阳性或假阴性结果，反之则扩增无效。一般而言，简单的固定不需要消化，固定时间越久则需要的消化时间越长，因为此时可能有较多的DNA-蛋白交联形成。不难看出原位PCR样品制备中固定和蛋白酶消化是一对矛盾，关键是找到他们之间的平衡点。
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表(3-1)：10%甲醛缓冲液固定时间对原位PCR过程中不依赖引物信
号的蛋白酶消化时间的影响
固定时间  蛋白酶a消化时间(分)
0 5 10 15 30 45 60 75 90
4小时 0 1+ 3+ 2+ 过量消化b 6小时 0 0 1+ 3+ 2+ 过量消化b 8小时 0 0 0 0 1+ 3+ －－－15小时 0 0 0 0 0 1+ 1+ 2+ 3+48小时 0 0 0 0 0 0 1+ 2+ 3+ 1周 0 0 0 0 0 0 1+ 2+ 2～3+c
信号打分方式：0，1+(<25%细胞阳性)，2+(25%～50%细胞阳性)3+(>50%的细胞阳性)，信号检测时不知到反应条件。a.  蛋白酶为胃蛋白酶(2mg/ml),室温消化。b.  过量消化标准指组织形态学丧失同时伴有原位PCR信号丧失。c.  2+信号是用胃蛋白酶消化，3+信号是用蛋白酶K(1mg/ml)消化。

2. DNA酶消化(用于原位PCR中的反转录)
三个组织切片或细胞悬液中的两个用DNA酶消化是必要的，而另一个作为阳性对照切片是不需要DNA酶消化的。大于50%的细胞为强阳性时显示蛋白酶消化时间是理想的；强阳性信号代表DNA修复，基因扩增和错误引导。阴性对照是用DNA酶消化但不经RT处理的细胞或组织切片。信号消失表明DNA酶消化破坏了天然DNA模板，不能进行DNA合成。检测样品是用DNA处理再经RT处理。
步骤：
(1) 取2张切片分别加入：1µl 10×缓冲液(此液由35µl 3mol/L NaAc， 1mol/L MgCl2和60µl DEPC水配制而成)，1µl无RNA酶的DNA酶，8µlDEPC水。
(2) 用一个灭菌的聚丙烯塑料封条盖住溶液以防止干燥，将载玻片置于一个37℃的湿容器内。
(3) 过夜消化，除去封条，用DEPC水洗1min，再用无水乙醇洗，室温干燥。
3. 反转录步骤
(1) 取一张经DNA酶消化的切片，加入下列溶液：2µl MgCl2(25mmol/L贮存)， 1µl RT缓冲液，1µl dATP、dCTP、dTTP(每种以10mmol/L贮存)，1.5µl DEPC水，0.5µl 3′端引物(20µmol/L贮存)，0.5µl RNA酶抑制剂，0.5µl反转录酶。这些试剂在RT-PCR试剂盒中均有。
(2) 为了防止干燥，用一小滴指甲油固定住封条，将载玻片放入PCR仪的加热铝板上，盖灭菌矿物油，42℃反应30min。
(3) 除去封条，用二甲苯洗5min除去指甲油，再用无水乙醇洗5min，室温干燥。
(三) 热启动(hot start)
热启动是在进行PCR扩增前先将组织切片与无DNA聚合酶的PCR反应混合液预热至一定温度(55℃～80℃)，然后再加入引物和Taq聚合酶继续进行反应。该过程可明显增强特定靶序列的扩增，降低PCR过程中引物的错误启动，减少非特异性扩增产物。其作用可能是降低引物与细胞内DNA的结合，防止了引物二聚体的形成，从而减少了错误发生率。有研究指出非热启动体系中非特异产物高达50%以上，而热启动后降至1/5000。另一种代替热启动的方法是所谓“化学热启动”，比如将大肠杆菌单链DNA结合蛋白(SS加入PCR反应混合物中，可以抑制错误启动而不影响靶特异性引物退火，增加原位PCR结果的特异性及敏感性。
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(四) PCR扩增细胞内的靶序列
对DNA靶序列的PCR扩增主要由高温变性(94℃×1min)、低温退火(55℃ ×3min)、适温延伸(72℃×2min)三步组成一轮的热循环重复而成。理论上每次循环PCR产物以2n指数递增，经20～25次循环后，PCR产物的积累可达到最大值，可使靶序列扩增106～7倍。但在实际操作中，每步反应率不可能是100%，因此一般循环次数设定为25～30次。过多的循环次数(>30次)之后酶的催化反应趋于饱和，就会出现“平台效应”。
步骤：
1. 每一张载玻片需加25µl溶液：2.5µl PCR缓冲液，4.5µl MgCl2(25mmol/L贮存)，4.0µl dNTP(每种核苷酸终浓度200µmol/L)，1.0µl 2% BSA，0.4µl地高辛标记的dUTP(1mmol/L贮存液), 1.0µl引物1(20µmol/L), 1.0µl引物2(20µmol/L), 11µl水, 0.5U Taq DNA聚合酶。
2. 加入上述25µl溶液到载玻片上，盖上封条，用指甲油固定。
3. PCR仪加热至80℃，加入预热的矿物油，终止程序，升温至94℃，运行PCR程序： 94℃ 1min、55℃ 3min、72℃ 2min25个循环。
4. 去除封条和矿物油，用二甲苯洗5min，乙醇5min，室温干燥。
(五) 细胞内PCR产物的检测
步骤：
1. 用1×SSC溶液(含0.2%BSA)52℃洗载玻片3min.
2. 除去过量的洗液，每张切片加100µl0.1mol/L Tris-HCl(pH7.5)和0.1mol/L NaCl溶液(含抗地高辛抗体1：200稀释)。37℃反应30min。
3. 用检测溶液(0.1mol/L Tris-HCI pH9.5和0.1mol/L NaCl)洗切片1min,在检测溶液中孵育切片直到NBT/BCIP生色剂加入。
4. 37℃孵育5～15min，在镜下检查切片，当信号很强时，终止反应。
5. 水洗切片1min后，核用快红复染5min，用水洗1min，无水乙醇洗1min，二甲苯1min，盖上盖玻片在显微镜下观察。
(六) PCR结果的对照实验设计
对原位PCR的每步均应有适当和严格的对照。对照应定性和定量以尽量排
除假阳性和假阴性结果。(见表3-2)

表(3-2)：PCR结果对照实验设计之比较
目的  方法
1、  一般对照检测所用方法的特异性和敏感性检测假阴性和敏感性检测内源性酶的活性检测假阴性DNA/RNA质量检测检测所用定量方法特异性和敏感性2、  细胞悬液检测PCR产物的特异性3、  间接原位PCR检测非特异性探针和抗体附着检测ISH特异性4、  直接原位PCR检测与DNA修复和内源性引物所致的有关的人工假象检测非特异性探针和抗体附着5、  原位逆转录PCR6、  检测错误启动和内源性DNA的扩增  使用已知阳性及阴性的对照样品进行原位PCR用所测试样品抽提DNA/RNA上进行液相PCR在免疫组化中省去一抗内源性对照DNA序列的扩增用不同比例的已知阳性及阴性的细胞混合物作原位PCR，用免疫组化鉴定不同的细胞类型原位PCR后用凝胶电泳和Southern blot杂交分析的细胞胞溶物PCR产物省去DNA聚合酶用与原位杂交无关的探针省去引物省去DNA聚合酶省去逆转录酶/用RNA酶处理样品
作者: 荷塘青蛙！ 时间: 2011-8-24 16:41

表(3-3)：细胞内DNA和mRNA原位检测技术之比较
  特征  应用  样品  优点  缺点  评述
原位杂交  标记探针对细胞内RNA或DNA的杂交  内源性DNAmRNA或细胞内外DNA/RNA定位  石蜡或冰冻切片、单细胞制备物、染色体制备物  形态学特征好特异性高可用于DNA或RNA、所需设备低廉、同温过程  敏感性较低  催化的显示系统可能明显增加敏感性
原位PCR  对细胞内PCR扩增并通过标记探针杂交或掺入标记核苷酸的免疫学方法对扩增DNA序列的特异性检测  改变的基因或细胞中外来基因的定位  石蜡或冰冻切片、单细胞制备品、染色体制备品  同温过程、高度敏感性、可检出单拷贝  设备昂贵、重复性不佳、可造成组织破坏或丢失、定量困难、工作量大  制定标准化操作方案改进显示系统以弥补缺陷
原位逆转录PCR  细胞内mRNA逆转录为cDNA然后进行细胞内PCR扩增和检测  特异性mRNA或细胞中病毒RNA之定位  石蜡或冰冻切片、单细胞制备品  高度敏感性、可检出极低拷贝信息  除同原位PCR外还需RT-ISH及热循环，能否通过直接掺入的标记核苷酸检测而获得精确结果尚有争议  制定标准化操作方案改进显示系统以弥补缺陷
PRINS  寡核苷酸启动的原位DNA标记反应  中期核扩展和间期核中染色体鉴定及DNA序列图谱、细胞中染色体DNA定位敏感、快速、非放射性  可能错误启动、特异性取决于一个单引物、可致假阳性  以高的信/噪比检测高拷贝的DNA序列
循环PRINS  同原位PCR
原位逆转录及RT PRINS  用mRNA互补引物逆转录酶和 dNTP底物在一个细胞内合成标记的 cDNA  细胞中特异性mRNA的鉴定和细胞内定位  石蜡或冰冻切片、单细胞制备品  比原位杂交更高的敏感性、同温过程、可坚定最小的序列变化  可能错误启动或出现标记核苷酸的非染色特异性  与高活性的显示系统联合可能明显增加敏感性
原位3SR`  同时用三种酶介导cDNA方式的mRNA的同温扩增然后用标记探针做ISH  细胞中特异性mRNA/cDNA的鉴定和定位  石蜡或冰冻切片、单细胞制备品  同温、无需特殊设备、比原位杂交更高的敏感性  过程复杂、引物在其5ˊ端需RNA启动子序列、扩增后需原位杂交在存档的石蜡包埋材料中应用此法的经验尚少
（待续）
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三、原位PCR中的问题和技术难点
原位PCR技术自上世纪90年代初建立至今，科学家就一直对原位PCR的技术和应用进行研究，目前该项技术已日臻完善。原位PCR既能分辨带有靶序列的细胞又能标出靶序列在细胞内的位置，在分子和细胞水平上研究疾病的发病机理、临床过程以及病理的转归，其特异性和敏感性均高于一般PCR技术。在病毒学、病理学和肿瘤已经成功展示了许多令人瞩目的成就，具有重要的实用价值。但是，任何事物都具有两面性，原位PCR作为一项发展中的新技术，还存在一些问题，在方法上还有待于进一步改进和完善。
(一) 非特异性问题
特异性是评价原位PCR是否成功的一个重要参数。原位PCR的非特异性问题主要是容易出现假阳性结果，包括“细胞内受损DNA的修复而形成的非特异性序列”、“错误启动”、“扩散人工假象”。其错误的原因可能是：①“错误启动”即引物与模板错配或在引物延伸过程中三磷酸核苷酸的错误掺入而导致非特异性序列扩增。导致错误启动的因素包括PCR反应物中寡核苷酸引物的特异性、pH值和Mg2+浓度，以及热循环中的退火温度等，可用热启动或减少冷启动，去除原位PCR中的错误启动。②“扩散人工假象”，即由于特异性扩增产物弥散出细胞外而附着在邻近的阴性细胞上，甚至扩散入该类细胞，导致假阳性信号。据研究发现，若选择最佳通透状况；控制PCR循环次数(少于30次)；在引物延伸时掺入生物素标记的三磷酸核苷酸；在PCR反应中，用针对同一靶序列不同片段的多对引物(5～7对)进行扩增，可得到不同长度的扩增产物，像“脚手架”一样重叠交织一起。由此，可避免扩增产物被洗脱，有利于扩增序列原位保留，防止弥散，使“扩散人工假象”减少。
(二) 敏感性问题
原位PCR是将靶序列扩增后再进行检测，因此提高了在组织细胞原位检出靶序列的敏感性。但与常规液相PCR相比，原位PCR的扩增效率要低得多，这样就会出现假阴性结果。某些常规的固定剂如甲醛有时会导致靶序列与蛋白交联，导致DNA暴露不足，这时可通过适当的蛋白酶、盐酸或加热处理。如何提高病理存档组织、石蜡包埋组织切片原位PCR的敏感性，困难仍就较大，可通过使用多对引物和短的PCR产物的方法来改善，使用相对长的DNA探针或混合寡核苷酸探针也获得了成功，但理论上不排除更多PCR产物停留在原位是由于使用多对引物对，在原位PCR产物中形成了“构架”的缘故，并在检测的清洗过程中不易被洗脱。
四、应用前景
回首人类文明进步的历程，无数伟大的发明和创造都是以研究方法与工具的创新为先导。原位PCR作为一种敏感性高、特异性强，能在组织细胞原位进行低拷贝数基因定位的形态学研究方法从一开始就倍受青睐。在检测病毒、原病毒和其他细胞内感染病原体，研究肿瘤发生中的基因变异和对遗传性疾病基因缺陷等方面都发挥了重要作用。原位PCR技术自1990年创立至今已逐渐形成了较完整的体系，有直接法、间接法、反转录法等。在电镜水平进行扩增产物的细胞内定位，原位扩增与免疫组织化学技术相结合，在同一细胞内同时进行DNA和RNA原位扩增以及在染色体带上进行原位扩增等新技术也正在探索之中。随着原位PCR技术的不断改进、完善和发展，其应用必将越来越广泛。可以想象不久的明天原位PCR技术一定会成为分子细胞生物学、分子发育生物学、分子神经生物学、分子病理学、分子遗传学、分子肿瘤学、分子病毒学以及临床各学科在内的科学园地里的重要的研究工具。随着原位PCR的理论和技术逐渐为广大的生物医学科学工作者所掌握，有一天它会真正走出研究实验室，成为诊断实验
作者: 荷塘青蛙！ 时间: 2011-8-24 16:42

第二节原位PCR的分类
一、直接原位PCR
直接法原位PCR是使扩增产物直接携带标记分子，在原位PCR反应体系中使用标记的三磷酸核苷酸或引物。地高辛-11-dUTP，生物素(荧光素-dUTP)和放射性同位素(3H-CTP)是最常用的三种标记物。当标记物进行PCR扩增时，标记分子就掺入到扩增产物中，可用放射自显影技术、免疫组织化学技术或亲和组织化学等技术检测扩增产物。直接法原位PCR的优点是快速、简便，曾一度被认为可完全代替间接法，但现已证明其结果的特异性不够。即使使用了严格对照的固定、蛋白酶消化和热启动程序，也容易出现许多较强的假阳性信号，严重干扰特异性信号的检测，尤其是在组织切片上进行原位PCR，其扩增效率较低。
直接法原位PCR的假阳性问题在组织切片标本要比完整细胞标本更为严重，原因很可能与标本内受损DNA的修复过程有关。因为固定、包埋及制片过程都会导致DNA损害。而在PCR反应中，受损的DNA可利用反应体系中的标记三磷酸核苷酸进行修复。这样，标记物就掺入到DNA的非靶序列中，形成所谓“DNA修复人工假象”。即使反应体系中没有引物，但由于cDNA或DNA片段的非特异性PCR产物引导的所谓“内源性引物” 也会导致这种假阳性出现。此外引物与模板的错配，以及醛类固定可能增加DNA中单链或双链裂缺的数目，也是造成假阳性的一个重要原因。目前认为，设置严格的、适当的对照，谨慎地解释直接原位PCR的实验结果是很重要的。
用标记引物进行直接法原位PCR，其扩增效率要比用不标记引物的低。在应用方面，直接法原位PCR不适于研究内源性基因重排和染色体易位。因为在所有的细胞内都有未重排的靶序列，而引物也会与相应的模板发生特异性结合，并在DNA聚合酶作用下延伸。这样就给基因重排分析带来了困难。
根据目前的文献报道，直接原位PCR不适合用于切片标本。要拓宽直接法原位PCR的应用范围，尚有待于进一步改进技术，以提高其特异性和扩增效率。
二、间接原位PCR
间接法原位PCR是目前应用最广泛的靶核酸序列原位扩增技术。Haase等于1990年首次报道原位PCR时，用的就是间接法。他们用经固定的细胞悬液做PCR扩增，然后将细胞离心沉淀在玻片上，再对扩增产物进行原位检测。
间接法原位PCR的反应体系与常规PCR相同，所用的引物和三磷酸核苷酸都不带任何标记物。当PCR原位扩增结束后，再用原位杂交技术检测特异性扩增产物。由此可见，间接法原位PCR与原位杂交技术结合，故亦称为PCR原位杂交(PCR in situ hybridization,简称PISH)。
与直接法原位PCR相比，间接法虽然复杂些，多了原位杂交检测步骤，但它扩增效率较高，更重要的是特异性比直接法强。理论上说，在靶标记上，介于两引物间的区域的探针的特异性是最完美的，而原位杂交所用的探针符合这一标准，可特异性地检出扩增产物中的靶序列。这样，即使扩增产物中有非靶序列成分，它们也不会呈现阳性反应，因而提高了原位PCR的特异性。
原位杂交的方法很多，原则上都可用于结合PCR技术。但还是以非同位素标记物，如地高辛、生物素标记的寡核苷酸探针原位杂交较为常用。
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三、原位反转录PCR
原位反转录PCR(in situ reverse transciption PCR,简称In Situ RT-PCR)是结合反转录反应和PCR扩增检测细胞内低拷贝mRNA的方法。全过程分两步进行。
第一步以mRNA为模板，在逆转录酶的催化下合成cDNA。第二步则以cDNA为模板，用PCR对靶序列进行扩增。与液相反转录PCR不同的是，原位反转录PCR反应过程在固定的组织细胞标本上进行。进行原位反转录PCR的标本先要用DNA酶处理，以破坏组织细胞中的DNA。这样可保证PCR扩增的模板是从mRNA反转录合成的cDNA，而不是细胞中原有的DNA。处理时可将150～300µl不含RNA酶的DNA酶滴加在标本上，再剪一块比标本略大的蜡膜轻轻地覆盖在液滴上。注意将蜡膜的清洁面向着标本。然后切片置于湿盒内，室温下孵育过夜。处理结束后，标本用PBS洗涤5min。如果PCR扩增的引物与细胞本身的基因DNA相距甚远，残留在细胞中DNA就不会被扩增。在这种情况下，标本则可不必用DNA酶处理。第一步反转录反应一般在42℃下进行30～60min。此时，在有逆转录酶、随机六聚物(random hexamer )和游离核苷酸存在的条件下，以mRNA为模板合成cDNA。反转录反应结束后，可将标本加热至90℃以上，以灭活逆转录酶，或用PBS洗涤5min，将逆转录酶洗去，接着以cDNA为模板进行第二步PCR扩增。
1991年Cetus公司推出了一种新酶，rTth逆转录酶。它的特点是具有很强的分别依赖RNA和DNA聚合酶活性。利用rTth酶，就可使原位反转录PCR上述的两个步骤用一种酶在一个条件下完成，简化了操作，缩短了实验时间。

第三节原位PCR技术
一、直接原位单拷贝PCR
在原位PCR未问世以前，中期染色体DNA标记的原位荧光杂交(FISH)等方法曾被有效地用于功能基因的物理绘图和了解高等生物的基因组成。但FISH方法不够敏感，检测长度小于3~5kb的序列很困难。目前已用原位PCR等方法直接在中期染色体上检测短序列，其中寡核苷酸启动原位合成(PRINS)系将一个寡核苷酸退火到一个变性的染色体上，然后经DNA聚合酶原位延长并标记，这是一个检测低拷贝序列的有效方法。直接原位单拷贝PCR(DISC-PCR)技术用两个引物对直接制备在载玻片上的中期染色体进行PCR反应以确认所研究的序列，将一个半抗原核苷酸如生物素-16-UTP掺入PCR扩增产物中，加入链霉素抗生物素一信号酶与适当底物，就会在放大位点上产生有色沉淀。
DISC-PCR不需要手边有克隆的基因，只要有合成PCR引物足够的序列资料即可用于定位哺乳动物染色体上100~300bp的短序列，它特别适合于序列界标(STS)的物理定位，也可以用于绘制表达序列标记(ESTs)。目前其最大的不便是完成程序之后分带比较困难，而且必须分析数目庞大的中期分离染色体。
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(一) 试剂和材料
1．淋巴细胞的培养和中期染色体的制备部分
(1) PBS。
(2) KCM培养液：
20mmol/L NaCl，
120mmol/L KCL，
0.1%TritonX-100，
10mmol/L Tris-HCl pH8.0。
(3) RPMA-1640  培养液。
(4) 乙酰甲基秋水仙碱储存液：10μg/ml水溶液，滤过消毒。

(5) 0.3%谷氨酰胺储存液。
胎牛血清(FCS)。
(7) Lymphopaque。
脂多糖。
(9) 培养(细胞)计数器。
(10) 细胞离心机。
(11) CO2孵箱。
2. 直接原位单拷贝PCR(DISC-PCR)部分
(1) 10mmol/L dATP、dCTP、dGTP、dTTP。
(2) 5mmol/L生物素-16-dUTP。
(3) 寡核苷酸引物可在ABI DNA合成器上合成。除了常规乙醇沉淀和洗涤，不需要进一步纯化即可直接使用，浓度为20μmol/L。
(4) Taq DNA 聚合酶。
(5) 10×Taq 聚合酶缓冲液 100mmol/L Tris-HCl pH8.3，500mmol/L KCl, 15mmol/L MgCl2，0.1%BSA。
显微镜载玻片和20mm×50mm 盖玻片，浸泡在无水乙醇中，在用滴加法分离中期染色体前用软布擦干净。
(7) 橡皮粘胶。
3. 信号检测部分
(1) 20×SSC。
(2) PBS缓冲液调pH值到7.4。
(3) 工作缓冲液 100mmol/L Tris-HCl pH7.5，150mmol/L NaCl，0.2% Tween，0.3% Triton。
(4) 阻断缓冲液 100mmol/L Tris-HCl pH7.5，150mmol/L NaCl，0.5%阻断剂(BMB Genius Kit)，配制时，先配Tris - NaCl液，后加阻断剂搅拌到至溶解，约需1h。
(5) 链霉素抗生物素辣根过氧化物酶，1mg/ml。
快红。
作者: 荷塘青蛙！ 时间: 2011-8-24 16:43

(7) 四甲基联苯胺(TM。
(二) 操作方法和步骤
1. 从小鼠脾细胞中培养淋巴细胞
(1) 处死小鼠，取出脾脏。
(2) 将脾脏放入培养皿中，用25号针吸5ml RPMI培养液，加压冲洗脾细胞2次，135g 离心洗出液10min, 收集沉淀，重悬于2ml RPMI-1640 培养液中。
(3) 加3ml PBS到细胞悬液中，在微离心管内加3ml Lymphopaque,然后将细胞悬液加在Lymphopaque 上，911g 室温下离心20min,可见一清晰条带。
(4) 用细移液管取出淋巴细胞，用含15%FCS和0.03%谷氨酰胺的RPMI-1640培养液洗细胞。
(5) 低转速沉淀细胞[同第(3)步]，重悬于10ml RPMI-1640 培养液中，计数细胞。
以106/ml的密度，用含有0.03%谷氨酰胺和15%FCS的RPMI-1640培养液培育10ml细胞，在37℃下培养72h, 然后以0.25mg/ml浓度加入脂多糖，刺激细胞生长。(在培养皿表面分开的淋巴细胞生长为细胞柱，这些细胞柱的数目是衡量培养好坏的指征)。
2. 人血淋巴细胞的培养
(1) 用消毒玻璃棒去掉血中纤维蛋白。
(2) 用5~10ml PBS稀释10~20ml 去纤维蛋白血液，然后加3.5ml在Lymphopaque上，911g室温下离心20min,可见一清晰条带。见“(二)操作方法和步骤同1(3)~”步吸取淋巴细胞及培养细胞。
3. 用标准技术制备中期染色体
(1) 在培养液中加终浓度为0.1μg/ml的乙酰甲基秋水仙碱培养1~2h。
(2) 手掌拍打培养瓶侧面使贴壁细胞脱落，135g离心10min收集细胞。真空吸去上清液。
(3) 重悬细胞于约10ml低张溶液(如75mmol/L KCl)中，37℃孵育10min或室温2min。
(4) 用血细胞计数器检测低张溶液中细胞的浓度，用Ames Cyto-Tek细胞离心机制备中期染色体的最佳细胞浓度是(1~2)×105/ml。用低张KCl稀释校正标本浓度。
(5) 将准确体积的标本加样于用乙醇清洗过的玻片上，用2500g离心10min。
在相差显微镜下检查初次展开的细胞的浓度是否需要校正。可以通过调节2~3个浓度参数去获得最佳分离效果。
注：如细胞浓度太高细胞散离差，形成稠密堆积；细胞浓度过低引起中期染色体展开或拉长。
(7) 用吸水纸吸去细胞边缘多余的液体，在空气中放置2min，然后放入一装有KCM培养液的广口瓶中室温下10min。
4. DISC-PCR
(1) 在PBS中洗10min, 在70%、80%、95%、100%乙醇中梯度脱水各5min。
(2)在微离心管中准备如下溶液(每张标本) dATP，dCTP，dGTP各200μmol/L；100μmol/L dTTP；100μmol/L生物素-16-dUTP；1.5μmol/L引物；2.0μl 10×Taq缓冲液；2.5U Tap聚合酶和去离子水20μl。
(3) 将以上反应混合液加在有中期染色体的载玻片上，盖上盖玻片。用橡皮粘胶封固盖玻片四周。
(4) 室温空气干燥橡皮粘胶，载片边缘涂上一层指甲油。
(5) 按以下热循环程序孵育标本 94℃ 3min→退火温度1min→ 72℃ 1min→92℃ 1min , 循环24次(总25次)，最后延长3~5min。
用软纸擦去指甲油，在100%乙醇中提插几次玻片，揭去橡皮粘胶，轻轻的去掉盖玻片(从此步开始应小心不能让标本干，但可用滤纸吸去玻片边缘多余液体)。
(7) 立即将标本浸入4×SSC中3min,然后浸入阻断缓冲液中1h。
作者: 荷塘青蛙！ 时间: 2011-8-24 16:43

5. 信号检测
(1) 从阻断缓冲液中取出标本，轻轻甩去多余液体，每片加100μl用工作缓冲液按1 ：100稀释的链霉抗生物素辣根过氧化物酶(如果出现背景问题，减少链霉素抗生物素偶联辣根过氧化物酶浓度或(和)增加洗涤时间)。
(2) 盖上盖玻片，湿盒中37℃孵育1h。
(3) 室温下用工作缓冲液洗10min, 再用0.1mlo/L Tris-HCl pH7.6 洗5min。
(4) 加100μl TMB, 盖上盖玻片，室温下1~2min(可呈现蓝色信号)。
(5) 用去离子水洗5min。
用快红复染5min, 流水冲洗。
(7) 梯度乙醇脱水(40%、70%、80%、95%)各5min。
常规方法封片。
(9) 用差相显微镜读片。
二、在细胞和石蜡切片上检测低拷贝DNA序列的原位PCR方法
原位PCR技术综合了原位杂交和液相PCR技术的优点，成为在细胞和组织切片内检测低拷贝数目RNA或DNA的一个敏感的方法。虽然存在重复性不够
好和假阳性等问题，但这种技术正广泛地应用于病毒病原体研究等多个领域。
本文介绍一种在培养细胞和组织切片上检测单拷贝人巨细胞病毒(CMV)和人乳头瘤病毒(HPV)核酸序列的原位PCR操作方案。本方案强调直接和间接原位PCR的严格的标准化步骤。
重点是：①不同材料(载玻片上培养的HeLa细胞、石蜡包埋组织、微孔板上培养的MRC5细胞等)的制备；②适当的固定时间、蛋白酶水解消化时的酶浓度和消化时间；③寡核苷酸引物的选择；④PCR溶液中各种不同试剂的最适浓度；⑤选择反应的热循环参数。
(一)试剂和材料
1. 聚-L-赖氨酸包被的载玻片制备部分

(1) 去离子水。
(2) 洗涤剂。
(3) 乙醚。
(4) 无水乙醇。
(5) 聚—L—赖氨酸氢溴化物。
Triton X-100。
(7) 1mol/L Tris-HCl pH8.0。
26mm×76mm载玻片。
(9) 玻璃染皿。
作者: 荷塘青蛙！ 时间: 2011-8-24 16:44

(10) 60℃烤炉。

2. 石蜡包埋组织部分

(1) 石蜡。
(2) 37％甲醛固定液。
(3) Na2HP04，KH2P04。
(4) 80％、95％和100％乙醇
(5) 二甲苯。
自动固定器。
(7) 铜包埋盒

3. 组织切片制备部分
(1) 0.1mol/L Tris-HCI pH7.4。
(2) 0.1%胶水(用去离子水稀释纯白胶)。
(3) 吸水纸。
(4) 切片机及刀片。
4. 培养细胞部分

(1) HeLa细胞(ATCC)。
(2) MRC5细胞(ATCC)。
(3) EMEM培养液。
(4) RPMI-1640培养液。
(5) 5％或10％胎牛血清(FCS)。
PBS。
(7) 二甲基亚砜DMSO。
地塞米松。
(9) 庆大霉素。
(10) 非必需氨基酸。
(11) 1％和2％甲醛缓冲液。
(12) 巨细胞病毒种属AD169(ATCC)。
(13) 冰预冷丙酮。
(14) 10cmPetri培养皿。
(15) 聚-L-赖氨酸包被的载玻片。
(16) 96孔组织培养板。
(17) 湿盒。
(18) 低速离心机。
(19) 玻璃染缸。
(20) 组织培养层流工作台。
5. 蛋白水解消化，病毒DNA变性和原位PCR部分
(1) 蛋白酶K，分装后存于一20℃。
作者: 荷塘青蛙！ 时间: 2011-8-24 16:44

(2) 100mmol/LdNTPs溶液。
(3) 0.1mo1/LTris-HCl，pH8.0。
(4) 10mmo1/L EDTA。
(5) 10×Taq平衡液 100mmol/L Tris-HCl pH8.5，500mmo1/L KCl，50mmo1/L MgCl2(为进行HPV分析)，25mmo1/L MgCl2(为CMV分析)，0.1％明胶，0.5％Tween-20，0.5％Nonidet P40。
0.4mmo1/L生物素-14-dATP溶液。
(7) 寡核苷酸引物(表3-4)由Genset合成，纯化，并用聚丙烯酰胺凝胶电泳检查。
TaqDNA聚合酶。
(9) 22mm×22mm盖玻片。
(10) 橡皮粘胶。
(11) PCR机。
6. 放大产物的检测部分
(1) PBS 0.1mol/L。
(2) Tris-HCl，pH7.4。
(3) 20×SSC 3mo1/L NaCl，0.3mo1/L柠檬酸三钠 pH7.5。
(4) 四唑氮蓝(NBT)，5-溴-4-氯-3-磷酸吲哚(BCIP)。
(5) 碱性磷酸酶抗生物素。
100％乙醇。
(7) 缓冲液A (存于－20℃)
组成： 0.02mo1/L NaH2P04
0.08mo1/L Na2HPO4
0.1mo1/L NaCl，5％BSA
0.5％TritonX-100
缓冲液B (存于4℃)
组成： 1mol/L Tris-HCl pH9.6
0.1mo1/L NaCl
50mmol/L MgCl2
(9) 为检测HPV，CMV，HIV的生物素化的探针。
(10) 去离子甲酰胺混合500ml甲酰胺和50g离子交换树脂(AG501-X8 CD)，10g活性碳，在4℃搅拌过夜，用滤纸过滤，5m1分装，储存于－20℃。
(11) 硫酸右旋糖酐：加100g硫酸右旋糖酐于100ml去离子水中，加热到60℃使其溶解，2m1分装，储存于－80℃。
(12) 鲑鱼精子DNA(10mg/m1) 用去离子水1：10稀释，250µl分装，存于－80℃。
(13) 水溶性封片液。
作者: 荷塘青蛙！ 时间: 2011-8-24 16:44

(14) 37℃和40℃烤炉。
(15) 小刀片。
(16) 光学显微镜和倒置显微镜。

表(3-4)：原位PCR中所用的寡核苷酸引物序列
名称  来源  序列
MY11  上游引物,位于HPV6/6722-6741(41)  5'GCM CAG GGW CAT AAY AAT GG3'
MY09  下游引物,位于HPV6/7170-7151(41)  5’CGT CCM ARR GGA WAC TGA TC3’
IE1  上游引物(41)  5’CCA CCC GTG GRG CCA GCT CC3’
IR2  下游引物(42)  5'CCC GCT CCT CCT GAG CAC CC3'
GAPDH1  上游引物  5'ATC ACC ATC TTC CAG GAG CG3'
GAPDH2  下游引物  5'CCT GCT TCA CCA CCT TCT TG3’
(二)操作方法和步骤
1. 聚-L-赖氨酸包被载玻片的制备
载玻片的处理和处理后放置的时间对成功的原位PCR是很重要的。干净的聚-L-赖氨酸包被的载玻片可使细胞和石蜡包埋的组织切片很好地贴附而无任何背景。要获得最好效果，载玻片应在使用前制备，不得早于1～2周。
(1) 0.05%多聚-L-赖氨酸氢溴化物溶液：在2L含200µl TritonX-100的
0.1mo1/L Tris-HCl pH8.0溶液中溶解100mg多聚-L-赖氨酸。贮存于4℃，如出现云雾状应弃去。
(2) 载玻片用洗涤剂清洗后用流水冲洗，浸入去离子水中浸洗2次，每次不少于10min。然后浸入无水乙醇中浸洗2次，每次10min，再浸入1:1 100%乙醇和乙醚的混合液中10min,取出室温干燥。
(3) 室温下用多聚-赖氨酸溶液浸泡载玻片20min后用吸水纸吸干多余液体在60℃烤箱中烤干1h。
(4) 室温存放于片盒中。
2. 石蜡包埋组织的制备
(1) 制备1％甲醛缓冲溶液用0.1mol/L Na2HPO4, 0.04mol/L KH2P04 pH7.2溶液将40％的甲醛稀释为1％。
(2) 细胞和组织的固定对原位PCR的效果有很大影响。用甲醛固定对此方案较适合，可提供很好的渗透性并使PCR试剂达到目标序列，并可形成一个物理的屏障防止PCR产物的扩散。用同样方法固定培养在载玻片上的HeLa细胞。培养在微孔板上MRC5细胞，用2％甲醛缓冲液和乙醇／丙酮的混合液固定20min，可产生PCR产物的最好检测效果。将组织块浸入1％甲醛缓冲溶液中一定时间，根据不同组织，固定时间在20 min～24h之间,一般组织固定12h以上适合于扩增。
(3) 在梯度乙醇中脱水 2×80％、2×95％、1×100％，各30min。
(4) 在二甲苯中孵育3次，每次60min。
(5) 石蜡包埋在60℃石蜡中浸蜡1h后，将组织块放入预热的铜包埋盒中进行常规包埋。
3. 组织切片的制备
(1) 切4～10µm厚的带状连续切片。在每一组织块切后清洁刀片，防止标本间的污染。
(2) 在每一预处理过的载玻片上滴1滴胶水。
(3) 每一载玻片上放2张切片于胶水上，并用小刷子铺展开。
(4) 将载玻片放在45℃热板上。
(5) 在切片完全铺好后，从热板上取下载玻片，并用吸水纸吸干多余胶水。
在60℃烤炉中烤切片90min，然后在20℃中晾24h，装入载玻片盒存于室温。切片在制备后12h内不得使用。
(7) 将切片放在60℃热板上5min，然后在二甲苯中脱蜡3×5min。
作者: 荷塘青蛙！ 时间: 2011-8-24 16:45

在2×100％、2×95％、2×80％的梯度乙醇中依次水化，每次5min。
(9) 在0.1mol/L Tris-HCl，pH7.4中浸泡5min(此步以后任何时候不应让切片干)。
4．HeLa培养细胞的制备
(1) 在每一个10cm×10cm培养皿中放5张预处理过的载玻片。
(2) 将HeLa细胞以106/m1的浓度重悬于30ml含有10％胎牛血清, 1％非必需氨基酸和56mg／L浓度的庆大霉素的EMEM培养液中，加入准备好的培养皿中。37℃ 5％CO2的孵箱中孵育24h。
(3) 将载玻片放入有1％甲醛缓冲液中22℃固定12h。吸干多余液体，在22℃干燥1h。如固定时间<12h，扩增效果和分辨率降低。
(4) 在2×100％、2×95％、2×80％的梯度乙醇中依次水化，每次5min。
(5) 在0.1mol/L Tris-HCl，pH7.4中浸洗5min(此步以后在任何时候不应让切片干掉)。
5．MRC5细胞的制备
(1) 重悬MRC5细胞在含有5％FCS和56mg/L庆大霉素的RPMI－1640培养液中，以每孔1.5×104/200µl的浓度计算并种植于96孔板上，在37℃ 5％CO2孵箱中孵育48h。
(2) 吸去培养液，每孔加200µl含有0.1％地塞米松和1％DMSO的用RPMI稀释的血液白细胞。
(3) 在30℃、200g离心1h以增加病毒感染力。
(4) 吸去上清，每孔加200µl含有10％FCS，0.1％地塞米松和1％DMSO的RPMI，以增加病毒复制。在37℃，5％CO2的条件下孵育16h。
(5) 用PBS洗2次。
用2％甲醛缓冲液室温下固定20h, 然后在4℃的冷乙醇:丙酮(90：1)的混合液中固定20h。
(7) 从以上固定液中取出便可用于原位PCR。
设置特异性的阳性对照用CM—VADl69感染的MRCS细胞，平行做原位PCR。
6．原位PCR
(1) 蛋白酶水解消化 (酶浓度越低其渗透性越差，浓度过高会损伤组织，消化时间在20min以上会导致扩增产物丢失。对微孔板培养的MRC5细胞，由于不须保存细胞形态，故蛋白水解消化一步可省略)。
1) 用预热的稀释在0.1mo1/L Tris-HCl pH8.0/10mmol/L EDTA中的蛋白酶K(组织切片浓度为10µg/m1，制备在载玻片上的HeLa细胞用20µg/m1)孵育载玻片上固定好了的组织切片和细胞，37℃，20min。在PCR机内95℃孵育标本2min使蛋白酶K失活。
2) 用0.1mol/L Tris-HCl pH7.4洗2×5min。
(2) 组织切片和HeLa细胞上病毒DNA的变性
1) 在标本上加100µl 1×Taq缓冲液，用盖玻片覆盖，并检查有无气泡。
2) 在PCR机上95℃孵育5min，然后放在冰上。轻轻揭开盖玻片，甩掉表面的液体。
作者: 荷塘青蛙！ 时间: 2011-8-24 16:45

3) 制备扩增混合液：2.5µl 10×Taq缓冲液，终浓度为200µmol/L的四种dNTPs，(在直接原位PCR中，dATP中含有100µmol/L生物素—14--dATP和100µmol/L未标记dATP)，二种引物MY09－MYll终浓度各100µmol，3.5UTaq聚合酶，去离子水加至30µl。
(3) MRC5细胞上病毒DNA的变性
1) 在微孔板的每个小孔中加20µl的1×Taq缓冲液，用蜡膜覆盖微孔板。
2) 在200g下离心10s以使平衡液分布均匀。
3) 扩增混合液中，除引物为每孔50µmol的IEl和IE2及聚合酶为1U/孔外，其它均与(2)，1)一样。
(4) 直接原位PCR
1) 在每张载玻片上或微孔中放30µl扩增混合液。
2) 用盖玻片覆盖标本，并用橡皮粘胶封固盖玻片边缘；用1cm×lcm大小的蜡膜覆盖每个微孔，再用一张大的蜡膜覆盖整块微孔板，以防止蒸发。
3) 按以下程序完成原位PCR。对人乳头瘤病毒：95℃ 60s变性，57℃ 90s退火，74℃ 90s延伸20个循环，然后74℃ 3min再延伸1次，30℃10s终止反应。对HeLa细胞和组织切片，按以上程序15～20次循环后即可得到最佳信号。对CMV DNA：95℃ 60s变性，55℃ 60s退火和延伸× 20次循环。
注：对HPV和CMV DNA的扩增，时间和温度应根据其使用的PCR扩增仪来优化。最佳退火温度根据每种寡核苷酸引物来确定。热循环次数可参照液相PCR，次数太少则信号不足；次数太多则背景增高，并可损伤组织和损失信号。
(5) 间接原位PCR 在这个实验中，扩增混合液中仅含未标记dNTP，其它程序均与直接原位PCR相同。
7. 组织切片和HeLa细胞直接原位PCR扩增产物的检测
(1) 用小刀揭去盖玻片，并用刀片刮掉橡皮粘胶。在0.1mol/L Tris-HCl pH7.4，洗2×5min。
(2) 在冰预冷的100％乙醇中固定10min。
(3) 80％乙醇中水化5min后用0.1moI/L Tris-HCl pH7.4，洗2×5min。
(4) 每个标本加100µl 用缓冲液A以1：200稀释的碱性磷酸酶抗生物素，37℃下湿盒中孵育30min。
(5) 用1×PBS洗2×5min。
用缓冲液B以0.33mg/m1浓度稀释NBT和以0.16mg/ml浓度稀释BCTP，混合成为底物缓冲液，每个标本上加100µl。
(7) 暗室中，室温孵育1～3h。
去离子水中洗2× 5min终止反应，然后室温晾干。
(9) 用水溶性封片液封片，光镜检查。在阳性细胞中可发现棕紫色信号。
(10) 直接原位PCR在获得最佳效果时，比间接原位PCR的非特异性信号少。
8. MRC5细胞直接原位PCR扩增产物的检测
(1) 去掉蜡膜，小心地吸去PCR反应液。
(2) 用0.1mol/L Tris-HCl pH7.2，洗2×5min。
(3) 将微孔板浸入100％乙醇中固定10min。
(4) 80％乙醇中水化5min后用0.1mol/L Tris-HCl pH7.4，洗2×5min。
(5) 每个标本加100µl用缓冲液A以1：200稀释的碱性磷酸酶抗生物素，37℃下湿盒中孵育30min。
作者: 荷塘青蛙！ 时间: 2011-8-24 16:45

用1×PBS洗2×5min。
(7) 用缓冲液B以0.33mg/m1浓度稀释NBT和以0.16mg/ml浓度稀释BCTP，混合成为底物缓冲液，每个标本上加100µl。
暗室中，室温孵育1～3h。
(9) 严密监测颜色生成，然后用去离子水洗2×5min终止反应。 ·
(10) 每孔加100µl去离子水防止细胞干燥，在倒置显微镜下观察结果。
9. 间接原位PCR扩增产物的检测
(1) 用小刀揭去盖玻片，并用刀片刮掉橡皮粘胶，或去掉蜡膜。
(2) 在0.1mol/L Tris-HClpH7.4，洗2×5min。
(3) 在冰预冷的100％乙醇中固定10min。
(4) 80％乙醇中水化5min后用0.1moI/L Tris-HClpH7.4，洗2×5min。
(5) 每份杂交缓冲液中含2×SSC，50％去离子甲酰胺，10％的硫酸葡聚糖，250µg/m1鲑鱼精子DNA，和5ng探针，共20µl，加在载玻片上或小孔中，用盖玻片覆盖。
在96℃水浴中变性靶DNA和探针DNA 5min。
(7) 湿盒中42℃原位杂交过夜。
将载玻片浸入4×SSC中室温下1～2min可使盖玻片脱落。
(9) 用2×SSC室温下洗3～5min，然后在42℃的2×SSC，0.5×SSC，和0.1×SSC中各洗5min。
(10) 每个标本加100µl用缓冲液A以l：200稀释的碱性磷酸酶抗生物素，37℃下湿盒中孵育30min。
(11) 用1×PBS洗2×5min。
(12) 用缓冲液B以0.33mg/ml浓度稀释NBT和以0.16mg/m1浓度稀释 BCTP，混合成为底物缓冲液，每个标本上加100µl。
(13) 暗室中，室温孵育1～3h。
(14) 去离子水冲洗2×5min终止反应，然后室温晾干。
(15) 用水溶性封片液封片，光镜检查；或每孔加100µl去离子水防止细胞干燥，在倒置显微镜下观察结果。在阳性细胞中可发现棕紫色信号。
三、冰冻切片上的逆转录原位PCR
PCR是实验室常用的一种高敏感的技术，应用于扩增低拷贝或单拷贝基因序列。通过与其它多种方法相结合，PCR已从单一液相的DNA、mRNA的放大和检测发展为对组织切片上靶目标的信号的原位PCR技术。与原位杂交相比，原位PCR的敏感性要高出几个数量级。
本文介绍在冰冻切片上的原位逆转录PCR(1S—RT—PCR)：在载有冰冻切片的载玻片上直接放大感兴趣的片段，将地高辛、生物素或放射物质标记的核苷酸结合到放大产物中，并用抗体或放射自显影进行检测。本方法适用于各种型号的载玻片，可以在3mm×3mm大小的组织切片和可放入500µg的薄壁PCR管中，在小的载玻片上进行标准的PCR反应。
本方法的要点是：
作者: 荷塘青蛙！ 时间: 2011-8-24 16:46

第一、设计针对目的核酸序列的特异寡核苷酸引物对。
第二、原位PCR可检测单个细胞中的基因组DNA或mRNA片段。反应过程中胞浆mRNA首先丧失或降解，逆转录酶或寡核苷酸引物难以和胞浆中低水平的mRNA形成足够量的结合，除了当被检测的细胞过度表达目的mRNA外，可检测出的大多是核的DNA或其它mRNA的阳性反应。
第三、更多的循环导致特异性降低和背景增强。如果检测组织或细胞中存在病毒DNA的单拷贝(如对HIV的分析)，可以通过增加热循环次数来适当的提高分析的灵敏度。在这种情况下本方法中将循环次数设定在7～10次。这样可不用DNA酶和RNA酶，而背景不会增加，因为没有基因组DNA去竞争。但是，实验必须用未感染组织作对照。
第四、原位PCR分析敏感性高，在组织切片上进行PCR反应可能带来诸如非特异性扩增；内源性启动合成；DNA修复人工假象的扩增；扩增产物相互融合以及检测出基因组DNA而不是mRNA等一些问题。通过仔细的预实验和严格的对照可以避免或减少以上问题发生。
第五、通过充分洗涤减少假阳性反应和背景。需预实验摸索扩增中的最佳解链和延伸温度、Mg2+离子浓度和pH值。
第六、本方法已成功检测EGF受体、人和鼠的PDGF、TGF－α、TGF－β、flil，H.ras和P53等。某些同源序列存在于交叉种类中，例如在EGF受体中，同样的引物已被用于特异的检测人类、猫科动物、鼠类、和兔的受体。
(一) 试剂和材料
所有的溶液均用高压消毒的去离子水配制；每月至少检修一次微加样器，用超声波和肥皂清洗并校准；所有操作时带手套均用消毒微加样器头；保持环境清洁。
1. 组织制备
(1) ProbeOn P1us载玻片(Fisher) 与其它载玻片比较，在这种载玻片上组织和细胞贴附最好且背景最小。
(2) 异丙醇(存于－20℃)。
(3) 去离子水。
(4) PBS-DIFP(洗液) PBS+0.1pmo1/L DIFP(注：凡含DIFP的溶液应在其使用前现配)。
(5) 0.1mmol/L DIFP(Dlisopropyflu—orophosphate)溶于异丙醇中,－20℃。
10％甲醛缓冲液。
(7) 3％多聚甲醛缓冲液(新鲜配制):100mmo1/磷酸钠pH7.4 5mmol/L MgCl2，3％多聚甲醛。
10％Nonidet P-40按0.1％浓度，稀释于PBS中使用。
(9)10×DNA酶缓冲液 0.4mo1/L Tris-HCl pH7.9,100mmol/L NaCl，60mmo1/L MgCl2。
(10) RQI无RNA酶的DNA酶。
(11) 1mg/m1蛋白酶K 溶于2mmo1/L CaCl2，20mmol/L Tris-HCl pH7.5，工作液浓度为10µg/m1。
(12) 2mg/m1胰蛋白酶原，溶于0.01N HCl中。中和液：0.1mo1/L Tris-HCl pH7.0，0.1mol/L NaCl，0.1µmo1/L DIFP。
(13) RNasin。
(14) 湿盒(在作ISH时应用一个可以保持湿润的塑料盒子)
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2. 逆转录
(1) 2.5mmo1/L dNTPs。
(2) 10µmo1/L寡核苷酸引物。
(3) RT酶 M-MLTV(Gibco)。MV和M-MLTVRT酶的最佳反应温度在37～42℃之间，推荐时间为1h，这种耐热的RT酶将用RNA或DNA作为底物。为了增加寡核苷酸引物结合到mRNA上的特异性，反应温度可增至50℃。
(4) 10mmol/L DTT。
(5) 5×RT缓冲液 50mmol/L Tris-HCl pH8.3，250mmo1/L KCl，7.5mmo1/L MgCl2。
盖玻片。
(7) RNasin。
3. PCR扩增
(1) 用重层铝板覆盖的PCR机。
(2) 橡皮粘胶。
(3) 20×SSC 3mmo1/L NaCl，300mmol/L柠檬酸三钠。
(4) 10×Taq聚合酶缓冲液 100mmo1/L Tris-HCl pH8.3， 500mmol/L KCl , 15mmo1/L MgCl2。
(5) 50mmo1/L MgCl2。
2.5mmo1/L dNTPs。
(7) Taq I DNA聚合酶。
10µmo1/L 5′和3′端寡核苷酸引物对。
(9) 2.5µmo1/L地高辛-11-dUTP。
4. 免疫检测
(1) 10％TritonX-100。
(2) 顺丁烯二酸盐缓冲液 100mmol/L顺丁烯二酸，150mmo1/L NaCl pH7.5。
(3) Triton-顺丁烯二酸盐缓冲液 0.3％Triton X-100稀释于顺丁烯二酸盐缓冲液中。
(4) 4％绵羊血清用Triton-顺丁烯二酸盐缓冲液稀释。
(5) Fab-抗地高辛-碱性磷酸酶 1:500比例稀释在4％绵羊血清-Triton-maleate中。
NBT(色原)缓冲液 100mmo1/L Tris-HCl pH9.5，100mmo1/L NaCl，50mmo1/L MgCl2。
(7) 四唑氮蓝(NBT)。
5-溴-4-氯-3-磷酸吲哚(X-磷酸盐)。
(9) Levamisole(Sigma)。
(10) NBT染液 45µl NBT，35µl X—磷酸盐，加入0.24mg levamisole/m1的色原缓冲液中，配好后立即使用，用铝膜覆盖试管口存于4℃。
(11) TBE缓冲液 l0mmol/L Tris-HCl pH8.0，lmmol/L EDTA。
(12) 75％、95％和100％乙醇。
(13) 二甲苯。
(14) 盖玻片。
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(二) 操作方法和步骤
1. 组织制备
(1) 用常规方法制备组织冰冻块，修成约1cm3大小，切片后置于ProbeOn Plus载玻片中央。
(2) 用10％甲醛缓冲液或3％多聚甲醛室温下固定10min。
(3) 用PBS-DIFP洗3×5min。再用去离子水洗1次。
(4) 在切片上加100µl 0.1％ NP-40或胰蛋白酶原或蛋白酶K
注:尚无标准的方法去除粘附在核酸上的结合蛋白质。本步骤是否必要，完全根据所要扩增的RNA／DNA片段决定。恰当的处理可获得最佳形态学图像。消化处理应根据不同组织和固定的条件而定。用0.1％NP-40孵育30min是非常温和的消化，用胰蛋白酶原或蛋白酶K消化10min产生的结果很差。
(5) 用PBS-DIFP洗5min。
在标本上加l00µl含有8U DNA酶和75U RNasin的DNA缓冲液，并用盖玻片覆盖，湿盒中37℃孵育30min。
(7) 浸入PBS中，去掉盖玻片，然后放入－20℃预冷的异丙醇中30min终止反应并固定，再用PBS洗3×5min。
2. 逆转录
(1) 在标本上加l00µl含有400U逆转录酶，1.5mmol/L MgCl2，10mmol/L DTT，四种dNTPs各2.5µmol/L，0.1µmol/L 引物或0.12µmol/L寡核苷酸d(T)15的RT缓冲液。
(2) 盖上盖玻片，湿盒中50℃孵育30min。然后将标本浸入1×SSC中，去掉盖玻片，95℃水浴中孵育5min终止反应。
(3) 用1×SSC洗3×5min，然后用去离子水洗2×5min。
(4) 室温下自然干燥。
3. PCR扩增
(1) 在标本上放60µl反应混合物（l×Taq缓冲液中含有0.25U Taq DNA聚合酶，1.5mmol/L MgCl2，四种dNTPs各2.5µmol/L，0.125gmol/L 地高辛-11-dUTP，0.1µmol引物），去离子水加到70µl。
(2) 盖上盖玻片，再用橡皮粘胶封固盖玻片边缘。
(3) 将标本置于PCR机内，92℃预热5min。
(4) 变性92℃ 1 min，退火60℃ l min，延伸72℃l min，7～10个循环后，72℃保持10min。
注：放在PCR机上面的载玻片，在设定的温度达到之前有约lmin的间歇。根据不同的引物，PCR反应条件不一。在大多数反应中，完成7～8个循环足以获得好的结果。其反应温度和时间完全根据PCR机的型号而定。
(5) 扩增产物冷却到室温，浸入2×SSC中去掉盖玻片，用2×SSC洗2×5min，1×SSC洗2×5min，5×SSC洗1×5min。
4. 免疫检测
(1) 用含4％绵羊血清的Triton-顺丁烯二酸盐缓冲液预孵育标本2×15min。此间持续晃动。
(2) 用移液器吸去4％绵羊血清的Triton-顺丁烯二酸盐缓冲液。
(3) 将100µl Fab'-抗地高辛素滴放在标本上，盖上盖玻片，湿盒内室温下孵育至少3h。
(4) 用Triton-顺丁烯二酸盐洗5×5 min。
(5) 用NBT缓冲液预孵育2×5min。
去掉NBT缓冲液，每张标本上加l00µl NBT染液，室温下湿盒内孵育5min。
注：加NBT染液应仔细控制反应时间。染液浓度明显影响染色时间。对每一批新的染液，其条件可能明显地不一样。反应的灵敏度需要在预实验时通过试验确定。如果mRNA丰度低，就用一个低丰度的对照实验去检测其染色时间。推荐使用BoehrimgerMan-nheim所生产的试剂，染色5min即可。
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(7) 30s后重复以上(4)～(5)步过程。
立即用TBE洗2×5min终止反应，再用TBE洗3×5min。
(9) 通过75％、95％和100％梯度乙醇各2×5min脱水，二甲苯5min透明，然后立即封片。
注：也可将冰冻切片铺在切成小片段的载玻片上，放入试管中进行以上试验。其优点是在PCR扩增可进行热启动。缺点是手续繁多且易于损坏标本。
四、 HIV-1前病毒 DNA的原位PCR检测及流式细胞仪分析
新近发展起来的原位PCR技术结合了PCR和原位杂交两个技术的优点，目前已被广泛地应用于临床疾病，特别是感染性疾病的诊断。其检测敏感度可达到培养细胞和临床标本上的特异DNA(或逆转录RNA)序列的单拷贝水平，又能定位靶序列阳性细胞。这样就解决了标准PCR过程需不可避免地破坏组织和细胞以提取核DNA而使扩增的靶序列在细胞或亚细胞结构中无法定位的难题。流式细胞技术能对细胞的重要参数进行定量测定，并对不同种类细胞可以进行快速分选，在肿瘤学、细胞生物学、临床医学领域中得到广泛的应用。
该部分介绍的是一种敏感的原位PCR程序。该法在PCR产物中直接掺入地高辛标记的dUTP，可对人类细胞的免疫缺陷病毒—I型(HIV－I)前病毒DNA进行检测并用流式细胞计数分析HIV-I阳性细胞。本方法的灵敏性已达到1／10000精度。并已成功地应用于不同期的HIV-I感染人群外周血单核细胞HIV-I前病毒DNA携带细胞的百分率的检测，最合适的检测对象是那些疑有HIV感染但又缺乏确切血清学依据的人群如HIV阳性母体所生的婴儿，阳性患者的性伴侣，静脉吸毒者和可疑的血清反应者，目前成为HIV-I感染的主要监控手段和制定治疗计划的重要参考标准之一。
(一) 试剂和材料
1．细胞和培养液部分
(1) PBMC的获得取自于HIV－I阳性血清患者(制备HIV-I阳性血清患者的未固定的PBMC和淋巴母细胞瘤8E5LAV细胞必须在有适当保护设施)和健康献血者(阴性对照)。
(2) 8E5LAV淋巴母细胞瘤细胞系每个细胞上含有一个整合的HIV-I病毒基因组拷贝，以及每次实验中的阳性和阴性对照细胞。
阳性对照
用HLA－DQ(α)特异寡核苷酸引物分析PBMC或淋巴母细胞瘤8E5LAV细胞。
用HIV-lgag寡核苷酸引物分析淋巴母细胞瘤8E5LAV细胞。
阴性对照
用HIV-lgag特异寡核苷酸引物分析采自HIV-I阴性血清供血者的PBMC。
用非特异的寡核苷酸引物分析淋巴母细胞瘤细胞。以上特异或非特异的寡核苷酸引物序列参考 “表(3-5)引物序列”。

表(3-5)引物序列
7131—7155 λ噬菌体 5’GATGAGTTCGTGTCCGTACAACTGG3’7606—7630 λ噬菌体 5’GGTTATCGAAATCAGCCACAGCGCC 3’1551—1578 HIV-lgag(SK38) 5’ATAATCCACCTATCCCAGTAGGAGAAAT 3’1638－1665 HIV-lgag(SK39) 5’TTTGGTCCTTGTCTTATGTCCAGAATGC 3’HLS DQ(α)(GH26) 5’GGTGTAAACTTGTACCAG 3’HLS DQ(α)(GH27) 5’GGTAGCAGCGGTGAGTTG 3’
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(3) RPMI-1640培养液。
(4) Iscove改良的Dulbcco培养液(IM－DM)。
(5) 胎牛血清(FCS)。
Ficoll-Hystopaque密度梯度溶液d＝1077g／mllPharmacia。
2. 固定和渗透性处理
(1) PBS。
(2) 多聚甲醛(PF)用PBS配制1％的PF，pH7.4
注：在抽风厨中加热混合液到50～60℃，然后室温冷却，存于4℃，于固定前现配，存放2周以上的固定液不能使用。
(3) 链霉蛋白酶(pronase)储存液浓度为 10mg／ml，溶于 PBS中，或 50mmol/L Tris－HCl，5mmol/L EDTA，pH7.6中。在37℃下保温 2h，然后分装存于－20℃。
(4) 37℃水浴。
(5) 台式离心机。
3. 原位PCR
(1) dNTP，存于－20℃。
(2) 地高辛-11-dUTP，存于－20℃。
(3) Taq聚合酶(5U／ml)，存于－20℃。
(4) 寡核苷酸引物序列见“表(3-5)引物序列”。存于－20℃。
(5) 10×PCR缓冲液 100mmol/L Tris-HCl pH8.3， 500mmol/L KCl，25mmol/L MgCl2。存于－20℃。
去离子水。
(7) 矿物油。
4. 放大产物的检测及阳性细胞的流体细胞计数分析
(1) 阻断剂(作用为避免非特异抗体结合)，100mmol/L Tris-HCl pH7.6和150mmol/L NaCl，保存于4℃。
(2) 荧光素抗地高辛抗体用1％阻断剂以1：100稀释，临用前配制。
(3) 有氩激光装置及适当软件程序的流式细胞计数仪(如LysisⅡ，Becton-Dickin-son)。
(4) 配有紫外线灯和适合荧光检测的滤光片的荧光显微镜。
(二)操作方法和步骤
1. 细胞制备
(1) 在37℃，5％CO2湿润条件下，用RP－MI-1640培养液(加 10％FCS)培养指数生长的淋巴母细胞瘤8E5LAV细胞最佳密度为(1～2.5)×106/ml，室温下离心300g,5min，收集细胞小团，用 PBS洗 2次，以 2 × 106浓度重悬于PBS中，并立即处理。
(2) 采集HIV-I血清阳性患者或健康献血者血标本，放在含有7.5％EDTA-钾盐的Vacationer管中，在4h以内按以下程序处理：(最佳密度为1～2.5 ×106 /ml)
1) 用IMDM按1：l稀释静脉血标本，仔细地将5ml稀释血液加在盛于离心管内的4ml Ficoll His opaque密度梯度溶液上(不要让稀释的血液与密度梯度液混合)。
2) 在18～20℃下 400g，离心30～40min。
3) 用吸管吸去上层的血浆,留下分界面上未受扰动的淋巴细胞层。
4) 用另一新的吸管将淋巴细胞移到干净的离心管中。
5) 加至少3倍体积的PBS轻轻地重悬细胞，并用 PBS洗 2 ×5min，用 PBS以终浓度为1×106细胞/ml重悬细胞并立即处理。
2. 固定和渗透性处理
(1) 将 0.5～1×106的各种细胞标本分别放在微离心管内。
(2) 600g离心5min，弃上清。
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(3) 用250μl PBS重悬细胞，并重复(2)。
(4) 重复(3)。
(5) 用 300μl％多聚甲醛PF(溶于PBS pH7.4)固定细胞，室温下2h。(其他方法也可获得好的固定效果，如用 4％PF 30min，或 2％PF室温下2h)。
用 250µl PBS洗 2 ×5min，同(2)。
(7) 每管标本加200µl链霉蛋白酶溶液(10µg/ml)37℃水浴中5min。(蛋白酶处理对每一批酶和细胞类别都应确定正确的浓度和处理时间。在本实验中，蛋白酶浓度在10～20µg／ml，孵育5min，可获得最好效果并能很好地重复。如果省略渗透处理步骤，或渗透无效，阳性细胞的百分比会大大减少)。
在PCR机内95℃加热5min或煮沸2min使蛋白酶失活。
(9) 室温下用 250μl PBS洗标本 2×5min，600g离心5min，弃上清。
3. 原位PCR
注意所有材料和用具必须常规清洗并消毒，微移液器与微离心管作为原位PCR实验专用应与其它实验分开。
(1) 反应混合液的制备：第1管----49.5μl；，含以下成分：10mmol/L Tris-HCl，pH8.3；50mmol/L KCl；2.5mmol/L MgCl2(对PBMC和淋巴母细胞瘤 8E5LAV细胞系的最佳MgCl2。浓度为1.5～3.0mmo1/L，活性的顶峰通常在2.5mmol/L)；dATP，dCTP，dGTP每种各220µmol/L；dTTP215µmol/L；7µmol/L地高辛－dUTP(为了避免非特异性背景， dTTP与Dig-dUTP的比例在10：1到30：1比较好)；200µmol/L引物。
(2)从第1管取2.5μL溶液加入第2管，置冰上。
(3) 将制备好的细胞标本重悬于第1管溶液中。
(4) 将第 1管放入 PCR机中 82℃加热6min。
(5) 加 0.5µl Taq聚合酶到第 2管，仍放在冰上。
立即将PCR机的温度调至65～70℃，将第2管中的内容物加到第1管内，然后用预热到 65～70℃的矿物油 50µ l覆盖。
(7) 设置如下热循环程序：94℃5min→55℃90s→72℃90s→94℃60s×35次循环。
将标本置于冰上冷到4℃，用微移液器尖端从离心管底部吸取细胞放入Eppendorf管中(避免吸入矿物油)。用 250µl PBS洗2次，600g室温离心 5min。
4. 检测
(1) 将细胞标本悬于含l％阻断液的溶液中37℃孵育10min。
(2) 室温下 600g离心5min。
(3) 再悬细胞于含荧光素—抗地高辛多克隆抗体(1/1000稀释于1％的阻断溶液中)，室温下孵育30 min。
(4) 用 250µ l PBS洗 2 ×5min，室温下600g离心5min，再悬于 350µl PBS中。
(5) 将每种细胞悬液标本的一小滴放在载玻片上，用盖玻片覆盖，在荧光显微镜下分析，荧光通常出现在大多数阳性细胞的核中。
注：在应用标准PCR方法中，一个值的注意的问题是由于标本污染引起假阳性的结果。原位PCR扩增的产物主要位于核膜以内，虽然偶尔也会显示弥散的细胞浆阳性，理论上扩增产物可从阳性细胞弥散进入阴性细胞，然而不可能像污染那样弥散到阴性细胞核内。因此，用细胞内荧光素的形态学检查来鉴别阳性细胞应该结合流式细胞计数分析结果
根据说明书标准化流式细胞计数仪的灵敏度，用事先制备好的鸡血红细胞或刻度珠校准仪器，使仪器的荧光信号足够的大，CV值尽量小。
作者: 荷塘青蛙！ 时间: 2011-8-24 16:49

(7) 将以上制备好的细胞悬液上机检测。收集一定数量的细胞检测结果并存入计算机。
推荐的上机顺序是：阴性对照，检测标本，阳性对照。不同的样品分别有四个检测通道：FSC—前向角散射，表示细胞大小；SSC-90°散射，表示细胞的颗粒性；FL1—测绿色荧光；FL2—测红色荧光。
处理结果并打印。
五、细胞内mRNA的原位PCR扩增
近年来，PCR与逆转录酶结合的逆转录PCR(reverse tran-scription PCR，RT-PCR)技术得到了大量的改进，在基础研究和临床诊断方面被越来越广泛的应用，原位RT-PCR技术也由此应运而生。原位RT-PCR可将mRNA原位反转录为cDNA，然后进行原位PCR，因此可用于扩增和检测标本中罕见的mRNA，比如定量细胞表达特殊mRNA的丰度或检测扩增产物的细胞起源。其优点是逆转录后，即在显微镜观察的载玻片上进行扩增，鉴定信号细胞起源，不需从标本中提取mRNA。这样，就不会有在核酸的分离步骤中潜在的信号丢失。该技术也可用于检测细胞群中基因表达的趋势。
该技术的一个要点是要保持酶和试剂可以自由地进入细胞的渗透性和PCR产物保留在细胞内不扩散性之间的平衡。这常常是比较困难的。实验表明，反复摸索最佳的固定和消化条件并形成严格的程序是非常重要的，对每个所使用的引物必须进行仔细地设计。
本文介绍将活化的人外周血淋巴细胞离心制备在载玻片上，然后进行原位PCR以检测粒酶A(granzyme A)和穿孔素(perforin) mRNA的方法。粒酶A和穿孔素是细胞毒 T－细胞、NK细胞和活化的淋巴细胞因子杀伤细胞的功能标记物，在试管中激活后可在成人周围淋巴细胞检测出。本技术将生物素化的核苷酸直接掺入到PCR产物中，然后用抗生物素抗体的免疫细胞化学方法来检测标记物，本法不适合用于组织切片，因为受损的 DNA可以启动并延伸这个反应，标记的核苷酸可以被结合到非特异的产物中，产生非特异性结果。
(一) 试剂和材料
1. 载玻片制备部分
(1) 载玻片和盖玻片。
(2) Decon90。
(3) 丙酮。
(4) 3－氨丙三乙基硅烷(3-Aminopropy-triethoxysilane，Sigma)。
(5) 溶于四氯化碳的l％二甲基二氯硅烷(Dimethyl dichlorosilane)。
DEPC(Diethyl pyrocabonate)处理的双蒸水(DEPC-ddH2O)。
注：实验中应尽量避免 RNA酶污染。先配制0.1％DEPC水溶液, 37℃下放置过夜，并在使用前高压消毒 30min。所有溶液均需用此DEPC溶液配制，但Tris缓冲液不能用DEPC直接处理。玻璃器皿及金属用品应用铝箔包裹，在 200℃烤炉中烘烤4h以除去RNA酶。操作中必须戴手套，如载玻片必须放在实验台上，应在台上铺一层铝箔，并用镊子镊取载玻片。
2. 细胞制备部分
作者: 荷塘青蛙！ 时间: 2011-8-24 16:49

(1) PBS。
(2) PHA(植物血凝素) 1mg/ml。
(3) 淋巴细胞分离液。
(4) 人外周血(抗凝)。
(5) PMA (Phorbol-12-myristate-13acetate)500ng/ml。
RPMI-1640 加入 10％FCS，2mmol/L L-谷氨酰胺，100U/ml青霉素和 100μg/ml链霉素。
(7) 37℃组织培养箱。
可做细胞离心涂片的冷冻离心机。
3. 固定部分
从此步开始，保证实验在无RNA酶环境中进行。
(1) 临用前用DEPC-PBS配制4％的多聚甲醛溶液。在通风橱内加热混合液至60℃并持续搅拌至少1h，让多聚甲醛完全溶于DEPC-PBS中，冷却至室温使用。
(2) DEPC－3×PBS，DEPC－l×PBS。
(3) DEPC－双蒸水。
(4) 50％、80％、100％梯度乙醇，均用DEPC-双蒸水配制。
4. 蛋白酶K消化
以下所有均为储存液。
(1) 蛋白酶K 10mg/ml溶于0.1mol/L Tris-HCl，pH8.0。
(2) 1mol/LTris-HCl，pH8.0。
(3) 500mmo1/L EDTA，pH8.0。
5. 杂交和逆转录
(1) 杂交溶液：50％甲酰胺；10％硫酸葡聚糖；300mmo1/L NaCl；20mmol/ L Tris- HCl，pH7.6；5mmol/L EDTA；1×Denhardt's；10mmo1/L DTT。
(2) 1μg/ml的反义引物序列。
(3) MMLV逆转录酶(Life Tech公司)。
(4) 5×逆转录缓冲液。
(5) 100mmo1/L dNTPs原液。
100mmo1/L DTT。
(7) RNA酶抑制剂。
牛血清白蛋白(BSA) 10mg/ml，DEPC-H2O配制。
(9) DEPC-ddH20。
(10) DEPC-2×SSC。
作者: 荷塘青蛙！ 时间: 2011-8-24 16:49

(11) 湿盒。
(12) 42℃杂交炉。
(13) 37℃杂交炉。
6. 原位PCR
(1) Taq聚合酶。
(2) 10×Taq聚合酶缓冲液。
(3) 100mmo1/L dNTPs原液。
(4) 22.5mmo1/L生物素-11-dUTP。
(5) 25mmol/L MgCl2。
矿物油。
(7) 二甲苯。
PCR机。
(9) 粒酶A引物
5'-CCAGAATCTCCATTGCACGA 5'-CTGTAACTTGAACAAAAGGT
(10) 穿孔素引物
5'-ACATGGAAACTGTAGAAGCG 5'-GGATTCCAGCTCCATGGCAG
7. 扩增产物的检测部分
(1) 人AB型血清。
(2) 10％BSA(溶于PBS)。
(3) 辣根过氧化物酶(HRP)-兔抗小鼠IgG抗体。
(4) 小鼠抗生物素单克隆抗体。
(5) 底物DAB 0.6mg/ml，溶于PBS，每毫升中加3μl 3％H202，使用前现配。
70％、90％、100％梯度乙醇。
(7) 苏木精。
DPX封片液。
(9) PAP蜡笔。
(10)保湿染缸。
(二)操作方法和步骤
1. 玻璃载玻片和盖玻片的制备
(1) 将玻片浸入用双蒸水配制的10％ Decon 90中清洗过夜，然后依次用：热流水冲洗→去离子水冲洗→双蒸水冲洗→放在片架上空气干燥，铝箔包裹→200℃烤4h以破坏 RNA酶活性。从此开始，所有玻璃器皿均不能有RNA酶。然后在含有2％Tespa的丙酮溶液中孵育2min包被载玻片，新鲜丙酮洗2次，DEPC-双蒸水洗2次，铝箔轻轻包裹，37℃烤炉过夜,存于室温。
(2) 盖玻片应用硅处理以利于实验过程中揭去。将盖玻片浸入溶于四氯化碳的1％二甲基二氯硅烷1min，用双蒸水洗净，铝箔包裹，200℃烘烤4h，室温储存备用。
2. 细胞的制备
(1) 用PBS按1：2比例稀释人外周血，通过淋巴细胞分离介质600g 20℃离心25min分离淋巴细胞。
(2) 从梯度界面收集淋巴细胞，用PBS至少1:2稀释,400g 20℃离心7min。收集沉淀，用PBS洗2次，300g 20℃离心5min。
(3) 以1×106细胞/ml的浓度再悬细胞于RPMI培养液中，并用溶于RPMI/FCS的 100ng/ml PMA和50μg/ml的PHA刺激细胞。
(4) 4d后，300g，20℃离心5min收集细胞。
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(5) 用DEPC-PBS缓冲液洗细胞，然后将细胞悬液滴在Tespa处理过的显微镜载玻片上，用细胞离心机80g 20℃离心5min使细胞沉淀到载玻片上。
3. 固定
(1) 将有细胞沉淀的载玻片置于烘烤过的片架上，室温下空气干燥5min后按以下过程固定细胞：4％多聚甲醛20min→3× DEPC-PBS 5min→1×DEP&PBS 5min→1×DEPC-PBS 1min→DEPC-双蒸水lmin→ 50％乙醇+50％DEPC-双蒸水1min→80％乙醇+20％DEP-双蒸水lmin→100％乙醇 lmin。
(2) 空气干燥后用铝箔包裹存于－80℃。
4. 蛋白酶K消化
(1) 将有细胞的载玻片放入装有溶于 0.1mol/L Tris-HCl，50mmol/L EDTA， pH8.0，浓度为10μg/m1的蛋白酶K的2L大烧杯中37℃消化30min。
注：细胞的固定和消化对该技术的成功至为关键，其条件可因细胞类型、PCR产物大小及mRNA的稳定性不同而有差异，应根据每个实验要求进行优化。
(2) 重复3，再次固定细胞。
5. 杂交和逆转录
在以下所述过程中，载玻片置于用铝箔覆盖的工作台上。
(1) 在有细胞的载玻片上，滴加10μl含有2.5ng/μl对人粒酶A或穿孔素基因反义寡核苷酸的杂交溶液，用烘烤过的镊子小心地在细胞上盖上盖玻片，湿盒中42℃孵育2h。
注：杂交时间需凭经验确定。虽然延长杂交时间有助于寡核苷酸与mRNA的结合，但不稳定的mRNA可降解，产生不完整的cDNA。
(2) 孵育结束后用2×SSC彻底地洗片5min以洗掉盖玻片和杂交液。
(3) 甩去载玻片上的液体，并用软纸吸去多余水分，空气干燥。
(4) 每个标本加7μl逆转录混合液，用新盖玻片盖好，湿盒中37℃孵育1h。
(5) 逆转录混合液含有：3U/μl逆转录酶，溶于75mmol/L KCl，10mmol/L Tris pH8.0，12mmol/L MgCl2，2μg/μl BSA，10mmol/L DTT，各种1mmol/L dNTP及 1U/μl RNA酶抑制剂。
用大量2×SSC缓冲液洗5min，再用双蒸水清洗一遍后晾干。
6. 原位PCR
在原位PCR中，对照是非常重要的。
(1) 用钻石玻璃刀将盖玻片切成1cm2大小，减少 PCR过程中试剂用量。
(2) 原位PCR反应液 0.5U/μl Taq聚合酶；1mmol/L dATP、dCTP、dGTP和 0.9mmol/L dTTP；0.1mmol/L生物素-11- dUTP；75mmol/L KCl；10mmol/L Tris，pH8.0；10mmol/L MgCl2；7μmoL/μl 5’-3’端与人粒酶A或穿孔素基因互补的寡核苷酸引物。每个标本上加5μl以上杂交反应液。
注：(原位PCR比试管PCR需要更高浓度的试剂，尤其在MgCl2，Taq聚合酶和核酸方面。因此，不能照搬试管PCR的优化条件)。
(3) 用切小的盖玻片盖住混合液，并滴一滴矿物油封住盖玻片，以防蒸发。将载玻片放入PCR机内。
注：(传统的PCR热循环机的热格对原位PCR不适用，应选用具有热平板的特殊设计的机器。如果PCR过程中标本干燥可产生假阳性信号，因此应用矿物油完全密封盖玻片)。
(4) 扩增程序为94℃预变性5min；然后94℃ 1min→60℃lmin→72℃ 1min，循环30次；最后在72℃保持10min。
(5) 完成PCR扩增后，将载玻片浸入二甲苯中2min洗去矿物油，将载玻片放在抽风厨中使二甲苯挥发。
用70％乙醇喷洒载玻片，并用软纸擦去载玻片上遗留的矿物油。因为水化油滴可干扰抗体，影响PCR产物的检测，故在免疫组化染色之前，必须完全清除矿物油。
(7) 将载玻片置于片架上，在2×SSC中摇动片架以使盖玻片脱落。然后用大量2×SSC和PBS充分洗涤，最后空气干燥。
7. 检测扩增产物
(1) 用蜡笔围绕细胞画一圆圈，使滴加的试剂局限于标本上。
(2) 在PBS中漂洗载玻片，每个标本上加 50μl小鼠抗生物素单克隆抗体稀释液(1:25稀释在含0.5％BSA的PBS中)，湿盒中 37℃孵育30min。
作者: 荷塘青蛙！ 时间: 2011-8-24 16:51

(3) 用PBS洗片3×5min。
(4) 每个标本上加50μl HRP-兔抗小鼠 Ig抗体稀释液(1:50稀释在含10％人AB型血清和0.5％BSA的PBS中)，湿盒中37℃孵育30min检测第一抗体。
(5) 用PBS洗片3×5min后，用新鲜配制的底物溶液(DAB和H2O2)显色。
用Harris苏木精复染。
(7) 经过70％、90％、100％梯度乙醇脱水，二甲苯透明并用DPX封片。

表(3-6) 原位cDNA PCR阴性对照
  A  B  C  D  E  F  G  H
杂交  +  +  +  +  -  +  +  +
逆转录  +  +  +  +  +  +b  +  +
PCR  +  +  -  +a  +  +  +c  +d
抗生物素抗体  -  -  +  +  +  +  +  +
HRP－偶联二抗  -  +  +  +  +  +  +  +
底物  +  +  +  +  +  +  +  +
期望结果  -  -  -  -  -  -  -  -
反应(A)中产生的阴性结果将证实标本中不存在内源性过氧化物酶。反应(中证实不存在非特异性 HRP-偶联的第二抗体。反应(C)和(D)将显示在标本中无内源性生物素或无单独的RT信号。反应和是特别重要的对照，阴性结果证明信号产生于cDNA的扩增而不是产自于由裂缺DNA引导或基因组DNA扩增。反应证明对引物的需要。表明信号由Taq聚合酶产生。
a省去生物素化核苷酸；b.省去逆转录酶；c.省去引物；d．省去Taq聚合酶e.用HRP辣根过氧化物酶

8. 注意事项
为了取得满意的实验结果，请注意以下两点：
(1) 在原位PCR系统，设立对照是非常重要的。阳性对照采用持家基因(house-keeping gene)引物在实验细胞上证实mRNA的存在。用已知有目的基因表达的阳性细胞应作为阳性对照，以证实实验条件的合理性。阴性对照在此系统特别重要，表(3-6)为推荐的阴性对照。
(2) 用原位PCR反应的上清液作Southern印迹分析可证实扩增产物的特异性。
六、组织切片上核酸序列的PCR扩增
——定位原位扩增
原位杂交(ISH)方法用于定位检测细胞和组织切片内的核酸序列，其不足之处在于很多感兴趣的目标是单拷贝基因，对这些基因的检测超出了ISH灵敏范围。多聚酶链式反应(PCR)是80年代以来广泛应用的体外基因扩增技术，具有高度特异性和敏感性，能对正常和许多疾病情况下的核酸靶序列进行分子水平的分析，常被用于扩增罕见或单拷贝基因序列，是理论研究和临床实验的一个重要分子工具。PCR分析的焦点集中于组织核酸的分离、纯化和扩增过程，不对靶序列进行细胞组织类型定位。
原位PCR将PCR和ISH相结合，形成一个具有高灵敏性和高特异性的定位研究新技术。过去许多实验室的工作限于利用原位PCR技术来检测组织标本上感染性病原体——即外来的核酸序列，很少用于检测细胞内新表达的基因及基因变异，其原因是后一种情况下检测的靶序列十分稀少。以前很难于用ISH检测到的单拷贝DNA靶序列,现在可以用这种叫定位原位扩增(licalized in situ amplification, LISA)的方法加以扩增和检测。
实践证明，本章所述的原位PCR方法特别适用于常规醛类固定、石蜡包埋组织上核酸序列的检测，对外来核苷酸系列、基因组变异检测和基因治疗效果监控等方面都非常有效。
作者: 荷塘青蛙！ 时间: 2011-8-24 16:51

(一) 试剂和材料
1．组织制备
(1) 甲醛固定和石蜡包埋组织：
按病理解剖实验室常规固定(10%甲醛缓冲液)和石蜡包埋组织。
(2) 组织切片：常规5~6 m厚。
(3) 有机硅硅化处理的载玻片。
2. 细胞渗透处理
(1) 二甲苯。
(2) 蛋白酶K。
3. LISA部分
(1) 双蒸水。
(2) 矿物油。
(3) PCR机。
(4) 透明指甲油。
(5) 25mmol/L MgCl2。
寡核苷酸引物。
(7) Taq DNA聚合酶。
地高辛-11-dUTP。
(9) dNTPs 10mmol/L四种dNTP溶液，工作浓度为1.25mmol/L。
(10) 10×Taq缓冲液
100mmol/LTris-HC1,pH8.3;500mmol/L KCL;0.01%(W/V)明胶。
(11) 组织培养克隆环(外径0.8cm，内径0.8cm，高1cm，Belleco Glass公司)。
4．检测
(1) 丙酮。
(2) 阻断缓冲液(0.5%阻断剂溶于洗液1中)。
(3) 终止缓冲液 10mmol/L Tris-HC1；1mmol/L EDTA ,pH8.0。
(4) 洗液 1 100mmol/L Tris-HCL；150mol/L NaC1,pH7.3。
(5) 洗液 2 100mmol/L Tris-HC1；100mmol/L NaCl；50mmol/L MgCl2 pH9.5。
抗地高辛抗体(碱性磷酸酶－抗地高辛)。
(7) 色原(Chromogen，Boehringer 公司)。
伊红染液。
(9) 湿盒湿盒可用一个带盖的塑料容器作成，里面放一个浸湿的海绵垫，当放入载玻片后再在上面盖一片海绵，这样可防止标本干燥。
(二) 操作方法
1．组织制备
(1) 组织用10%甲醛缓冲液固定、石蜡包埋。
(2) 切6μm厚切片，铺于用有机硅硅化的载玻片上。
2．细胞渗透处理
作者: 荷塘青蛙！ 时间: 2011-8-24 16:52

(1) 组织切片的脱蜡和水化
二甲苯2×10min→100%乙醇2×5min→95%乙醇2×2min→70%乙醇2min→50%乙醇2min→PBS(pH7.6)5min。
(2) 蛋白酶K处理组织
用37℃ 1μg/ml溶于10mmol/L Tris-HC1, pH7.6/1mmolEDTA的蛋白酶K处理组织10min。
注：蛋白酶消化对渗透组织标本是必要的。固定使蛋白质和核苷交联，从而妨碍试剂的渗透和对靶序列的作用。消化时酶的浓度、消化时间及温度都需要优化。过度消化会损坏组织学形态，反之则渗透性差，减少扩增并使背景增高。
(3) 70%、90%和100%乙醇各2min脱水。
3．LISA
(1) 将以上处理好的组织切片放置在特殊设计、有热平台的PCR机上。
(2) 94℃加热片1min使蛋白酶K失活，室温下选择性地将组织克隆环放于组织切片上套住部分组织。
(3) 用约50μl干净指甲油将玻璃环密封并固定在载玻片上，形成一个LISA反应的扩增小室，在反应前应让指甲油完全干燥。
注：有色指甲油不适合LISA反应。
(4) 在每个玻璃克隆环内加扩增反应液25μl，扩增反应液中含有：引物各75ng，0.5UTaq聚合酶，各200nmol/L的四种 dNTP，10mmol/L地高辛-11-dUTP,1.5mmol/L MgCl2，67mmol/L Tris-HC1 pH8.8，10mmol/L EDTA。
注：可先用传统的试管扩增反应来优化PCR反应混合液。将此反应混合液加入玻璃克隆环中，并加适量矿物油以防挥发。在此步中设立至少包括以下的对照实验：省略引物；不含靶序列的组织等。
(5) 将此载玻片标本置于PCR机的热平台上。扩增前94℃加热使DNA变性。注：在传统的PCR机上进行，只需用铝箔覆盖热室即可。
LISA反应用20个循环引物变性94℃ 1min→引物退火55℃ 1min→延伸72℃1.5min。
4．检测
用药盒提供的改进方案，检测含有结合地高辛-11-dUTP的扩增产物。
(1) 用移液器吸去反应液，用二甲苯洗3次，除去油迹。
(2) 将切片浸入丙酮内1~2min以取掉玻璃环。
注：环外的组织可起一个检测程序中阴性对照的作用。
(3) 用500 l洗液1洗3次，然后用500μl含有0.5%阻断剂的洗液1 在湿盒中孵育30 min。
(4) 用洗液1按1：100比例稀释抗体 (碱性磷酸酶偶联抗体地高辛)，每片加500μl，湿盒中孵育1h。
(5) 用洗液2洗片3×5 min。
染色反应约10~25 min。
注：应根据扩增靶序列的数量和大小来决定最佳时间且该步应在严密监视下进行以防过度染色。
(7) 终止液洗3次终止显色反应。
乙醇脱水后用伊红复染，裱片及封片。
(金树王廷华)
作者: 荷塘青蛙！ 时间: 2011-8-24 16:52

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第四章定量PCR 技术
第一节概述
近几年来,研究者们不再满足于得知某一特异DNA序列的存在与否, 他们更着眼于对其进行精确的核酸定量。人们曾运用 Southern、Northern、狭孔印迹定量分析特异核酸序列, 但普遍认为这些方法其定量的下限为105～ 107 靶分子。在RNA水平上, Rnase 保护试验法和S1 核酸酶处理法检测所必需的最少靶分子数应达5×104。定性技术不断改进和完善,可以达到检测单个靶序列的水平。但实际工作中常需要定量检测标本中的核酸,而不是某一特定序列存在与否。如血浆中人类免疫缺陷病毒(HIV)的RNA浓度直接反映病毒颗粒的滴度,用PCR定量检测HIV中RNA量可用于临床分期和判断预后;肿瘤坏死因子2A(TNF-2A)水平与动脉粥样硬化严重程度呈正相关,定量检测TNF-2ARNA可监测病变的发展情况。尽管把PCR作为一种定量工具在技术上面临着一些挑战,但是由于它能在千百万分子构成的背景中重复地检测到10个分子的靶序列, 甚至更少量的特异核酸分子,使得这种挑战具有很强的诱惑力。随着PCR 技术的发展,人们在利用PCR 技术进行定量研究方面进行了一系列有意义的探索。现在定量PCR 技术已被广泛用于研究基因表达、癌基因检测、诊断遗传缺失、估计病毒负荷量以及评价临床治疗效果等各个方面。定量PCR 技术也经历了从相对定量到绝对定量的过渡。随着相对定量PCR 技术研究的深入,在定量PCR 反应动力学模型的指导下, 人们逐渐建立起以竞争性PCR 为基础的绝对定量PCR方法。
定量PCR旨在评估靶分子数。此测定可以是绝对的，如每微克DNA的分子数；也可以是相对的定量，即与设定的内参照或外参照比较而言。鉴于PCR扩增过程的特性，对靶基因的定量仍存在技术上的问题。迄今研究和应用的定量PCR方法各有利弊。对其选择取决于：（1）靶基因的的特性；（2）PCR产量的期望值；（3）准确度的要求。这些方法均需做大量实验和调控以达到结果重复性好及统计学上有意义。
第二节基本概念
定量PCR（Quantitive Polymerase Chain Reaction）技术有广义概念和狭义概念。广义概念的定量PCR技术是指以外参或内参为标准，通过对PCR终产物的分析或PCR过程的监测，进行PCR起始模板量的定量。
狭义概念的定量PCR技术（严格意义的定量PCR技术）是指用外标法（荧光杂交探针保证特异性）通过监测PCR过程（监测扩增效率）达到精确定量起始模板数的目的，同时以内对照有效排除假阴性结果(扩增效率为零)。??
在广义概念下，定量PCR技术大致分为五种类型：（1）外参法+终产物分析。所谓“外参法”是指样本与阳性参照在两个反应容器内反应。这种类型没有对样本进行质控监测，易出现假阴性和假阳性结果，没有监测扩增效率，定量不准。（2）内参法+终产物分析。所谓“内参法”是指样本与阳性参照在一个反应容器内反应。这种类型对样本进行质控监测，排除假阴结果，但是定量不准。（3）外标法+过程监测。这种类型监测扩增效率，阳性样本定量准确，但是无法排除假阴结果。（4）内参法+过程监测。由于样本与阳性参照在一个容器内反应，用同样的Taq酶和反应物，存在竟争性抑制，起始模板量浓度高的反应会抑制起始模板量浓度低的反应，所以定量不准。（5）外标法+过程监测+内对照。这种类型监测扩增效率，阳性样本定量准，同时排除假阴性结果，这种类型是值得提倡的一种方法。
作者: 荷塘青蛙！ 时间: 2011-8-24 16:54

第三节定量PCR 技术基本原理
在实验生物学及医学中,由单纯PCR 所提供的阳性或阴性结果还远远不够阐述问题的本质时,基因及其表达的定量起着至关重要的作用。根据PCR反应的指数增长特性,通过改进方法来寻求扩增产物与样本中原始靶核苷酸之间量的关系,以达到对后者进行定量之目的。因为PCR反应每个循环的产物均成为下个循环的底物,并按指数级扩增,所以可用方程式Y = X (1 + E )n来推算扩增产物,Y 代表PCR产物,X 指起始模板核苷酸的量,n指反应循环数,E在有限的循环周期中保持相对恒定,通常是20～ 30 个循环,随后扩增效应减慢直至为零,扩增过程到达平台期,此时,PCR 产物的积累不再依赖于投入的模板核苷酸量。因此,在使用上述方程式前,必须用实验检测PCR 扩增的指数增长特性。在PCR 扩增的指数增长过程终止前的循环数的多少取决于扩增效率E 和起始样本的特异核酸序列丰度。对于一个给定的扩增片段, 起始样本的含量越大,则指数扩增过程越短。扩增过程中的内在特性或参数很可能会引起动力学的变化, E 取决于诸多因素, 包括引物和扩增序列的特性、组份的浓度以及PCR反应温度等。其中特别是DNA聚合酶量/模板量的商值,它可能会随着热循环仪上标本位置或不同临床标本中某个DNA聚合酶抑制物的出现而变化。即使在同一条件、使用同一试剂的条件下,管与管之间的扩增效率也可能发生变异。影响E 的因素中任何微小的差异将导致特异PCR 产物水平的极大变化。显而易见,与那些处于良好状态下的标本相比,某些相似的样本所含的特异靶序列已部分降解,含量减少。由于RNA 易于降解和在逆转录过程中效率的不稳定性, 样品问题更加突出。围绕这些问题, 一些方法被改进以期尽可能地消除这些变异达到精确定量。与非定量PCR 分析方法不同,定量PCR分析的操作程序有助于评估污染的情况,即测出污染的程度,即使负对照产生了正的信号,只要这些信号比实验样品中的低得多,依据这样的结果,至少可以推测出实验中所得出的信号是真实的。在一定程度上消除了单纯PCR过于敏感、假阳性率高的缺点。
第四节定量PCR技术的种类
在定量PCR技术发展之初,人们进行的一些探索主要集中在相对定量方面,通过同位素、生物素标记引物或dNTP的方法进行扩增,扩增产物通过杂交,免疫捕获等方法,根据扩增后产物的发光强度推测目的基因的初始模板数。这些方法繁琐、费时,可重复性差,并且具有放射性危害,而且往往偏重于通过评估样品间核酸含量差异的粗略定量,没有充分考虑扩增过程中的各种影响因素及扩增效率的差异造成结果的不准确性,多为相对定量的方法。从定量PCR 反应动力学分析中可以看出, 最符合PCR数学模型,最易于操控,最有前途的定量PCR 技术就是竞争性PCR ,故竞争性PCR成为定量PCR的基础。目前定量PCR常用来研究发病机制、估计病毒的负荷量、监测临床治疗进展或用于诊断遗传缺陷等。通过对靶基因量的检测,将其与疾病的临床表现、临床分型以及各种标志酶的数值联系起来,为疾病的诊断和药物疗效监测提供科学的依据。定量PCR 在这些方面的应用,特别是阈值的选择,仍需进行大量的研究工作。
定量PCR技术在定量过程中须广泛借助于各种形式的参照物,参照物按其性质不同可分为内参照和外参照。内参照和外参照均是在定量PCR过程中一种已知含量的标准品。内参照与待检样本一起加于同一扩增系统,与待检样本共用同一对引物或采用另一对不同引物。内参照若与待检样本共用同一对引物,两模板的扩增存在竞争性,则内参照又称为竞争性参照物, 这种条件下进行的定量PCR又称竞争性定量PCR。若内参照与待检样本不共用同一对引物,这种定量PCR 因其不存在竞争性故属非竞争性定量PCR。外参照与内参照相对而言, 独立于待检样本定量PCR 扩增系统, 常采用系列稀释的已知含量标准品。在非竞争性定量PCR中,通过外参照单独扩增建立标准品初始含量与最终产物之间的标准曲线用于未知样本的类推定量。采用外参照进行的定量PCR亦属非竞争性定量PCR。参照物在定量PCR中具有以下作用:①作为扩增系统的阳性对照。②作为未知样本定量的参比标准。③通过竞争性作用校正扩增系统之间的扩增效率, 使其具有可比性。理想的竞争性内参照应具备与待检样本长度相等或相近,扩增效率相同,通过一定方法扩增产物较易与靶基因扩增产物分开的特点。在竞争性PCR中通过梯度稀释系列标准品与已知含量的内参照混合扩增而作出初始状态下标准品含量与竞争模板含量比例和靶基因终末产物的标准曲线，用于待检样本的定量。
在PCR 定量体系中,人们常提及相对定量和绝对定量的问题。相对定量的目的是评估样品间核酸含量的差异,绝对定量的目标是确定某个样品准确的分子数。通常比较样品间核酸分子的相对含量而不是绝对分子数对于很多应用场合已经足够。在DNA水平, 因为很容易获得精确对照,即使只要求相对定量值,人们也倾向于报道绝对数值。大多数mRNA含量在整个细胞周期中变化很大,且很难获得精确的RNA对照,所以mRNA的相对定量被广泛应用。在一些方法中,相对和绝对定量的区别并不很显著。任何定量工作的准确性都在本质上与所用标准的准确性相关联。目前,一些定量PCR方法虽各有优缺点,但已得到了一定程度的应用和发展。选取何种方法,须由靶序列特性、靶序列分子数的估计范围、定量要求的精确程度和相对与绝对等因素来决定。各种定量PCR 方法联合使用的例子也经常出现。所有Q-PCR 方法均要求进行检测和核实,以保证结果的可重复性和统计学的可靠性。除了有限稀释度方法,其它方法都须对产物本身进行定量。
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一、外对照PCR定量
外对照定量PCR产物是最简单的PCR定量方法。外对照,通常是质粒,一个已知量的标准稀释系列,能与样品中的靶序列平行扩增。并能得出这个标准稀释系列PCR产物起始物量的线性关系,在同一PCR 扩增循环中，用样品靶序列的起始量的相对值即可推测出来。但是这个定量过程必须在指数扩增期进行。事实上,为了得到统计学的可靠结果,对一个反应过程中多个时间点的产物量进行线性回归分析是必要的。这种方法甚至可以消除管与管之间的差异, 但不能消除样本与样本之间的差异。现在,有些研究人员趋向于用重组RNA 模板作为定量RNA 的标准。体外转录类似于RNA 靶序列的特异RNA可以纯化后作为外对照。但这种方法还须检测试管间的差异以增加试验的精确度。外对照PCR 定量可与巢式PCR 联合使用。巢式PCR已被广泛接受并基本有效地解决PCR中的非特异性。虽然在巢式PCR 反应中, 内外两对引物也将产生一些不同种类的非特异产物, 但其数量常常不能达到能干扰定量的水平。一些相对简单的非特异性检测方法可用于对巢式PCR产物进行定量。巢式PCR面临的问题始终是污染。对于外对照定量PCR 这种相对简单的方法,一个始终潜伏的问题是PCR 对试验过程中微小差异的敏感性,因受对外扩增效率的影响,有可能破坏实验的精确性和可重复性。因此,建立一个外对照定量PCR,必须分析这个试验的精确性和可重复性的限制程度。有学者通过扩增特异的IgH和TCRC的基因重排来粗略估计急性淋巴细胞白血病治疗后的疾病残余水平。近两年来,使用外对照定量PCR 的文献较少。
二、有限稀释PCR定量分析
有限稀释是一个在细胞生物学水平上建立起来的定量方法。属非竞争性外参照定量PCR 方法。方法为对检测标本进行梯度稀释后作PCR ,直至检测结果为阴性为止。这样即可依据PCR 检测阳性结果的最大稀释度结合外参照进行定量。这种方法可经过对阳性样本进行系列稀释直至靶序列不再被扩增来进行PCR定量。它基于使用一个定性全或无端点并假定混合物中一个或多个靶序列会导致一个阳性端点。稀释的程度用来计算起始靶分子的数量。为了增加这类定量方法的可重复性, 应使PCR 过程最佳化,一个或几个靶分子能被稳定检测出来。在每个稀释度均应进行多次反应,结果利用统计学泊松分布原理来计算。必须严格消除污染物,以免假阳性干扰正常结果。这种分析方法的突出优点是定量不依赖扩增效率, 但每个样品需要多次PCR 反应,工作繁琐。扩增产物的检测多采用凝胶电泳。本方法系统误差大,步骤繁琐,已淘汰。
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三、内对照PCR 定量
从细胞材料中提取的核酸包含大量非靶序列的DNA或RNA,这为靶序列和细胞中的某个特异序列在同一个PCR管中共同扩增提供了便利。这个特异序列既不占据靶序列引物的结合位点,也不处于靶序列间,可作为一个内部标准,如细胞B2珠蛋白基因。靶序列和内对照在扩增过程中使用不同的引物,靶序列的定量通过与内对照比较产物带的强度来进行。内对照在样品中DNA的数量、扩增效率、电泳上样量的变化都是标准化的。只有二者起始量、指数扩增期的效率相似,才能精确对靶序列定量。内对照PCR可以消除管与管之间的变异,并在一定程度上消除样本与样本之间的变异。内对照定量PCR 是常用的研究方法之一。最近,Lee 等运用同源基因作内对照Q-PCR 快速检测21三体, 并认为这种方法可被用于21三体综合征的产前诊断。而Andrei等为了增加准确性利用双重内对照定量PCR同时扩增HIV病毒基因和宿主细胞特征基因HAL-DQa ,二者的比率作为DNA 水平感染程度指标,用以监测病毒复制情况和药物疗效评价。实验中所加入DNA的量对于一个成功的定量分析是非常关键的。太多的模板DNA 将会使复制过程饱和,不但会产生特异产物,而且会产生非特异产物。RNA内对照PCR 定量显得比较困难。目前普遍认为逆转录效率较低,是一个产生变量的重要来源。DNA标准不能用来监测逆转录步骤，而通过测量cDNA来推断mRNA通常比实际值低。因此，精确定量RNA,选用RNA 标准较合适。将内对照RNA与靶序列一起转录和扩增以弥补RT-PCR 较低的可重复性。Souaze等认为,这个反应的成功依赖于在反应过程中保持靶分子(TM)和内对照分子(ICM)数的等同,我们能通过调整TM/ICM 的比率来控制RT-PCR定量的精确性。TM( target molecule)即靶分子、ICM( internal control molecule)为内对照分子。当TM /ICM比率于0.66～1.5,最终结果出现错误的可能性大约为10%,若TM /ICM = 2,则出错率达到60%。
四、非竞争性对照基因定量法
本技术为靶序列和作为内标的对照序列(另一内源性基因 )在同一反应中共同扩增。此标准序列可控制DNA的量、可扩增性和管间扩增效率的变化。通过比较两个产物的颜色强度对靶基因定量。此法只有在靶基因和对照基因的数量及扩增效率相似时才能得到准确的定量结果。最好定量处于扩增指数期的PCR产物。扩增后可通过测量电泳带的相对强度而定量。
五、竞争性定量PCR
竞争性定量PCR由于采用内参照的竞争性定量,克服了常规PCR 扩增效率不稳定的缺陷,各管间的差异得以避免,故在准确性方面比终点稀释法定量优越,是目前较理想的一种定量方法。最精确的DNA 和RNA 定量, 可以通过竞争PCR和竞争RT-PCR 获得。这个方法基于靶序列与一个已知浓度的内部标准在同一反应管中竞争性地共同扩增,二者具有相同引物的结合位点,以同一引物扩增,二者竞争引物、核苷酸和聚合酶。由于竞争作用,当一种模板量逐渐增加时,另一种模板扩增产量逐渐减少。两种模板PCR 产物的比值与两种初始状态时核酸含量的比值有关。当两种模板的拷贝数相等时,它们的扩增产物也基本相当, 这时初始反应体系中内部标准模板的量也就代表了被检测模板的量。如果这个竞争性的模板选择并构建恰当,在整个反应过程中扩增效率与靶序列扩增效率一致,就不一定要把反应限制在指数扩增期内。Klaus等认为这是竞争PCR技术最大的优点之一。但有学者认为,还是把竞争PCR 限制在指数扩增期,视结果为相对定量而不是绝对定量较好。竞争PCR 能消除管间及样本间的变异,定量范围较广,能够检测2 倍的差异。因此,这种方法被描述以来,就吸引了许多研究者,被广泛运用于细胞DNA、RNA 以及细菌核酸的定量检测。例如: 用竞争Q -PCR方法检测的患者血清HCV-RNA量与血清在感染潜伏期,特别是在以血清转氨酶升高为标志的感染活动期对病毒滴度进行检测。Simone等改进一种竞争性逆转录定量PCR (即pcPCR )检测样本中极少量的HBV mRNA,证实HBV不仅存在于PMBC中, 而且被其复制以提示PMBC可能是病毒肝外持续存在的场所之一。竞争性模板常通过修改靶序列的克隆来构建。如:一个小的限制性片段的插入、缺失或通过体外诱变导入一个新颖的酶切位点。另外, 包含同一引物结合位点的特异组织竞争物也可使用。
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尽管如此, 这种方法仍存在诸多不足: 竞争性模板制备较难, 需经反复测试, 实践中其与靶基因模板扩增效率很难达到完全相同; 内参照与靶基因相互作用, 内参照与靶基因是否会形成二聚体尚有待深入研究; 定量原理从根本上说仍是采用基于标准曲线的类推法, 单个标准品的点变异对定量结果影响较大。
六、 PATTY定量分析mRNA法
PATTY(PCR aided transcript titration assay)即PCR辅助的转录物滴定试验。此法是为克服竞争性 PCR的缺点而设计的,竞争性 PCR不能监控逆转录反应 ,且只有在竞争模板与未知模板浓度相近时才能获得准确结果。此法将突变cDNA再转录为 RNA作为内参照模板,整个试验设计类似于滴定系统 ,即等量的总RNA与递减量的内参照突变 RNA混合,逆转录成cDNA并进行PCR扩增,扩增产物经酶切消化以区分两种RNA。由于内参照是递减量的,因此总有一份样品中含有等量的两种DNA,说明两者 RNA含量相同。
七、 PCR－ELISA法：
利用地高辛或生物素作为标记引物，扩增产物被固相板上特异的探针所结合，再加入抗地高辛或生物素酶标抗体－辣根过氧化物酶结合物，最终酶使底物显色。常规的PCR－ELISA法只是定性实验，若加入内标，作出标准曲线，也可实现定量检测目的。
八、荧光定量PCR
荧光定量PCR（Fluorescence Quantitive Polymerase Chain Reaction FQ-PCR）是新近才出现的一种定量PCR检测方法,可采用外参照的定量法,亦可采用内参照的定量方法。扩增后产物采用荧光显示, 定量方法多样化,算法更为精确。
九、实时定量PCR技术
实时定量PCR(real-time PCR)技术是近几年发展起来的新技术,既保持了PCR技术灵敏、快速的特点,又克服了以往PCR技术中存在的假阳性污染和不能进行准确定量的缺点。
十、定量PCR的主要影响因素
(一) PCR扩增的动力学
用PCR对靶基因定量时，首先应考虑的是PCR扩增动力学的有关因素，每一次PCR产物均是下一次循环的底物，模板的扩增呈指数式。但是，DNA的每一次复制都是不完全的，故积累分子数N=NO(1+E)N，NO是初始靶DNA的分子数，E是扩增效率(指每次循环中参与复制的模板与总模板的比率),n是循环数。扩增效率的微小差异便可导致产物积累量的显著不同。效率受靶DNA的序列及长度，反应条件，尤其是受Y引物序列的影响。更重要的是，即使同时使用同样的试剂及操作，同等反应条件，PCR法管与管间的扩增效率也有明显差别。
随着循环次数的增加，扩增不在呈指数式进行，效率最终降为0，导致扩增产物的积累处于平台期，此时很可能意味着一个或几个反应组分已接近反应极限，或产物与模板在退火阶段同时竞争引物。达到平台期的PCR循环次数是不能预测的。指数式扩增期的长短也取决PCR中靶DNA的分子数。一般而言，从PCR扩增开始至平台期大约是20个循环，扩增产物可从经溴乙锭染色的电泳凝胶中观察到。
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(二) 样品的性质
样品性质可有显著差异，特别是临床样品。与良好样品相比，部分降解或不新鲜的样品显然含少量靶基因。靶基因的质量对逆转录PCR影响极大，因为RNA易于降解，且逆转录反应效果存在固有差异。这些重要的误差常被忽视，但只要对每份样品定量设置一个内参照，如第二基因或序列，即可获得很好控制。
第五节荧光定量PCR 技术及其在临床上的应用
聚合酶链反应(PCR)是一项体外基因快速扩增检测技术。由于其简便易行、灵敏度高等优点，已迅速而广泛地应用于感染性疾病病原体的检测研究。但是用于临床基因诊断有许多局限性。主要体现在两点:一是不能准确定量；二是由于灵敏度高,操作不慎易交叉污染，产生假阳性。为了克服以上缺陷，人们采用了杂交法、竞争法和酶联法及尿苷酶降解法等办法，均不尽人意，直到最近荧光定量PCR ( Fluorescence Quantitive Polymerase Chain Reaction ,FQ-PCR) 的出现,才解决了上述问题。荧光定量PCR (FQ- PCR)检测技术，它融汇了PCR技术的核酸高效扩增,探针技术的高特异性，光谱技术的高敏感性和高精确定量的优点,直接探测PCR过程中荧光信号的变化以获得定量的结果。完全封闭操作，仪器直接读数，结果判断更客观真实，定量范围宽 (可包括0～108个拷贝/μL),且无需样品梯度稀释等特点。基于荧光能量传递技术( Fluorescenceresonance energy transfer ,FRET)，通过受体发色团之间偶极-偶极的相互作用,能量从供体发色团转移到受体发色团，受体荧光染料发射出的荧光信号强度与DNA产量成正比，检测PCR 过程的荧光信号便可得知靶序列初始浓度。下面将详细介绍目前国内外几种荧光定量PCR技术的原理及其在临床上的主要应用。
一、荧光定量PCR
(一) 荧光定量PCR 的原理简介
1. Taqman 技术　（图4-1）
美国PE公司于1996 年发明Taqman技术,目前已广泛应用于基因检测。Taqman PCR的基本原理是在PCR的反应体系中设计一对特异性引物 ,并在引物 3′端的下游再设计一条带有双荧光标记的探针 ,该探针能与模板DNA发生特异性杂交。探针的5′端标记荧光报告基团 FAM (6-羧基荧光素,荧光发射值在518nm), 3′端标记荧光淬灭基团 TAMRA(6 -羧基四甲基丹诺明,荧光发射值在582nm),两者之间构成能量传递。探针的结构完整时,5′-FAM所发出的荧光被3′-TAMRA所吸收或抑制,不出现荧光信号的变化。随着 PCR反应的进行，由于Taq酶具有5′到3′外切酶的活性,当合成的新链移动到探针结合的位置S时 ,Taq酶将探针切断,探针的完整性遭到破坏,能量传递结构亦被破坏 ,3′TAMRA的淬灭作用被解除 ,5′FAM的荧光报告基团的荧光信号被释放出来。PCR每复制一个特异的核苷酸片段 ,就有一个探针被切断 ,同时一个荧光报告基团被释放出来。产物与荧光信号产生一对一的对应关系 ,随着产物的增加 ,荧光信号亦随之增强。在 PCR反应过程中检测反应体系中荧光信号连续不断的变化,当信号增强到某一阈值时(根据荧光信号基线的平均值和平均标准差,计算出以99.7 %的置信度大于平均值的荧光值,即为阈值),循环次数即循环阈值 Ct(cycle threshold,Ct)被记录下来。该循环参数 Ct和 PCR体系中起始模板数的对数之间有严格的线性关系 ,利用不同梯度的阳性定量标准模板扩增的 Ct值和该阳性定量标准的模板数经过对数拟和作图 ,制成标准曲线 ,再根据待测样品的 Ct值就可以准确的确定起始模板的数量，所以根据PCR反应液的的荧光强度即可计算出初始模板的数量。
作者: 荷塘青蛙！ 时间: 2011-8-24 16:56

2. Amplisensor 技术（图4-2）

图(4-1).TaqMan探针的原理
R：报告基因；Q：淬灭基因

图(4-2).Amplisensor引物荧光定量PCR的原理
R：报告基团； Q：淬灭基团

Amplisensor 是一种复合探针技术,一个探针上连接一种荧光物,另一个探针连接一淬灭物,两探针的长度不同,其中淬灭物标记探针5′端多出7 个碱基( GCGTC2CC) ,PCR 扩增前需将荧光物标记探针与一个半套式PCR 引物连接,PCR 引物的5′端应有一段与长探针互补的序列,以便连接酶将该引物与短探针连接。扩增时该探针-引物复合物作为半套式引物掺入到模板,从而释放出淬灭探
针部分,破坏FRET ,产生荧光。荧光强度与扩增时加入的模板数成正比。该方法的主要特点: (1) 每次PCR 反应前,需进行Amplisensor 标记,增加了操作步骤和检测成本。(2) 采用半套式PCR 扩增提高了灵敏度，但无法区分因引物二聚体形成的非特异扩增信号,易造成假阳性。(3) 反应中需加入半套式引物,污染的机会增加。Matera G等用AmpliSensor 技术对丙型肝炎病毒(hepatitis C virus HCV) 的基因型进行检测,发现此方法具有很高的特异性,能准确检测待测标本中DNA 的基因型和含量。

图(4-3).分子信标杂交定量的原理
R：报告基团：Q：淬灭基团

3. 分子灯塔技术（图4-3）
亦称分子灯塔法,分子灯塔(Molecular beacon，M是一段荧光标记的单链寡核苷酸探针,其链由两部分组成,一部分是能与靶基因碱基序列互补的寡核苷酸序列,是检测靶基因的部分,位于探针的中间位置,探针形成后构成探针的环部,另一部分是分别在5′和3′端的荧光标记物质和荧光淬灭剂。5′和3′端有几个互补的碱基存在,因而可形成两端反转配对,构成探针的茎部。在游离状态下,分子灯塔形成茎-环发夹结构,使荧光剂和淬灭剂紧密接触,导致荧光淬灭,此时茎环结构的分子灯塔发出的荧光检测不到。而在PCR变性过程中,靶基因双链打开形成完全互补的单链，经过复性即可发生杂交。杂交的结果使探针5′和3′端分离,淬灭剂对荧光剂的淬灭作用消失,产生荧光。而在PCR 的延伸阶段,分子灯塔又从模板上解离,重新形成茎环结构,荧光消失。因此,随着每次扩增产物的增加,其荧光强度也增加,因而它可反映每次扩增末期扩增产物积累的量。Helps C 等报道此种技术对动物衣原体感染的诊断有一定的特异性,它可以特异性的鉴别衣原体的外膜蛋白基因,且具有高度的可重复性。
作者: 荷塘青蛙！ 时间: 2011-8-24 16:57

图(4-4).蝎状引物PCR荧光定量原理
R：报告基团； Q：淬灭基团； S：间隔臂
最近 Whitcombe等将上述方法进行了改进，发明了一种称之为蝎状引物（scorpion primer）的荧光定量PCR技术（图4-4）。该技术在引物与MB探针之间连接一个间隔臂，使PCR延伸反应时不能够延伸至MB分子，这样非特异扩增产物便无荧光信号，但是当有特异扩增产物时，MB即可以同扩增产物进行分子内杂交，产生荧光信号。既解决了非特异问题，又保留了其响应快的特点。但是，仍存在杂交时探针不能完全与模板匹配以及合成复杂的问题。
4. Lightcycler 技术
Lightcycler 是Roche 公司最近开发的一种PCR 定量技术。该技术的特点也是将荧光分子和淬灭分子分别标记在两个不同的探针上，产生发生探针和淬灭探针，前者5′端连接荧光分子，后者3′端连接淬灭分子。由于两探针设计时可与模板同一条链相邻的序列杂交，杂交时两探针的荧光分子和淬灭分子紧密相邻，从而发生FRET使荧光淬灭。荧光淬灭的程度与起始模板的量成正比，以此可进行PCR 定量分析。该方法的特点是淬灭效率高，但由于两种探针结合于模板上会影响扩增效率。此外,由于需要合成较长的探针，成本较高。Kearns AM 等报道，Lightcycler 技术在对病毒DNA 的快速分型和定量方面有特殊的优势。
5. 复合探针法(Complex Probes) 　
该法的基本原理则综合了Roche和MB两种技术的优点,并克服了他们的不足。首先合成两个探针,一个是荧光探针(25bp)，在5′端接一个荧光分子,另一个为淬灭探针(15bp) ,在3′端连接一个淬灭分子,淬灭探针能与荧光探针的5′ 端杂交。当两个探针结合时,荧光探针发出的荧光被淬灭探针吸收,溶液中没有荧光产生,但两个探针分离时,荧光探针发出的荧光不再被淬灭探针吸收,溶液中即可检测到荧光。当PCR 扩增时溶液中无模板时,两种探针特异性结合,无荧光产生,相反,在模板存在的条件下,两探针分别与模板结合,从而使两探针分离,产生荧光。荧光强度与溶液中模板数量成正比,因此,可进行PCR 定量。其优点: (1) 使用非荧光淬灭剂,本底低。(2)对扩增效率影响小。(3)探针设计、合成、标记、纯化方便。
6. SYBR 荧光染料　
在PCR 反应体系中, FQ-PCR 的荧光标记可分为荧光探针标记和荧光染料标记两种。SYBR 荧光染料能特异性地掺入DNA 双链,发出荧光信号,而不掺入DNA双链中的SYBR 染料分子不会发出任何荧光信号,从而保证荧光信号的增加与PCR 产物的增加完全同步。此方法未使用目的特异性探针,其特异性完全由引物决定。在有非特异双链DNA 产生时,其荧光也同样增强,此法与常规PCR 的特异性差别不大。
作者: 荷塘青蛙！ 时间: 2011-8-24 16:57

(二) FQ-PCR 技术在医学上的应用
1. 在常见病原体检测中的应用　
HBV 的检测　
以前,对乙肝病毒的检测主要依靠乙肝表面标志物这种间接指标。多年来也确立了一套较为稳定而准确的HBV 检测方案。但在临床实际运用中,仅仅根据HBsAg阳性或阴性很难判断该患者体内病毒是否处于复制期,病毒复制的量又如何,以及患者是否具有传染性。随着PCR的出现,人们得以运用此种快速的方法来检测HBV ,但也只能定性检测。直到1996 年实时FQ-PCR 的出现,才真正解决了这一难题。它可及时、准确地检测出标本中HBV的拷贝数。研究证实,HBV e抗原阳性的乙肝患者有97 %HBV-DNA阳性,HBV e抗体阳性的患者有37%HBV-DNA 阳性。结果表明e抗原阳性患者体内大多有乙肝病毒存在,而e抗体阳性患者有37 %左右体内存在乙肝病毒复制情况,即此类患者有传染性,需注意与家人的隔离。HBV-DNA (HCV-RNA)结果为101～105拷贝/ml时,表明病毒复制水平较低,传染性较弱,而当HBV-DNA大于105拷贝/ml 时,表明病毒复制水平高,传染性强。另外HBV-DNA 定量检测可及时灵敏地监测患者药物治疗的效果。研究结果显示,对于低拷贝量(小于105 拷贝/ml)的乙肝患者,干扰素治疗效果尚可,而对于高拷贝量感染的患者,干扰素疗效较差。因此通过检测HBV-DNA 水平来决定是否选用干扰素,可大大提高治疗的成功率。1998 年底我国药监局批准拉米夫定用于治疗慢性乙型肝炎患者。目前国内外学者对拉米夫定使用有了一个较为明确的范围,其治疗效果可用HBV-DNA含量进行监控,随着拉米夫定的广泛应用,HBV对拉米夫定耐药株的出现引起了大家的关注,耐药株出现后,HBV-DNA水平明显升高,可升高3个指数级以上,随后出现转氨酶及胆红素升高等肝功能损伤标志。耐药株的出现发生在使用拉米夫定治疗28 周后,尤其是治疗一年后发生率可达25%。通过HBV-DNA 定量检测观察到拉米夫定耐药后,可辅助医生及时调整治疗方案,不至于贻误病情,浪费时间和财力。
HCV 的检测　
HCV 是一种RNA 病毒,HCV-DNA 的出现先于免疫血清学标志3～4 周,能更及时地检出病人的感染状况和病原体的复制水平,有利于病人早诊断、早治疗。目前COBAS Amplicor 法被公认为一种具有良好准确性和重复性的HCV-RNA的PCR 定量方法。但由于其设备和配套试剂极其昂贵,很难在临床实验室推广应用。FQ-PCR 是一种实时检测策略,即扩增和产物检测一步完成。检测过程无需打开扩增管,造成产物污染的可能性小,易为基础试验室接受,故而在国内应用较多。现已有一些国内厂商生产相应的试剂盒,可使用PE5700/ 7700 或Lightcycler 检测系统。Shigenobu 等报道RT FQ-PCR 检测血清中HCV-RNA 的含量比Amplicor Monito的结果高10～100 倍。而王露楠使用PE5700 法检测结果表明:RT FQ-PCR 检出的含量比COBAS Amplicor 约低5倍,这可能是由于国内试剂在提取、逆转录扩增等环节与国外产品存在一定差异。根据王露楠的方法比较得出:COBAS Amplicor与RT FQ-PCR 具有良好的相关性,并且其检测范围比COBAS Amplicor 大一个对数级,说明用FQ-PCR 来检测HCV-RNA 具有广阔前景。
对于其他常见病原体的检测　
作者: 荷塘青蛙！ 时间: 2011-8-24 16:58

FQ-PCR 技术还可用于多种细菌、病毒、支原体、衣原体的检测,如人巨细胞病毒( HCMV)、EB病毒( EBV)、单纯泡疹病毒(HSV)、结核杆菌( T、解脲脲原体(UU)、沙眼衣原体(CT)、淋球菌(NCG)、人乳头瘤状病毒(HPV)等。目前临床上正开展越来越多的基于FQ-PCR 的检测项目。
2. FQ-PCR在医学分子遗传学方面的应用
由于荧光定量PCR高灵敏、高特异性和精确定量的特点，在基础科研、临床检测和遗传学研究方面得到广泛应用。从一个复杂的模板合成大量特异DNA片段的这种能力在序列分析中有重要的应用价值。扩增DNA 的核苷酸序列不需要分子克隆、宿主细胞内的生长准备,即可在媒介中的生物分子纯化过程中直接测得,由此,FQ-PCR可进行特异突变基因的检测。与FQ-PCR有关的一系列间接测序方法的建立,使其在研究领域的应用不断扩大。如对已知DNA 序列进行位置突变基因及序列多态性的定位,制备特异序列的探针和引物,扩增DNA限制性位点检测遗传变异,用于遗传标记研究的基因位点扩增等。而从mRNA 反转录扩增cDNA是基因表达测定的重要方法,此方法使在特异细胞株中检出mRNA成为可能, FQ-PCR 扩增单一模板的已知序列可用于重组基因及基因图分析。FQ-PCR 技术已广泛应用于基因变异、表达、重组和进化等分子遗传学研究。
3. 染色体病的诊断
过去对染色体病的诊断 ,多在细胞水平上进行染色体核型分析 ,该法具有费时长 ,对妊娠晚期的孕妇不利的缺点。1999年Lo等利用荧光定量PCR技术 ,分别对从香港和波士顿两个中心收集的怀有 21-三体胎儿母亲的血液中胎儿细胞游离 DNA进行定量检测。用胎儿Y染色体上的一段序列作为分子标记 ,运用实时定量PCR进行扩增，β球蛋白基因作为血浆DNA扩增的阳性对照。结果发现 ,在波士顿收集的标本中 21-三体胎儿母血中胎儿游离 DNA的水平是正常对照的 1.97倍；在香港收集的标本中21-三体胎儿母血中胎儿游离DNA的水平是正常对照的2.46倍。说明染色体异常的胎儿其母体血液中细胞游离 DNA的水平较正常胎儿的母亲血液中的细胞游离DNA水平增高。但是，这种方法仅限于男性胎儿，对于女性患儿无特异性，尽管如此，它为无创性染色体异常的产前诊断提供了一种新的思路。
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4. 单基因病的诊断
在单基因病的诊断方面 ,对于基因的大片段缺失可设计跨基因片段的荧光探针 ,然后对其进行扩增。若有基因缺失 ,将无荧光的产生。直接观察荧光的有无,免去了常规 PCR后的电泳检查 ,且敏感性大大超过常规的 PCR,现已能够对单细胞的核酸进行检测。1999年Laurendeau等对一个家族性皮肤黑色素瘤进行基因诊断。利用球蛋白基因为参照基因 ,对p15基因 (皮肤黑色素瘤基因 ,该基因定位于染色体 9 p21,皮肤黑色素瘤的发生与 p15、p1 6、p19等肿瘤抑制基因的缺失有关 )进行扩增。正常的 p15基因起始拷贝数 /球蛋白基因的起始拷贝数值为 1,结果发现在该家系的 11位被检者中 ,有 5例比值为0.9 19～ 1.019 ( SD,0.006～ 0.075) ,有 6例比值为0.472～ 0.556( SD,0.013～ 0.078)。在6例中有三例是该病的患者,另外的三例可能是高危发病者。 2000年Costes等对一对可能怀有囊性纤维化胎儿的母亲进行产前诊断 ,发现胎儿的致囊性纤维化基因的外显子 19可能有基因的缺失 ,他们应用 ABI7700PCR扩增仪 ,抽取胎儿脐带血和母亲的白细胞的 DNA进行19外显子扩增。结果发现 ,父母的19外显子的扩增效率低于对照的2倍 ,而胎儿的 19外显子基本没有扩增出来。表明胎儿极有可能是一个19外显子缺失的囊性纤维化的患者。因为该对夫妇已经属于妊娠晚期 ,要求继续妊娠 ,结果分娩了一个囊性纤维化的患儿。该报道将单基因病的实时定量 PCR的诊断范围进一步扩展。之后又有在进行性神经性肌萎缩、地中海贫血等其他遗传病诊断方面的多篇报道。
5. 基因表达的研究
mRNA体内表达水平的定量PCR应用之前 ,mRNA的定量是用传统的Northern印迹的方法 ,其定量的下限是 106 ～ 107个分子。这种方法要求的mRNA的量较大,其在基因表达研究应用上受到很大的限制。实时荧光定量PCR的发明,解决了这个难题。其灵敏度可检测到400个分子的 m RNA。它以其精确、快速、污染小,已广泛应用于分子遗传学领域。在1996年PE公司研制出ABI7700系列荧光定量PCR仪后 Gibson等随后即发表了用荧光定量PCR来定量细胞内的mRNA的文献。该文作者利用 PGEM-3Z质粒 DNA作为内对照 ,精确的定量了T84细胞经腺病毒介导,转入CFTR基因后其细胞内 CFTRmRNA的水平。有的学者通过检测肿瘤相关癌基因表达的水平来判断肿瘤的微转移或预后。
6. 基因突变及其多态性
在突变检测上 ,常规的PCR多用SSCP、RFLP、DGGE等方法 ,其操作费时,在处理大批量的标本时其工作量极大。与之相比荧光定量PCR运用特异性荧光探针和杂合曲线分析 ,用来检测突变则省事、省时无污染 ,在大批量的标本检测时其优势更加明显。Roch公司新近开发了一种实时荧光定量 PCR技术—— lightcycler PCR。分别设计两个探针 ,一个带有 3′端单标记荧光供体 ( fluorophoredonor)另一个 5′端单标记荧光受体 ( fluorophore acceptor)。退火时两条探针均与同一条模板相结合 ,它们之间相隔 1～ 3个碱基 ,荧光受体与荧光供体之间形成荧光共振能量传递。发光二极管激发 3′端单标记荧光受体 ,经荧光共振能量传递给5′端单标记荧光受体探针产生实时荧光而被检测。例如 ,设计一对跨突变位点的荧光探针 ,由于跨越突变位点的荧光探针与模板完全配对时的解链温度(Tm)比模板出现单个碱基错配时的Tm值要高 ,所以 ,在扩增结束后对产物进行缓慢加热,同时检测荧光信号。随着温度的增高 ,3′端单标记荧光供体探针逐渐与模板解离 ,使荧光共振能量传递系统 ( fluorescence resonance energy transfer,FRET)的结构破坏 ,荧光信号逐渐减弱 ,当到达Tm值时探针与模板完全解离,其荧光信号消失。根据荧光的变化 ,绘制熔解曲线。根据曲线的形状来判断有无基因突变。Walburger等运用 Tap-man实时PCR和 Lightcycler PCR对 43例遗传性血色病的 HFE C282Y基因同时进行突变检测其符合率达到百分之百。Parks等运用
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LightcyclerPCR对 155例凝血因子v基因突变,157例前凝血酶原基因突变,及 156例遗传性血色病的HFEC282Y基因突变 ,运用CR-RFLP和 Light-cycler PCR进行突变检测 ,来验证荧光定量 PCR检测突变的可靠性。他们针对这三种遗传病的基因突变 ,分别设计三对跨越突变位点的荧光探针 ,对跨越突变位点的一段基因进行扩增。扩增结束时,对产物进行缓慢加热以获得熔解曲线 ,根据熔解曲线判断是否有基因突变。结果诊断符合率达到百分之百。说明了运用荧光定量 PCR检测基因突变具有准确、快速的优点 ,同时能有效的减少污染。说明在单碱基突变的检测及单核苷酸多态性的检测方面有很好的应用前景。
7. FQ-PCR技术在其他方面的应用
医学诊断　由于特异核苷酸杂交探针的应用,感染性疾病致病基因的检测及与遗传变异相关疾病的确认发生了巨大变革。FQ-PCR 首先被应用于诊断单基因遗传病镰状细胞贫血,随后又用于诊断X连锁遗传病,如Duchenne′s 肌营养不良。当多态性DNA 序列与人类遗传性疾病位点连锁时,它就可作为遗传缺陷或携带者的标记,结合家族史综合分析作出诊断。用FQ-PCR 原理可诊断的遗传病有:苯丙酮尿症、脆性X综合症等。根据FQ-PCR 原理,一旦了解与疾病相关的特异DNA 序列,就可设计出探针和引物进行DNA诊断。因而FQ-PCR 可用于各种遗传病包括染色体病、免疫遗传病等的诊断。FQ-PCR分析HLA多态性的基因分型在器官移植配型和相关疾病的诊断中亦起着重要作用。在感染性疾病方面, FQ-PCR 可诊断病毒性、细菌性及寄生虫疾病。最引人注目的是将FQ-PCR 与等位基因特异性核苷酸(Allele specific oligonucleotide ,ASO) 探针技术结合检测艾滋病病毒HIV-1 ,并发现了潜伏的HIV-1 ,证明仅少数宿主细胞隐藏病毒,没有任何病毒蛋白或抗体产生。另外FQ-PCR 还可用于检测癌症残留病变和早期病变,如对急性脊髓性白血病、结肠肿瘤等的诊断。
法医学应用　FQ-PCR已经开始应用于法医学个人识别和亲子鉴定,以往法医学鉴定的生物学检测条件很差,微量生物学物质常遭破坏,给鉴定工作带来很多困难,使用传统的方法往往无助问题的解决,给法医举证带来困扰。用FQ-PCR进行DNA分型为法医学鉴定开辟了新天地,它可检测微量及降解DNA,快速、简便、识别率高。目前已有对血痕、精斑、毛发、骨及其它组织DNA 分型的研究和应用于个人识别及亲子鉴定的成功报道。准确、灵敏、快速和经济的FQ-PCR 技术已发展成为一项完全自动化的分析技术,多种分析法与FQ-PCR 的结合使其具有广阔的应用前景。
作者: 荷塘青蛙！ 时间: 2011-8-24 16:59

肿瘤学研究意大利Gelmini等用FQ-PCR技术检测乳腺癌标本c-erbB-2基因拷贝数目变异情况。他们以β-肌动蛋白基因为参照探索最佳实验条件，当扩增循环数在28～31之间时，△RQ与模板DNA有着较好的剂量依赖关系。他们在此条件下扩增了c-erbB-2基因和β-球蛋白基因，发现△RQ都与各自的模板DNA浓度存在着线性关系，虽然二者斜率不同，但是各个实验浓度下二者的△RQ之比却是恒定的。说明尽管二者发光效率不同，却不影响定量效果。为了检验FQ-PCR的准确性和对不同基因拷贝数的分辨率，他们将c-erbB-2基因的DNA样本用正常胎盘DNA做不同倍数稀释后进行实验，测得的结果与期望值高度相关（r=0.997）。他们将实验数据与Southern印迹结果和已报告的竞争性PCR结果比较都显示高度相关性（n=25，r=0.94，P〈0.01）。
1998年法国Bieche等用FQ-PCR测定了108例乳腺癌标本。他们选择扩增频率较高的myc、ccnd1和erbB2基因进行扩增，在108例标本中，发现10%的myc基因、23%的ccnd1基因和15%的erbB2基因都有不同程度拷贝数增加，拷贝数增加的最大值分别为4.6、18.6、15.1。同时他们又将这些数据与Southern印迹的结果进行比较，显示了较好的相关性。
免疫组群分析对免疫T细胞群体V-β组份进行分析是研究健康和疾病免疫应答反应的重要手段，可通过流式细胞法或RFQ-PCR法来进行。流式细胞法是通过对细胞群体进行直接而方便的V-β表达方面的研究，但需要一整套单克隆抗体和大量细胞来进行染色分析，而且人类V-β特异性抗体尚不完备，因此该方法有许多不便之处。如果用FQ-PCR方法，即不需要大量细胞，引物设计也很方便，而且已有多种定量方法，包括锚式PCR法、半定量PCR法、竞争性PCR法等，但都因PCR产物的后处理过程需凝胶电泳、EB染色和光密度测量等既费时，又降低了准确性，还增加了污染机会，使得FQ-PCR的应用受到限制。1997年Lang等用FQ-PCR技术进行实验，从而避免了这些问题，他们在反应系统中引入荧光探针，将下游引物与探针固定，然后，针对不同的V-β成份，选用特异的上游引物进行扩增，再对反应中产生的荧光信号进行处理，即可获得各个成份的数据。
(三) FQ-PCR 的应用前景及展望
FQ-PCR 的出现,简化了mRNA 的可重复定量和检测过程,并可精确定量。FQ-PCR反应迅速、信号重复性好、灵敏度和特异性高,结果准确,与传统RT-PCR 相比有明显的优势。因此,实时FQ-PCR 在核酸的检测应用中,在临床诊断或大规模的人群分子流行病学调查中,都有广阔的应用前景。基因分析的定量化和均相化是未来基因诊断的发展趋势,目前该领域的研究刚刚起步,仍有许多问题需要解决,如分析灵敏度及重复性问题、自动化仪器和试剂成本、样本处理及多基因同时分析等问题。生物芯片技术与荧光探针定量技术的结合将有助于上述问题的解决。FQ-PCR 的分子灯塔技术与肽核酸技术结合,可大大增加反应的稳定性，将大大推动荧光定量检测技术在生命医学领域的应用普及。
待续
作者: 荷塘青蛙！ 时间: 2011-8-24 17:00

二、实时荧光定量PCR
实时荧光定量PCR技术近几年已开发应用于病原体核酸检测,已广泛应用于医学和生物学领域 ,在医学临床和研究中,也开始被推广使用。随着生物技术的快速发展 ,核酸扩增技术在医学临床与分子生物学研究领域中显示了重要作用。PCR是DNA扩增技术中应用最广泛的方法。例如 LCR(连接酶链式反应 )、SDA(链替代扩增反应 )、NASBA(依赖核酸序列扩增 )、TMA(转录介导扩增 )、bDNA(支链核酸信号放大 )、RCA(滚环扩增 )、杂交捕获、DNA裂解信号放大等 ,Taq Man荧光探针便是其中之一。Taq Man技术是从PCR衍生而建立的新的核酸扩增技术,由罗德公司( Rode Molecular System Inc.)发明并注册专利。1991年Holland等首先报道了一种不可延伸的双标记寡核苷酸杂交探针,利用DNA聚合酶的5′端外切酶活性检测 PCR产物。最初称其为实时定量PCR技术( Real-time quantitative PCR)或荧光定量PCR( FQ-PCR)。美国 Applied Biosystems公司于1996年根据上述原理开发设计了Taq Man( r)序列检测仪进行双标记荧光定量 PCR检测。不久,美国匹兹堡大学癌症研究所成立了 Tony Godfrey领导的Taq Man(r)实验室 ,对各种病原体进行临床检测使用。该技术不仅实现了PCR从定性到定量的飞跃 ,而且与常规PCR相比 ,它具有特异性和灵敏性更强 ,能有效解决PCR产物污染问题,自动化程度高等特点,目前在医学和分子生物学领域已得到广泛应用。
(一) 实时荧光定量PCR的原理
实时荧光定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。实时荧光定量PCR反应是在常规PCR的一对引物之外，加入一个两端带有荧光标记的寡核苷酸探针。在探针完好的状态下，5´端报告荧光基团的激发光被3´端的淬灭荧光基团所抑制。PCR反应过程中，随着链的延伸，Taq酶沿着DNA模板移动到荧光标记探针的结合位置，发挥它的5´端→3´端外切核酸酶活性，将荧光探针切断，释放出报告荧光基团的荧光信号，每合成一个模板，有一个报告基团的信号释放，被释放的激发离解报告荧光基团的数目和PCR产物是一对一的关系。通过定量PCR仪定时动态监测每一循环，可以得到样品实际扩增曲线，找到PCR扩增的对数期。通过标准品与待测品的对数值比较，得到每一样品模板DNA的起始拷贝数。
1. 定量程序
(1) Ct 值的定义
在荧光定量PCR技术中，有一个很重要的概念Ct值。C代表Cycle，t代表threshold，Ct值的含义是：每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数。见图(4-5)

图(4-5) Ct值的确定
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（2）荧光值的设定：PCR反应的前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号，荧光域值的缺损设置是3-15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍，即：threshold = 10 ´ SD cycle 6-15
（3） Ct值与起始模板的关系：
研究表明，每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，Ct值越小。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对数，纵坐标代表Ct值如（图4-6）所示。因此，只要获得未知样品的Ct值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。
（4）荧光化学: 荧光定量PCR所使用的荧光化学可分为两种：荧光探针和荧光染料。现将其原理简述如下：
PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5’端－3’端外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。如(图4-7)所示。

图(4-6). 荧光定量标准曲线

(5) 荧光域值（threshold）的设备 PCR反应前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号，荧光域值是PCR 3-15个循环荧光信号标准差的10倍，即threshold=10×Sdcycle 6-15。荧光域值设定在PCR扩增的指数期。
基线（Baseline）是指在PCR扩增反应的最初数个循环里，荧光信号变化不大，接近一条直线，这样的直线即基线。
(二) 实时荧光定量PCR技术检测仪器
美国 Applied Biosystems公司推出的ABI-7700实时荧光定量 PCR仪已成为专利产品。美国应用生物系统公司( Applied Biosystems)是全球最大的生命科学仪器制造厂商,该公司由 1986年推出世界第一台 PCR仪以来,一直不断完善和开发各种分子技术诊断设备 ,1996年又推出了全球第一台荧光定量PCR仪即 ABI-7700型荧光定量PCR仪。该仪器采用488nm氩离子激光器光源, 保证高能稳定的荧光激发。它还采用了520～660nm光栅全波长荧光同时分光及CCD( Charge coupled device电荷偶联装置 )摄像机荧光检测技术。扩增系统
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图(4-7)

采用9600型PCR仪 ,其加热冷却速度不受环境温度影响,保证了定量 PCR的批间重现性 ,而且其热膜加热设计又保证了96个样品孔温度的高度均一性,保证了定量 PCR的批内重现性。设计了阴性内对照荧光信号自动校准程序消除管间信号差异。该仪器一次最多可同时分析 96个样品 ,全波长同时检测各种颜色荧光 ,可做管内阳性模板对照或在同一反应管内定量多个靶基因。配套软件为等位基因分析软件和引物设计软件 ( Primer Express)。在此基础上研究和开发了其他同类仪器有 ABI-79 00型、PE-5700型、Cycle iQ荧光定量 PCR仪等。
(三) 实时荧光定量PCR的特点
1. 敏感性实时荧光定量PCR技术的敏感度通常达10²拷贝/ml，且线性范围很宽，为0-1011拷贝/ml。一般来讲临床标本中病原体的数目为0-1010/拷贝，在此范围内FQ-PCR定量较为准确，标本不需稀释。同时实时荧光定量PCR应用了光谱技术,与计算机技术相结合有较多的优点,有效的减少了劳动量。如Taqman PCR使用氩激光来激发荧光的产生 ,利用荧光探测仪检测荧光信号的大小,通过计算机的分析软件进行分析,灵敏度达到了极限 ,可以检测到单拷贝的基因,这是传统的 PCR难以做到的。敏感性大大提高。
2. 特异性实时荧光定量PCR技术具有引物和探针的双重特异性，故与传统的PCR相比，特异性大为提高。荧光探针的使用相当于在PCR的过程中自动完成了Southern印迹杂交,进一步提高目的基因检测的特异性。
降低产物污染的风险性传统的PCR在扩增结束后需要电泳或紫外光下观测结果除了有污染外,还对人体产生一定的伤害 ,而荧光实时定量PCR在全封闭状态下实现扩增及产物分析,有效的减少了污染及对人体的伤害。在大批量的标本检测中能有效的减少劳动量。
3. 可重复性实时荧光定量PCR技术结果相当稳定，同一标本的Ct值相同，但是其产物的荧光量却相差很大。因为域值设置在指数扩增期，在此阶段，各反应组分浓度相对稳定，没有副作用，Ct值与荧光信号的对数呈线性关系。而当PCR反应进入平台期后，由于反应体系各组分的耗尽，酶活性的降低及产物的反馈抑制等原因导致产物不再增加。与终点法相比Ct值能更稳定，更精确地反映起始模板的拷贝数。同时，因PCR是对原始待测核酸模板的一个扩增过程，任何干扰PCR指数扩增的因素都会影响扩增产物的量，如扩增孔间温度差异、标本中DNA聚合酶抑制剂的存在、加样的差异和待测标本中核酸模板的量等。因此，在扩增产物的数量与起始模板数量之间没有一个固定的比例关系，通过检测核酸产物很难对原始模板准确定量。
作者: 荷塘青蛙！ 时间: 2011-8-24 17:01

实时荧光定量PCR技术是将PCR从定性检测发展到定量检测的重大飞跃 ,这无疑扩大了它的应用范围 ,也提高了其应用价值。与常规 PCR比较起来 ,它具备更为突出的优点 ,近几年国内外医学临床和实验中报导了Taq Man技术的优点，它具有良好的敏感性和特异性。特异性方面 ,用以检测病原体的拭子样品,应用 Taq Man探针和常规PCR比较,特异性分别为96.5%和92.9 % ,检测外周血样品的特异性为96.7%和95.6% ,特异性之间的差异无显著性( P >0.05)。敏感性方面 ,Taq Man技术明显高于常规PCR。据陈效友等试验结果,纯化的结核分支杆菌染色体基因组 DNA经751型紫外分光光度计定量 ,从 100ng/μL开始,10倍稀释至1fg,并对结核分支杆菌菌体进行10倍稀释 ,分别进行Taq Man-PCR检测3次,结果显示 PCR的检测灵敏度达1pgDNA和20个菌体/m L,而Taq Man-PCR的检测灵敏度达10fgDNA和 1～ 5个菌体 /m L。也就是说 ,Taq Man技术的检测灵敏度要比常规 PCR高 10～ 100倍。德国的B.Schweiger等用Taq Man-PCR检测流感病毒 A、B型和 15个亚型中,100倍稀释时,灵敏度可达0.1TCID50,近似10个病毒 DNA,而常规PCR约为100～200病毒DNA。Taq Man技术的优点还在于由于全程的闭管操作,没有 PCR的后处理过程 ,因此污染率降低,克服了常规PCR污染率高造成假阳性的致命弱点。又由于其标准曲线的动力学范围广 ,为精确定量提供了较大的可信区间。 Taq Man技术采用的是外标准曲线的定量方法 ,它比内标法和半定量法要准确得多 ,而且 ,荧光探针高度重现性的特点保证了定量检测的稳定性。另外,定量过程的全自动化、高效率为其商品化提供了可行办法。实时荧光定量PCR技术使用了“内对照”系统 ,可校正 PCR效率获得定量结果。实时荧光定量PCR技术使用即时法 ,有效地解决了传统定量只能终点检测的局限 ,实现了每一轮循环均检测一次荧光信号的强度,并记录在电脑软件中,Ct值代表样品的浓度 ,通过对每个样品 Ct值的计算,常规法须在 PCR完成后测出全部的 PCR产物量 ,再确定原样品浓度。实时荧光定量PCR技术无需内标而采用外标准曲线定量 ,其原理根据 Ct值的重现性以及 Ct值与起始模板的线性关系。用实时荧光定量PCR技术检测,循环数约 20～24个 ,而常规 PCR法需使用 34循环。然而 ,Taq Man技术也有其不足之处尚未解决 ,如假阴性结果,这有可能是由于扩增体系中存在抑制物( inhibitors)而导致的结果或由于部分病原体存在序列缺损,这些问题有待进一步研究。另外,Taq Man荧光探针采用了酶外切活性,因此定量时常受酶性能的影响。
(四) 实时荧光定量PCR技术的应用
实时荧光定量PCR技术鉴定病原体的工作流程部分与常规PCR方法基本相似 ,要进行标本的前处理、DNA制备、设计引物、DNA模板扩增等。而 Taq Man-PCR使用的仪器、试剂、统计学方法不同 ,除常规引物外 ,它需设计并使用两端标记了荧光素的DNA探针,在 PCR反应体系中添加荧光染料SYBR Green I,随着产物链的延伸 ,Taq酶沿着 DNA模板移动到荧光标记探针结合位置,发挥 5′端～ 3′端外切酶活性 ,将荧光探针切断使报告荧光基团游离,然后通过Taq Man检测仪器测报告荧光信号 ,荧光信号的强弱由所测的Ct值确定,大于一定值为阳性,利用标准曲线计算出样品的起始拷贝数,进行定量分析。目前实时荧光定量PCR技术在医学和分子生物学领域已得到广泛应用,尤其是对RNA定量分析及基因遗传突变分析。主要应用于3个方面 :病原检测 (即病毒、细菌、霉菌等 )、基因表达(即细胞因子、生长因子、转录因子等 )和等位基因的鉴定(单核苷酸多态性( Single nucleotide polymorphism,SNP)的检测。在医学临床上已用实时荧光定量PCR技术诊断各种病原体 ,如流感病毒、人类免疫缺陷病毒( HIV)、结核分支杆菌、布鲁氏菌、大肠杆菌、性病病原体等。用 Taq Man技术检测致病性钩端螺旋体时可作出精确诊断 ,可避免使用 ELISA和 SAT等检测时出现假阳性的结果。通过实验和临床比较 ,常规PCR方法阳性率明显高于培养法 ,而 Taq Man技术检出标本阳性率高于常规 PCR。实时荧光定量PCR技术在兽医诊断学中也开始推广使用 ,在检测牛病毒性腹泻病毒 ( BVDV)、禽分支杆菌、牛布鲁氏菌、鹦鹉衣原体、猫冠状病毒等多种病原体的诊断和鉴别中陆续被采用。用实时荧光定量PCR技术诊断鸡新城疫和禽流感是特异性和敏感性较高的有效方法 ,并可区分新城疫病毒毒株的强毒、中间毒和弱毒株的差异。Cristian M L等已用Taq Man-PCR成功地建立了实时荧光定量检测技术及应用猫免疫缺陷病毒 ( FIV)疫苗中RNA和DNA的定量系统。实时荧光定量PCR技术还被应用于转基因食品及农产品的定量分析(如转基因大豆和玉米等 )。使用 ABI-7700型检测仪可准确测出食品中转基因成份的含量。人类基因组计划中,用实时荧光定量PCR技术可同时检测多种基因,比单独检测每一个基因提供更多有效的信息。在胚胎植入前的遗传学诊断中也使用了Taq Man技实时荧光定量PCR技术。在分子生物学中, 实时荧光定量PCR技术主要用于基因表达的定量检测和等位基因的鉴别。目前已建立了不同物种之间,基因表达定量的Taq Man PCR实时系统 ,此系统可靠性高。还可应用实时 Taq Man PCR检测基因突变和基因组的不稳定性。另外,用该技术对致癌基因进行扩增和检测肿瘤抑制子基因的缺失等。实时荧光定量PCR技术应用于SNP研究及基因表达分析包括 SNP发现(discovery)、SNP验证(validation)以及 SNP筛选( Screening or Scoring)。根据 SNP研究的不同阶段,解决方案选择包括测序法、单一核苷酸延伸法以及 Taq-Man MGB探针法。
作者: 荷塘青蛙！ 时间: 2011-8-24 17:02

(五) 实时荧光定量PCR技术的研究进展
美国应用生物系统公司又最新推出了一种Taq-Man MGB荧光探针。与常规Taq Man荧光探针相比,一是这种探针 3′端标记了自身不发光的淬灭荧光分子,以取代常规可发光的 TAMRA荧光标记 ,这一新技术使荧光本底降低,荧光光谱分辩率得以大大改善。二是探针3′端另结合了 Minor groove binder结合物,使得探针的Tm值提高,大大增加了探针的杂交稳定性。用Taq Man MGB荧光探针检测SNP,其探针长度在13～18个碱基之间 ,而常规 Taq Man长度较多时可达30～40个碱基,探针长度越长,其SNP识别率越低。新型Taq-Man MGB探针使荧光定量 PCR技术既可进行基因定量分析 ,又可分析基因突变 ,有望成为基因诊断和个体化用药的首选技术平台。实时荧光定量PCR技术另一种应用就是分子信标( molecular beacon)。其反应原理是1996年Tyagi等提出的“分子信标”概念。也有人译为“分子灯塔”,因其在与核酸分子互补结合之后荧光素便能开始发光,故称为“分子灯塔”。“分子信标”是一种茎环状发夹型探针 ,也叫Beacon探针,其茎环状部分与靶序列互补,位于主干部分的 5′和 3′端分别标记报告荧光 R和淬灭荧光Q。正常时,发夹呈环形关闭状态 ,报告荧光和淬灭荧光相距很近 ,报告荧光被淬灭。PCR扩增时,探针与模板杂交,发夹展开,报告荧光和淬灭荧光拉开,从而释放荧光,即在退火时可测定荧光。而在PCR的延伸阶段 ,探针又从模板上解离,重新形成茎环结构 ,荧光消失。荧光强度与扩增产物成正比 ,随着每次循环扩增产物的增加 ,其荧光强度也增加 ,它可反映每次扩增末期扩增产物积累的量。为了配合 Taq Man实时荧光定量检测,可在因特网下载探针设计软件 ,在因特网上有丰富的生物应用软件资源 ,可供研究人员使用。Taq Man探针设计软件 Beacon Designer2.0.exe是一个独立的核酸序列分析工具和 Beacon设计软件包 ,其中包含多媒体演示程序、功能介绍、运行步骤等项内容 ,用于实时 PCR技术、分子信标、Taq Man探针设计以及常规 PCR引物设计。在网上可下载软件 demo版 (约12Mb) ,注册版 18 8 5美元。访问数据来自Entrez或db SNP,可在线搜索BLAST序列,该软件十分实用 ,功能强大,快速且准确,可供进行实时定量检测。
Taq Man实时荧光定量检测技术是迄今为止定量最准确、重现性最好的定量方法,已得到世界公认。它广泛应用于基因表达研究、基因定型研究、核苷酸定量、基因突变筛选、转基因研究、药物疗效考核、病原体检测与鉴别等诸多领域 ,对兽医诊断学也具有十分重要的实际意义。
第六节 PCR 产物的定量检测与技术
一、凝胶检测系统　
凝胶检测系统用凝胶扫描仪或计算机辅助视频设备对溴化乙锭染色的琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶进行定量, 放射性标记的扩增产物可通过放射自显影定量测定。最近,有用自动DNA 测序仪检测荧光标记的核酸, 这种方法可准确测量扩增产物的大小, 而且其检测灵敏度可达fg 水平, 但由于自动DNA 序列仪和荧光标记引物极为昂贵, 所以现在仅用于研究。
作者: 荷塘青蛙！ 时间: 2011-8-24 17:02

二、 HPLC检测系统　
HPLC检测系统的优点为PCR 产物不用纯化,对未标记的产物灵敏度可达fg水平,对标记产物的检测限度可能更低。HPLC 能区分不同分子的大小,可允许我们使用不同大小的内标衡量扩增的效率。
三、固相测定系统　
固相测定系统最常用的为96孔聚苯乙烯微量滴定板,可用仪器比色或读数。可用亲合素分子通过疏水相互作用包被滴定板,此固相系统可特异结合生物素或生物素化的分子可用于生物素化的PCR产物的定量, 如用生物素和地高辛双重标记的扩增产物可用微量滴定板法定量。将生物素和地高辛同时标记PCR 产物的方法有三种途径:①在反应混合物中同时加入地高辛和生物素标记的脱氧核苷酸类似物(DIG-/Bio-dU TP); ②加入生物素化的引物1和DIG-dUTP; ③加入生物素化引物2和地高辛标记的引物2。定量方法为: 双重标记的扩增产物用乙醇沉淀以去除未结合的标记物,然后加至亲合素包被的微量滴定板上温浴至少2小时,洗涤数次后,与DIG 抗体和AP结合物温浴,根据其底物不同可产生不同的颜色。亲合素介导的固相捕获生物素标记靶分子的技术是一个有效、灵敏和容易操作的技术,将成为定量PCR的一个关键技术。
四、 SPA系统　
SPA (Scintillation Proximity Assay) 系统用亲合素包被的氟微球作为固相载体, 用生物素标记引物, 在扩增时掺入氚化的核苷酸, 扩增完成后,加入已包被的氟微球以捕获生物素化的PCR 产物, 此捕获过程可使氚与氟微球紧密结合, 氟被氚激发产生光脉冲, 可用闪烁计数仪测量。与比色法相比,此法具有更大的线性范围。
五、杂交检测系统　
将扩增产物变性后固定于尼龙膜表面, 与标记的DNA 探针杂交,亦可将序列特异的寡核苷酸探针通过多聚T(poly T ) 尾巴固定于膜上,与变性后的已标记的扩增产物杂交。在后者由于靶基因不是直接结合于膜表面, 故其反应动力学接近于液相, 反应速度快。通常使用生物素化的探针或扩增产物, 用亲合素2AP结合物产生颜色斑点,通过与已知浓度的标准比较颜色强度进行定量。
六、电化学发光检测系统　
通过亲合素2生物素系统将扩增产物结合于磁性珠, 然后与2,2′-联吡啶-2钌螯合物(TBR )标记的探针杂交,加入三丙胺(tripropylamine,TPA )溶液,并转移至电化学发光仪的检测池,当电极的电压增加至一定水平时TPA和TBR都瞬时氧化,TPA氧化后生成一种不稳定的、具有高度还原性的中间物质,可与氧化的TBR反应,使之进入激发态,当由激发态变为基态时可发射出620nm的光。发光强度与TBR标记物的量成正比,通过发光强度对PCR产物定量。此法的敏感性很高,可自动化测量。
七、 DNA酶免疫测定系统　
通过抗DNA单克隆抗体与扩增产物结合, 再通过酶-第二抗体结合物进行定量测定。此法不需对引物和扩增产物进行标记, 但易出现交叉反应和单克隆抗体昂贵的费用限制了此法的广泛应用。
八、激光诱导荧光检测法　
首先用荧光标记物FAM(商品名)的N-羟基琥珀酰亚胺酯衍生物借助氨己基连接臂偶联于正向引物的5′-核苷酸上,然后PCR扩增,用毛细管电泳扩增产物,最后用氩离子激光光源检测器检测荧光强度进行定量测定。此法的优点为样本用量少,可自动化检测, 快速、灵敏和高分辨率。
作者: 荷塘青蛙！ 时间: 2011-8-24 17:02

第七节目前存在的问题及展望
综上所述,定量PCR 技术的发展具有以下趋势:①从粗略定量、半定量到精确定量、绝对定量。②从单纯外参照非竞争性定量到内参照竞争性定量。③从扩增样品终点一次检测到扩增过程中动态连续检测进行定量。④检测方法也由手工、半自动发展到成套设备检测, 检测效率及自动化程度越来越高。定量PCR术的发展,是在不断克服其原有的缺陷,求得高度的灵敏性和较好的精确性的统一过程中发展、提高的。采用定量PCR技术对慢性病毒感染患者血中病毒荷载量进行测定,可用于抗病毒药物治疗的疗效预测和疗效观察。目前,已用于指导HIV、HBV、HCV 慢性感染的抗病毒治疗。
PCR技术在定量领域中的应用已逐渐由实验室中的探索发展成为理解复杂的生物本质的一项关键技术。目前,关于PCR能否精确定量的问题,正在进行激烈的争论。许多研究者趋向于将更多的精力投入新颖定量PCR方法的研究开发,使之进一步合理化,以增加试验的可信度。通过定量PCR涉及的所有过程的最终自动化,以消除重复性差的问题。毫无疑问,在不久的将来,定量PCR 技术将以其精确的定量,在分子生物学、实验医学,特别是在临床医学领域中得到实质性的应用。
尽管定量PCR 技术的发展促进了定量PCR 的准确性和可靠性, 然而PCR过程中任一因素的细微变化, 均要导致最终结果的巨大差异。另外, PCR反应前的提取方法的效率差异的存在,往往可引起最终定量的结果的显著变异,如果这些因素不能很好解决的话,进行真正意义的临床标本定量PCR的可信度将大打折扣。因此, 在进行定量PCR 研究中，我们在注意PCR过程标准化的同时, 应努力创造更加可靠的定量PCR技术。这不仅能积极推动定量PCR技术的发展,而且为正确判断疾病的发生、发展、预后提供有力的支持，为临床治疗中的量化以及临床治疗工作进入基因量化阶段提供帮助, 提高治疗的稳定性、可靠性、科学性,为最终揭示疾病的发生、发展过程提供一种科学量化指标。

(董坚杨莹魏双霞)

参考文献
1  仝文斌,高巍,费然等.核酸扩增产物的量化酶免疫通用型检测方法.中华医学检验杂志，1999,22:83-86.
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作者: 荷塘青蛙！ 时间: 2011-8-24 17:03

8  Higuchi R, Fockler C, et al. Kinetic PCR analysis: real-time monitoring of DNA amplification reactions. Biotechnology, 1993,11(9): 1026-1030.
9  Nittre C T, Herrmann M G, Moss A A , et al. Continuous fluorescence monitoring of rapid cycle DNA amplification. Biotechniques,1997,22 (1):130 –138.
10  Germ i R, Grance JM , Garin D, et al. Q uantitative real-time RT-PCR to study hepatitis C virus binding onto mam-malian cells. Am Clin Lab, 2001,20 (7):26-28.
11  张华,徐叔祥.定量聚合酶链式反应的研究进展与临床应用.中华医学检验杂志,2000,23(2):120-1211.
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第五章其它相关PCR技术
第一节逆转录—聚合酶链反应
一、原理
逆转录—聚合酶链反应（Reversetranscription-polymerase chain reaction, RT-PCR）的基本原理是由mRNA逆转录产生的cDNA链作为模板进行PCR扩增。以RNA模板反转录（RT）为cDNA一链，再以cDNA一链复制出cDNA二链。分别以cDNA一、二链为模板，进行PCR扩增，通过电泳检测PCR产物，并定量分析以间接了解组织细胞中的mRNA的表达及含量。两步RT-PCR法可以使用oligo（dT）或随机引物引导cDNA第一链的合成。因此，可以从一个特定的样品中反转录出所有的mRNA的信息。此外，两步法可将反转录产物分别进行多重不同的PCR反应，因而可以从一个样品解答多个问题。一步法可使RT及PCR过程在单管和单一的缓冲液中完成。RT完成后不需要打开反应管、消除了不必要的加样过程，同时可避免污染。这种安排比RT及PCR分开的过程更方便。
作者: 荷塘青蛙！ 时间: 2011-8-24 17:03

RT-PCR的特点是灵敏并且用途广，可用于检测产生的转录产物，确定某一基因转录物的存在与否，分析表达的水平；在无需构建和筛选cDNA文库时，克隆cDNA产物。
二、实验方法
(一) 主要试剂
1.  细胞总RNA或mRNA
2.  10×逆转录缓冲液：0.5mol/L Tris-HCl，pH8.3，0.4mol/L KCl，70mmol/L MgCl2，10mmol/L DTT，1mg/ml BSA
3.  dNTPs
4.  随机引物，目的基因引物
5.  AMV逆转录酶
6.  RNA酶抑制剂
7.  Taq酶
(二) 操作步骤
1. 逆转录反应：20μl反应体系内，包括2μl细胞总RNA或mRNA，1U/μl AMV逆转录酶，50pmol随机引物，1 U/μlRNA酶抑制剂，500umol/L dNTPs，10×逆转录缓冲液2μl，5mmol/L MgCl2。42℃反应30min，95℃加热10min灭活逆转录酶，4℃保存。
2. 聚合酶链反应：50μl反应体系内，包括1.5 mol/L MgCl2，200 umol/L dNTPs，25pmol基因引物，Taq酶2U，1μg总RNA来源的cDNA模板。混匀后加50μl轻质石蜡油，在适当温度参数下扩增30-35循环。
3. 琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳，紫外灯下观察结果或吸收光密度扫描。
(三) 优化RT-PCR反应
1. RNA模板
逆转录反应的成功有赖于作为模板的mRNA的完整性及纯度。操作时使用无菌的反应管、吸头、手套及DEPC处理过的水。当从核酸酶活性很高的样品中分离RNA时，建议使用核酸酶抑制剂（RNasin）。并常规或快速纯化RNA。无论是总RNA制备物、mRNA还是合成的RNA转录物，都应该是无DNA的。如果RNA制备物中含有微量的DNA，且与模板RNA具有相似序列时，反应体系就会产生该DNA的扩增产物。
使用RT-PCR扩增所需RNA的最小量取决于模板和引物两方面。一般情况下总RNA模板在10pg-1μg时，或poly(A)+ RNA模板在1pg-100ng时，均可得到很好的扩增效果。
作者: 荷塘青蛙！ 时间: 2011-8-24 17:04

2. 对照反应
为了便于优化RT-PCR反应，处理常见问题，应设立阳性对照和阴性对照。阳性对照使用的是阳性对照RNA和上、下游对照引物。阴性对照是无菌的无核酸酶反应体系中RNA模板。
3. 核酸污染的避免
操作时应当心，以便使样品间交叉污染的可能性减少到最低程度，并且避免核酸（RNA和DNA）从一个反应遗留到另一个反应。扩增前后应使用不同的工作区域及加样器。操作时应戴手套并时常更换。使用灭菌技术来防止DNA遗留到后续的反应中。
4. 镁离子浓度
RT-PCR系统中反转录与DNA聚合酶所要求的Mg2+浓度受反应体系中核苷酸、寡核苷酸引物及模板终浓度的影响。每一实验均须依据目的mRNA引物的不同组合来确定Mg2+的最佳浓度。以滴定的方法确定Mg2+的浓度能够显著地改进敏感性、特异性及反转录和扩增产物的质量。
5. 引物设计
引物是决定PCR扩增片断长度、位置和结果的关键，它的设计尤为重要。RT-PCR引物的设计，首先应清楚所选择的组织特异性标志物的基因序列，识别出外显子与内含子的连接部位，使设计的引物能跨越外显子的断裂连接区。RT-PCR扩增产物的片段长度较基因组DNA扩增的短，因而能很容易地将污染的基因组DNA扩增产物区分开来。为增加检测的敏感性，须设计两对引物进行巢式RT-PCR扩增。巢式逆转录PCR技术（nested-RT-PCR）即先用外引物作第一次扩增，再用第一次扩增产物用内引物作第二次扩增。因为采用了二次PCR扩增，而且在第一次扩增基础上应用内引物再次扩增，所以增加了敏感性和特异性。
6. 温度
逆转录反应在适当的温度下进行，以便使RNA二级结构的形成减少到最低程度，有利于全长cDNA的合成。在逆转录反应之后，使杂交的RNA/cDNA变性，同时灭活AMV反转录酶，从而在使用耐热DNA聚合酶时能够得到高产量的扩增产物。
在决定PCR扩增循环的温度时，引物的序列是一个应主要考虑的因素。一个扩增循环一般包括三步：变性（94℃）、模板/引物退火（42-60℃）及延伸（68℃）。对于具有高解链温度（Tm）的引物而言，将退火和延伸温度升高是有利的。因为较高的温度可使模板与引物的非特异性结合减少到最低程度，从而提高特异性产物的产量。而对于低Tm值的引物而言，则有必要降低退火温度，从而使引物结合到目的模板上。
作者: 荷塘青蛙！ 时间: 2011-8-24 17:04

7. 孵育时间及循环数
当孵育温度为37-48℃时，有效的第一条cDNA链的合成可在20-60min内完成。在第一条cDNA链合成之后，将反应体系于95℃温浴，使AMV逆转录酶失活，同时使杂交的RNA/cDNA变性。这一步骤直接导致第二条cDNA链的合成，进入PCR扩增阶段。大多数RNA样品经40个扩增循环后均可被检测到。如果目的RNA含量稀少或可供实验用样品材料量少，则有必要将循环数提高到45或50。在延伸过程中，每1kb长度的扩增引物大约需要1min进行延伸（最小延伸时间=1min）。最后的68℃、7min的延伸步骤将截短的扩增产物延长为全长扩增产物，从而可提高终产物的质量。
三、常见问题处理
(一) 第一条cDNA链产物产量低或没得到
1.  RNA被降解
通过变性琼脂糖凝胶电泳检验RNA的完整性。确保试剂、加样器尖头及反应管均无RNA酶。在有核酸酶抑制剂存在的情况下分离RNA.
2.  AMV反转录酶高温灭活
如果在实验的开始加入了一个变性/退火步骤，则应确保在变性步骤及以后的42℃恒温之后再加入含有AMV逆转录酶的混合物。
3.  引物的特异性
核对“下游”引物是否与RNA下游序列相互补。
4.  引物退火
如果以寡聚（dT）作为“下游”引物，则应确认在反转录反应之前，用适当的温度进行退火反应。
5.  RNA纯化问题
一些RNA纯化过程中遗留的试剂（如SDS、NaCl、肝素、异硫氰酸胍）会干扰RT-PCR，影响目的RNA的质量。
(二) 扩增产物的分子量高于预期值
与模板RNA相关的基因组DNA污染了RNA制备物，使用无RNA酶的DNA酶消化污染的DNA。
(三) 扩增产物产量低或没有扩增产物
1.  循环数不够
将反应体系再进行5个循环
2.  热循环仪程序出现错误
检查设置的时间和温度是否正确
3.  热循环仪中的一些部位温度太低
设定一组阳性对照，用以确认在热循环仪的某些特定部位PCR产物的产量是否太低。
4.  反应条件不合适
降低退火温度和/或针对较长的扩增产物而延长延伸时间。
5.  遗漏反应体系中的组分
查对反应体系中的组分并重新进行反应。
6.  矿物油的问题
反应体系必须用高质量的、无核酸酶活性的轻质矿物油覆盖。不要使用经高压灭菌处理过矿物油。
7.  反应管未经高压灭菌处理
将反应管进行高压灭菌，去除抑制扩增的污染物。
作者: 荷塘青蛙！ 时间: 2011-8-24 17:05

8.  引物设计不当
确认引物无自身互补或两条引物不互补, 检查PCR引物的长度及Tm。
9.  扩增产物产量低或没有扩增产物
引物的特异性错误：检查所设计的引物是否与正确的链互补。
反应条件不是最佳：优化Mg2+浓度、退火温度及延伸时间。确认两条引物浓度相同。
核苷酸降解：将核苷酸小量分装，冻存。快速融化，融化后置于冰上。避免反复冻融。
目的序列不在目的RNA上：重新设计实验，或尝试用其他来源的目的RNA。
10. 多个非特异性扩增产物
反应条件不是最佳：优化Mg2+浓度、退火温度。
引物设计不当：确认引物无自身互补，或两条引物不互补，尤其在近3，端。检查PCR引物的长度和Tm。避免在引物的3，端使用3个连续的G或C。
体系被另一目的RNA/DAN污染：加样时减少交叉污染。再扩增前和扩增后分别应用独立的操作区域和加样器。戴手套并经常更换。采用灭菌方法来防止DNA遗留到后续反应中。
目的RNA中含有多个目的序列：设计新引物。
(何永文)

参考文献
1  迪芬巴赫,德维克斯勒著.黄培堂等译.PCR技术实验指南.北京:科学出版社,1998,第一版.
2  张维铭主编.现代分子生物学实验手册.北京:科学出版社,2003,第一版.
3  方福德,周吕.现代医学实验技巧全书.北京:北京医科大学中国协和医科大学联合出版社,1995,第一版.
4  谭骏等.基因工程原理及实验操作技术.北京:山东大学出版社,1994,第一版.
第二节套式PCR
套式PCR(nested primers-polymerase chain reaction，NP-PCR)
一、原理
套式PCR亦称为巢式PCR(nested-PCR)或嵌合PCR，通过设计“外侧”、“内侧”两对引物进行两次PCR扩增，外侧引物的互补序列在模板的外侧，内侧引物的互补序列在同一模板的外侧引物内侧。先用一对外侧引物扩增含有目的靶序列的较大的DNA片段，然后用另一对内侧引物以第一次PCR扩增产物(含有内侧引物扩增的靶序列)为模板扩增，使目的靶序列得到第二次扩增，从而获取目的靶序列。这样两次连续的放大，明显地提高了PCR检测的灵敏度，保证了产物的特异性。对于极其微量的靶序列，应用套式PCR技术可以获得满意的结果。
作者: 荷塘青蛙！ 时间: 2011-8-24 17:05

根据两对引物设计的不同，又可以把套式PCR分为巢式PCR和半巢式PCR。如果一对内侧引物的互补序列是在一对外侧引物的内侧，称之为巢式PCR；如果内侧引物中的一条与外侧引物相同，而另一条在外侧引物内侧，则称之为半巢式PCR，半巢式PCR亦有很强的特异性。
二、基本技术
(一)主要设备和仪器：
紫外分光光度计，高速离心机，PCR扩增仪，电泳仪，紫外检测凝胶分析仪等
(二)主要试剂
DNA提取试剂盒(或经典酚、氯仿、乙醇法提取DNA所需的饱和酚、氯仿、异戊醇、蛋白酶K、无水乙醇等试剂)、分子量标准(Markres)、PCR扩增试剂(引物、dNTPs、Taq DNA聚合酶等)、ddH2O(PH8.2)、液体石蜡、琼脂糖、溴乙锭(E、溴酚蓝等。
(三)操作方法
1. 样本采集及DNA提取：DNA提取可以用DNA提取试剂盒或实验室常用的一些DNA提取方法进行。
2. DNA定量：用紫外分光光度计进行DNA含量测定。
3. 引物的设计、合成：根据自己所要扩增的目的靶序列设计一对外侧引物和一对内侧引物，由生物公司合成。
4. PCR扩增
(1) 扩增体系：20μl或50μl，含有DNA模板、10×buffer、dNTPs、引物、Taq酶、液体石蜡、ddH2O(PH8.2，用于补足反应体积)。
(2) 扩增条件：根据所设计合成的引物及目的靶序列，设定扩增参数，两次PCR扩增的扩增条件相同。
(3) 两次PCR扩增：以外侧引物进行第一次PCR扩增，然后再以第一次的扩增产物作为模板，以内侧引物进行第二次PCR扩增。
5. 扩增产物的分析：
(1) Southern印迹杂交
取PCR扩增产物20μl，加样，电泳分离，然后用变性液和中和液进行处理后转膜；80℃烤膜2h，42℃预杂交30min，加入32P标记的相应的探针(20pmol)后42℃杂交过夜；第二天用1％SDS/PBS (PH7.2)，42℃洗15min，0.5％SDS/PBS(PH77.2)，42℃洗15min后将膜置X线暗盒内，放射自显影后观察，显影者为阳性，不显影者为阴性。
(2) 琼脂糖凝胶电泳分析
取5μl扩增产物与1μl溴酚蓝混合后加样，同时加样分子量标准(用以确定扩增片段大小)，经2％琼脂糖凝胶(含0.5μg/mlE恒压(70-100V)电泳15-30min，紫外检测凝胶分析仪观察结果，出现荧光带者为阳性结果，阴性结果无条带，并摄像，记录分析结果。
作者: 荷塘青蛙！ 时间: 2011-8-24 17:05

三、套式PCR的应用与评价
套式PCR技术主要是用来提高扩增的灵敏度和特异性，用“外侧”、“内侧”两对引物扩增，其结果较一对引物扩增的结果敏感100倍，特别适合与微量靶序列的扩增。病毒、钩端螺旋体等病原微生物的检测常选用套式PCR技术，此外，线粒体测序其测序片段的制备，可用套式PCR技术。对于样本中极其微量的靶序列，一次常规的PCR，结果不令人满意，此时，应用套式PCR技术，可以有效的提高扩增效率，得到满意的结果。
(张金国景强)

参考文献
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2  郭景元,李伯龄主编.中国刑事科学技术大全.法医物证学.北京：中国人民公安大学出版社,2002,第一版.
3  郑秀芬.法医DNA分析.北京:中国人民公安大学出版社,2002,第一版.
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5  易广才,陈华,陈静琴等.用套式PCR检测孕妇及胎儿B19病毒感染.中国优生与遗传杂志,2001,9(4):17-19.
6  刘佩娜,姜素华,廖琳等.应用套式PCR技术检测我国西南部分疟区疟原虫的感染状况.华西医大学报,2002,33(3):452-455.
7  杨岁虎,杨双旺,孙佩等.套式聚合酶链式反应极量稀释法评价外科乙型肝炎表面抗原携带着血液的传染性.中华医院感染学杂志,2000,10(5):396-398.
8  孟钵,谈维,孙启俊,等.套式聚合酶链反应检测HTLV-ⅠDNA方法的建立与初步应用.临床检验杂志,2000,18(5):270-271.
第三节多重PCR(mulitiplex PCR)
一、原理
多数的PCR技术都是设计一对寡核苷酸引物扩增所需要的目标靶序列。如果在实验中要求分析不同的DNA序列时，可以根据实验的要求，设计多对引物，在同一个PCR反应体系中，同时扩增一份DNA样本中几个不同靶区域的DNA片段，这一过程称之为多重 PCR。由于每一对引物扩增的是位于模板DNA上的不同序列的DNA片段，因此，扩增片段的长短不同，可以据此来检测特定基因片段，检测其大小、缺失、突变是否存在。PCR扩增后电泳检测，有条带则说明有待测基因片段，反之，则这一片段缺失。
二、基本技术
(一) 主要设备、仪器：
PCR扩增仪，紫外分光光度计，高速离心机，电泳仪，紫外凝胶检测分析仪等。
(二) 主要试剂：
DNA提取试剂盒(或经典酚、氯仿、乙醇法提取DNA所需的饱和酚、氯仿、异戊醇、蛋白酶K、无水乙醇等试剂)、分子量标准(Marker)、PCR扩增试剂(引物、dNTPs、Taq DNA聚合酶等)、ddH2O(PH8.2)、液体石蜡、琼脂糖、溴乙锭(E、溴酚蓝等。
(三) 操作方法：
同一般的PCR操作相同，只是反应中所加入的是多对引物而不是一对引物。
1.DNA提取：DNA提取可以用DNA提取试剂盒或实验室常用的一些DNA提取方法进行。
2.DNA定量：用紫外分光光度计进行DNA含量测定。
作者: 荷塘青蛙！ 时间: 2011-8-24 17:06

3.多重PCR扩增：反应体系可以选定为20μl，50μl等，反应体系中含有：DNA模板，Mg++，dNTP，Taq DNA聚合酶，各种引物等。根据实验要求，设计合适的循环参数。在设计循环参数时要注意两个原则：一是退火温度要足够高。这是因为，多重PCR技术是在扩增体系中加入了多对引物同时进行扩增，这样就会由于错配而产生一些非特异性的扩增产物，增高退火温度，可以有效的减少非特异性扩增产物的生成；二是循环参数要尽量少，以利于检测扩增产物。多重PCR在一个反应体系中同时扩增多个DNA片段，其扩增效率并不是完全相同的，循环参数的增加，会使Taq酶的消耗增加，再加上每对引物相对退火效率不同，就会使扩增产物混乱，所以，循环次数不宜过多。
4.电泳检测及结果分析：取扩增产物10×与26×载样缓冲液(溴酚蓝)混匀上样，同时加入分子量标准，经2％琼脂糖凝胶(含0.5μg/ml E、恒压(200-600V)、电泳1-2小时后，置凝胶于紫外检测凝胶分析仪观察结果，并拍照，记录分析结果。
三、多重PCR的应用与评价：
多重PCR技术可应用于生物学研究的多个领域，如病原体鉴别、性别筛选、遗传性疾病诊断、法医学研究以及基因缺失、突变和多态性分析等等。多重PCR技术作为一种可靠的检测基因序列的缺失或突变的方法，在假肥大性肌营养不良症(DMD)的诊断中得到应用。半数的DMD病人是由于Dystrophin基因的部分缺失所引起的，根据Dystrophin基因中易于缺失的9个区域的序列，设计合成一系列引物，同一实验中同时扩增这9个区段，电泳分析。正常人多重PCR电泳图谱为9个片段，如果Dystrophin基因中的某一个区段缺失，那么在PCR电泳图谱上就没有相应的条带，据此可以诊断DMD。
随着PCR技术的发展，多重PCR技术已经取代了较为烦琐的Southern印迹杂交来检测基因的突变或缺失。应用多重PCR技术，在同一反应管中可以同时检测分析多种目的DNA序列，既节约了实验样本和试剂，而且使操作更加简便，省时省力。
与常规的PCR技术相比，多重PCR技术涉及到了多对引物，随着引物对数的增加，也增加了得到错配的扩增产物的机会，因此，需要根据实验的要求、目的以及所设计的引物等等因素，对反应条件进行优化，对多重PCR中的各种影响因素进行组合、调整，以寻找到一个最优的扩增条件，从而可以进行高度特异性的多重PCR，这在对病原微生物的基因检测和临床诊断方面有着十分重要的意义。
作者: 荷塘青蛙！ 时间: 2011-8-24 17:06

(张金国景强)

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第四节 PCR结合等位基因特异性的寡核苷酸探针法(PCR-SSO)
通过对基因特异性的寡核苷酸探针与基因的杂交的情况可以判定基因是否突变。即首先通过PCR反应特异性的扩增目的基因片段，然后将含有目的基因片段的PCR扩增产物点样于尼龙膜上，使其与根据目的等位基因设计的一套寡核苷酸探针杂交。寡核苷酸探针的5’端使用放射性同位素标记，严格的控制杂交和洗膜的条件，使探针和目的DNA片段之间只要有一个碱基错配就不能杂交。这样当扩增片段和探针完全互补时，由于两者牢固结合而不会被洗脱脱下来，反之，只要有一个以上的碱基不互补时将被洗脱下来，在经过放射自显影，从而判断目的基因中是否含有与探针同源性的序列。
PCR-SSO技术包括PCR扩增反应和寡聚核苷酸探针杂交两个阶段。PCR反应阶段与标准PCR反应相同(详见PCR反应有关章节)，根据具体情况选择合适的反应条件。PCR扩增的产物点样于尼龙膜上后，使其与预先设计好并已标记的寡核苷酸探针杂交。
作者: 荷塘青蛙！ 时间: 2011-8-24 17:07

探针的标记除了传统的放射性同位素标记法以外，还可以使用非同位素探针标记技术。非同位素标记技术主要包括生物素标记法、辣根过氧化物标记法及地高辛标记法，这些方法都是在寡聚核苷酸上结合某种化合物制成探针，与待测DNA片段杂交后经过一系列化学反应而显色。此外，反向斑点杂交技术也可应用到PCR-SSO技术中，从而大大地简化了操作。1989年，Saiki等首先报道了反向斑点杂交技术，他在寡核苷酸的3’末端加上一个多聚胸苷酸尾巴，经过紫外光照射，激活的胸腺嘧啶与尼龙膜上的腺嘌呤结合。使用这种方法，先将一套探针固定在同一张膜上，然后使其与目的DNA片段杂交，这样就可以同时分析一系列序列，或者分析某个基因位点存在着哪些等位基因。
在PCR-SSO应用方面，自上世纪80年代中期SSO技术的发明以来，SSO技术就用于等位基因的分型，此后随着PCR技术的问世和推广，SSO技术通常和PCR技术相结合形成PCR-SSO技术。PCR-SSO技术同时具有PCR技术灵敏度高和SSO技术特异性强、可靠性好的优点。1990年第11届国际组织相容性会议推荐了一套标准的探针和条件，使得PCR-SSO技术趋于成熟，并且使不同实验室的结果具有可比性，从而得到广泛的应用。目前，PCR-SSO技术主要用于等位基因监测、基因分型和基因突变的检测等领域。然而PCR-SSO技术也有其不足之处，主要有以下几方面：⑴传统方法使用同位素标记技术，但同位素标记具有半衰期短、标记率不稳定、容易造成放射污染的缺点；⑵随着新的等位基因的不断发现，需要越来越多的探针和杂交次数，然而使用常规的PCR-SSO技术不但操作繁琐、技术要求高而且费时、影响因素多；⑶不能进行单倍型分析。目前，通过采用非同位素标记技术和反向斑点杂交技术对PCR-SSO技术进行了改进，部分地克服了上述的一些缺点。
第五节 PCR结合序列特异性引物技术(PCR-SSP)
PCR结合序列特异性引物技术(PCR amplification with sequence-specific primers， PCR-SSP)是一种新的基因多态分析技术，可用于多种具有多态性特点的基因的分型。
作者: 荷塘青蛙！ 时间: 2011-8-24 17:07

基因的多态性是由其编码等位基因的碱基顺序不同所决定的，在PCR-SSP技术中，预先根据多态性等位基因中的核苷酸序列设计出等位基因特异性的引物，即序列特异性引物(SSP)，SSP只能与其特异等位基因片段的碱基序列互补结合。将SSP引物与目的基因通过PCR反应扩增，PCR反应产物经过电泳分离后，可以直接检测该等位基因的多态性。
PCR-SSP技术除使用的引物为SSP引物外，其反应体系的组成和各反应参数都与常规的PCR反应相类似，故使用该法进行基因分析时，只需根据目的基因中的等位基因设计SSP引物，然后就同常规PCR反应体系一样，根据具体情况选择合适的反应条件和反应参数，进行PCR扩增反应即可。最常用的扩增产物的检测方法是琼脂糖凝胶电泳-溴化乙锭检测和聚丙烯酰胺凝胶电泳-银染色检测法。
在应用方面，自1992年Olerup首先建立PCR-SSP技术以来，其在实践中得到了迅速的发展和推广。目前，PCR-SSP技术主要用于等位基因多态性的分析，例如是HLA复合体的分型和基因突变的研究。在器官移植的组织配型和HLA与疾病的关联的研究中，PCR-SSP法已被证明是一种实用有效的检测技术。实践证明，PCR-SSP技术具有方法简便、快速、结果准确的优点，但由于目前设计合成的SSP引物只具有相对的特异性，使得该法在基因分型和突变的检测中仅限于较低分辨率的检测，而要获得更加精细的结果，则需要依赖于其他的技术进行进一步的分析。
第六节单链构型多态性分析(PCR-SSCP)
一、原理
DNA分子在凝胶电泳中的泳动速率除取决于其分子量的大小外，还受到其空间构型的影响。在非变性条件下，单链DNA分子由于分子内碱基配对而重新折叠形成一定的构象，因此当单链DNA分子中存在由于各种突变导致其核苷酸序列的微小变化时，这些变化会影响DNA分子的构象从而使其在凝胶电泳中的泳动速率发生改变。通过DNA分子在凝胶电泳中不同的电泳迁移率，我们可以将变异的DNA与“正常”DNA区别开来。而PCR技术能在短时间内把目的基因片段扩增数百万倍，将两者结合起来，就形成了单链构型多态性分析(PCR-SSCP)。
作者: 荷塘青蛙！ 时间: 2011-8-24 17:08

二、基本技术
(一)试剂
变性上样缓冲液
95% 甲酰胺
5mmol/L EDTA
0.05% 溴酚蓝
0.03% 二甲苯晴蓝
0.5×突变凝胶
6% 聚丙烯酰胺凝胶
10% 甘油
0.6% TBE
0.05% 过硫酸铵
0.005% TEMED(N，N，N’，N’-四甲基二胺)
10%醋酸固定液
去离子水
(二)所需设备及材料
垂直电泳装置
恒压恒流电泳仪
染色盘
脱色摇床
照相设备
(三)具体操作步骤
1．变性：PCR循环结束后，取5μl扩增产物与3μl的变性上样缓冲液混合，95℃热变性后骤冷从而得到单链DNA分子。
2．电泳：将变性得到的单链DNA分子上样于0.5×MDE突变分析凝胶，同时加入一标准单链DNA作为对照以克服胶与胶之间或泳道间的差异。在室温下5W恒电流电泳过夜，微型胶用3W恒电流电泳3小时即可。
3．电泳结果检测：除了常规的电泳后溴化乙锭染色和银染色法显示电泳结果外，在电泳前使用同位素或非同位素标记引物和脱氧核苷酸后再进行PCR反应，电泳后采用荧光分析等方法也可以显示电泳结果。
作者: 荷塘青蛙！ 时间: 2011-8-24 17:09

4．结果判定：根据不同泳道DNA数目和位置，确定样品扩增产物的PCR-SSCP谱型。根据位置的差异分析判断产物单链构型的差异，从而间接反映模板DNA序列间的差异。
至今，PCR-SSCP技术已被广泛的应用于癌基因、抑癌基因突变的鉴定，遗传病致病基因分析和基因诊断等领域中。与其它的基因检测技术相比较，PCR-SSCP技术具有简单、快速、敏感性高、需要样本量少、适合大量样本的筛选的优点。由于其检测结果是通过电泳条带的变化而不是信号的缺失体现的，因而PCR反应的失败不会导致假阳性结果。但是由于没有完整的理论依据来预测迁移率与序列构像的对应关系，使得其结果的判定只能基于经验的总结基础之上。此外，SSCP只能检出影响分子构像的某些一级序列的突变，因而可能漏检某些序列即存在假阴性。并且，随着DNA片段长度的增加，检测的敏感性逐渐降低，尤其对于大于300bp的DNA片段，依其序列的不同，可能表现出复杂的图谱。另外，尽管PCR-SSCP在不同系统中的突变检出率可高达70%到95%以上，但是高的检出率需要在不同条件下做凝胶电泳才能得到。因此，PCR-SSCP仅仅是一种简单、高效的突变筛选方法，而并不是最佳的方法。
第七节限制性酶切片段长度多态性分析(PCR-RFLP)
限制性内切酶能够特异性的识别特定的碱基序列，并将其切开。若目的基因的碱基突变位点与限制性内切酶的识别位点相关，碱基的突变则可能引起某些酶切位点的消失或者新的酶切位点的出现，当用特定的限制性内切酶来消化发生突变的目的基因后，将会产生与“正常”的目的基因不同大小的片段。通过电泳可将上述酶切片段分离从而得到目的基因的电泳酶切图谱，将其与“正常”基因的酶切图谱相比较，可以直接判定目的基因是否发生碱基突变。这种根据不同长度的限制性酶切片段来分析目的基因的多态性的方法称为限制性片段长度多态性(restriction fragment length polymorphism，RFLP)分析。将RFLP分析技术与PCR扩增反应相结合，即使用RFLP分析技术来分析PCR扩增产物可以大大提高RFLP分析的灵敏度，这就是PCR-RFLP分析技术。具体操作步骤如下：
作者: 荷塘青蛙！ 时间: 2011-8-24 17:09

(一)试剂和设备
限制性内切酶
琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶配制试剂
EB染色试剂或银染色试剂
电泳仪
水浴锅
(二)实验步骤
1. PCR扩增：按常规的方法分离提取目的DNA片段，按标准的方法进行PCR扩增反应。
2. 酶切反应：根据不同的目的DNA片段选择合适的限制性内切酶与目的DNA片段进行酶切反应。具体的酶切反应按内切酶生产商提供的说明进行。
3. 电泳分析将酶切得到的DNA片段经过电泳后染色以得到相应的酶切图谱。常用的有琼脂糖凝胶电泳溴化乙锭染色和聚丙烯酰胺凝胶电泳银染色分析，也可以电泳后通过转膜，选取适当的探针杂交检测。
PCR-RFLP分析技术目前主要用于基因突变的检测和等位基因的分析，RFLP是最早用于HLA基因分型的方法。但由于PCR-RFLP分析只能检测到某些已知与限制性内切酶酶切位点相关的碱基变异而不能检出一些未知的碱基突变，故其检测视野很窄，此外其还有很多不足，如操作繁琐、费时、影响因素多、费用高等因素而限制了其在检测DNA多态性和基因突变中更广泛的应用。
第八节 MVR-PCR
微卫星DNA是指核心序列(Core Sequence)在基因组非编码区中以10~50bp为重复单位的***重复序列。微卫星DNA***重复序列的多态性(Minisatellite Variant Repeat，MVR)包括核心序列***数目的变异以及核心序列组成的微小变异。1991年，Jeffrey等首先使用两种MVR特异的引物进行PCR扩增反应，并结合数字编码详细地分析了小卫星区域D1S8(MS32)核心序列的变异情况，从而建立了MVR-PCR技术。1993年，Nail等报道了小卫星区域D1S8(MS32)核心序列的变异的同时还发现了重复核心序列的侧翼区也存在变异，从而可以根据不同的保守序列引物和不同的MVR特异引物进行PCR反应扩增，这就是等位基因特异的MVR-PCR(Allele-specific MVR-PCR)。
一、原理
MVR-PCR利用MVR特异引物对微卫星DNA片段进行PCR扩增，扩增产物经电泳分离后，通过染色法或者标记引物的方法来检测微卫星DNA的多态性。根据PCR反应体系中使用的MVR特异引物，MVR-PCR可分为二态MVR-PCR技术、四态MVR-PCR技术和等位基因特异MVR-PCR技术。
(一)二态MVR-PCR技术
二态MVR-PCR技术采用2种MVR特异引物进行PCR扩增反应，核心序列至少有1个碱基替换。Jefferys等分析小卫星D1S8基因时设计了32D、32-TAG-T、32-TAG-A和TAG四种引物，其中32-TAG-T、32-TAG-A分别特异性的与a型和t型核心序列特异性的结合从而保证PCR产物的特异性。
作者: 荷塘青蛙！ 时间: 2011-8-24 17:11

(二)四态MVR-PCR技术
四态MVR-PCR技术利用4种MVR特异引物进行PCR反应扩增，核心序列至少有2个或2个以上碱基替换。将4种MVR特异引物与基因组DNA分别在4个PCR反应体系中进行扩增反应，可进一步增加微卫星DNA多态性的可检出性。例如，Y染色体特异小卫星MSY1(DYF155S1)是以25bp的DNA片段为核心序列的***重复序列，其核心序列上有4个位置出现碱基替代，通过四态MVR-PCR技术已发现有10种类型的核心序列，并且以1、3、4型多见。
(三)等位基因特异MVR-PCR技术
二态和四态MVR-PCR检测的均为微卫星DNA***重复的核心序列的多态性，然而1993年Nail等报道了微卫星DNA的侧翼区也会发生微小的变异(如碱基替代)，故可能使同一个体双等位基因表现为杂和状态或不同个体间的差异表现为一定的多态性。预先确定出微卫星DNA侧翼区域的DNA变异的位置后，设计出能与不同的等位基因互补的特异引物，使其3’端与侧翼区域变异的碱基配对，通过PCR扩增后，扩增产物电泳分离后可以得到MVR图谱，此即等位基因特异的MVR-PCR技术(Allele-specific MVR-PCR)。利用该技术，不仅可以检测到微卫星DNA核心序列多态性的状况，还可以获得其侧翼序列DNA多态性的信息，从而更有利于分析微卫星DNA的结构和多态性。
二、基本技术
MVR-PCR分为PCR扩增反应和扩增产物的检测两个阶段。PCR扩增反应体系与标准的PCR反应体系相同，根据待增的微卫星重复核心序列及其侧翼序列的情况以及所选择的MVR-PCR技术选取不同的MVR特异引物。
通过MVR-PCR扩增产物的检测，可以获得微卫星DNA多态性的信息。常见的MVR-PCR扩增产物的检测方法主要有如下几种：
(一)探针杂交法
1.  32P标记探针杂交法 Jeffrey等建立的MVR-PCR技术中，PCR扩增产物使用1%琼脂糖凝胶分离后经Southern blotting转移到尼龙膜上，与探针杂交后经放射自显影，可获得至少50个数字编码的MVR图。
2.  碱性磷酸酶法和辣根过氧化物酶法 Hopkins等采用碱性磷酸酶法，虽然避免了放射污染，但方法过于繁琐；而郑秀芬等使用的辣根过氧化物酶法不仅方法简便，而且提高了检测的灵敏度。
(二)电泳检测法
1.  聚丙烯酰胺凝胶电泳-银染色法 Rodringuez-Calvo等采用6%聚丙烯酰胺凝胶电泳分离PCR扩增产物，然后使用硝酸银染色检测。此法具有简单、费用低、可快速获得清晰的MVR图的优点。
2.  琼脂糖凝胶电泳-溴化乙锭染色检测法 Yamamoto等将PCR反应扩增产物在含有溴化乙锭(E的1%琼脂糖凝胶中电泳后在紫外灯下观察。此法简单、省时，但是当PCR扩增产物中含有较大或着较多的DNA片段时，不易分离。
(三)荧光标记引物法
Hau等使用荧光染料6-FAM标记MVR特异引物经PCR反应扩增，在DNA序列分析仪上电泳后，经过计算机程序处理后可得到60个以上的数字编码MVR图。此法实现了DNA的自动化分析，可以客观、灵敏、直观地分析微卫星MVR图谱，而且操作简单、快速，可以在2天内得出结果。
作者: 荷塘青蛙！ 时间: 2011-8-24 17:12

三、应用和评价
与其他技术相比较，MVR-PCR技术具有如下的优点：⑴获得的多态性信息量高、灵敏度高：即使微量(1ng/μl)的DNA模板通过此法也能获得令人满意的多态性结果；⑵保证结果的客观性和准确性：MVR-PCR技术采用数字编码，不需要检测片段的长度，且编码的产生不需要特殊的DNA分子量标准，不受凝胶变形和谱带漂移等因素的影响，不要求在同一凝胶中进行样品的对比；⑶数字化：MVR-PCR技术可通过计算机将微卫星DNA多态性的信息转化为一组数字信息，简明直观、便于储存。然而，MVR-PCR技术也有其不足之处，主要表现在：⑴已发现的适合MVR-PCR技术使用的微卫星还很少；⑵尚未建立标准有效的与微卫星相关的数据库；⑶目前发现的微卫星的突变率比较高。这些因素限制了MVR-PCR技术的应用，目前其应用主要局限于法医学和人类遗传学的研究。
自Wyman等克隆分离人类基因组第一个微卫星DNA以来，越来越多的微卫星DNA被克隆、分析。微卫星DNA核心重复序列在不同的个体间存在较大的变异，同时MVR-PCR技术具有简单、快速、可以数字编码有利于计算机储存的特点，使得MVR成为法医学领域中应用广泛的遗传学标记之一，故MVR-PCR技术被广泛的应用于法医学的个人识别和亲子鉴定中。微卫星DNA突变率极高，且突变过程也极复杂，是目前遗传学研究的难点之一，由于MVR-PCR技术可以揭示DNA序列内部的变异结构，使其成为研究微卫星DNA突变机制和过程的方法之一。近年来，MVR-PCR技术已被肿瘤研究和微生物学领域的研究所采纳，可以预见，随着更多符合要求的微卫星DNA的发现，MVR-PCR技术将会在更多的领域中得到广泛的应用。
第九节 RAPD技术
自从1985年Jeffreys建立了DNA指纹技术以来，该技术就得到了广泛的应用。随着PCR技术的建立，DNA指纹技术也不断的发展。1990年Welsh等首先使用任意引物进行基因组指纹分析来检测DNA的多态性。
一、原理
使用随机选择的的核苷酸作为PCR反应体系中的引物，在较低的复性温度下(36℃)进行PCR。由于非特异性的引物与模板上的多个位点结合而不是与某一限制性位点特异性的结合，因此经过PCR扩增反应后可以产生多个PCR产物。经过凝胶电泳可以将上述的多个PCR反应产物分离，这样的多态性的产物通常称为随机扩增多态性DNA(Random Amplification Polymorphism DNA,RAPD)。最有效结合的引物在扩增过程中相互竞争而产生指纹，从而形成相应的DNA指纹图谱。
作者: 荷塘青蛙！ 时间: 2011-8-24 17:13

二、基本技术
(一)试剂
2×AP-PCR 混合物
引物：以成对混合方式使用10碱基的任意引物，选择能产生中等复杂的指纹图谱的引物，以获得较高的重复性。一般推荐使用两种任意10碱基的引物(每种0.4μmol/L)
0.1U/μl Taq DNA聚合酶Stoffel片段(Perkin-Elmer公司)
0.2 mmol/L dNTP
0.1 μCi/μl[α-32P]dCTP
10 mmol/L MgCl2
20mmol/L KCl
20mmol/L Tris-HCl(pH8.3)
凝胶：若产生相对少量的PCR产物，可选择琼脂糖凝胶电泳分离，这样可以充分的显示出在PCR反应中占优势的产物。然而，若指纹图过于简单，会引起“背景效应”从而影响结果判定，因此应避免使用那些不到10种主要PCR反应产物的简单指纹图谱。一般首先可以使用琼脂糖凝胶电泳以确定反应是否成功，待技术熟练后，使用产生大量DNA片段的方法产生较多的产物然后使用聚丙烯酰胺凝胶电泳。
(二)设备
热循环仪
电泳装置等
(三)方法
实验中使用两种以上的DNA的量来确定产生最浓指纹的浓度，在哺乳动物DNA，通常在每20μl的反应体积中加入5~50ng的DNA可以获得最佳指纹。引物的浓度必须根据具体经验确定，通常对于大多数10碱基的引物的最佳引物浓度约为0.4μmol/L。
通常应做两种终浓度的反应，以确定制备的DNA的质量是否对结果造成不利影响。
1.  制备2×终浓度的DNA，取10μl于PCR反应管中
2.  向PCR管中加入10μl 2×AP-PCR混合物。DNA和反应混合物的体积可以依据具体要求有所变化，但应注意维持各组分的终浓度不变
3.  进行PCR循环，循环条件设定为：94℃1 min、35℃1 min、72℃ 2 min，共循环40次
4.  电泳和检测
(1)聚丙烯酰胺凝胶电泳使用含有10mmol/L EDTA和示踪染料的80%的甲酰胺液稀释产物至1:4，65℃加热15 min，取2μl在变性聚丙烯酰胺凝胶(1.0×TBE缓冲液，50W，65℃电泳3 h)或者MDE凝胶(0.5×TBE，7W，室温电泳18 h)上电泳，凝胶干燥后对X光片曝光。
(2) 琼脂糖凝胶电泳扩增产物采用普通的琼脂糖凝胶电泳后溴化乙锭染色。
三、技术应用和评价
DNA指纹图谱具有如下的优点：①具有高度的个体特异性，一般仅同卵双生子才有相同的DNA指纹；②体细胞稳定性，即同一机体不同组织中的DNA指纹完全一致；③简单稳定的遗传性，子代与亲代的DNA指纹几乎完全一致，新生带低于5‰；④较之单纯的RFLP分析，DNA指纹更能反映基因组的特异性。由于上述优点使得RAPD技术作为一种使用方便的检测DNA多态性的技术应用于DNA指纹分析中并在法医学、遗传学、系统发生学、种群生物学和肿瘤学研究中得到了广泛的应用。其主要优点有：①可用一系列的通用引物分析不同种类的生物，②可用于制备探针和DNA顺序的研究，③使高效基因制图工作更为方便有效，使基因型的鉴别自动化。
邓兴力王廷华
通讯地址：昆明医学院神经科学研究所
E-mail：tinghua_neuron@263.com
作者: 荷塘青蛙！ 时间: 2011-8-24 17:14

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下篇
PCR相关技术的应用

第六章 PCR技术用于构建cDNA文库、测序及基因突变的检测
第一节 cDNA文库构建的基本技术
基因的结构、功能分析及其表达调控是现代生命科学研究中的主要课题，而基因的分离和纯化是研究的基础。基因文库的构建使基因的分析变得简单而快捷。真核或原核细胞的染色体DNA经物理或化学方法使基因组DNA分裂成为一定大小的片段，而后选择适当的载体与这些片段进行体外重组，并将这些重组体转染细菌后，可得到一组含有不同DNA片段的分子克隆混合体称为DNA文库。
cDNA文库是由mRNA反转录后获得的cDNA，是在某种特定的细胞及特定状态下的全部cDNA克隆，因此，只有细胞内存在mRNA，才能建成相应的cDNA文库。而且，不同种类不同状态的细胞有不同的cDNA文库。所以，cDNA文库中所含有的特异性基因片段反映了组织或细胞中特定阶段表达蛋白质的编码基因，而且，这些编码基因所含序列是既可被转录又能被翻译的外显子部分，而不含有内含子。
cDNA文库分为非表达型和表达型二种：非表达型cDNA文库多用λgt10作为载体。λgt10系免疫区插入载体家族中的一员，非重组的λgt10长约43kb，最多可插入长7.6kb的外源性DNA，重组与非重组的λgt10可根据其所形成的噬菌斑表型加以区别。构建于λgt10的基因文库可用核酸探针进行筛选；表达型cDNA文库用λgt11作为载体。λgt11是一个表达载体，可插入全长约7.2kb的外源性DNA片段，其表达的融合蛋白氨基端为β-半乳糖苷酶序列而羧基端为外源多肽。与非表达型相比较，表达型载体插入的cDNA片断最终以融合蛋白形式表达，蛋白保持原有的抗原性与生物活性，该文库可用与表达蛋白能特异结合的抗体或与表达蛋白特异结合的受体进行筛选，因此，该类文库特别适用于氨基酸序列不清楚的蛋白质的筛选。下面是具体介绍cDNA文库的构建方法。
一、经典cDNA文库的构建方法
自cDNA克隆问世以来，cDNA合成和克隆方法不断改进，与之相适应的cDNA文库也得到不断改善。经典cDNA文库是以带有多聚腺苷酸的mRNA为模板，在反转录酶的作用下合成cDNA第一链，再用适当的方法合成cDNA第二链，而后加入合成接头后，把cDNA克隆到能在细菌中扩增的载体中。
构建过程包括：mRNA的分离；合成cDNA第一链；合成cDNA第二链；cDNA甲基化；cDNA与连接子连接以及连接后cDNA的过滤分离；cDNA与载体的重组连接以及重组DNA的体外包装等步骤。
(一) mRNA的分离
1. 仪器和所需试剂及配制
(1) 所需仪器：玻璃匀浆器，紫外分光光度计，高速冷冻离心机，水浴锅，DEPC处理过的微量离心管
(2) 所需试剂及配制：TRIZOL reagent，oligo(dT)-纤维素，氯仿，异丙醇，无水乙醇，DEPC(核酸酶抑制剂)，0.1mmol/L NaOH。
2×上样缓冲液：40mmol/L Tris-Cl(pH7.6)，1mmol/L NaCl，2mmol/L EDTA (pH8.0)，0.2(m/V)月桂基肌氨酸钠
1×洗脱缓冲液：10mmol/L Tris-Cl(pH7.6)，1mmol/L EDTA (pH 8.0)，0.05% SDS
2. 实验步骤
(1) 总RNA提取
1)  100mg新鲜组织放入DEPC处理过的匀浆器中，加1ml预冷的TRIZOL reagent，冰浴中匀浆至无组织块。
2)  将匀浆转移至1.5ml Eppendorf管中，加入200μl氯仿，用力振荡Eppendorf管直到充分混匀(静置时间长一些能提高效率), 4oC 12000g离心10min，Eppendorf管中分三层，上层为水相，中间为变性后的蛋白质，下层为氯仿层，含有组织沉淀物。
3)  小心将上层水相(内含RNA)移至另1支Eppendorf管中，加入250μl异丙醇沉淀RNA，用力振荡Eppendorf管直到充分混匀，室温放置5-10min。
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注：TRIZOL reagent，裂解样品；氯仿，抽提去除蛋白质(为提高RNA的纯度，去掉更多的蛋白质，此步骤可重复一次)；异丙醇，沉淀RNA。
4)  将Eppendorf管4oC 12000g离心10min，小心将上清液去掉。此时可以看到Eppendorf管底有少量白色沉淀(应该为少量无色沉淀或根本看不到，白色为少量杂蛋白)。
5)  加入1ml 75%乙醇，轻轻振荡几次后4oC 7500g离心5min，小心将上清液倒掉。注：75%乙醇，目的是充分洗掉沉淀中的杂质。
6)  将Eppendorf管内壁的小水滴用加样枪吸干，倒扣在吸水纸上，室温放置10-15min直到Eppendorf管内恰好干燥，加入DEPC处理过的双蒸水50μl，溶解RNA保存于-80℃。取少量溶于双蒸水的RNA，用紫外分光光度计测量RNA的纯度。
(2) oligo(dT)-纤维亲合层析法制备mRNA
mRNA是构建cDNA文库的材料，大多数真核生物mRNA在其3，端带有由20-300腺苷酸组成的poly(A)尾巴，因此，mRNA能用oligo(dT)-纤维亲合层析法将其从细胞总RNA中分离出来。该方法是应用带有poly(A)尾巴的mRNA能与连在纤维素介质上的短链(通常长度为18-30个核苷酸)oligo(dT)形成稳定的RNA-DNA杂合链的原理，将带有poly(A)尾的RNA吸附于与poly(A)互补配对的oligo(dT)-纤维素介质上，oligo(dT)-纤维素层析法得到的mRNA的纯度较高,方法如下:
1)  0.5-1g的oligo(dT)-纤维素，用0.1 mmol/L NaOH悬浮。
2)  在柱床中加入oligo(dT)-纤维素悬浮液(0.5-1.0 ml柱体积)，并用DEPC处理过的蒸馏水冲洗柱子。
3)  用无菌的1×上样缓冲液冲洗柱子，至流出液pH值低于8.0。
4)  将双蒸水溶解的总RNA，650C，5min处理后，迅速冰浴冷却至室温，并加入等量的2×上样缓冲液。
5)  将RNA溶液加到柱子上，收集流出液，当所有的RNA溶液进入柱子时，用1倍体积的1×上样缓冲液冲洗柱子，继续收集流出液。
6)  650C加热收集液5min，重新上样。
7)  用5倍体积的1×上样缓冲液冲洗柱子后，用2-3倍柱体积的无菌、无RNA酶的洗脱缓冲溶液从oligo(dT)-纤维素柱上洗脱poly(A)+RNA。收集流出液，测量OD260值，-800C保存。
(二) 合成cDNA第一链
1. 仪器和所需试剂及配制
(1) 所需仪器：水浴锅，DEPC处理过的微量离心管
(2) 所需试剂及配制：poly(A)+RNA(1mg/ml)，核苷酸引物(1mg/ml)，鼠反转录酶(M-MLV)，dNTP溶液(含有4种dNTP，每种5mmol/L)，1mol/L MgCl2，1mol/L KCl，0.1mol/L二硫苏糖醇(DDT)，1mol/L Tris-HCl(pH8.3)，10mCi/mlα-32P-dCTP，DEPC(核酸酶抑制剂)，RNase 抑制剂
2. 实验步骤
(1) 无菌离心管中加入以下试剂：10μl poly(A)+mRNA(1mg/ml)，1μl寡核苷酸引物(1mg/ml)，1mol/L Tris-HCl(pH 8.0，370C)2.5μl，1mol/L KCl 3.5μl，250mmol/L MgCl2 2μl，dNTP溶液10μl，0.1mol/L DDT 2μl，RNase 抑制剂25U，加水至48μl，加入2μl M-MLV，温和振荡混匀。
(2) 取2.5μl以上混合物至另一微量离心管中，加入0.1μlα-32P-dCTP, 两管370C温浴1h。
(3) 第一离心管700C温浴10min后放于40C；含同位素的微量离心管中加入1μl 0.25mol/L EDTA，取0.5μl计算总放射性和三氯乙酸(TCA)放射性。
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(4) cDNA第一链合成量为
合成的cDNA第一链(μg)=掺入的活度值(cpm)/总活度值(cpm)×66(μg)
(三) 合成cDNA第二链
1. 仪器和所需试剂及配制
(1)  所需仪器：水浴锅，DEPC处理过的微量离心管，SepHadex G-50离心
(2) 所需试剂及配制： cDNA第一链，dNTP溶液(含有4种dNTP，每种10mmol/L)，α-32P-dCTP(10mCi/ml)，1×104U/ml Ecoli DNA聚合酶Ⅰ，1×104U /ml Ecoli DNA连接酶，2.5U/μl T4噬菌体DNA聚合酶，30U/μl T4 噬菌体多核苷酸激酶，50mmol/Lβ-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(β-NAD)，1000U/ml RNaseH，氯仿，酚：氯仿(1：1，V：V)，无水乙醇，1mol/L MgCl2，1mol/L(NH4)2SO4，2mol/L Tris-HCl(pH7.4)，0.5mol/L EDTA (pH8.0)，TE(pH7.6)
10×T4 噬菌体多核苷酸激酶缓冲液：700mmol/L Tris-HCl(pH7.6)，100mmol/L MgCl2，50mmol/L二硫苏糖醇(DTT)。
2. 实验步骤
(1) 在第一链反应混合物中加入：2mol/L Tris-HCl(pH7.4)5μl，10mmol/L MgCl2 70μl，10mCi/mlα-32P-dCTP10μl，1mol/L(NH4)2SO4 1.5μl，RNaseH (1000U/ml) 1μl，大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ(1×104/ml) 4.5μl，温和振荡混匀, 1600C温浴4h。
(2) 在反应物中加入：50mmol/Lβ-NAD 1μl, Ecoli DNA连接酶1μl，室温温浴15min。
(3) 加入dNTP溶液(含4种dNTP，每种10mmol/L)1μl，5U T4噬菌体DNA聚合酶，混合后室温温浴15min。
(4) 取1μl反应液测定总放射性和TCA沉淀放射性。
合成的cDNA第二链(μg)=掺入的活度值(cpm)/总活度值(cpm)×(66μg-cDNA第一链量)
(5) 将0.5mol/L EDTA (pH8.0) 5μl，加入剩余的反应物中，用酚:氯仿和氯仿分别抽提混合物一次，乙醇沉淀回收DNA，将DNA溶解在90μl TE(pH7.6)液中，加入10×T4 噬菌体多核苷酸激酶缓冲液10μl，30U/μl T4多核苷酸激酶1μl，室温温浴15min。然后用等量的酚：氯仿抽提。
SepHadex G-50 用含有NaCl的TE液平衡后，分离未掺入的dNTP和α-32P-dCTP，最后用70%的乙醇洗涤沉淀物，弃乙醇干燥后用80μl TE(pH 7.6)溶解。
(四) cDNA甲基化
cDNA第二链合成后得到的cDNA在与载体连接时需在末端加上EcoRⅠ接头，当带有EcoRⅠ位点的双链接头加到cDNA上后，必须要进行相应的酶切以产生粘性末端，cDNA甲基化后可保护双链cDNA的内部酶切位点不被EcoRⅠ切割。
1. 仪器和所需试剂及配制
(1) 所需仪器：高速冷冻离心机，水浴锅
(2) 所需试剂及配制：双链cDNA，8×104U/ml EcoRⅠ甲基化酶，20mmol/L S-腺苷甲硫氨酸，氯仿，酚:氯仿(1：1，V：V)，乙醇，5mol/L NaCl，2mol/L Tris-HCl(pH8.0)，0.5mol/L EDTA(pH 8.0)，TE(pH8.0)
2. 实验步骤
(1) 在80μl cDNA 溶液中加入: 2mol/L Tris-HCl(pH8.0)5μl, 5mol/L NaCl 2μl, 0.5mol/L EDTA(pH8.0)2μl，20mmol/L S-腺苷甲硫氨酸 1μl，加双蒸水至98μl，加入2μl EcoRⅠ甲基化酶(8×104U/ml), 370C温浴1h，680C 15min。
(2) 用等体积的酚/氯仿抽提一次，氯仿抽提一次，40C 12000g离心15min，沉淀用70%乙醇洗涤后溶于30μl TE(pH8.0)。
(五) cDNA与连接子连接及连接后cDNA的过滤分离
1. 仪器和所需试剂及配制
(1) 所需仪器：高速冷冻离心机，分级分离柱，SepHadex G-50离心柱，水浴锅
(2) 所需试剂及配制：EcoRⅠ酶，1×104U/ml T4噬菌体DNA连接酶，500U/mlT4噬菌体DNA聚合酶，已磷酸化的连接子(EcoRⅠ)，dNTP溶液(含有4种dNTP，每种5mmol/L)，0.5mol/L EDTA (pH8.0)，TE(pH8.0)，酚:氯仿(1：1，V：V)，3mol/L乙酸钠(pH5.2)，乙醇，10mmol/L Tris-HCl (pH8.0)
10×T4噬菌体DNA聚合酶缓冲液：330mmol/L Tris-乙酸(pH 8.0)，660 mmol/L乙酸钾，100mmol/L乙酸镁，5mmol/L 二硫苏糖醇，1mg/ml牛血清白蛋白
10×EcoRⅠ酶缓冲液：1mol/L乙酸钾，250 mmol/L Tris-乙酸(pH7.6)，100mmol/L四氢乙酸镁，5mmol/Lβ巯基乙醇，0.1mg/ml牛血清白蛋白
10×T4噬菌体DNA连接酶缓冲液：200mmol/L Tris-HCl(pH7.6)，50mmol/L MgCl2，50mmol/L二硫苏糖醇
TEN缓冲液：10mmol/L Tris-HCl(pH8.0)，1mmol/L EDTA(pH8.0)，100mmol/L NaCl
2. 实验步骤
(1) cDNA末端削平
1) DNA 680C加热5min，冷却至370C后，加入5×T4噬菌体DNA聚合酶缓冲液10μl，dNTP溶液(含有4种dNTP，每种5mmol/L)5μl，加双蒸水至50μl。
2)  加1-2U的T4噬菌体DNA聚合酶，370C温浴15min。
3)  加入0.5mol/L EDTA (pH8.0)1μl以终止反应。
4)  酚：氯仿抽提，SepHadex G-50离心柱层析，除去未掺入的dNTP。
5)  乙醇沉淀后，溶于13μl 10mmol/L Tris-HCl (pH8.0)。
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(2) 与连接子的连接
1) 在已削成平末端的cDNA中加入：10×T4噬菌体DNA连接酶缓冲液 2μl，已磷酸化的连接子800-1000ng(EcoRⅠ)2μl，1×104U/ml T4噬菌体DNA连接酶2μl，10mmol/L ATP 2μl，混匀后160C温浴8-12h。
2) 加入10×EcoRⅠ缓冲液 20μl，双蒸水150μl，EcoRⅠ酶 200U，混匀后370C温浴2h。
3) 加热680C 15min后，酚:氯仿抽提、乙醇沉淀纯化回收cDNA，cDNA溶于20μl TE(pH8.0)中。
(3) cDNA的过滤分离
将cDNA插到载体之前，装有连接子的cDNA要经过进一步的分离，以除去未连接的连接子及长度小于500 kb的cDNA片断，这样将会增加文库中全长mRNA 的数量，且减少了需要筛选的重组子的数目。
1)  反应产物进行SepHaroseCL-4B柱层析，平衡缓冲液用含0.1mol/L NaCl的TE(pH7.6)。
2)  收集带有放射活性的流出液，每管约60μl，直至将所有的放射性洗脱出柱为止。
3)  从每一管中取出5μl，以末端标记的已知大小(0.2kb-5 kb)的DNA片断作标准参照物，通过1%的琼脂糖凝胶电泳进行分析，根据放射自显影结果，收集0.5kb以上的cDNA。
4)  加入0.1倍体积3mol/L的乙酸钠(pH5.2)和二倍体积的乙醇，40C放置15 min使cDNA沉淀，40C 12000g离心15min，沉淀干燥后溶于30μl 10mmol/L Tris-HCl(pH7.6)。
(六) cDNA与载体的重组连接、重组DNA的体外包装和转染
1. 仪器和所需试剂及配制
(1) 所需仪器：水浴锅
(2) 所需试剂及配制：大肠杆菌菌株，包装蛋白混合物，λ噬菌体DNA，1×104U/ml T4噬菌体DNA连接酶
10×T4噬菌体DNA连接酶缓冲液：200mmol/L Tris-HCl(pH7.6)，50mmol/L MgCl2，50mmol/L 二硫苏糖醇。
SM培养基：NaCl 5.8g，MgSO4.7H2O 2g，1mmol/L Tris-HCl (pH7.5)50ml，2%明胶溶液5ml加水至1L，高压灭菌20min
2. 实验步骤
(1) 离心管中加入收集的大于500bp的cDNA片断50 ng，λ噬菌体DNA 0.5μg，10×T4 DNA连接酶缓冲液 1μl，T4噬菌体DNA连接酶1μl (1×104U /ml)，加双蒸水至10μl混匀后160C温浴12h。
(2) 包装蛋白混合物加入体外连接的噬菌体DNA进行包装，完成后加入0.5ml SM培养基，稀释包装后的噬菌体感染宿主菌，根据产生的噬菌斑数测定转染效价，据之将剩余的噬菌体全部感染宿主菌。
(七) cDNA文库的扩增
已构建好的cDNA文库可直接用于实验研究，但为了长期使用的需要，一般将cDNA文库扩增后低温长期保存。载体为λgt10噬菌体时选用EcoliBNN102为宿主菌；λgt11一般适用EcoliY1090作为宿主菌。步骤如下:
1.  105个噬菌体感染大肠杆菌，铺平板，加入15mlSM培养基，室温振荡2h。
2. 回收SM培养基，7000g离心30min后，上清分装每管1ml，加入20-30μl氯仿，40C保存，若要长期保存加入甘油，-700C保存。
(八)注意事项：
1.  在mRNA的分离过程中，因为mRNA的含量很低，且多为低丰度mRNA，所以在操作过程中一定要选基因拷贝数高，表达旺盛的组织作为分离mRNA的材料，此外，对实验的器皿、试剂一定要严格无RNase处理，防止RNA的降解。
2.  在cDNA第一链合成过程中，逆转录酶是关键，建议使用缺失RnaseH的鼠反转录酶(M-MLV)，且在反应中加入一定量的RNase抑制剂。
3.  克隆时选用合适的载体，λgt10为常用的非表达型载体，λgt11是常用表达型载体，在其基础上衍生了一系列其它的载体如λgt18、λgt19，另外，还有λZAP，这些载体根据适当的情况选用。
随着分子生物学的发展，经典cDNA文库的构建方法在模板制备、cDNA合成效率和克隆载体等方面，取得了很大的进展，但经典cDNA文库尚存在以下几个方面的不足：第一，构建经典的cDNA文库所需的mRNA量大，不可能以少数细胞或组织为材料构建所需的cDNA文库；第二，低丰度表达序列在文库中出现的机率很低；第三，筛选经典cDNA文库工作复杂，限制了基因克隆的速度。
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二、用PCR 方法构建cDNA文库
与经典cDNA文库相比，用PCR 方法构建的cDNA文库周期缩短、操作快捷，使用少量组织细胞构建cDNA文库成为可能。PCR技术的建立通过把经典cDNA文库和PCR技术结合起来,建立了适用于少量RNA的PCR cDNA文库，不管是来源丰富、mRNA丰度较高的组织或细胞的cDNA文库构建，还是来源稀少、mRNA丰度极低的组织和细胞的cDNA文库构建,都有较高的成功率。PCR cDNA文库的构建方法自建立以来,经过了多方面的改进,已趋完善。因此, PCR cDNA文库已成为目前常用的cDNA文库。主要步骤有：
(一) RNA的提取
可从细胞或组织中分离总RNA，方法参见上述经典cDNA文库构建中RNA的提取。操作中注意无RNase污染。
(二) 用逆转录酶合成cDNA第一链
PCR管中加入提取的RNA 3μg，3，随机引物(50ng /μl)1μl，RNasin(36Uμl)1μl，70℃温浴10min,冰浴中冷却5min。再加入10×逆转录缓冲液 10μl(500mmol/L Tris-HCl PH 7.6，30mmol/LMgCl2，750mmol/L KCl)。
40mmol/L焦磷酸3μl，dNTP溶液(含有4种dNTP，每种10mmol/L)3μl，AMV逆转录酶40U，加水至总体积50μl，37℃温浴2h。0.5mol/L EDTA 1μl终止反应。消化RNA，去除引物，75%乙醇再次沉淀，溶于20μl双蒸水。
(三) 加poly dG同聚尾
在DNA末端转移酶的作用下,在cDNA3，端加上poly dG尾, 0.5mol/L EDTA 1μl终止反应,用乙醇沉淀后,溶于20μl双蒸水。
(四) PCR扩增
合成cDNA第二链，TaqDNA聚合酶进行PCR扩增, 循环参数视具体情况而定。
用琼脂糖凝胶电泳分离纯化PCR产物, 反向电压凝胶电泳浓缩产物,溶于20μl双蒸水中。
(五) cDNA的克隆
参照上述的传统方法进行,将PCR 产物与克隆载体连接,然后进行噬菌体的包装与转染。
第二节 PCR测序
一、 PCR产物直接测序法
PCR产物直接测序技术现已成为分子生物学和基因组学研究中的一个重要技术，广泛用于基因突变检测、遗传性疾病诊断、单核苷酸多态性研究、基因组重叠序列群等。与传统克隆测序技术相比较，直接对PCR扩增的DNA进行测序，省去了耗时的克隆步骤，避免了传统的细菌培养，模板提取等重复性操作，可以从少量的原始样品中得到正确的DNA序列信息。PCR产物直接测序技术具有快速、简便、稳定经济的优点。
(一)仪器和所需试剂及配制：
1. 所需仪器：高速冷冻离心机，水平电泳仪，微量离心管，水浴锅
2. 所需试剂及配制：PCR扩增的双链DNA模板，长约20个核苷酸的DNA引物，DNA聚合酶，测序胶，0.1mol/L DDT，α-32P-dATP，dNTP/ddNTP混合物(80μmol/L/8μmol/L)，dNTP(dCTP、dGTP 、dTTP 各0.75μmol/L)
测序反应缓冲液：40mmol/L Tris-HCl(pH7.5)，20mmol/L MgCl2，50mmol/L NaCl
终止缓冲液：95% 甲酰胺，20mmol/L EDTA，0.05% 溴酚蓝，0.05% 二甲苯腈
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(二)操作步骤：
1.  4个微量离心管中各加入dNTP/ddNTP混合物2.5μl，混合物37OC温浴5min，备用。
2.  在一个空的微量离心管中加入1pmol的PCR扩增双链DNA，10pmol测序引物，2μl 5×测序缓冲液，加双蒸水至总体积10μl，96OC加热8min，冰浴泠却1min，4OC 10000g离心10s。
3.  加入2μl预冷的标记混合物(dCTP、dGTP 、dTTP 各0.75μmol/L)，α-32P-dATP 5μCi，1μl 0.1mol/L DDT，测序酶2U，加水至15μl，混匀后置冰上2min，标记新合成的DNA链。
4.  在第1步骤的4个管中各加入3.5μl标记反应混合物，37OC温浴5min。每管各加入4μl终止液。
5.  样品在80OC的水浴中热变性5min，每一泳道加2μl 加到测序胶上，电泳分离这些片段。
(三) 注意事项：
1.  PCR产物要有一定的长度(>200bp)，因为测序结果两端20-30bp的电泳峰图的准确性较低。
2.  纯化PCR产物可通过离子交换层析使扩增的DNA片段与反应剩余的dNTP及引物分离；也可通过琼脂糖凝胶电泳,将PCR产物与非特异性扩增产物和引物分离开来；如果扩增的特异性较高时，可直接通过酚：氯仿抽提，乙醇沉淀的方法来纯化。
3.  测序引物设计原则类似于PCR引物设计，可在DNA合成仪上合成20个左右的核苷酸作为引物，经过高压液相层析或聚丙烯酰胺凝胶电泳纯化后，即可用作测序引物。
二、 PCR循环测序法
PCR循环测序法是将PCR扩增和核酸序列分析技术相结合，从而形成的一种测定核苷酸序列的研究方法，也称作线性扩增测序。该方法采用PCR仪加热使DNA模板变性，在TaqDNA聚合酶作用下，以温度循环模式在模板上进行多轮的双脱氧核苷酸测序反应，线性扩增标记的DNA分子。
PCR循环测序法与以往的测序方法相比，其优点在于：大大减少所需的模板量；能提高测序反应产生的信号，降低了操作的复杂性，且聚合酶的用量减少；可在小量制备的模板上进行筛选反应；高温下进行的测序反应使DNA聚合酶催化的聚合反应能够通过模板二级结构的区域；双链闭环DNA可以直接作为反应模板应用，不用作预先碱变性处理。由于PCR循环测序法能够简单、快速地检测特定序列，因此, PCR循环测序法在核酸序列分析研究中受到广泛的重视。
(一)仪器和所需试剂及配制：
1. 所需仪器：PCR仪，水平电泳仪，微量离心管，冰盒
2. 所需试剂及配制：DNA测序试剂盒，dNTP，ddNTP，丙烯酰胺，双丙烯酰胺，尿素，TEMED(N，N，N‘，N’-四甲基乙二胺)，过硫酸铵
6%测序胶：6%丙烯酰胺，7mmol/L 尿素，1×TBE。
10×测序缓冲液：100mmol/L Tris-HCl(pH8.8)，500mmol/L KCl，40mmol/L MgCl2，0.01%明胶，20μmol/L dATP，50μmol/L dCTP，50μmol/L dGTP，50μmol/L dTTP
终止混合液：ddATP (600μmol/L)，ddCTP (600μmol/L)，ddGTP (100μmol/L)，ddTTP(1000μmol/L)
终止缓冲液：95%甲酰胺，20mmol/L EDTA，0.05%溴酚蓝，0.05%二甲苯腈
作者: 荷塘青蛙！ 时间: 2011-8-24 17:16

(二)操作步骤：
1．  4个小离心管，每个小管加入3μl的终止混合液，将管子放在冰上。
2．  在DNA模板中加入引物(4pmol)， 4μl 10×测序缓冲液， 10μlα-32P-dATP, 2U TaqDNA聚合酶，加双蒸水到30μl彻底混匀，每管7μl加入上面4个小管中。
3．  反应液上加30μl的石蜡油。
4．  95OC 30S，50OC 30S，72OC 60S共30个循环，可根据具体的情况进行适当的调整循环条件及循环次数。
5．  反应结束后在油层下加入5μl的终止缓冲液并用加样枪混匀。
6．  上样前将样品在大于80OC的水浴中热变性5min，每一道加2μl加到测序胶上，电泳分离这些片段。
(三) 注意事项：
1．制备测序模板
PCR 扩增的产物可以经过低熔点的琼脂糖凝胶电泳纯化回收后，用于序列分析；可经过柱层析纯化，去除PCR 反应后剩余的dNTP和引物后，用于序列分析。PCR 产物也可不经纯化直接用于测序，但是这种测序产生的结果较差，建议测序之前应进行PCR产物的纯化。各种标准的质粒制备方法所纯化出的质粒均可作为测序模板使用。用标准方法制备的M13噬菌体、粘粒、λDNA都适合用作测序模板用。但要注意的是反应体系中不应有与引物互补的非目的基因序列，否则将会导致测序实验的失败。
2．测序引物
测序引物是指合成的与测序模板链特异性互补的寡核苷酸序列。可用α-32P-dATP和T4多聚核苷酸激酶对引物的5‘端进行标记，反应体系中引物、激酶和α-32P-dATP要保持在最佳的比例，以得到高比活性的标记引物；也可用α-32P-dATP标记新合成的DNA链。引物的浓度不宜高，否则容易形成引物二聚体，或产生非特异性的扩增引物。
3．酶
各种缺乏3‘—5‘端外切活性的耐热DNA聚合酶都可以用于循环测序，其中TaqDNA聚合酶在DNA测序中最为常用。
虽然应用PCR循环测序法能够简单、快速的进行基因序列的测定，但仍未能适应大规模DNA序列测定的需要，而PCR循环测序法、荧光标记和自动测序仪的联合使用成为大规模基因组测序的主要技术。该技术是采用荧光标记引物或双脱氧核苷三磷酸，反应产物经聚丙烯酰胺凝胶电泳后，经特定的DNA序列分析仪和分析系统处理待测的DNA序列。它的应用减轻了DNA序列测定的工作量，提高了测序的效率。
第三节 PCR技术用于基因突变的检测
基因结构的异常可引起多种疾病的发生，它包括点突变、插入、缺失、重排、易位、基因扩增、基因结构多态性异常等形式。许多人类遗传性疾病源于基因的突变，基因突变分析是指对单个或低拷贝基因序列等位基因改变的鉴别，对诊断和理解遗传病有非常重要的价值。
聚合酶链反应(PCR)是一种高特异和高灵敏性的基因分析手段，PCR操作简便，可以在几个小时内使DNA片段的拷贝数扩增百万倍，使对微量DNA的分析鉴定成为可能，伴随着分子生物学各领域的飞速发展，PCR及其衍生技术以其快速准确在基因突变的检测中得到了广泛的应用。
虽然特异基因序列区段的直接测序是基因突变分析最可信和最精确的手段,但该方法繁琐、耗时、费力。PCR的应用则提供了一系列比直接测序更方便、快捷的方法。PCR在此领域也引起了巨大的革新。
基于PCR技术的常用基因突变检测方法有：
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(一) PCR/ASO(allele specific oligonucleotide,ASO,等位基因特异性寡核苷酸)
PCR/ASO探针诊断点突变，系在扩增DNA片段后，直接与相应的寡核苷酸探针杂交，来明确诊断是否有突变以及突变是纯合子还是杂合子。
(二) PCR-SSCP(single strand conformation polymorphism, SSCP)
PCR-SSCP系1989年由Orita首先报道的，它是一种基于单链DNA构象差别来检测点突变的方法。该方法操作简单、灵敏且特异性高，是目前检测点突变最简捷的方法。
(三) PCR-RFLP (restriction fragment length polymorphism，RFLP，限制性片段长度多态性分析)
RFLP分析与PCR反应相结合，先用PCR来扩增待检的片段，再进行RFLP来检测那些发生在酶切位点的突变简化了RFLP的分析过程，并使该项技术得到了广泛的应用。
(四) DNA序列测定法(direct sequencing, DS)
PCR产物经克隆后测序或直接对PCR产物进行测序是所有进行基因突变检测的方法中最灵敏、最直接、最全面的，不仅可以确定突变的部位，还可以确定突变的性质。尤以循环测序法最具有代表性，该方法以TaqDNA聚合酶代替测序酶。测序反应通过多次的变性、退火、延伸来完成，具有快速、简便、灵敏等优点。但是DNA序列测定法所需的仪器和高昂的费用限制了它在临床诊断中的应用。
(五) 异源双链分析(heteroduplex analysis, HA)
该方法类似于SSCP。在一个PCR反应中，如果同时存在野生型和突变型的DNA模板，那么在PCR循环中突变型和野生型DNA形成的杂合双链DNA分子即异源双链DNA片段，它与同源双链在聚丙烯酰胺电泳中呈现不同的电泳速率，经聚丙烯酰胺电泳就可以将仅有一个碱基改变的异源双链片段与同源双链片段分开，从而达到诊断碱基突变的目的。该方法依赖于双链DNA分子序列依赖性的构象变化。对于小于300bp的小DNA片段其敏感性较好，且已在许多遗传性疾病中得到应用。
(六)变性梯度凝胶电泳(denaturing gradient gel electrophoresis,DGGE)
DGGE是一项根据DNA解链特性分离鉴定DNA片段的技术。在温度和变性剂浓度增加时，DNA分子内一些称为变性区域的独立片段将发生变性。PCR扩增片段通过一线性增加的变性凝胶电泳体系时，一旦进入相当于某些区域解链温度(Tm)的变性剂浓度区将会解链形成分叉的DNA分子，并因此使迁移率显著下降。变性区域的解链温度(Tm)由其核苷组成决定，序列中发生一个碱基的改变，其解链温度Tm改变1.5℃，在变性梯度凝胶上表现出不同的迁移率。同SSCP比较，DGGE需要制备新鲜的梯度胶，检出率也较低，且只能确定突变的存在，不能进行突变位置和性质的定量分析。但DGGE无需知道待测片段的DNA序列，无需制备测试引物。
(七) 化学错配裂解法(chemical mismatch cleavage, CMC)
CMC是将同位素标记过的野生型DNA分子和突变型DNA(或RNA)片段混合后经过变性与复性, 形成DNA-DNA或DNA-RNA的异源杂交双链，在突变部位会产生凸起。对凸起处错配碱基进行化学修饰并使之从双链分子上断开，通过变性聚丙烯酰胺凝胶电泳及放射自显影即可确定是否有突变发生。CMC法最大优点是能对放大片段进行“扫描”式分析,存在于序列中任何部位的突变都能被检出,多用于多基因突变的遗传病。
此外还有等位特异性PCR(allele specific PCR,AS-PCR)、PCR核糖体分型(ribotyping)技术、可变数目***重复(variable number tandem repeats,VNTR)序列和短***重复(short tandem repeats,STR)序列分析等方法可用于基因突变的分析。这些方法各有所长，具有不同的优缺点，在不同的领域内有着不同的应用。无论是哪种检测技术都体现了PCR技术本身所具有的优越性,在实际应用时，可根据实验目的和具体需要，选择最恰当的方法或将不同的方法联合应用，PCR的应用将使基因突变检测技术有更广阔的应用前景。

(关宇光王廷华)
作者: 荷塘青蛙！ 时间: 2011-8-24 17:17

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第七章 PCR技术分析DNA序列多态性
每个个体在遗传上是不同的，而不同的本质不是在基因产物上，而是在DNA 水平上的差异。这些差异是由于不编码蛋白的区域和没有重要调节功能的区域发生了中立突变，这些中立突变构成的DNA变异称为DNA多态性。DNA碱基序列，对于个体来说保持终生不变，并按孟德尔规律世代相传。对于一个群体而言，DNA多态性千差万别，换句话说，世界上没有两个个体的DNA是完全相同的。
过去对于人类遗传标记多态性的研究，主要是在基因产物如抗原、蛋白质和酶水平进行。近年来逐渐认识到基因产物多态性起源于结构基因的多态性。在疾病调查研究中发现，基因在生物进化过程中，由于突变、缺失、插入或置换，使DNA分子在不同个体之间存在差异。单一基因座的遗传标记有多个等位基因存在，就叫多态性(polymorphism)。当这样的基因座表现出有很多的变异体(多达几百个)时，就称之为高度差异性(hypervariable)。
第一节 DNA的二种多态性和遗传标记分类
一、片段长度多态性(fragment length polymorphism，FLP)
片段长度多态性表现在二个固定端点间DNA片段的长度上的差异性。DNA的长度多态性表现为限制性长度多态性(restriction fragment length polymorphism，RFLP)和扩增片段长度多态性(Amplified fragment length polymorphism Amp-FLP)。RFLP是用限制性内切酶切割成不同长度的DNA片段，即不同大小的等位基因，其产生的原因主要是DNA顺序上某个碱基发生突变，如单个置换，或少数碱基缺失、重复、插入，使突变部位的DNA序列产生或丢失某种限制性酶切位点，当用该限制性内切酶消化此DNA时，DNA限制性片段长度发生变化，产生与正常不同的限制性片段。Amp-FLP是定位于可变数目***重复序列(Variable Number of Tandem Repeats， VNTR)、短***重复序列(Short Tandem Repeats，STR)位点的等位基因，它们的重复序列核苷酸排列顺序相同，重复序列在每个个体中出现的次数不同，在个体间产生了DNA片段的长度差异，表现出高度的多态性。当用限制性内切酶切割这些位点区域时，只要酶切位点不在重复区内，就可得到长度不同的片段。VNTR、STR的长度多态性可以通过PCR扩增后用电泳方法检出。
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二、序列多态性(Sequence polymorphism)
表现为碱基排列顺序上的差异，其本质是定位于VNTR、STR位点或者其它区域DNA位点的等位基因，它们重复序列的核苷酸排列顺序不相同；或者单一序列核苷酸排列不相同，但不同个体间同一位点的等位基因长度相同。例如多标记位点：人类白细胞抗原DQA1(HLA-DQA1)，低密度脂蛋白受体位点(LDLR)，血型糖蛋白(GYPA)，血红蛋白Gr球蛋白位点(HBGG)，第7号染色体S8位点(D7S8)和维生素D结合蛋白位点(Gc)。
第二节 PCR技术分析DNA序列多态性
PCR技术分析DNA序列多态性的技术主要有：1、PCR-RFLP技术；2、PCR-SSO技术(PCR-sequence specific oligonucleotide，正向或反向特异性寡核苷酸探针杂交)；3、PCR测序； 4 、PCR-SSCP(PCR-single sequence conformation polymorphism，单链构象多态性技术)； 5、PCR-OLA技术(PCR- oligonucleotide ligation assay，寡核苷酸连接检测技术)；6、PCR- RCA技术(isothermal rolling circle amplification，等温滚环扩增技术)；7、线粒体DNA(mitochondrial DNA,mtDNA)多态性及分析等。
一、 PCR-RFLP(restriction fragment length polymorphism )技术
在人类基因组中存在着许多限制性内切酶切点，这些切点在人群中具有明显的遗传多态性。因此可用PCR方法扩增基因内或其旁侧序列中有酶切位点的已知DNA序列，然后用相应的内切酶进行切割，通过用琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳技术进行酶切产物分析，即PCR-RFLP。PCR-RFLP的基本步骤：1、PCR扩增包括有酶切位点的靶序列；2、以特异的限制性内切酶消化扩增产物；3、电泳分离酶切消化产物。用PCR-RFLP即可分析单个的酶切位点多态性，亦可分析多个酶切位点多态性。与传统的RFLP分析技术相比，此技术使少量的目的DNA的RFLP分析成为可能，且操作简便快速，分型简单，被广泛应用于ABO、HLA、GPT、PGM1、mtDNA等序列多态性的分析。
PCR-RFLP技术具体详见相关章节。
二、 PCR-SSO(sequence specific oligonucleotide-PCR，SSO-PCR)技术
序列特异性寡核苷酸—聚合酶链式反应(PCR-SSO)，或等位基因特异性寡核苷酸—聚合酶链式反应(allelic specific oligonucleotide –PCR，PCR - ASO)技术的基本原理是采用特异性引物进行PCR扩增，利用合成与一种或多种等位基因特异碱基序列的互补寡核苷酸探针，与固定在尼龙膜上的PCR扩增产物进行杂交，从而简单、快速地检测序列多态性。PCR-SSO技术的基本步骤： 1、提取目的基因DNA；2、以位点间或组间特异性引物进行体外扩增；3、将扩增产物转移到硝酸纤维素膜或尼龙膜上；4、以放射性同位素32P或非放射性(酶、地高辛等)标记的人工合成序列特异寡核苷酸(SSO)探针进行杂交。此法可分辨几乎所有等位基因的特异性，也能分开差异仅仅是 1~2bp的亚型。具有技术简单，可以同时分析多个样品等优点。PCR-SSO技术是目前应用最多的一种简单、快速而又精确的HLA-II类抗原分型方法，能鉴定所有已知序列的HLA-DR、DQ、DP等位基因。
PCR-SSO技术具体详见相关章节。
作者: 荷塘青蛙！ 时间: 2011-8-24 17:18

三、 PCR测序
(一) 直接测序
检测DNA序列多态性的根本方法是直接测序，方法有两种，即化学法DNA序列测定(Maxam Gilbert法)和酶促DNA序列测定(双脱氧法，Sanger法)，但两种方法测序均需进行PCR扩增，然后对PCR产物进行直接的序列分析。PCR通过简化DNA模板的筛选、制备和操作，使所有DNA测序工作变得准确、快速。长DNA片段也能被测序，可以快速精确地鉴定不同序列间的一致性或变异性。
(二) 循环测序：
PCR测序的最新发展是将双脱氧末端终止法测序技术与PCR技术相结合进行循环测序，其方法是在PCR反应体系中除DNA聚合酶、模板、引物(是PCR扩增引物中的一条)、缓冲液、dNTPs外同时加入终止剂ddNTPs，并利用同位素或荧光素标记的引物引导进行扩增，使模板的扩增与测序同时进行，其特点在于使用的模板量小，而且不需分离单链PCR产物。
PCR技术测序具体详见相关章节。
四、 PCR-SSCP(single strand conformation polymorphism，SSCP)技术
单链构象多态性—聚合酶链反应(PCR-SSCP)是在完成目的DNA的PCR扩增后进行单链DNA多态性分析的一种技术。其原理是在非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳时，单链DNA会因单个或多个碱基突变形成的不同构象，电泳迁移率不相同。通过PCR扩增包括单个碱基部位及两侧DNA片段，变性后进行SSCP分析，从理论上可以分辨出单个碱基的差异，有效地检出点突变和DNA的多态性，有利于探测新的等位基因。目前还没有有效的理论预测碱基突变、构型改变与电泳迁移率三者间的定量关系，在合适的条件下，一般可检测到70%~95%的点突变。SSCP检测的准确率不如直接的序列测定，适用于快速检测大量样品，初步筛选突变个体。
PCR-SSCP技术具体详见相关章节。
五、单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism ，SNP)及PCR分析
(一) 概述
单核苷酸多态性(SNP)是指由单个核苷酸替代、插入或缺失突变，并且在群体中的频率大于或等于1%而形成的分子多态，实际就是一种基因组碱基序列多态性，它是人类基因组最常见的遗传变异。SNP不仅分布在基因组的非编码区,也存在基因的编码序列中。据报道，人类基因组有25~40万个SNP，其中20%~30%引起蛋白质编码序列的非同义编码，SNP会导致蛋白质功能的变化。SNPs具有以下特点：1、高密度性，在人类基因组中约每400~1000碱基出现一次，其总数超过300万，遗传距离为2~3cm；2、代表性，某些位于基因内部的SNP有可能直接影响蛋白质结构或表达水平，因此它们可能代表疾病遗传机理中的某些作用因素；3、遗传稳定性，SNPs认为是一种可以稳定遗传的早期突变，与微卫星等重复序列多态性相比，SNP具有更高的遗传稳定性；4、易实现分析自动化，SNPs是只有两个等位基因的遗传标记，在检测时能通过一个简单的“+/-”分析进行基因分型，分型简单，易于自动化。
作者: 荷塘青蛙！ 时间: 2011-8-24 17:19

(二) SNP的分析方法
SNP表现为单个碱基的变异，理论上任何检测点突变的技术均可用于SNP检测分析。因此，分析检验方法很多，但主要以PCR为基础，利用碱基差异造成的DNA片段的各种差异来进行基因分型。如利用单碱基差异引起限制性内切酶点的产生或缺失进行限制性内切酶分析，或者利用差异碱基设计等位基因特异引物进行特异扩增，或利用单个碱基的差异导致的构象不同进行分析。早期常用的方法有：利用限制性内切酶位点进行PCR扩增产物的RFLP(PCR-RFLP)分析，正向或反向特异性寡核苷酸探针杂交(SSO-PCR)分析，单链构象多态性(SSCP)分析，等位基因特异引物扩增分析(ASP)，异源双链分析，变性梯度凝胶电泳(DGGE)分析，直接测序和连接酶反应(oligonucleotede lifation assay，OLA)等。目前已经建立了多种SNP分析新方法，如：根据因等位基因序列不同产生的熔解温度差异进行Tm漂移(Tm - shift)分析，变性高效液相色谱(DHPLC)分析，分子信标(molecule beacons)分析，引物延伸结合时间飞行质谱(time – of flight mass spectrometry，TOF-MS)分析，微阵列和DNA芯片(DNA chip)分析等。现就一部分PCR方法进行简单介绍，具体详见相关章节。。
1. PCR-OLA技术(PCR- oligonucleotide ligation assay)
PCR结合寡核苷酸连接分析(oligonucleotede ligation assay，OLA)的原理是基于DNA连接酶只能连接完整的变性目的DNA的PCR产物，即使在探针接头处只有一个碱基错配也会阻碍杂交探针的连接。因此，针对每一SNP位点的等位基因设计一对寡核苷酸探针(即5＇端探针和3＇端探针，DNA模板中可能存在的SNP位点位于5＇端探针的3＇端)，与同一条DNA模板链退火结合，其中5＇探针的3＇端紧靠3＇探针的5＇端探针和3＇端探针，PCR反应时，只有当5＇端探针的3＇端碱基与DNA模板完全互补时，DNA连接酶才能连接这一对探针。通过对SNP位点的每一等位基因进行独立的的连接反应，根据连接反应的阴性和阳性就可识别DNA模板中的序列多态性。OLA最显著的优点是：1、运用一个单一的反应条件就能识别DNA片段中特异的碱基替代、缺失和插入，不需离心和电泳；2、能分析DNA的内部序列，所以其分析结果不受PCR产生的非特异产物的影响，其结果可以直接转化为数字存储于计算机中。
2. 单管双向等位基因专一性扩增(single tube bi-direction allele specific amplication，SB-ASA)技术
SB-ASA技术的原理是针对选择的SNP位点，设计4个引物F1、F1`、R1、R1`。F1`和R1`延伸方向相反，其3`末端分别与不同的等位基因配对，3`端第3位碱基引入不配对。F1和R1`、F1`和R1分别扩增长度相差100bp以上的特征片段，而F1和R1在所有的样本中会扩增出1条可作为内对照的长片段。不同基因型的样本有不同的谱带，杂合子由于存在两重等位基因，扩增后可产生2条长度不等的特征片段和1条内对照片段，纯合子则只扩增出1条特征片段和1条内对照片段，样本基因型可根据扩增片段的长度和数量进行判读。
六、线粒体DNA(mitochondrial DNA,mtDNA)多态性及PCR分析
(一) 概述
线粒体是真核细胞内重要的细胞器，能量生成的场所，还参与脂肪酸的合成及某些蛋白质的合成。多年来的研究发现线粒体有自己的一套遗传控制系统，同时也受到细胞染色体DNA的控制。
人类线粒体DNA(mitochondrial DNA,mtDNA)是独立于细胞核染色体外的基因组，它能自主复制，由16569个碱基对组成，每一个mtDNA分子为环状双链DNA分子，外环为重链，内环为轻链。基因组含有37个基因，其中13个为蛋白质基因(包含1个细胞素b基因，2个ATP酶复合体组成成分基因，3个细胞色素c氧化酶亚单位的基因及7个呼吸链NADH脱氢酶亚单位的基因)，2个为rRNA基因，还有22个tNRA基因(图7－1)。线粒体基因组是人类基因组的重要组成部分，1980年剑桥大学的Anderson等人完成了对线粒体基因组的全序列测定，该序列可在基因库中找到，称之为Anderson序列或剑桥序列。现在都以Anderson序列作为标准，进行人线粒体DNA序列多态性比对。
作者: 荷塘青蛙！ 时间: 2011-8-24 17:19

图(7－1) 人类线粒体基因组H：重链；L：轻链
ND1－ND6：基因编码NADH脱氢酶亚单位CO1－CO3：基因
编码细胞色素C氧化酶亚单位1－3CYB：基因编码细胞色素b
(二) 特点
人类线粒体基因组具有下列特点：
1. 人类线粒体的基因排列得非常紧凑，除与mtDNA复制及转录有关的一小段区域D环(D-loop)外，整个mtDNA基因组上基因之间无间隔区(spacer)，基因中亦无内含子，甚至有基因重叠现象。因此，mtDNA的任何突变都会累及到基因组中一个重要功能区域。
2. mtDNA为高效利用DNA。有5个阅读框架，缺少终止密码子，仅以U或UA结尾。
3. mtDNA的突变率高于核DNA，并且缺乏修复能力。
4. mtDNA为母系遗传，遗传信息只能从母亲传递给子女，再由女儿传给后代。因此，除突变外，理论上拥有共同女性祖先的个体具有相同的mtDNA序列。
5. 部分mtDNA的密码子不同于核内DNA的密码子。
(三) mtDNA多态性
mtDNA分为编码区和非编码高变区，存在着广泛的变异。编码区主要编码细胞呼吸链的一些酶和蛋白，序列差异主要集中分布在非编码区的D-环区内。相对于编码区，非编码高变区在个体间存在较大差异，有许多单碱基取代和突变，mtDNA非编码高变区每100bp有1-3个核苷酸发生变化，碱基序列多态性主要集中在二个高变区：高变区I(位于16024-16365nt)和高变区II(位于73-340nt)，简称HVR I和HVR II。
(四) mtDNA序列多态性分析
mtDNA序列多态性分析方法：SSO、SSCP、PCR-RFLP、DGGE、DNA chip、直接测序等。由于单个细胞中含有上千个拷贝线粒体DNA，使之比核DNA更容易进行测序，且单倍体比二倍体核DNA更容易测序，加上直接测序可以获得更多的信息，因此目前最为常用的是mtDNA直接测序。
应用实例：
1. PCR-自动测序和PCR-SSCP检测技术分析mtDNA
应用PCR-自动测序和PCR-SSCP检测技术分析mtDNA nt16081-16546区间(位于HV I)序列多态性，并对其进行统计学分析。
材料与方法：
(1) 样本：血液、肌肉、肝、肾、心肌、脾、胰、肺、不同部位的毛发等组织均可。
(2) 试剂
引物序列为：
5′端引物：5′-ACC GCT ATG TAT TTC GTA CA-3′；3端′引物：5′-GAA CGT GTG GGC TAT TTA GGC-3′(GIBCO BRI 公司德国)；
Wizard系统纯化试剂盒(Promemga 公司，美国)；deRhodamine试剂盒(ABI公司，美国)；5%聚丙烯酰胺凝胶(29：1)(用于SSCP检测)；DNA银染系统(Promemga 公司，美国)。
(3) 仪器：ABI377型序列分析仪(ABI公司，美国)；960、2400PCR扩增仪(ABI公司，美国)；Mini-Protein II电泳系统(BioRad公司，英国)
(4) 方法
1) DNA的提取酚/氯仿法或chelex-100法提取检材mtDNA。
2) PCR扩增反应体系为25μl，反应液包括5′端引物、3′端引物各0.25μmol/L，Mgcl2 1.5μmol/L，Tris 10μmol/L，KCL 50μmol/L，0.1% Triton X-100(pH 9.0 25℃)，200μmol/L dNTP 。94℃5min；94℃1min，50℃1min，72℃1min，30个循环后72℃保持5min。进行测序反应，应用ABI377序列分析仪分析检测。
3) 测序 PCR扩增产物纯化后，ABI PRISMTM310基因分析仪测序分析，从5′、3′两端得到mtDNA序列，并经Sequence Navigator软件(ABI公司)与Anderson所报道的序列进行比较后得到检测结果。
4) 统计与计算按照遗传差异度DP=1-ΣX2，变异度=[n(1-ΣX2)]/(n-1)，偶合概率P=ΣX2(这里X表示单倍型频率，n表示群体样本数)进行统计学计算。
作者: 荷塘青蛙！ 时间: 2011-8-24 17:19

5) SSCP检测将扩增产物稀释10倍后取6μl，与等体积SSCP上样缓冲液(95%甲酰胺，10mmol/L EDTA，0.02%溴酚蓝)混合后，95℃变性10min立即置于冰上。变性样品用10%的非变性聚丙烯酰胺凝胶(含10%甘油)垂直电泳，电泳缓冲液为1×TBE。电泳条件为4℃、200V、10min后，120V-11h；银染显色。
2. 直接测序法检测高变区I和高变区II序列多态性
所用样本、试剂、仪器等同上。
引物：
高变区Ⅰ：L159975＇－CACCATTAGCACCCAAAGCT－3＇
　　　　　 H164015＇－TGATTTCACGGAGGATGGTG－3＇
高变区Ⅱ：L000155＇－CACCCTATTAACCACTCACG－3＇
　　　　　 H003705＇－CTGGTTAGGCTGGTGTTAGG－3＇
PCR 反应在5Oμl体系中进行，包括PCR Reaction Mix(ABI公司)2Oμl ，Amp Taq Gold DNA Polymorease 0.7μl，5Oμmol/L引物各5μl，DNA模板10-10Oμl。
循环参数分别为：
高变区Ⅰ95℃11 min；94℃1 min，60℃1 min，72℃2 min，30个循环；72℃10 min。
高变区Ⅱ95℃11 min；94℃1 min，61℃1 min，72℃2 min，30个循环；72℃10 min。
PCR扩增产物经纯化，测序反应进行序列分析，并经Sequence Navigator软件(ABI公司)与Anderson所报道的序列进行比较后得到检测结果。
(五) mtDNA序列多态性分析应用
1. 法医学应用由于mtDNA非编码区在个体间存在较大差异，具有高度多态性，在每个细胞中都存在上千的拷贝，属于母系遗传，因此在法医学个人识别、亲子鉴定方面具有较高应用价值。特别是毛发、指甲等无核角化组织，以及陈旧骨骼、***组织等核DNA分析比较困难的样本，mtDNA分析是一种有效的手段。涉及母子关系的亲子鉴定时，如果核DNA检测不确定时，mtDNA序列检测可提供重要的参考信息。当无法提供被检验者样本，同一母系的个体的样本可代替作为参考样本。此外，Batille等研究表明，mtDNA序列多态性分析在种属鉴定中有重要价值：对mtDNA链上的细胞色素b(cyt b)基因和D－环(D－loop)高变区进行复合PCR扩增，经琼脂糖凝胶电泳，若检材同时出现cyt b扩增产物(309 bp)和D－环高变区扩增产物(259 bp)，说明检材为人源性；若检材仅出现cyt b扩增产物(309bp)则表明非人源性。该法的优势在于种属鉴定和个体识别可以同步进行。
2．mtDNA与人类进化 mtDNA进化速率快，表现为母系遗传。因此，从逻辑上讲，分析 mtDNA序列单倍型，构建系统进化树，可以追溯现代人类的女性祖先。结合其他遗传标记如微卫星、Y-DNA、Alu序列多态性等，mtDNA可为研究人类起源、进化、迁移等提供可靠的遗传学证据。80年代，Wilson等分子遗传学家比较研究人类mtDNA序列变异，提出了“现代人类起源于20万年前的一位非洲母亲”的观点。
3．遗传性疾病研究目前，已发现有些遗传病如Leber遗传性视神经病，肌阵挛性癫痫等与线粒体基因突变有关，因而它的基因结构引起普遍关注。

（聂胜洁景强）
作者: 荷塘青蛙！ 时间: 2011-8-24 17:20

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作者: 荷塘青蛙！ 时间: 2011-8-24 17:21

第八章用PCR技术分析VNTR和和STR
第一节概述
DNA片段长度多态性(DNA fragment length polymorphism , DNA-FLP)是指单一基因位点上，不同个体间不同基因的核苷酸排列数量的差异，表现为等位基因片段长度大小不同，其常见的形式有VNTR和STR。
基因组DNA中存在一类***重复序列，其***重复单位(核心序列)数目在人群中存在较大差异，具有高度多态性。1980年Wyman和White利用DNA重组技术研究人的DNA，他们用EcoRⅠ切割之后，把含有16kb单拷贝的人类DNA片段插入噬菌体λ-CH4A-rHs18克隆作为探针进行杂交，发现这个酶切位点高度变异，至少有8个不同的DNA片段，由此认为这种多态现象是DNA再次排列的结果，而不是碱基对的替代和修饰。1985年英国Leicester大学的Jeffreys A与其同事在人的肌球蛋白基因中发现了一些短的简单重复单位，他称之为“小卫星中心(minisatellite core )”，它含有一组重复单位，重复子的数目和顺序存在个体间的差异。随后的许多研究逐渐表明，在人类基因组中分布有大量此类长度的多态性标记，它们可能以 “头-尾”正向或“头-头”、“尾-尾”反向***成簇，重复排列，并分布于基因组的各个部位，构成数量可变的***重复(Variable Number of Tandem Repeats， VNTR)。由于该区AT含量高，如果将基因组DNA切成较小片段后放在氯化铯(CsCl)溶液中进行密度梯度离心时,可在大部分DNA形成的一个主区带以外形成小的区带，因小的区带在主区带旁似卫星而称为卫星DNA。其中，重复序列为6~70bp的称为小卫星DNA(minisatellite DNA)。1989年另一类称作微卫星标记系统(microsatellite DNA)的重复序列被发现，它们的重复序列长度为2~6个核苷酸，又被称作“短***重复序列(Short Tandem Repeats， STR)”。
小卫星和微卫星DNA的多态性产生机制不同。小卫星的多态性是有丝分裂、减数分裂期姐妹染色单体不等交换或染色体内部不等交换的结果。微卫星的多态性主要是DNA复制过程中滑动，或者DNA复制和修复时滑动链与互补链碱基错配，导致一个或几个重复单位的缺失或插入的结果。小卫星和微卫星DNA各有其特点，表(8-1)为两者比较。

表(8-1) 小卫星DNA和微卫星DNA的区别
  微卫星DNA 小卫星DNA
存在部位  染色体任何部位  染色体近端粒和着丝粒区
重复单位长度  1-6 bp  6-70 bp
重复次数  10-60次  几次到几百次
总序列长度  约200bp  0.5-30kb
重复单位的差异  重复单位的变异性低，可看成结构相同  单位组成稍有差异，如单个碱基置换
存在数量  很多，整个人基因组5-10万  有限，有些染色体尚未见到

小卫星DNA和微卫星DNA(STR)在人类基因组中出现的数目和频率不同，表现出多态性，为人类遗传分析提供了大量的多态遗传标记。STR由于其高度多态性，并且CA等简短重复不受进化上的选择，以至于在同一位点中数目变化很大，在群体中可形成多达几十种的等位片段(多态性)，提供的信息量相对很大；另外, 可采用PCR技术使其操作实现自动化。微卫星DNA是目前最常用的遗传标记之一。
作者: 荷塘青蛙！ 时间: 2011-8-24 17:21

第二节扩增片段长度多态性分析分型技术基本原理
根据VNTR或者STR基因座的侧翼序列，设计合成与侧翼互补的寡核苷酸作为特异性引物，应用PCR技术扩增包含VNTR或者STR基因座的侧翼和重复单位序列。扩增产物为该位点所含的等位基因，这些等位基因在长度上存在巨大的个体差异，凝胶电泳分离片段长度不同的扩增产物，根据扩增片段长度差异确定其基因型。识别AMP-FLP等位基因有二种方法：1、电泳分离后直接银染，显出的特异的电泳谱带即等位基因，然后用等位基因阶梯作为参照标准进行分型；2、采用DNA测序仪，电泳分离，结合基因自动扫描技术，计算机直接分析处理，自动分型。这种用PCR技术检测VNTR或者STR的基因座多态性的分析称为扩增片段长度多态性分析(amplified fragment length polymorphism , AMP-FLP)。
它（AMP-FLP）充分发挥了二个优势：一是基因组VNTR或者STR基因座具有的高度多态性优势；二是PCR快速、高效扩增的优势。它使DNA分型实现了高效、快速、灵敏的目标，被称为第二代DNA分型技术。
AMP-FLP图谱简单，纯合子个体只有一条带，含有二个长度相同的等位基因；杂合子个体有二条带，含有二个长度不同的等位基因。
第三节用PCR技术分析小卫星VNTR基因座分型的基本技术
一、 VNTR基因座特征
VNTR是人类基因组中由数目不定的***重复单位组成的DNA片段，分布于整个基因组，约占10%，一般位于基因侧翼或内含子等非编码区以及染色体的近端粒区。每个VNTR由两部分组成，即中心的核心区(数目不定的***重复单位)和外围的侧翼区，其主要特征是核心区内的***重复单位(长度约6~70bp)重复6~100次不等，在同一基因位点上，人群中的不同个体表现为侧翼区相同而***重复单位的数目不同。分析VNTR的技术已被用于遗传病诊断、基因定位、绘制遗传图谱、个体识别和亲权鉴定等方面。1987年Donis-Kall绘制的遗传图谱是根据DNA杂交技术检测RFLP或VNTR，1992年NIH/CEPH发表的遗传图谱是包括RFLP或VNTR为主及较少的STR的DNA遗传标记。
目前，研究VNTR的方法主要有以下几种：①DNA指纹图谱法、②RFLP(restrication fragment length polymorphism，RFLP)分析法、③PCR扩增后的RFLP (PCR-RFLP)、④PCR扩增后的寡核苷酸探针(PCR-ASO)、⑤AMP-FLP法等。DNA指纹图谱法、RFLP分析法、PCR-RFLP、PCR-ASO具体方法参见有关章节。本节重点介绍AMP-FLP法分析VNTR。
常用的VNTR： D1S118、D1S80、D4S95、D17S30、ApoB、ApoE、P33.6等。
二、试剂和器材
(一) PCR扩增试剂
1. 引物：根据各特定基因座序列设计，合成后一对引物，配置成一定浓度(一般工作浓度为20pmol/μl)。可人工设计或计算机辅助设计(可选择的软件如PRIMER v 1.4，PINCERS，Oligo 5.0等)，引物长度为17~40个碱基，通常20~28个碱基，一般制成冻干粉。
使用前可加适量超纯水(pH7.0)充分溶解，溶解后配成一定浓度母液(如PCR反应的10倍工作浓度)保存，分装，-20℃贮存备用。避免反复冻融，否则引物易降解，PCR扩增效率下降。两条引物PCR扩增时可分别加入反应体系中，也可等量混合后再加入反应体系中。
2. PCR缓冲液：标准1×PCR缓冲液组份为：10mmol/L Tris – HCl(pH8.3)，50mmol/L KCl， 1.5 mmol/L MgCl2，0.001%白明胶。一般购买Taq DNA聚合酶时带有10×PCR缓冲液，缓冲液成分可能有所不同，有的反应液中以小牛血清(BSA100μg/ml)或Tween-20(0.05%~0.1%)代替明胶。
3. dNTPs：dNTPs(dATP、 dTTP、 dCTP、 dGTPs)贮存液浓度为10 mmol/L(必须中性，pH7.0)，工作浓度一般为200μmol/L。
作者: 荷塘青蛙！ 时间: 2011-8-24 17:22

dNTP的质量与浓度　dNTP的质量与浓度和PCR扩增效率有密切关系。dNTP粉呈颗粒状，若保存不当易变性失去生物学活性。dNTP溶液呈酸性，使用时应配成高浓度，以1M NaOH或1M Tris-HCl的缓冲液将其PH调节到7.0～7.5，小量分装， -20℃冰冻保存。多次冻融会使dNTP降解。在PCR反应中，dNTP应为50～200μmol/L，尤其是注意4种dNTP的浓度要相等(等摩尔配制)，如其中任何一种浓度不同于其它几种时(偏高或偏低)，就会引起错配。浓度过低又会降低PCR产物的产量。dNTP能与Mg2+结合，使游离的Mg2+浓度降低。
4. Taq DNA聚合酶：贮存液浓度为5u/μl，通常20μlPCR反应体系中用量为0.5 u。一般同一厂家批次的Taq DNA酶均有相应配套的10×PCR缓冲液，二者应配套使用。
5. 灭菌超纯水用于补足反应体积。
(二) PCR扩增主要仪器、耗材
1. DNA扩增仪：可选择不同厂家的热循环仪如PE9600、 PE9700或PE2400等。
2. 微量可调移液器：5μl、10μl、20μl、200μl、1000μl，误差小于0.1μl。
3. 0.2ml或 0.5ml薄壁离心管(Eppendorf管)
4. 微量移液器吸头(tip)：10μl、 20μl、200μl、1000μl
(三) PCR扩增产物电泳分离主要器材、试剂
1. 电泳仪器及凝胶制备装置：电泳仪、电泳槽(水平或垂直)
2. 微量可调移液器：10μl、20μl、100μl、200μl
3. 水平摇床
4. 染色盘（可用普通方瓷盘代替）
5. 可见/紫外检测仪
6. 琼脂糖
7. 30%聚丙烯酰胺单体溶液(29：1)
将29g丙烯酰胺和1g亚甲基双丙烯酰胺溶于60ml蒸馏水中，充分溶解后再补加蒸馏水至终体积为100ml，滤纸过滤后置棕色瓶中，4℃保存可保存一个月。
8. 10%过硫酸胺(APS)
如配制100ml：10g APS溶于100ml蒸馏水，配制好后可冷冻保存一段时间，但最好新鲜配制使用。4℃可保存一周，-20℃可保存一个月。
9. TEMED：N，N，N’，N’-四甲基乙二胺，直接使用原液。
10. 6×载样缓冲液(pH8.0)：50%甘油，0.4%溴酚蓝，0.1%二甲苯腈FF，1 mmol/L EDTA。
如配制10ml： 5ml甘油，溴酚蓝40mg，二甲苯青FF10mg，1 mmol/L EDTA10μl。(表8-2)
核酸电泳的指示剂：核酸电泳常用的指示剂有溴酚蓝和二甲苯腈。溴酚蓝在碱性液体中呈紫蓝色，在0.6%、1%、1.4%和2%琼脂糖凝胶电泳中，溴酚蓝的迁移率分别与1kb、 0.6 kb、0.2 kb和0.15 kb的双链线性DNA片段大致相同。二甲苯腈的水溶液呈蓝色，它在1%和1.4%琼脂糖中电泳时，其迁移速率分别与2 kb和1.6 kb的双链线性DNA大致相似.
指示剂一般与蔗糖、甘油或聚蔗糖400组成载样缓冲液。载样缓冲液的作用有①增加样品密度，使其比重增加，以确保DNA均匀沉入加样孔内；②在电泳中形成肉眼可见的指示带，可预测核酸电泳的速度和位置；③使样品呈色，使加样操作更方便。
DNA样品载样缓冲液加入约为其1/10体积，为避免蔗糖或甘油可能使电泳结果产生U形条带，可改用2.5%Ficoll(聚蔗糖)代替蔗糖或甘油。
作者: 荷塘青蛙！ 时间: 2011-8-24 17:22

表(8-2) 常用电泳载样缓冲液配方
缓冲液类型  6×载样缓冲液  储存温度
  0.25%溴酚蓝
Ⅰ  0.25%二甲苯青FF  4℃
  40%(w/v)蔗糖水溶液
  0.25%溴酚蓝
Ⅱ  0.25%二甲苯青FF  室温
  15%聚蔗糖(ficoll 400型，Pharmacia)水溶液
  0.25%溴酚蓝
Ⅲ  0.25%二甲苯青FF  4℃
  30%甘油水溶液
Ⅳ  %溴酚蓝  4℃
  40%(w/v)蔗糖水溶液
  碱性载样缓冲液
  30 NaOH
Ⅴ  6mmol/L EDTA
  18%聚蔗糖(ficoll 400型，Pharmacia)水溶液
  0.25%溴甲酚绿，0.25%二甲苯青FF

11. 电极缓冲液：0.5×TBE溶液或1×TBE溶液
1×TBE(pH8.0)：0.089 mol/L Tris，0.089 mol/L 硼酸，0.002mol/L EDTA。
如配制1×TBE 1000ml： Tris 10.76g，硼酸5.5g，EDTA-Na20.744g，加蒸馏水至1000ml
注意：
(1) 低离子强度缓冲液时， DNA迁移快；高离子强度时，DNA迁移慢，电泳带比低离子强度时细窄，但由于电流太大会大量产热，严重时，会造成胶熔化和DNA变性。
(2) 常用的电泳缓冲液有(表8-3)Tris-乙酸(TAE)，Tris-硼酸(TBE)或Tris-磷酸(TPE)等，浓度约为50mmol/L(pH7.5~7.8)。TAE缓冲能力较低，后两者有足够高的缓冲能力，DNA分离效果好，但TPE在DNA片段回收时含磷酸盐浓度高，容易使 DNA沉淀，因此更常用TBE。
(3) 电泳缓冲液一般都配制成浓的贮备液，临用时稀释到所需倍数。TBE浓溶液长期贮存会出现沉淀，此时应废弃。聚丙烯酰胺凝胶电泳时用1×TBE，以提供足够缓冲容量。
(4) 碱性缓冲液应现用现配。
作者: 荷塘青蛙！ 时间: 2011-8-24 17:23

表(8-3) 常用的电泳缓冲液配方
缓冲液  使用液  储存液
  1×：0.04mol/L Tris-乙酸0.001mol/L EDTA  50×：242g Tris
Tris-乙酸(TAE) 57.1ml冰醋酸
100ml 0.5mol/L EDTA(pH8.0)
  1×：0.09mol/L Tris-磷酸0.002mol/L EDTA  10×：108g Tris
Tris-磷酸(TPE) 57.1ml85%磷酸(1.679g/ ml)
40ml 0.5mol/L EDTA(pH8.0)
  1×：0.089mol/L Tris-硼酸0.002mol/L EDTA  5×：54g Tris
Tris-硼酸(TBE) 27.5g硼酸
20ml 0.5mol/L EDTA(pH8.0)
碱性缓冲液  1×：50mmol/L NaOH 1mmol/L EDTA  1×：5ml 10mmol/L NaOH
2ml 0.5mmol/L EDTA

12. 特异基因座等位基因分型标准物(Ladder)：通过人群调查筛选出所有等位基因片段，经序列分析确认，大量扩增，然后等量混合作为等位基因分型标准物，也可用商品试剂。
(四) 核酸电泳的染色
核酸电泳后，需经染色才能显现出带型，最常用的是溴化乙锭染色法和银染色法。
1. 溴化乙锭(E：
溴化乙锭(ethidium bromide，E是一种荧光染料，EB分子可嵌入核酸双链的碱基对之间，在紫外线激发下，发出红色荧光。根据情况可在凝胶电泳液中加入终浓度为0.5μg/ml的EB，有时亦可在电泳后，将凝胶浸入该浓度的溶液中染色10～15min.琼脂糖凝胶EB染色，肉眼可见核酸电泳带，其DNA量一般>5ng，当溴化乙锭太多，凝胶染色过深，核酸电泳带看不清时，可将凝胶放入蒸馏水浸泡30min后再观察.
配制：储存液10mg/ml，取10mg溴化乙锭溶于1ml蒸馏水中，避光，棕色瓶，4℃保存。掺入琼脂糖凝胶和缓冲液的溴化乙锭终浓度为0.5μg/ml。溴乙锭是强诱变剂，在接触含溴乙锭的凝胶或溶液时，一定要戴手套。
2. 银染试剂
银染色：银染色液中的银离子(Ag+)可与核酸形成稳定的复合物，然后用还原剂如甲醛使Ag+还原成银颗粒，可把核酸电泳带染成黑褐色。主要用于聚丙烯酰胺凝胶电泳染色，也用于琼脂糖凝胶染色，其灵敏度比EB高200倍。但银染色后，DNA不宜回收。
作者: 荷塘青蛙！ 时间: 2011-8-24 17:23

(1) 银染固定液：10%乙醇，5%乙酸
配制：100ml无水乙醇，50ml，加蒸馏水至1000ml
(2) 银染染色溶液：12 mmol/L AgNO3
配制10% AgNO3母液：10g AgNO3加蒸馏水至100ml充分溶解；
使用液：2ml母液加蒸馏水至100ml。
(3) 银染显色溶液：15gNaOH，10.8ml甲醛，加蒸馏水至1000ml
(4) 停显液：10%冰醋酸
(5) 蒸馏水
三、基本操作步骤
(一) 模板DNA的提取
一般采用酚-氯仿或Chelex-100法，具体参看DNA提取章节。
(二) PCR扩增反应
标准PCR反应体系为100μl，根据需要也可采用50μl、25μl、20μl的反应体积，各反应成分相应按比例减少。反应的容器根据DNA扩增仪型号和机型，可采用0.5ml或0.2ml薄壁离心管(Eppendorf 管)，在一个反应管中将PCR反应各组分混合后置热循环仪中，设定热循环参数进行扩增。现以50μl反应体系的PCR扩增为例介绍操作过程。
1. 标记好每一个离心管。
2. 模板DNA用量1~100ng，对于有机溶剂提取、酒精沉淀的模板DNA，先稀释成1~100 ng/μl，取1μl用于PCR反应
3. 确定反应管数，配制各反应组分，计算10×缓冲液，dNTPs，引物及Taq酶及灭菌超纯水等总量，(表8-4)是以D1S80基因座为例设定的各反应组分浓度与用量，其他基因座可参照设定。
4. 按下列顺序加样：先加灭菌超纯水、缓冲液和模板DNA，均匀混合，加1~2滴无菌的石蜡油覆盖PCR反应液(如果扩增仪配有热盖，使用薄壁离心管则无须加石蜡油)，快速离心数秒(反应要求不严格时此步可省去) ，置扩增仪上，95℃预变性后在80℃加入分装引物、dNTPs、Taq酶组成的混合物，按设定PCR热循环参数，进行扩增，(表8-5)。

表(8-4) 50μl扩增体系各组分含量
PCR反应液组分  贮液浓度  加入量
1×缓冲液  10×缓冲液  5μl
200μmol/L dNTPS  2.5mol/L  4μl
0.2μmol/L引物1  2μmol/L  5μl
0.2μmol/L引物2  2μmol/L  5μl
模板DNA  1-100ng  Xμl
Taq DNA聚合酶1.25 u  5u/μl  0.25μl
灭菌超纯水至50μl
作者: 荷塘青蛙！ 时间: 2011-8-24 17:23

标准的循环参数：
95℃预变性5min→80℃分装引物、dNTPs、Taq酶混合物，94℃变性1min→60℃退火1min→72℃延伸3min，循环35次→72℃延伸7min→取出反应管，放置4℃冰箱保存或直接进行检测分析。
注意：不同的基因位点，其最佳循环参数应视具体情况做相应的调整，(表6-5)为扩增不同长度的DNA片段参考循环参数。
(三) PCR扩增产物的电泳分离与检测
不同片段长度的PCR产物经电泳分离后按片段分子大小彼此分离，通过谱
带显现，可以确定等位基因的基因型。PCR扩增产物电泳分离的方法主要有琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳。可根据扩增产物片段长度范围分别选用 (表8-6,8-7)。

表(8-5) DNA片段参考循环参数
扩增DNA片段长度
  ≤100bp  100bp ~500bp  500bp ~1000bp  1000bp ~2000bp
94℃变性  30s  30s  1min  1min
55℃退火  30s30s  30s  1min  1min
72℃延伸 1min  2min  3min

表(8-6) 琼脂糖凝胶浓度与有效分离DNA片段的分子范围
琼脂糖凝胶浓度(%)  线状DNA分子的有效分离范围(kb)
0.3  60~5
0.6  20~1
0.7  10~0.8
0.9  7~0.5
1.2  6~0.4
1.5  3~0.2
2.0  2~0.1

表(8-7) 聚丙烯酰胺凝胶浓度与有效分离DNA片段的分子范围
聚丙烯酰胺凝胶浓度  分离DNA分子的有效范围(bp)  二甲基苯腈  溴酚蓝b
[%(w/v)]  双链  单链  FFb
3.5  100~1000  750~200  460  100
5.0  80~500  200~1000  260  65
8.0  60~400  50~400  160  45
12.0  40~200 70  20
15.0  25~150 60  15
20.0  6~100 45  12
1. 琼脂糖凝胶电泳与EB染色法
琼脂糖凝胶电泳是一种非常简便、快速和常用的分离纯化和鉴定核酸的
方法，琼脂糖是从海藻中提取的一种线状高聚物，根据琼脂糖的溶解温度，把琼脂糖分为一般琼脂糖和低熔点琼脂糖。低熔点琼脂糖熔点为62～65℃，溶解后在 37℃下维持液体状态约数小时，主要用于DNA片段的回收，质粒与外源性DNA的快速连接等。
电泳类型：用于分离核酸的琼脂糖凝胶电泳可分为垂直型及水平型(平板型)。水平型电泳时，凝胶板完全浸泡在电极缓冲液下1-2mm，故又称为潜水式。目前更多用的是后者，因为它制胶和加样比较方便，电泳槽简单，易于制作，又可以根据需要制备不同规格的凝胶板，节约凝胶，因而较受欢迎。
琼脂糖凝胶的制备：以稀释的电极缓冲液为溶剂，用沸水浴或微波炉加热溶解配制一定浓度的溶胶，灌入水平胶框或垂直胶膜，插入梳子，自然冷却。
作者: 荷塘青蛙！ 时间: 2011-8-24 17:24

电泳：琼脂糖凝胶分离大分子DNA实验条件的研究结果表明，在低浓度、低电压下，分离效果较好。在低电压条件下，线性DNA分子的电泳迁移率与所用的电压呈正比。但是，在电场强度增加时，较大的DNA片段迁移率的增加相对较小。因此随着电压的增高，电泳分辨率反而下降，为了获得电泳分离DNA片段的最大分辨率，电场强度不宜高于5V/cm。
电泳系统的温度对于DNA在琼脂糖凝胶中的电泳行为没有显著的影响，通常在室温下进行电泳。只有当凝胶浓度低于0.5%时，为增加凝胶硬度，可在4℃进行电泳。
染色和拍照
琼脂糖凝胶电泳染色和拍照：常用荧光染料溴乙锭(E染色，在紫外光下观察DNA条带，用紫外分析仪拍照，或用凝胶成像系统输出照片，并进行有关的数据分析。
实验操作：
(1) 小卫星VNTR基因座扩增片段长度一般在300~1000bp之间，配制1%~2%琼脂糖凝胶(多采用水平潜水式电泳)，凝胶缓冲液为1×TBE，凝胶长度为14cm以上。
2%琼脂糖凝胶配制(50ml)：取1g琼脂糖加50ml 1×TBE，置三角瓶中加热至琼脂糖完全溶解(注意补充蒸馏水至原体积)，溶液清亮，将溶液小心灌入模具(若EB溶液直接加在琼脂糖凝胶中，则应待凝胶冷却到60℃左右加入EB再灌胶，EB在琼脂糖凝胶中浓度为0.5μg/ml)，胶面应平整无泡，插上加样梳，室温冷却20~40min后即可将凝胶放入电泳槽中电泳。
(2) 取10~15μl PCR扩增产物与1/10体积载样缓冲液混合加样，1×TBE溶液为电极缓冲液，在100V或200V恒电压条件下电泳，电泳时间根据检测基因座片段长度确定，一般可根据载样缓冲液中染料溴酚蓝与二甲苯腈蓝的位置判断。
(3) 采用EB染色，紫外灯下观察电泳分离的DNA片段，照相记录结果。
EB溶液直接加在琼脂糖凝胶中，这样在电泳过程中能随时观察电泳分离情况，但容易污染环境；也可以在电泳结束后，将凝胶浸在EB溶液中，然后取出观察拍照。
2. 垂直非变性连续聚丙烯酰胺凝胶电泳
聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺单体，在催化剂TEMED(N，N，N，N'一四甲基乙二胺)和过硫酸铵的作用下，丙烯酰胺聚合形成长链，聚丙烯酰胺链在交联剂，N，N'一亚甲双丙烯酰胺参与下，聚丙烯胺链与链之间交叉联接而形成凝胶.
聚丙烯酰胺凝胶电泳适宜分离鉴定低分子量蛋白质、小于1Kb的DNA片段和DNA序列分析，其装载的样品量大，回收DNA纯度高，长度仅相差0.2%(即500bp中的1bp)的核苷酸分子即能分离，(表8-8)。
表(8-8) 不同浓度聚丙烯酰胺凝胶的配制
试剂  聚丙烯酰胺最终浓度
  3.5%  5.0%  8.0%  12.0%  20.0%
30%聚丙烯酰胺(ml)  11.6  16.6  26.6  40.0  66.6
蒸馏水(ml)  67.7  62.7  52.7  39.3  12.7
5×TBE(ml)  20.0  20.0  20.0  20.0  20.0
10%过硫酸铵(ml)  0.7  0.7  0.7  0.7  0.7
TEMED(μl)  35  35  35  35  35
总体积(ml)  100  100  100  100  100
作者: 荷塘青蛙！ 时间: 2011-8-24 17:24

注意：过硫酸铵应新鲜配制：TEMED在其它试剂加入混合后加入，加入量可随室温高低调整，室温高减少，室温低增加。
聚丙烯酰胺凝胶电泳实验操作
(1) 聚丙烯酰胺凝胶的制备
依据分离的DNA片段的大小以及所需凝胶的容积的多少，配制聚丙烯酰胺凝胶：
1) 按要求装配好垂直电泳板，玻璃板插入电泳槽中，两块玻璃板的底部用2%的琼脂糖封底，防止聚丙烯酰胺液漏出，如果水平灌胶则可不封底。(凝胶板也可在灌胶模具里聚合好后再安装在垂直电泳装置上)。
2) 将配制好所需 X%浓度的凝胶注入两玻璃板间，直到液体接近溢出时为止，注意避免产生气泡；插入梳子，密切注意防止梳齿下产生气泡，然后将电泳槽斜靠在物体上，使成10°角，可减少液体泄漏的机会；
3) 室温聚合0.5～１小时，聚合好的聚丙烯酰胺凝胶梳齿处可见折光不同的界面，凝胶应是透明、均质和富有弹性的半固体状态，并且无空泡。凝胶聚合过快表示过硫酸铵(APS)和/或四甲基乙二胺(TEMED)用量太多；凝胶聚合过慢甚至不聚合，则表示过硫酸铵和/或四甲基乙二胺用量不够，或凝胶系统中的试剂不纯或已失效，特别要注意过硫酸铵的有效性。
注意：灌胶模具要保持清洁、光滑平整，不可与粗糙物摩擦以免刮划玻璃板。一般用清洁剂洗净后再用蒸馏水冲淋至少一次，有条件时可用硅化剂使玻璃板表面硅化，这样可避免凝胶粘附在玻璃板上不易剥离。
(2) 预电泳目的是在凝胶上形成均一的电场，并除去部分杂质。在垂直电泳装置的上下槽分别注入1×TBE缓冲液(应浸没电泳槽的铂金丝电极)，小心拔出样品梳，用移液器吸取TBE缓冲液小心冲洗加样槽内的残留胶液，预电泳条件(电压、电流、功率)同分离扩增产物的电泳条件，时间约5～10min。
(3) 扩增产物电泳分离在预电泳完成后，吸取5μl扩增产物与0.5μl载样缓冲液混合均匀依次加入样本槽内，在凝胶两端样本槽内分别加入等位基因分子量标准品5μl(含1μl载样缓冲液)，电泳分离等位基因，不同VNTR基因座电压和时间不同，如D1S80： 300V，2h。
(4) 电泳分离完成后，取下凝胶准备银染。
(5) 银染显色方法检测扩增产物
方法1：
电泳分离完成后，小心剥离凝胶轻轻放入银染盘中，加入200ml～500ml固定液，在水平摇床上轻轻缓慢摇动，浸胶10 min，倾去固定液(固定液可重复使用多次，但时间需延长)，用蒸馏水洗胶二次，每次数秒；加200ml～500ml银染液，在水平摇床上轻轻缓慢摇动，浸胶3～10 min，倾去银染液(银染液可重复使用多次，但时间需延长)，用蒸馏水洗胶二次，每次数秒；加200ml～500ml显色液，浸胶，在摇床上振动直至电泳谱带出现，加1～2滴冰醋酸停显(该步骤可省略)，倒掉显色液，用蒸馏水洗胶二次，每次数秒，然后可浸胶于蒸馏水判读结果，或可将凝胶干胶后(干胶仪或将凝胶置两玻璃纸之间或滤纸与玻璃纸之间压平自然干燥)再判读结果并保存。
作者: 荷塘青蛙！ 时间: 2011-8-24 17:25

方法2：
电泳分离完成后，从电泳装置上取下凝胶玻板，小心分离两块玻璃板，凝胶粘附在大玻板上，将大玻板轻轻放入银染盘中，在水平摇床上轻轻缓慢摇动，加入500ml固定液，浸胶15 min，用蒸馏水洗胶三次，共5min，加500ml银染液避光暗室操作，浸胶30 min，此步骤不使用摇床，回收银染液保存。用蒸馏水快速洗胶10-20s，加500ml显影液，避光，浸胶2-3 min，在摇床上振动直至电泳谱带出现。倒掉显影液，加入500ml固定液，浸胶5 min，除去固定液，待凝胶干燥，在暗室进行成像术，制作成X胶片。
注意：
1) 银染过程中，所用试剂均用去离子水配置，溶液中不能含Cl-，否则会使凝胶变得不透明呈乳白色。
2) 银染过程中，不能用手直接接触凝胶，手套上也不能有滑石粉等杂质，否则手上的汗液、蛋白质以及其它杂质等可能会被染色，使凝胶背景增高或形成银染指纹干扰谱带。
3) 显色反应需在碱性环境中进行，酸性环境中Ag+不能被还原，电泳谱带不能显现。
等位基因分型
电泳结果用照相记录，设计计算机扫描分析软件，以国际上通用等位基因标准品(美国lifecodes)作为分型标准，确认等位基因按重复单位拷贝数命名，使AMP-FLP等位基因分型实现了国际标准化。结果的判读是以已知重复单位数的等位基因分型标准物(allele ladder)作为参照进行的，以等位基因重复数命名等位基因。如样品的谱带位置与邻近的等位基因分型标准物中等位基因6一致，则样品中该谱带为等位基因6。
四、常用遗传学数据的统计处理
(一) 等位基因频率
在染色体某基因座上，某一等位基因占该基因座上全部等位基因的百分率称为该等位基因的频率(allele frequency)，即该等位基因在群体中出现的概率。任何一个基因座上所有等位基因的频率总和为1。其计算法可按直接记数法计算：
Pi(i等位基因频率)=i等位基因观察数/总等位基因数目
总等位基因数目=2×N N是观察群体的个体总数
(二) Hardy—Weinberg平衡法则及吻合度检验
Hardy—Weinberg平衡法则：1908年英国数学家G.H.Hardy 和德国医W.Weinberg同时分别提出群体遗传学中的一个基本定律，被称为Hardy—Weinberg平衡法则，简称H—W定律，其内容是：在一个较大的、随机婚配的群体中，如果不存在迁移(不发生与其他群体的基因交流)、选择(每个个体的子女数不受该个体基因型的影响)、突变等情况，则群体中各种等位基因的基因频率和基因型频率将保持世代不变。
按照H—W定律，由各基因的随机组合所获得的各种基因型频率的期望值，该理论与实际观察值之间的比较，即进行吻合程度的定量估计，称为Hardy—Weinberg吻合度检验，简称H—W检验，主要用于：①作为支持或排除某种遗传方式的一种提示；②估计群体遗传学调查资料的可靠性，包括基因频率估计的可靠性和精确性。
Hardy—Weinberg平衡吻合度检验：基因型期望值和观察值之间的吻合程度用X2检验来量度,对个别的基因座,采用Rand等人(1992)的分组检验法验证,以P≧0.05作为无显著性差异的界值,χ2计算公式为：
自由度df＝基因型数目(观察值)-等位基因数目
作者: 荷塘青蛙！ 时间: 2011-8-24 17:25

基因型期望值(纯合子)＝(Pi)2×N Pi是i等位基因频率，N是观察群体的个体总数
基因型期望值(杂合子)＝(2Pi Pj)×N Pi的Pj分别是I、j等位基因频率，N是观察群体的个体总数
(三) 杂合度(Heterozygosity)
杂合度是指随机选择的某个个体在某一标记位点上同时具有两个不同的等位基因的可能性。
(Nei,1978) n—等位基因数 Ai—等位基因频率
期望杂合度 n—样本数 Xi—等位基因频率
杂合度标准误 n—样本数 h—杂合度
(四) 多态信息容量(polymorphic information content，PIC)
多态信息容量是衡量DNA位点信息度(即利用该位点去对兴趣基因或另一位点进行连锁分析时可获得的信息量，从而判定该位点与其它基因或位点之间的连锁关系)的一个参数。DNA位点的PIC值是指从这一家系中推断得到的信息提供者(可体现通过检测DNA位点的等位基因)的期望分数。
(Botstein,1980)
n=等位基因数 Pi= i等位基因频率 j=i+1
(五) 个人识别力(discrimination power，DP)
个人识别力是遗传标记识别无关个体能力的量化参数，是指同一群体中随机两个无关个体在同一个遗传标记基因分型不同的概率。
1. 常染色体基因座个人识别力计算公式：
(Fisher,1951)
n—观察到的基因数 Pi—基因型频率
累积个人识别力
2. 对紧密连锁的遗传标记，如Y染色体基因座，mtDNA序列差异，个人识别力是在单倍型的基础上计算，又叫基因差异性(gene diversity，GD)
GD=
n—观察到的单倍型种类数 Pi—单倍型频率
3. 对于X染色体上的基因座，个人识别力计算公式：
Dp=
(六) 匹配概率(probability of matching，PM)
匹配概率是指同一群体中两个无关的个体，在同一个遗传标记基因分型相同的概率。
无关个体匹配概率(PM)= Pi— 第i个等位基因频率
累积无关个体匹配概率(PM)=
(七) 非父排除率(Excluding probability of paternity，EPP)
非父排除率是指随机男子被排除是孩子生父的概率。
(Odelberg,1990)
n—等位基因数 Pi、Pj— 等位基因频率
累积非父排除率(CCE) =
五、小卫星VNTR扩增分析的质量控制
(一) 试剂及仪器
PCR引物、Taq DNA聚合酶等试剂及扩增仪的质量和性能必须严格质量控制，符合分型检测的技术标准。不同厂家的Taq DNA聚合酶的活力可能不同，换用不同厂家或不同批号的酶要做预实验。Taq DNA聚合酶要求在-20℃低温保存，贮存浓度为5u/μl，稀释后的低浓度酶保存一段时间后易失活。引物反复冻融，易引起降解，引物应分装冷冻保存。进行PCR反应时，要求设置已知分型结果的样品作阳性对照，以检测反应系统是否准确有效。
不同型号的热循环仪，控温机制不同，温度变化速度不同，应定期测试与校正，以达到最佳扩增效果。
(二) 小卫星VNTR扩增分析注意的问题
扩增片段长度多态性分析应用PCR扩增技术将某一VNTR基因座的等位基因片段扩增出来，然后通过电泳技术将这些扩增出来的片段按大小分离开来。为保证检测结果的准确性，在检验中必须注意PCR反应中涉及的每一环节和因素。
作者: 荷塘青蛙！ 时间: 2011-8-24 17:25

1．模板DNA
模板DNA的质和量均影响PCR扩增。模板量太少，得不到扩增产物；模板量太多，扩增特异性会降低，非特异带影响结果的判断。小卫星VNTR扩增片段相对较大，灵敏度较STR低，一般模板DNA量1-100ng为宜，在进行PCR反应前最好进行DNA定量。此外，模板DNA不纯，含较多蛋白质、血红素、深色染料等易DNA聚合酶抑制剂会使PCR扩增效率降低甚至失败。
2．较小等位基因优先扩增
由于小卫星VNTR的***重复单位相对较大，等位基因片段间长度相差很大，易产生较小等位基因优先扩增现象。二个等位基因扩增产量差异明显，易将杂合子误判为纯合子，尤其是D17S30、ApoB基因座，这种现象更为常见。摸板DNA用量越少，越容易出现等位基因丢失。当微量检材的检验结果为一条谱带的纯合子时，分型时要加以注意，以免造成错判。PCR反应前进行模板DNA定量，以避免扩增中较大等位基因丢失的可能性。
3．降解DNA样品大等位基因丢失
严重降解的DNA样品可能会影响到VNTR基因座等位基因的扩增，大片段等位基因影响较大甚至不被扩增，分型时可能将杂合子个体误判为纯合子。
六、小卫星VNTR扩增分析的应用
(一) 法医学应用
采用AMP-FLP技术检测DNA遗传标记VNTR位点D1S80、D17S3、APOB，他们的Dp值分别为0.9623、0.9555和0.96，累积非父排除率为94.51%，具有高度个体特征，是亲权鉴定和个体识别强有力的手段，而且其技术容易标准化，结果直观可靠，可长期保存，准确性和灵敏性也优于传统的血清学和电泳方法，特别适用于微量标本和组织样本。在法医学实践中，若联合使用3~5个VNTR位点，在亲权鉴定中就可达到认定或否定程度。
(二) 疾病相关性研究
利用连锁分析间接诊断遗传病。***重复序列在人群中具有高度的遗传多态性，人群中的杂合子比例在50%以上，最高的可达90%以上，因此它可提供更多的多态信息量。VNTR可用其两端的序列合成引物，用PCR进行扩增，PAGE＋银染即AMP-FLP，扩增片段呈孟德尔遗传，因此用之作为连锁分析的标记具有重要价值，目前AMP-FLP已广泛应用多种遗传病的连锁分析如DMD/BMD，DKU等，利用***重复区所测序列合成的引物即可对这些遗传病时行基因诊断。
第四节用PCR技术分析微卫星(STR)基因座
一、 STR基因座特征
重复单位长度为2~6bp的重复序列称为微卫星序列，也称短***重复序列(Short Tandem Repeats，STR)或简单序列重复，统称STR。STR在整个人基因组分布广泛，平均每10kb出现一个，主要存在于基因组非编码区及染色体近端粒区，极少数在编码区域，重复单位以(CA)n、 (AAAN)n、(AAN)n和(GT)n较常见，长度一般在400bp左右。1989年Litt和Lutty等发现了STR的存在，随后Webber等从人基因组中成功扩增出特异性STR位点的等位片段，证实STR具有高度多态性，Edwards等的研究也支持约一半以上的STR具有遗传多态性。目前，在人基因组DNA(23对染色体)发现的STR序列达8000多，STR是DNA分析中最常用的一类遗传标记。
STR的优点有：1)灵敏度极高，目前已可对仅50pg的模板DNA进行扩增，1ng的DNA就足以有效扩增；2)对陈旧、***、降解样本的检测成功率高于VNTR系统，对室温保存5~10年的陈旧样本，STR扩增成功率在95%以上，而VNTR系统小于50%。3)适用生物检材类型十分广泛，从常见的血液、血痕、组织、毛发到骨骼、牙齿、指甲、头皮屑、甲醛固定组织、石蜡包埋组织乃至各类细胞、分泌物的染色涂片均可进行STR分型。此外，也可对古代生物DNA进行检验。4)STR分型简单可标准化，结果可转化为简单的数字形式，便于对数据进行计算机处理。
STR检测最常用的方法是PCR扩增，电泳分离，银染或激光荧光分析等位片段的大小和分型，或者利用DNA测序仪直接进行序列分析。目前， STR的检测已发展到可大批量(如BioTherm BioOven Ⅱ可进行864 孔板反应)、微体积(反应总体积可低至5 ~10μl)、超微量(可检测pg级的DNA)和自动化分析。根据各个STR位点PCR扩增条件相近，通过一定的调整(如引物浓度、热循环温度)，可将几个不同的STR位点的扩增在同一反应管中进行，即STR复合扩增技术(Multiplex PCR)。近来出现的STR基因扫描技术以荧光分析为基础，复合扩增分析STR基因座，不同基因座同步电泳，设分子大小内标，电泳分离后多色测序和自动分型一次完成。
作者: 荷塘青蛙！ 时间: 2011-8-24 17:26

二、常用的STR扩增基本技术
STR基因座扩增的原理和小卫星VNTR基因座基本相同，因此用于PCR扩增以及扩增产物检测的仪器、试剂以及操作步骤等也基本相同，不同之处主要在几个方面：1、PCR反应中组成成份含量不同，对模板DNA的质量要求不高，且用量较少；2、PCR扩增退火、延伸时间较小卫星时间短；3、STR各位点PCR循环条件差异不大，经调整某些循环参数，STR位点既可以进行单个位点扩增，也可以进行两个或两个以上STR位点在同一反应管扩增的复合扩增，同步扩增则是两个或两个以上STR位点在独立的反应管中进行，但在相同的PCR循环参数下进行扩增，复合扩增和同步扩增均能提高STR位点检测效率；4、STR位点PCR产物的检测方式较小卫星更多、更简便。
以下所介绍的一般性的操作程序，反应体系各组分的含量要根据具体检验的基因座进行调整，达到最佳反应体系组成以及扩增热循环参数。对于使用商业化的试剂盒应严格按照说明书操作。
(一) PCR扩增
现以FIBRA基因座位于人类4号染色体长臂，重复单位为[TTTC]n 为例。
FIBRA基因座引物:
A:5′-GCC CCA TAG GTT TTG AAC TCA-3′;
B:5′-TGA TTT GTC TGT AAT TGC CAG C-3′
PCR反应体系总体积均为20μl ，包括：1μl 0.2μmol/ L四种引物，2μl 0.2mmol/ L dNTPs，0.5u-1.0u Taq聚合酶，2μl 10×PCR反应缓冲液(100mmol/L Tris-HCl,pH8.0, 500mmol/L KCl,15mmol/L MgCl2,1mg/ml白明胶)及适量模板DNA，不足部分由pH8.2纯水补足。
PCR热循环参数：
FIBRA：97℃5min×1cycle， 94℃×1min/58℃×1min/72℃×1min×28cycles， 72℃×7min×1cycle;
1. 计算所需要试剂的量：每一反应管所需的量×(所要分析的样品数+3)。多出的3份主要是：一份用于阳性对照，一份用于阴性对照，另一份补偿加样过程中的损失。
2. 在室温下融化引物；
3. 标记每一个反应管；
4. 将PCR反应管放在冰水浴中架子上10s；
5. 加入所需的无菌水、10×STR缓冲液、引物混合液；
6. 加入所需Taq DNA聚合酶量，混匀，即配制成PCR混合液；
7. 每一个反应管中加入PCR混合液；
8. 加入所需2μl DNA提取液，同时加2μl无菌水到阴性对照管中，加2μl已知DNA到阳性对照管中。最后各管加入1滴石蜡油，快速离心数秒。如果使用有热盖的扩增仪，可以不加石蜡油；
9. 将离心管放入热循环仪中。根据扩增基因座，设定PCR反应的热循环参数，进行扩增。
基因座不同，PCR反应条件也可能不同。因此，根据所分析的基因座，具体选择反应条件。STR基因座扩增较为常用的热循环参数：为95℃变性60s，59℃退火60s，72℃延伸60s，总共28个循环，60℃延伸45min，最后温度降至25℃。这个程序既可以扩增复合体系的单个STR基因座，也可用于STR基因座复合扩增。反应体系也可以减少到5μl，各组分用量需相应减少。
(二) PCR扩增产物的分离与检测
1. 扩增产物的分离方法
由于STR基因座的重复单位短，等位基因片段间的长度差异很小，一般选用聚丙烯酰胺凝胶电泳分离。
STR-PCR扩增产物分离方法主要有：①水平不连续非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳；②垂直非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳；③垂直变性聚丙烯酰胺凝胶电泳；④高效液相色谱(HPLC)；⑤毛细管电泳(CE)；⑥基质辅助激光解析电离—飞行时间质谱(MALDI-TOF)分析。
2. DNA片段检测方法
根据PCR反应中引物或底物是否带标记或修饰，STR-PCR扩增产物分离后的谱带显现方法分为三大类：
(1) 银染法用于常规的聚丙烯酰胺凝胶电泳分离扩增产物的谱带显示。PCR反应中引物或底物dNTPs不经任何修饰，PCR扩增产物不带任何标记。该法现被广泛使用，其灵敏度可达pg水平，所需试剂常见易得、廉价而且无害，整个染色过程只需1h左右。
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(2) 同位素、非同位素标记法在PCR反应时将引物或底物dNTPs用放射性同位素标记，PCR扩增产物带有放射性，电泳分离后采用放射自显影的方法显示结果。非同位素标记有辣根过氧化物酶等，电泳分离后进行酶联化学反应显现谱带。
(3) 荧光法在PCR反应时将引物或底物用特殊的荧光染料标记，使扩增产物片段带上荧光标记，电泳分离后用荧光扫描峰的形式显现出来。
目前在DNA 分析中STR扩增产物分离和检测方法上，应用的主要是垂直聚丙烯酰胺凝胶电泳银染法，荧光标记检测法和毛细管电泳荧光标记检测法。下面重点介绍垂直聚丙烯酰胺凝胶银染法：
聚丙烯酰胺凝胶电泳银染法具有简便、快速、灵敏和成本低等优点，但只适用于单个基因座或几个扩增产物片段长度不重叠的基因座的复合扩增体系。
3. 操作程序
(1) 凝胶的制备
1) 非变性聚丙烯酰胺凝胶(见PCR-VNTR检测)；
2) 变性聚丙烯酰胺凝胶配制：按下表(表8-9)配制T4%(或4%)、7mol/L尿素的变性PAG。
表(8-9) 变性聚丙烯酰胺凝胶
组分  4%  6%
尿素  12.6g  12.6g
超纯水  16ml  14.5 ml
10×TBE  1.5ml  1.5 ml
40%丙烯酰胺溶液(19：1)  3ml  4.5 ml
总体积  30ml  30 ml

待尿素完全溶解后，加入10%过硫酸胺120μl，TEMED20μl，混匀，用平推法或注入法灌胶，插入加样梳子，最后用夹子夹好玻璃板，室温聚合1h以上。
平推法：将长玻璃板平放在水平台上，配以配套的夹条。一手拿住短玻璃板的一端，将短玻璃板的一端搭在长玻璃板的右端，另一手拿盛凝胶液的烧杯，缓慢将胶液倒在玻璃板一端，让胶液自动流到长玻璃板的另一末端，充满两玻璃板之间的空间，然后右手缓缓将短玻璃板向前推动，一边推，一边倒剩余的胶液，直至两玻璃板左端(电泳时的阳极端)对齐，胶液充满整个空间，插好梳子。
注入法：用加样器或直接将胶液加在以组装好的玻璃板中，一边加，一边敲打玻璃板，使胶液流动加快，不易产生气泡，灌好胶后，室温聚合1h以上。
(2) STR扩增产物的电泳分离
1) 预电泳及上样待凝胶聚合后，将梳子拔出，用0.5×TBE缓冲液冲洗加样槽(孔)以去除槽中的尿素，将凝胶安装在电泳槽中，上下电泳槽中加入0.5×TBE。接通电流，在40W下预电泳至胶温度达50℃左右(约10min)，同时取4μlPCR产物与2×载样缓冲液等体积混合制成上样混合液，95℃变性2min，立即放入冰水浴，上样前再冲洗加样孔以除去析出的尿素，取5μl上样混合液加在凝胶泳道中，在相邻泳道内加等位基因分型标准物。
2) 电泳在恒功率下电泳。对于长32cm的凝胶，设定恒功率40W电泳约80min，40cm的凝胶在60W恒功率电泳约80min。具体时间可根据染料迁移位置确定。在4%的变性胶中，溴酚蓝的移动位置相当于40bp，二甲苯腈蓝的移动位置相当于105bp。
(3) 银染显色
1) 电泳结束后，小心将两块玻板剥离(或将凝胶剥离玻板)，将粘有胶的短玻板放在染色盘中；
2) 加固定液至没过凝胶，室温下轻轻摇动固定20min。用去离子水洗涤3次，每次2min；
3) 加染色液至没过凝胶，室温下轻轻摇动染色30min后，用去离子水冲洗10s；
4) 凝胶于显色液中显色，条带清晰后，用10%乙酸溶液停显；
5) 晾干，观察和记录结果。带胶玻板于10%NaOH溶液中浸泡过夜，凝胶从玻璃板下脱落下来，用水冲洗玻璃板，干燥备用。
对于固定在聚酯薄膜上凝胶，银染过程原则相同：
1) 小心将短玻璃板揭去，将粘有胶的薄膜放在染色盘中；
2) 凝胶在20%乙醇固定液固定5min，用去离子水漂洗2次；
3) 加1.4%硝酸溶液到有凝胶的染色盘中，轻轻晃动2min后，用去离子水漂洗2次，每次10s；
4) 加银染染色液(0.2%硝酸银溶液)染色2min，用去离子水漂洗2次，
5) 凝胶在显色液(9g Na2CO3、170μl甲醛/300mlH2O)中显色，条带清晰后，用蒸馏水漂洗凝胶2次，每次10s，然后用10%乙酸溶液停显，干燥，得到可永久保存的凝胶图谱(1%NaOH可代替Na2CO3)。
(4) 操作注意事项
1) 玻璃板要清洗干净，以防灌胶时产生气泡，玻璃板清洗要彻底，否则胶容易粘在板上。
2) 灌好胶后立即插入梳子，勿使梳齿下留有气泡。
3) 聚丙烯酰胺凝胶的质量不好，或电泳温度太高，或样品量太多会使带模糊。解决的方法是，使用高质量的聚丙烯酰胺凝胶，胶溶液应贮存在棕色试剂瓶中且时间不宜过长，电泳温度控制在40~60℃，减少样品加样量。
4) STR基因座重复序列较短，各等位基因片段产度差异小，相邻等位基因片段有时难以辨别，横向比对有时易产生偏差，再加上边缘效应或谱带漂移也会引起等位基因片段分型出现误差，因此要求每隔3个待检样品加一等位基因分型标准物，并且外侧的两个泳道也都加等位基因分型标准物。
5) 某些基因座的扩增产物变性后的二条单链由于碱基组成有差异，构象有所不同，在凝胶电泳中电泳迁移率不同，在凝胶图谱上表现为一个等位基因有2条带，会干扰结果的判读，见(图8-1)。
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图(8-1)FIBRA电泳分型结果(下为阴极)
Result of FIBRA typing by electrophoresis (downside is negative)
Lane1: 1/11; Lane2: 4/12; Lane3: 6/13; Lane4: 4/8; Lane5: 6/8; Lane6: 9/13; Lane7: 8/9; Lane8: 8/13; Lane9: 6/7; Lane10: 6/9; Lane11: 6/14; Lane12: 6/10; Lane13: 4/7; Lane14: 4/5; Lane15: 2/15; Lane 16: 3/7; Lane17: marker pBR322/MSPⅠ(由左到右)
三、 STR复合扩增(multiplex PCR)
(一) 概念
STR基因座由于片段较小，各基因座之间的扩增条件接近，因此可以通过反应体系和循环参数的适当调整，将二个或二个以上的基因座放在同一个反应管中同时进行扩增，称STR复合扩增(multiplex PCR)。复合扩增的优点在于：节约试剂和样本，检测效率提高，同样的样本和时间，单次检测提供的信息量却大大提高。STR复合扩增所需的仪器、试剂与PCR反应体系组成成分均与单基因座扩增相同，只是反应体系中各基因座的引物浓度以及热循环参数与单基因座扩增有所改变，扩增效率、灵敏度较单基因座最适条件扩增低。
复合扩增的类型：按复合扩增基因座的多少，目前已有双基因座复合扩增，三基因座复合扩增，四基因座复合扩增，五基因座复合扩增以及六、七、八、九、十、十二、十三、十六基因座复合扩增等。
(二) STR复合扩增法医应用常用的试剂盒、仪器及分析软件
试剂盒 Profiler Plus 试剂盒(ABI公司)；Cofiler (ABI公司)；Identifiler(ABI公司)
仪器：ABI PRISMTM310基因分析仪(ABI公司)； ABI PRISMTM3100基因分析仪(ABI公司)
软件：GeneScan3.1基因扫描软件(ABI公司)分析片段大小， Genotyper2.5分析软件进行基因分型(ABI公司)
(三) STR复合扩增的一些影响因素
1. PCR扩增体系的体积减少对DNA分析的影响
应用全自动荧光检测技术时，由于配套的检测试剂盒价格昂贵，不少实验室采用减少PCR扩增体系的体积来增加检测量，从而降低成本。据周怀谷等在ABI PRISMTM310基因分析仪(ABI)、 ABI PRISMTM377测序仪(ABI)、ABI PRISMTM3100基因分析仪(ABI)对Profiler Plus 试剂盒(ABI公司)的50μl、25μl、12.5μl、6.25μl四种体积的扩增体系研究发现，减少PCR扩增体系的体积可能出现的问题有：1)同一基因座两个等位基因峰值出现偏差甚至等位基因的丢失，主要出现在小体积扩增体系且模板DNA浓度较低的情况；2)额外等位基因产生，主要出现在模板DNA浓度偏高或偏低两种情况。模板DNA浓度偏高产生的额外等位基因往往是pull—up峰，是由处于同一位置的其它荧光染色中的等位基因带起来的；模板DNA浓度偏低产生的额外等位基因往往是由于正常等位基因的峰值偏低，因分析时把参数值定得很低，致使一些非特异峰进入分析范围所致；3)与模板DNA浓度的关系 50μl的反应体积包含1～2.5ngDNA为试剂盒供应商推荐的反应模式，扩增体系的体积减少可使加入的模板DNA相对含量增加或扩增条件改变而导致扩增效果的不佳。通常条件下，50μl扩增体系和25μl扩增体系均可得到满意的扩增效果，可作为常规的扩增体系应用于日常检验；如样品条件较好，可选择类似12.5μl扩增体系，因偶尔会出现等位基因的丢失，必要时用50μl或25μl扩增体系进行复测确认；6.25μl扩增体系易出现上述各种现象，不宜采用。
作者: 荷塘青蛙！ 时间: 2011-8-24 18:00

2. 模板DNA用量对荧光STR复合扩增的影响用Profiler Plus 试剂盒在ABI PRISMTM3100基因分析仪检测，其最适扩增模板DNA用量在0.31～2.5ng，模板DNA量过高或过低均会影响STR复合扩增检测结果的可靠性。当模板DNA用量小于0.31ng时，即有非特异峰出现，影响附近基因座检测结果的可靠性。实践中，由于正常等位基因的峰值偏低，在分析结果时把参数值定得过低，易使非特异峰进入分析范围导致检测结果错误。当模板DNA用量大于5ng时会产生pull—up峰(是由某一色荧光某一基因座的高荧光吸收值引起处于同一位置其它颜色荧光的荧光吸收峰的升高)，干扰了正常峰的出现。
四、 STR扩增分析的质量控制
同小卫星VNTR扩增分析的质量控制。
五、 STR扩增分析注意的问题
(一) 检测极灵敏易致污染与某些检验要高灵敏度检测的矛盾
目前PCR-STR技术已可对pg级的DNA进行分析，因此，检测分析过程中混入任何生物检材均可导致错误判型、假阳性的结果，避免和防治污染，这是STR分析中需特别注意的问题。在某些特殊检案，当获得可用生物性检材只是微量、痕量时，则要求STR检测有更高的灵敏度，但在DNA量太少的情况下，除由于不均一扩增造成的人为等位基因“缺失”以及点突变外，还会产生微卫星片段长度的突变。
(二) 微量DNA的STR分型
一个经过优化的复合扩增，在25μl的体系中的模板用量通常为1-2ng，当模板量≤1ng时，分型结果常不理想。
通常把模板量比较少，影响扩增结果的DNA称为低拷贝DNA(low copy numbers，LCN)。为使低拷贝DNA可扩增出足够检出的产物，必须使用较多的PCR循环数。Gill等认为34个PCR循环是一个比较合理的选择，可较好的平衡产物量与非特异性带、影子带之间的关系。 LCN DNA 的STR分型易受到非特异性带、影子带、等位基因漏扩和扩增不平衡，甚至等位基因判读等很多干扰因素的影响，因此，对此类检材分型结果的解释应小心谨慎。
(三) STR扩增不平衡
STR的等位基因间片段的差异不是很大，一般认为由于片段大小的差异引起的优势扩增对STR位点来说并不明显(实践中也可见杂合子短片段的等位基因的条带染色明显淡于长片段的等位基因)，其原因可能为：1)模板中两个等位基因的拷贝数不等，包括染色体数目的增多或等位基因的重复；2)引物结合部位的变异，引物结合部位的突变会改变引物的退火温度和解链温度，造成扩增效率下降，信号减弱，但也可能使扩增效率提高。因此，使用不同的试剂盒可能会由于因引物设计不同而出现同一样本等位基因带强弱不等，甚至分型不同。
扩增不平衡现象有可能会引起分型的错误。由于扩增不平衡，杂合子两个等位基因的扩增条带强弱相差太远，弱的条带易误为Stutter带，非特异性带等，将杂合子当成纯合子。混合斑中各个个体的DNA组分往往不等，本身就会出现扩增效率不同，扩增不平衡将难以鉴定混合样本中各个组分的STR分型或混合个体数。
(四) 异常电泳行为和准确分型问题
STR扩增产物电泳时，影子带和迁移率改变等异常电泳行为是一个较普遍的现象，其中以富含AT的STR和有微变异的STR容易出现异常电泳迁移，二核苷酸和三核苷酸重复序列易出现影子带。为消除异常电泳迁移，有学者认为变性胶电泳(特别是测序胶)优于非变性凝胶电泳，因其可以消除DNA二、三级结构对迁移率的影响。EDNAP的研究认为，如果构建了等位基因阶梯，使用变性PAG电泳系统，把检测样本与等位基因阶梯同步电泳可消除绝大多数异常电泳行为的影响。
(五) 等位基因分型标准物(allelic specific ladder)的应用
作者: 荷塘青蛙！ 时间: 2011-8-24 18:00

使STR分型结果稳定、有重复性和标准化是各国实验室一直共同努力的目标。目前，大多数学者均认为构建分型标准物，待测样本与等位基因分型标准物同步电泳进行比较是获得准确分型的关键。在非变性PAG不连续缓冲系统水平电泳条件下，待测样本与等位基因分型标准物对比得出的分型结果与测序凝胶分型结果相同。荧光检测时，在建立了等位基因判定视窗的基础上，以荧光检测峰面积对等位基因进行定量判定，可以区分真正等位基因和非特异性扩增产物，消除人工假象。
等位基因分型标准物的制备目前主要有三种方法：
1. 等位基因简单等量混合法先对人群进行全面的群体调查，尽可能发现该群体中某STR位点的所有等位基因，将有代表性的个体的样本分别进行重复扩增，再把所有的扩增产物混合在一起制备出该位点的等位基因阶梯。值得注意的是调查的群体人数必须足够，否则回遗漏某些等位基因。
2. 等位基因等量混合再扩增法将代表性的DNA样本，经过定量以后，按等量混合的原则，混合在一起作为模板再进行扩增。这些扩增产物即具有该位点所有的等位基因。
上述2种方案在普通的实验室容易做到，但缺点是这些等位基因阶梯每次制作的量有限，且等位基因阶梯的条带的清晰度也会受到扩增效果的影响。
3. 基因重组法用基因重组技术将各个等位基因的扩增产物重组(插入)到某种质粒，再将质粒转染至大肠杆菌里。利用大肠杆菌内固有的DNA复制机制，大量地扩增这些质粒。提纯质粒以后，再用原来使用的限制性内切酶将等位基因片段切出来，提纯后即可以使用。
(六) 紫外线照射
紫外线照射是最常采用的防止和消除PCR污染的方法，其作用为：在相邻的嘧啶碱基之间形成环丁烷环，从而抑制聚合酶介导的链延伸反应。紫外线照射后，STR检测可出现PCR扩增成功率降低、等位基因丢失(杂合子变纯合子)、等位基因发生变化，但是紫外线照射27h内主要影响大片段STR分型，对250bp以下STR位点影响较小。
六、 PCR分析STR技术的应用领域
(一) 人类基因组遗传图谱的制作
遗传图谱(Genetic Map)是指人类基因组内的基因和专一的多态性的DNA标记的相对位置的图谱。1989年STR被发现，因其在基因组内分布广泛，数目众多，多态性程度高，检测简便，可自动化，故成为制作基因组遗传图谱的首选遗传标记。1994年Colette等采用了5264个STR标记制作了分辨率为1.0 cM的高密度遗传图谱；1996年法国Genethon实验室与美国国家卫生研究院几个中心合作，建立了以6000多个STR为主体遗传标记，分辨率达194kb的高精密度图谱。STR作为遗传标记使人类基因组的遗传制图和连锁分析发生了革命性的变化。
(二) 疾病相关基因的定位、克隆
STR可为连锁分析提供很多的遗传信息，如果进行数百个位点的全基因组扫描，加上合适的家系，就能在短时间内使连锁关系定位于1-2cM，增加该范围标记数目，即可实现基因的定位和克隆。有研究表明，STR不仅与某些遗传病的致病基因和易感基因密切相关，本身也是一些疾病的发病基因，其中以三核苷酸序列与疾病的关系研究较多。如三核苷酸序列延长可引起Huntington病、Kennedy病、脆性X综合症， CAG***重复与某些精神病和神经病有关，CAA***重复与Friedreich共济失调相关。此外，利用STR标记可以追踪肿瘤细胞染色体某一特别类型的畸变在肿瘤发生过程中的传递行为，找到与畸变发生相关的最狭窄的区域，为某些肿瘤发生相关基因的定位与搜寻奠定基础。人类恶性肿瘤中常发生染色体杂合性丢失(lose of heterogisity , LOH)，在定位克隆抑癌基因的过程中，对肿瘤中高频染色体杂合性丢失的分析是对抑癌基因进行定位并最终发现和克隆该类基因的先决条件之一;微卫星不稳定性(Microsatellite Instability， MI)是肿瘤细胞特有的复制错误的遗传改变，检测MI可对某些肿瘤进行基因诊断。
(三) 临床医学中的应用
1．遗传性疾病基因诊断
常染色体显性遗传多囊肾病(ADPKD)是最常见的单基因遗传病之一,目前PKD1的早期诊断是依赖STR进行家系连锁分析。李少英等研究均认为微卫星CW2基因可用于PKD1的基因诊断。王丽娟等应用5个STR基因座对Wilson病家系进行单体型分析，发现STR单体型可提供高信息量的遗传诊断信息，为Wilson病的症状前诊断及杂合子检测提供了新途径。利用孕妇外周血中分离富集的胎儿细胞进行产前诊断的无创性诊断方法已成为近年来众多学者研究的热点，在临床上主要是应用PCR鉴别胎儿性别、Rh血型、诊断单基因遗传病等。
2．器官移植植入状态检测
目前，各种器官移植技术在国内外发展均较迅速，器官移植后植入状态的检测对了解受者治疗疗效、指导用药、预后估测等均有重要指导意义。朱平等用微卫星标记检测HLA完全相合、性别相同的同胞异基因骨髓移植后供者细胞是否成功植入，认为STR作为移植后供者细胞植活的证据是很客观的，供者细胞植活后，受者外周血出现供者的STR类型，而受者口腔黏膜细胞仍为原来类型，因此，可以长期观察供者细胞在受者体内存活情况。
作者: 荷塘青蛙！ 时间: 2011-8-24 18:01

(四) 人类学、群体遗传学的应用
STR标记多位于非编码区，变异一般不影响人体的结构与功能，突变在进化过程中受自然选择压力较小，以近乎稳定的速率传递且不断积累，形成多样性。通过研究STR多态性，变异速率以及比较序列间差异、人群间差异，分析不同人群间的遗传距离，就可从分子生物学角度揭示人类的起源、迁移、进化等历史进程。Bowcock等对全球14个人群进行了30个STR位点分析，根据遗传距离以邻接法构建了高分辨率进化树，先分出非洲人群，再分出欧洲、大洋州、美洲印第安、亚洲人群，Calafell等的研究结果亦遵循该趋势，因此，非非洲人群的遗传多样性应为非洲人群的分支，支持了现代人类起源的替代假说。90年代以来对Y-DNA STR的研究，更为STR标记在人类进化方面开拓了新的研究领域。Y-染色体STR由于在减数分裂时不发生重组，呈稳定的父系遗传，序列的改变仅是由突变引起。因此，选择多个Y-STR构建合适的单体型，研究单体型在不同人群中分布规律，可以追溯现代人类父系祖先，阐明各人群间的遗传进化关系，与母系遗传的线粒体DNA(mtDNA)研究互补。目前，根据mtDNA、STR标记、Y-DNA以及多态性AluI序列的研究，大多数分子遗传学家支持现代人类单起源学说，认为现代人类起源于20万年前的非洲，在过去的10万年分布到世界各地，但也有学者支持现代人类多起源，认为除非洲外，亚洲、欧洲也可能是人类发源地。Karafet 等通过Y-DNA创立者单倍型的分析揭示存在1个以上的父系创立者单倍型，美洲土著起源于亚洲。
(五) 法医学中的应用
STR属高鉴别能力遗传标记，各位点的等位基因片段多在100~400bp，检测灵敏，被广泛应用于法医学的个体识别和亲子鉴定。对传统血型系统，小卫星DNA，STR在亲权鉴定中的应用价值进行比较，结果传统血型系统、3个高多态STR(ACTBP2、D8S51、D21S11)的最大无关个体排除值(Max，Random men excleded,RME)为99.997%，小卫星DNA及Profiler STR(含9个STR位点)均大于99.999%；联合检测各个系统，则小卫星DNA与3个STR的Max，RME值均大于99.999%，Profiler STR及3个STR联合的Max，RME均约等于100%。
STR法医学应用的优点有：1)灵敏度极高，目前已可对仅50pg的模板DNA进行扩增，实际检案中，1ng的DNA就足以有效扩增；2)对陈旧、***和降解的样本检测成功率高于VNTR系统。朱少建报道对室温保存5~10年的陈旧血痕、毛发、精斑，STR扩增成功率在95%以上，而VNTR系统小于50%。3)对混合性生物检材的个人识别和被控父亲缺乏的亲权鉴定非常有效。多人成分混合性生物检材(如轮奸案的个人识别)是法医学检验难题，Y-STR由于为男性特有成分，在PCR检测时无需特殊处理即可排除女性成分干扰直接进行分型。对男女混合性生物检材，即使男女成分比例为0.0001%(男：女)时，应用Y- STR亦可准确分型。Y-DNA 呈父系遗传，对被控父亲缺乏(死亡、失踪等)的亲权鉴定，被控父亲的任何血亲男性个体均可提供与之相同的Y-DNA序列进行鉴定。4)适用的生物检材类型十分广泛，从常见的血液、血痕、组织和毛发到骨骼、牙齿、指甲、头皮屑、甲醛固定组织和石蜡包埋组织，乃至各类细胞和分泌物的染色涂片均可进行STR分型。此外，也可对古代DNA进行检验，Kurosaki等利用8个STR位点结合mtDNA测序技术，对距今1500~2000年两个墓藏群55个个体的骨牙进行了个体识别。古代DNA由于降解，目前STR分型是其研究可行有效的方法。因此，无论对现代人类还是古代人类，STR都是最有效的个体识别标记，在古生物学、考古学、人类学等方面有极广阔的应用前景。5)STR分型简单可标准化，结果可转化为简单的数字形式，因此，被各国相继采用建立“罪犯DNA 数据库”。1995年4月，英国采用6个STR位点建成了世界上第一个全国性“罪犯DNA 数据库”，其他国家如美国、荷兰、澳大利亚、德国、丹麦、芬兰等均已相继建成国家DNA数据库。

（聂胜洁景强）
作者: 荷塘青蛙！ 时间: 2011-8-24 18:01

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作者: 荷塘青蛙！ 时间: 2011-8-24 18:01

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作者: 荷塘青蛙！ 时间: 2011-8-30 15:04

第九章用PCR技术对性别染色体进行分析
第一节概述
细胞间期的染色质可分为两类；呈松散状、染色较浅而具有转录活性的染色质，称为常染色质(enchromatin)；浓缩、而且染色较深，很少进行转录的染色质称为异染色质(heterochromatin)；异染色质又可分为两种：一种叫结构异染色质(constitutive heterochromatin)，这类异染色质在细胞中总是处在凝缩状态，大多含有高度重复的DNA序列，没有转录活性，常见于染色体着丝粒区和端粒等区。另一种叫兼性异染色质(facultative heterochromatin)。这类染色质在特定细胞或在一定发育间段，由常染色质浓缩转变而成。在浓缩时，基因失去活性，无转录功能；当其处于松散状态时，又能转变为常染色质，又恢复转录活性。例如，X染色质(X chromatin)是一种兼性异染色质。又称性染色质(sexchromatin)，性染色质除了X染色质外，还有Y染色质(Y chromatin)。
用DNA技术鉴定性别，自20世纪80年代中期开始各国学者就报道了Y染色体特异DNA的序列等多种方法检测性别。20世纪90年代开始用PCR法扩增X、Y两条染色体特异DNA片段鉴别性别。由于PCR分析技术鉴定性别具有微量、准确等优点，目前已成为性别鉴定的主要方法。要求用于性别鉴定的方法能够同时或平行检验X、Y染色体，如果不同时检验X染色体，结果解释比较复杂，因为有以下三种情况会导致没有Y特异产物：(1)只有女性DNA；(2)有男性DNA，但量太少，不能得到扩增产物；(3)PCR反应失败。
第二节 PCR扩增的基本方法
一、 PCR扩增模板的制备
PCR扩增技术对模板DNA的质量和数量要求较低，常见的DNA和RNA的制备方法都能满足PCR扩增要求。模板制备常采用盐析法，即通过SDS和蛋白酶K消化，NaCl盐析，酚-氯仿抽提，酒精沉淀，干燥后溶于双蒸水(PH8.2)，4℃保存。具体操作步骤：捣碎组织，用PBS(5倍左右)洗涤二次，每次离心1000转/分，10min；收集离心后的沉淀细胞于离心管内；加STE液至总体积500μl；加蛋白酶K约10μl；加SDS 20μl；混匀，37℃消化过夜。然后进行酚-氯仿抽提 (详细步骤详见《用PCR技术对植物、动物、微生物DNA进行分析》一节)，无水乙醇沉淀干燥，4℃保存。
二、主要试剂及其配置、所使用仪器、DNA浓度和纯度的检测方法
详见《用PCR技术对植物、动物、微生物DNA进行分析》一节。
三、 PCR反应
(一) PCR引物的选择
针对性别染色体基因结构的特殊性，Y染色体是人类染色体中最小的之一，估计平均大小为600万个bp。从细胞学的角度看，人类Y染色体包含一个异染色质和一个常染色质区。异染色质区被定位在Y染色体长臂远端并且在大小上有变化，一些正常男性染色体一半以上由异染色质组成，但是在一些个体中通常又不能检测到。人类Y染色体因在染色体组中无同源序列,而在遗传过程中除拟常染色体区外基本不发生重组,可以完整地传给子代,呈男性伴性遗传。如果检验了多个X染色体的基因座，由于位于同一条染色体上，必须考虑连锁的可能性。可根据人类基因作图，从数据库中各基因座间的物理图距和群体调查基因座间的连锁不平衡分析，判断基因座之间是否存在连锁关系。若存在连锁则要以单倍型来统计各种概率，不能简单地将各个基因座的概率相乘。
采用X-Y同源序列的PCR引物进行性别鉴定(详见表9-1)：
(二) PCR反应体系、反应条件、循环参数
可以参照《用PCR技术对植物、动物、微生物DNA进行分析》一节。
(三) PCR产物的检测
作者: 荷塘青蛙！ 时间: 2011-8-30 15:05

Sex-Typing Markers
locus  primers  product size  comments
Amelogenin (96)  5'-CCCTGGGCTCTGTAAAGAATAGTG-3' 5'-ATCAGAAGCTTAAACTGGGAAGCTG-3'  X=106bp Y=112bp  可同STR复合扩增
Amelogenin (96)  5'-ACCTCATCCTGGGCACCCTGG-3' 5'-AGGCTTGAGGCCAACCATCAG-3'  X=212bp Y=218bp  可同STR或VNTR复合扩增
Amelogenin (99)  5'CTGATGGTTGGCCTCAAGCCTGTG-3' 5'TAAAGAGATTCATTAACTTGACTG-3'  X=977bp Y=788bp  可用琼脂糖凝胶检测
Centromericalphoid repeat (98)  5'-TATTTGGACTCTCTCTCTGAGGA-3'(X3) 5'TTCTACTACAAGGGTGTTGCA-3'(X4) 5'-GTGTATTCACCTCCGGGGAG-3'(Y3) 5'-ACAAAAGGTTCAATTCTGTGAG-3'(Y4)  X=157bp Y=200bp  两对引物同时同管扩增
Centromericalphoid repeat (100)  5'-AATCATCAAATGGAGATTTG-3'(X1) 5'-GTTCAGCTCTGTGAGTGAAA-3'(X2) 5'-ATGATAGAAACGGAAATATG-3'(Y11) 5'-AGTAGAATGCAAAGGGCTC-3'(Y22)  X=170bp Y=130bp  两对引物分开扩增
ZFX/ZFY zinc finger gene (103,104) 5'-CTGGAGAGCCACAAGCTGAC-3' 5'-TTGCTGTGGACTGCCAAGAG-3'  X/Y=209bp afterHaeⅢ cuts X=172＋37 Y=88+84+37  reverse dot blot typing assay;may be used with AmpliType PM and HLA-DQA1
SRY93 (800,1185)  5'-ATAAGTATCGACCTCGTCGGAAG-3' 5'-GCACTTCGCTGCAGTACCGAAG-3'  Y=93bp  can be multiplexed with amelogenin

可以参照《用PCR技术对植物、动物、微生物DNA进行分析》一节。
第三节讨论
1. 人类Y染色体因为在染色体组中无同源染色体，所以在遗传过程中除拟常染色体区外基本不发生重组，可以完整地传给子代，从而呈男性伴性遗传。由于男性的连锁遗传特性和以单倍型为遗传方式的特征使得Y染色体的多态信息弱于常染色体，X染色体也具有连锁遗传特性和以单倍型为遗传方式的特征。性别染色体的这些特殊性使PCR的研究方法更加多样化、更加具体化。从引物的选择、研究目的、PCR扩增的循环参数、反应体系等方面都与常染色体有着既共性又个性的地方。因此，在实验前先明确研究目的，确定研究方法，设计最佳引物是很必要的。
2. 目前主要是针对性别染色体与性连锁疾病进行相关性研究，特别是针对某一碱基突变所产生的疾病易感性进行研究。在性别染色体的多态性研究方面也是比较热门的。选取一些具有高度多态性的***重复序列进行等位基因区分并且追溯人类祖先以及研究不同个体近亲关系的研究成为人类学家和法医工作者和考古学者的得力工具。
3. 应该注意的问题：扩增PCR必须标明引物序列，扩增样品必须严格保护不被扩增产物污染，扩增反应条件及试剂(引物、酶和离子)浓度应严格控制，保证结果的一致性。PCR的检测每份样品都应设阳性和阴性对照。PCR产物直接分型，应使用合适的分子量标准标识等位基因。检测时待测样本要在等位基因混合物或分子量标准之间的泳道上电泳；直接测序分析PCR扩增产物，要求建立评估序列的适当标准。通过杂交分型，杂交和洗脱条件必须严格统一，保证结果的特异性。实验中设计阴性、阳性及空白对照，必须严防污染。

（景强）
作者: 荷塘青蛙！ 时间: 2011-8-30 15:06

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3  许丽萍,许玖瑾,朱苏玲,等.中国10个人群中Y染色体Alu序列的多态分布.科学通报，1998,43:843-846.
4  吕德坚,刘秋玲.X染色体STR的法医学应用进展.中国法医学杂志,2002,17(4):252-255.
5  吕德坚.用复合PCR检测DXS7132和DXS6804的单倍型.遗传学报,30(1):10-14.

第十章用PCR技术对动植物、微生物DNA  进行分析
第一节概述
对于植物遗传学家、动物遗传学家、微生物遗传学家、进化和群体生物学家来说，PCR技术已成为他们研究生物体的一种崭新而有力的工具。我们以特异性PCR表示一种标准的双引物扩增，它是以扩增基因组中某一特定区域基因为目的的，因此需要根据有关的DNA序列的信息来设计特异引物。而随机引物PCR也叫随机扩增的多态性DNA标记(RAPD)，我们在这里称之为随机引物PCR，它用随机序列的引物特异性在很多基因组的一系列随机位点上进行扩增，而不需要事先知道位点的序列。
一、特异性PCR
特异性PCR在植物科学中的应用主要有两个方面：①对属性特异的DNA序列定性以用于系统发育或亲缘关系的分析或用于鉴定种系和品种；②通过简单纯化从复杂生物样品的混合物中鉴定病原体和土壤微生物。用于动物DNA扩增的技术主要有线粒体DNA的测序分析、RAPD分析和STR等分析。在微生物方面，PCR技术主要用于对细菌、真菌、病毒和其他微生物的检测和鉴别分析。
PCR技术可用于对许多位点的动植物、微生物的分析。常用的方法是用Taq聚合酶和一整套套叠引物来扩增所研究的DNA区段，然后直接测序。通常所设计的引物要能与一个高变区两端的保守区进行互补，这样就可以对各种不同的基因型进行比较。内含子是用这种方法扩增的极好的对象，因为它比外显子进化快。用一套套叠引物中内向的一对引物在测序反应中扩增起到了进一步纯化的作用，从而可得到更清晰的序列结果。较长的序列在测序前要先克隆，叶绿体DNA可不经扩增直接作为模板测序。扩增后测序和限制性内切酶酶解的分析方法不一定要用成套的同源引物。Waugh等(1991)采用了一种类似的策略，使用直接针对马铃薯U2snRNA多基因家族基因内部的核苷酸序列的引物，可以鉴定出6种新的基因变异类型并能确定遗传连锁关系。根据玉米微管蛋白第一个内含子的PCR扩增结果，可以估计这一多基因家族的不同基因的数量，比用RFLP分析得到的数量要高。
以PCR的高特异性为基础的另一种方法是特异等位基因的PCR扩增，也称之为等位基因特异性PCR(ASPCR或ASP),或者叫做扩增受阻的突变系统(ARMS)。不论是用哪种名称，都是有选择地扩增特异的等位基因，所用引物只与某一个等位基因的核苷酸序列对应，而不与不相似的等位基因对应。这种方法已被用于分析玉米自交系的waxy(蜡质基座)(Shattuck-Eidens等，1991)。为研制等位基因的牧民引物需要费大量的时间和精力，但是一旦得到这样的引物，就可以检测大量个体。也许在植物育种中用特异性PCR鉴定优良的基因只是PASA许多应用中的一种，Dietrich等(1992)用这种方法建立了鼠的遗传连锁图，从而可以用特异性PCR对种内杂交后代进行基因型分析。这一连锁图含有317个简单序列的长度多态性标记(SSLP)，它们是由位于简单重复序列(SSR，又称微卫星)两端的引物扩增得到的。SSR在很多真核生物基因组中都能找到，所以植物也要采用类似的方法。特异性PCR多态性的主要优点是它们可能是共显性的(与SSLP一样)，而且有时是复等位的，因此每个标记可以提供较多的信息。
作者: 荷塘青蛙！ 时间: 2011-8-30 15:06

由于在许多种类的生物中有些调节元件在进化上的保守性，我们可以通过PCR来确定某一特定类型的调节子是否也存在于其它生物中，从而可以获得可平行比较的知识。例如Singh等人(1991)设计了一对可以与黑腹果蝇(Drosophilamelanogaster)cDNA克隆杂交的引物，已知该cDNA编码一个修饰因子可抑制色斑的形成。用这对引物扩增得到了一段111bp的DNA片段，再用这一片段作为异源探针筛选并克隆了含有保守的色调节盒的完整的cDNA。现已阐明这一色调节盒是一个主要的调节基元(SINGH等，1991)。同样的序列在植物中也出现了(SING等，1992)。在得到了大量关于逆转录座子的信息之后，最令人惊异的发现也许是在不同的物种之间逆转座子的横向转移在这些元件的进化过程中发挥了某种作用(Flavell和Smith，1992；Flavell等，1992)。利用PCR扩增的探针还从水稻中分离出了与酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)C蛋白激酶的同源的基因(H等，1992)，它们在真核生物的细胞分裂中有重要的调节作用，植物病毒基因组的系统发育研究也可借助PCR，例如不对称PCR扩增和DNA测序被用于研究菜豆黄色花斑双联病毒的两份基因组的变异性(Gilbertson等，1991)。
病原体鉴定是动植物种质交换和生存的一个关注的焦点。在许多不同的动植物组织和各种器官上包括在细胞内、细胞间和表面上均可以发现大量的病菌体。迄今检测动植物病原体最好的常用方法都是建立在抗原抗体反应的基础上。其中抗体是用荧光或其他物质标记的。而抗体检测的方法比较复杂，抗体结合的实验中，不光需要相对纯的材料，而且需要用单克隆的，已交叉吸附过的抗体，结果是造成许多实验室和检疫机构的高耗费和技术困难。另外，韧皮部病原体的检测一直是个难题，例如对类支原体生物(MLO)，因为它们与专性寄生物锈病菌和黑粉病菌一样，很难在实验室条件下培养。
针对基因组的保守区，如rDNA和tDNA基因，用特异PCR方法已成功地从复杂的生物样品中检测出了病原体。简单地说，这一方法就是先列出被研究对象的序列，然后将其与动植物、微生物的同源序列比较，目的是找到拟检测病原体(通常是属级水平)特异的序列区段，这些区段应不存在于植物或其他的DNA污染源(如实验操作者的人体DNA或许多生长于动植物表面或组织内和各种腐生菌)中。因为被扩增区域的差异性是明显的，所以可以将不同菌株或物种区分开，从而有助工于流行病学和群体遗传学的研究。设计的引物只有当遇到来自病原体的DNA时才能杂交和扩增。在T聚合酶的参与下扩增的DNA片段可以直接测序(不经过克隆)，也可采用传统的克隆后再测序，后一种方法允许鉴定限制性酶切位点的多态性。一旦得到限制性图谱，就可以通过对扩增片段的限制性酶切分析获得的可用于系统发育研究的限制性位点多态性(MRSP)的数据。用特异性PCR或逆转录PCR(RT-PCR)还可以迅速地从复杂的混合物中鉴定出RNA病毒和DNA病毒。如用RT-PCR方法从苹果、柑橘、李子、梨和葡萄中检测出RNA病毒。用特异PCR也解决了鉴定动、植物共生体的难题。在基因工程出现后，向土壤这样复杂的环境中引入几粒细菌已成为一个难以控制的目标，应用PCR技术，则可望追踪引入的细菌。
但是它的横向传递是可以设想的。插入相似的基因到染色体的多个基因座上可测定染色体标记在种间或属间横向转移的频率，这是很有意义的，因为大多数细菌的群体结构都是鲜为人知的。
由于PCR高度自动，而且就特异性PCR而言，扩增反应的结果只是判断DNA的有或无两种形式，所以我们可以预期很快就能利用这一技术对大量的如根瘤或土壤样品进行分析，对是否含有特异的共生菌或由工程引入的细菌进行分类，如此大量的分析工作需要我们发展非电泳的检测扩增产物的方法，如EB染色后直接用计算机审阅经染色的微量滴定板，以获取数据，适合于用PCR分类的定量方法对于这样的应用是很重要的。
真菌是作物的重要病原体。谷类作物的锈病菌是影响谷类产量的主要共生病原体之一，许多专性寄生菌的分类是基于对宿主与病原体间的相互作用的遗传分析，也就是说许多病原体主要是根据它们的无毒基因的内涵进行分类的，而无毒基因对于测试植物病理学上重要的真菌物种的遗传多态性、流行病学、群体结构和系谱关系等方面几乎不能提供什么帮助。这主要是因为无毒基因的表现型不能体现病原体的遗传多样性，这与前面提到的用于制备相应抗体的主要抗原决定基因是一样的。除了昂贵、费时和技术上的困难以外，基于蛋白质差异的方法一般来说不能产生出有足够区别的类型，因此不能算是什么重要的改进。
作者: 荷塘青蛙！ 时间: 2011-8-30 15:08

二、任何引物PCR
在许多基因组中，用一个任意选择的引物可以扩增出一组特异的位于随机分布的基因座上的片段。这一手段的出现奠定了得到大量遗传标记的基础，这些遗传标记可以被用于很多方面。由于这种方法所需要的那种能产生大量标记的技术要求不高、又适合于各种目的研究和实验的环境。任意引物PCR的出现，首先是因为任意引物PCR只需少量的DNA，而且不需要研究对象的克隆库或其他分子形式；而且任意引物PCR通常不需要用放射性标记核苷酸；最后一点，因为任何PCR的方法都具有能进一步自动化的性质，所以有希望通过自动化实现分子标记在遗传育种计划中的常规使用，而这正是用RFLP技术做不到的。
在动植物学、微生物学中，任意引物PCR主要应用于以下几个方面：①构建遗传图谱；②不同目的的系统学研究；③鉴定控制重要性状的染色体区域。用任意引物PCR来构建遗传图谱的工作已取得显著的进展。利用任意引物PCR的多态性得到的生物体基因组的指纹，已经用来进行各种系统学和群体遗传学的研究。尽管对如何分析这些资料有许多看法，但这种讨论主要不是由于方法上的限制，而是由于在系统学、群体遗传学和系统发育推理的关系方面不同的认识以及在如何正确分析这些资料方面存在着分歧。因为用任何引物PCR检测的多态性具有显著的遗传特征，他们的多态信息含量较低但仍可以对适量的生物学分类进行系统发育的分析。尤其是当研究对象的基因组符合所有的推论方法得出的假设时，就可以采用发育的途径分析任意引物PCR的资料。这就是说，该生物体主要是通过漂变和突变进化的，符合二歧分枝树的假定。当任意引物PCR多态性被用于各种研究时，另一个常被提到的问题是在基因组不同基因座的扩增产物在电泳时共同泳动的可能性，统计分析表明，这种可能性很小，但凝胶分离系统以及基因组的亲缘关系却有可能提高这种可能性的概率。在进行种间比较时，聚丙烯酰胺凝胶的分辨效果比琼脂糖凝胶高，在很多情况下，通过加入标记的核苷酸对可疑的多态性进行再扩增，以及用Southern印迹来显示在DNA序列的水平上是否有同源性的方法可以消除可疑的多态性。
总的来说，各种形式的PCR已加深了我们对很多生物体遗传结构的了解，这一点是不容置疑的。而且随着方法的改进，尤其是随着速度和自动化的提高，PCR将使我们对生物体基因组及进化的了解再产生一个飞跃。当然最终的DNA分子标记是DNA序列的信息。当获得和分析大量的DNA序列变得足够廉价和方便时，我们估计至少对于有大量资料被研究的物种，将不再使用其他方法了。
同时，看起来在获得信息的技术作些小的改进如观测扩增产物的非电泳方法和凝胶的计算机辅助识别就可以使基因图谱的构建、上千个遗传基因座或一种细胞中所有mRNA的筛选在几天内而不是几年的时间里完成。我们希望这些改进将能促进对科研资助机构不重视的大量物种的研究工作，而且能在生态和群体遗传学方面产生出一些新的研究焦点，因为这些技术进步能产生大量的标记，并且使自动化分析大量个体成为可能。对于那些基于特异PCR和必将设计出的新策略以对任意引物PCR标记的进一步改进，如将它们转变成有序列特殊性的扩增区成为以特异PCR反应为基础的显性标记，以及采用其它新策略将能使标记辅助育种超级基因型的构建、群体遗传学和种质保存的大规模研究的梦想成为现实。此外我们还期望标记辅助基因转移和选择以及最终的基于图谱的基因克隆能够发展得更快些并且能应用到大量的生物体中去，因为获得信息不再需要很多钱，与其他分子标记相比，任意引物PCR的技术要求也比较简单。将各种基于PCR的研究手段用于生物体将会促进我们对这些生命的了解以便更合理地控制它们。
第二节实验方法与步骤
一、样品来源
收集动植物、微生物的有核细胞组织，干燥或冷藏备用。
二、主要试剂及其配制
(一) 提取DNA试剂及其配制
PrK，SDS，NaCl，TRis，EDTA，TES，PBS，酚·氯仿·异戊醇，氯仿·异戊醇 chelex-100,无水乙醇，双蒸水(PH8.2) 白细胞分离液
1. 0.5%mol/lEDTA(PH8.0)：在80ml双蒸水中加入18.61g的EDTA，用NAOH(约20g)调PH值至8.0，定容至1L后，高压灭菌。
2. 10%SDS：在90ml双蒸水中加入10gSDS，加热至68℃助溶，加HCl调PH为7.2，定容至100ml。
3. 3mol/L NaCl：在80ml双蒸水中加入17.55gNaCl，定容至100ml后，高压灭菌。
4. TES缓冲液：称取Tris-HCl 1.21g，NaCl 0.584g， EDTA-Na2 0.372g，加双蒸水至1000ml，高压灭菌。
5. PBS原液：称取NaCl 216g，NaH2PO4 6g，KCl 7g，Na2HPO4·2H2O 32.6克(Na2HPO4·H2O 65.5g)，蒸馏水加至1000ml，经9磅15min高压消毒，冰箱保存备用。使用稀释液：原液40ml，加蒸馏水至1000ml。
6. 10%chelex-100溶液：称取chelex-100 10g，加入双蒸水至100ml，使用前需充分摇匀。
7. 10㎎/ml PrK：于1㎎蛋白酶K中加入100μl双蒸水，充分摇匀，-20℃保存备用。
8. 酚·氯仿·异戊醇(25：24：1)及保护剂的配制：量取苯酚100ml,氯仿96ml，异戊醇4 ml，充分混匀，上层加保护剂。
200 ml保护剂的配制：称取2.4gTris，0.2g8-羟基喹啉，0.4ml巯基乙醇,加蒸馏水至200ml，由Tris-HCl 0.1 mol/L滴定为PH=8，可以与下层酚·氯仿·异戊醇充分混匀，置4℃冰箱中过夜，上下层分界已经非常清楚，下层液即可使用。
9. 氯仿·异戊醇(24：1)的配制：量取氯仿120ml，异戊醇5 ml，充分混匀，冰箱保存备用。
作者: 荷塘青蛙！ 时间: 2011-8-30 15:08

(二) 琼脂糖凝胶电泳试剂及其配制：
琼脂糖 Tris 硼酸 EDTA 溴化乙锭
1. 5×TBE贮存液：称取54gTris，27.5g硼酸，3.27gEDTA-Na2，定容至1000ml。
2. 溴化乙锭(10㎎/ml)：在10ml双蒸水中加入0.1g溴化乙锭，磁力搅拌数小时以确保其完全溶解，然后保存于棕色瓶，于室温放置。
3. 6×buffer载样缓冲液：量取甘油5 ml，0.5M EDTA(PH=8)20μl,加溴酚蓝40㎎,补充双蒸水至10 ml。
(三) 聚丙烯酰胺凝胶电泳试剂及其配制：
丙烯酰胺亚甲双丙烯酰胺过硫酸胺 TEMED
1. 30%丙烯酰胺(丙烯酰胺：亚甲双丙烯酰胺=29：1)：在100 ml双蒸水中溶解58g丙烯酰胺，2g亚甲双丙烯酰胺，定容至200ml后，4℃保存。
2. 10%过硫酸胺：在8ml双蒸水中溶解1g过硫酸胺，定容至10ml后，4℃保存。
(四) 银染试剂及其配制：
无水乙醇丙乙酸硝酸银 NaOH 甲醛
1. 固定液(10%乙醇及5%丙乙酸)：量取100ml无水乙醇及50ml丙乙酸，加蒸馏水定容至1000ml。
2. 染色液：称取10gAgNO3，加蒸馏水定容至100 ml配制为母液，取母液6 ml，加蒸馏水定容至300 ml备用。
3. 显色液：称取10gNaOH，量取10.8ml 甲醛，加蒸馏水定容至1000ml。
(五) 主要仪器设备
PCR仪(PE2400)，高速离心机，低速离心机，电泳仪(Bio-Rad)，水浴箱，-20℃冰箱，电泳，紫外分光光度计
三、基因组DNA的提取及其检测
(一) 基因组DNA的提取(酚-氯仿抽提法)
采用盐析法，即通过SDS和蛋白酶K消化，NaCL盐析，酚-氯仿抽提，酒精沉淀，最后溶于双蒸水(PH8.2)，4℃保存。
具体操作步骤：捣碎组织，用PBS(5倍左右)洗涤二次，每次离心1000r/分，10min；收集离心后的沉淀细胞于离心管内；加STE液至总体积500μl；加蛋白酶K约10μl；加SDS 20μl；混匀，37℃消化过夜。
(二) 酚-氯仿抽提DNA
1．于上述消化液中加等体积的酚·氯仿·异戊醇(25：24：1)抽提，反复混匀3—5min。
2．离心，10000r/ min，5min。
3. 吸取上清液，移入另一离心管。
4. 加等体积酚·氯仿·异戊醇(25：24：1)继续抽提3—5次。
5. 吸取上清液，移入另一离心管。
6. 加氯仿·异戊醇(24：1)抽提1次，混匀3—5min，离心，10000r/ min，5min。
7. 吸取上清液，移入另一离心管。
8. 加2倍于上清液的冷无水乙醇，加3M NaCL 1/10个上清液体积，混匀，将沉淀挑出放入干净的离心管中，用70%乙醇洗1遍，离心，10000r/ min，15min。
9. 倒掉上清液，自然干燥，加超纯水溶解。
(三) 基因组DNA的质量检测
用0.75﹪琼脂糖凝胶电泳，电压200伏15min，在紫外透射仪下观察有无DNA产物及其质量如何。
(四) 基因组DNA的浓度测定
DNA的浓度测定及纯度测定可通过紫外分光光度计测定其OD值来估测。纯度测定公式：DNA纯度=A260nm∕A280nm
1.6～1.8 属于正常值范围，但也有可能同时混有RNA和蛋白质
＞1.8 混有RNA
＜1.6 混有蛋白质
四、 PCR反应：
(一) PCR引物的选择：
根据目的，参考文献选择待扩增片段及设计相应引物。
(二) PCR反应条件的确定：
同人类基因组常染色体PCR的方法，并就具体生物体物种参考相关文献。
(三) 反应体系
在0.2mlPCR管中加入下列反应体系达总体积20μl，10×buffer 2μl ，MgCL2 2μl，模板DNA，20—30μg(因座位而异)，dNTP200μmol/l，
引物1pmol/l，Taq酶1U，双蒸水要根据座位补足总体积
(四) PCR循环参数
包括预变性、变性、复性、延伸
(以下为人类染色体STR基因座扩增时常用的方法，在此，仅供参阅)
1．预变性：97℃ 5min
2. 变性： 94℃ 1 min
3. 复性： 60℃ 1 min 20个循环
4. 延伸： 70℃ 1.5 min
5. 变性： 90℃ 1 min
6. 复性： 60℃ 1 min 10个循环
7. 延伸： 70℃ 1.5 min
8. 后延伸：72℃ 7 min
9. 4℃保存
(五) 聚丙烯酰胺凝胶电泳及其染色：
1. 8%聚丙烯酰胺凝胶的制备：
例如以8%聚丙烯酰胺凝胶12 ml为总体积时，用移液管吸取30%的丙烯酰胺3.36 ml于烧杯中，加入5×TBE 2.4ml，用去离子水定容至12ml，混合均匀。向烧杯中加入84 μl过硫酸胺和10 μlTEMED(四甲基乙二胺)混合后立即灌胶于电泳槽两块玻璃板之间，室温聚合1小时。凝胶聚合好后，拨出梳子，并用1×TBE冲洗点样孔，往电泳槽里小心加入1×TBE电泳液，电泳液要淹没电泳槽的短板。
作者: 荷塘青蛙！ 时间: 2011-8-30 15:09

2. 聚丙烯酰胺凝胶电泳
预电泳10min，用20 μl的移液枪吸取6×buffer载样缓冲液点样于薄膜塑料上，用微量加样器取PCR产物5μl加到6×buffer载样缓冲液液滴上面，充分混合，再用微量加样器吸取小心点样于加样孔中，上样完毕后，200V电压电泳2h左右(根据基因座片段范围大小做适当调整)，以确保跑出的带紧凑且清晰。当溴酚蓝指示剂跑到距玻璃板下缘1—2 cm位置时，结束电泳。
3. 聚丙烯酰胺凝胶的银染
(1) 玻璃板的分离：电泳结束后，关闭电泳仪，倒出电泳液，小心地揭开玻璃板，将凝胶剥离后放入已准备好的盛有固定液的瓷盘中。
(2) 凝胶的固定：固定10min。
(3) 洗胶：将瓷盘中的固定液倒回原位，用蒸馏水洗胶2次，使残留在胶上的固定液冲洗干净。
(4) 凝胶的染色：倒掉瓷盘中的水，加入染色液，缓缓摇动染色10min。
(5) 洗胶：将瓷盘中的染色液倒回原位，用蒸馏水洗胶2次，使残留在胶上的染色液冲洗干净。
凝胶的显影：加入一定体积的显色液，使其覆盖凝胶，轻摇瓷盘直到看到清晰的条带，一般为7—8min，时间不要太长，否则背景会过深(边摇边观察，棕褐色条带到一定强度后，马上终止)。
(7) 终止显影：倒掉瓷盘中的显影液，在自来水上冲洗两次，放置一定量的自来水于瓷盘中。
阅读序列：根据片段跑的快慢确定序列大小排列顺序，作好记录，并将凝胶用滤纸转移到塑料板上，放置在空气中干燥保存。必要时重新识读序列，并用数码相机摄影。
第三节结果与讨论
1. PCR技术有助于鉴定某一特定DNA片段，因为它能在短时间内精确地复制成百万的目的DNA片段。它使一度非常稀有的实验所需遗传物质变得丰富。遗传物质不但总量变多了，而且不再受限于活的生物体。虽然克隆也可使稀有的遗传物质变得丰富，但该法的缺点在于必须采用活的生物体作为复制遗传物质的载体。PCR的起始材料“目标序列”是DNA上的一个基因或片段。在几个小时内，该目标序列能被扩增超过一百万倍。所谓引物，就是两条很短的合成DNA，它们分别与目标序列两端的特定序列互补。每个引物都与它的互补序列相结合，于是，聚合酶就能从引物处开始复制它的互补链，在非常短的时间内产生与目标序列完全相同的复制品。在后续的循环中，无论是起始DNA还是其复制的双链分子都被分开成单链，引物再次与其互补序列结合，在聚合酶的作用下使新的DNA链合成。多次循环以后，样品中目标DNA序列的含量大大增加，经扩增的遗传物质就能被用于进一步的分析研究。
2. 动物、植物以及微生物的DNA在PCR反应中，具体操作原理相同，操作步骤大同小异，关键是样本DNA的收集与提取，只要有好的模板，整个PCR的操作过程是比较成熟而且简单、快速。另外，针对不同的研究对象，如动物体、植物体和微生物，有着不同的循环参数和条件，同一物种不同待扩增基因序列，也有着不同的循环参数和条件，具体参数和条件可以参考相关文献，也可以自行探索。

（刘德华景强）
作者: 荷塘青蛙！ 时间: 2011-8-30 15:09

参考文献
6  华亮,王毅,李雁,等.用双重荧光原位杂交技术区分外周血细胞中X、Y染色体.中国计划生育学杂志,1998,8(40):377-378.
7  戚其玮,张宏岩,马守中,等.应用X-Y同源基因对性连锁遗传病进行产前性别诊断.中国优生与遗传杂志,2001,9:24-25.
8  徐营,杨利国,郭爱珍,等.性别决定基因SRY的研究进展.生物技术通报,2002,(1)：30-32.
9  Sinclair AH, Berta P, Palmer MS, et al. Nature,1990,346(6281):240-244.
10  Vollrath D, Foote S, Hilton A, et al. Science,1992,258(5079):52-59.
11  张小爱,张海军,聂刘旺.人类性别决定和性别分化研究进展.生物学杂志,2001, 18(5):7-10.
12  袁灿,朱敏,刘智,等.SRY基因启动子不同模块的克隆及功能分析.湖南医科大学学报,2000,25(3):227-230.
13  张文红.人类Y染色体异常对精子发生的影响.国外医学.计划生育分册,2001,20(1):2-5.

第十一章 PCR技术检测CDK4敲入转基因鼠的基因型
第一节实验原理
人类肿瘤的发生提示我们需要精确的理解G1期的调节路径以便能够发展出新的治疗方法。目前，使用基因敲入和敲除技术可建立许多研究肿瘤的基因突变模型。CDK是细胞周期依赖激酶，在细胞周期进程中起促进作用。将CDK4基因插入正常的细胞可使其增殖速度加快，从而使巨核细胞增殖过快造成血小板过多的血液病模型。本实验使用PCR技术检测插入的CDK4基因以确定小鼠的基因型。
第二节实验方法
一、仪器及试剂配制
(一) 试剂
1. 缓冲液
Tris- HCl(2M pH 7.6)    250ml
NaCl(4M)    5 ml
蒸馏水 50 ml
(消毒灭菌后4℃保存备用)
2. 蛋白激酶K：20 μg /ml
3. 氯仿和饱和酚等DNA提取试剂，PCR试剂盒。
（二）仪器设备
PCR仪，手术器械，37℃恒温箱。
二、实验方法
(一) 提取DNA
1. 取下鼠尾放入Eppendorf离心管中，做好标记。
2. 向离心管中加入300μl细胞溶解液、12μl蛋白激酶K，置于56℃热水浴中过夜。
3. 缓和震荡离心管，使管内溶液充分混合，观察组织是否已完全消化。若没有，则继续消化，若已消化完成可进行下一步。
4. 在孵箱中100℃孵育30min。
5. 置于冰上，迅速冷却，离心10秒后加入等体积的饱和酚，充分混合，4000r/min离心5min。
6. 将上清转移至另一离心管中，加入等体积的饱和酚，充分混合，4000r/min离心5min。
7. 重复操作一次。
8. 将上清转移至另一离心管中，加入等体积的氯仿，充分混合，4000r/min离心5min。
9. 将上清转移至另一离心管中，加入一半体积的乙酸钠(3M)，三倍体积的100%的乙醇，缓和震荡混合后，在-20℃储存2h以沉淀DNA。
10. 4℃下10000r/min离心10min，弃去上清，保留离心管底的DNA。向离心管中加入900 μl 90%乙醇洗脱。然后4℃下10000r/min离心10min，弃去上清，保留管底的DNA。
11. 在真空器中干燥10min使DNA干燥。
12. 加入30μl的纯净水稀释DNA并将其放入60℃的热水浴中10min以使DNA彻底溶解。将其迅速旋转后置于冰浴中。
13. 取5 μl的DNA样本，加入495 μl蒸馏水，在分光光度计下估计DNA的纯度。
14. DNA样品-20℃储存备用。
(二) PCR
1. CDK4基因序列(部分)
用于扩增新生鼠的基因组的引物为PDMS1和PDMS3，如下。

正义链：
GGTGGTCGTGGGAGGTCGAGGGGTGCGCACGCGCAGCGACCGACTAATACCTTCCACCGG
作者: 荷塘青蛙！ 时间: 2011-8-30 15:09

反义链：
CAATGGCGGGAAGTGGGGCCTTTGTGGTCGCGGGCAAGGGTGTGATTTTGGAGAGTGAAG
PDMS3
3721……………………………………………………………………………

正义链：
CCTCCCAAACTACCCTCAGAAACACAATGGATTCCGCGCCCGGGACCTTCACACCTCCCC
PDMS1
反义链：
TGGGATGTTGCTGATCGCGTTGGCGAGGTCTTGTGCAGGAGTTCCTTTGTTACCGCCGGG
3961 …………………………………………………………………………
ACCCTACAACGACTAGCGCAACCGCTCCAGAACACGTCCTCAAGGAAACAATGGCGGCCC

2．引物的设计
PDMS1(Primer 1)  TAG GTA ACA CAA AGA ACT CC (5'®3')
PDMS3(Primer 3)  ATT TTG GAG AGT GAA GTG CA (5'®3')
3. PCR反应条件
程序(Takara 系统)
水 34.7 μl
缓冲液 5 μl
混合 dNTP 5 μl
MgCl2 5 μl
引物 1 1 μl
引物 3 1 μl
Taq酶 0.3 μl
模板DNA 2 μl
95 °C 10 min
95 °C 1 min
55 °C 1 min 40 循环
72 °C 1 min
72 °C 10 min

(三) 电泳检测PCR产物
PCR反应产物在1.5%的琼脂糖凝胶上80V、电泳50min，电泳后的PCR扩增产物使用溴化乙锭染色在紫外灯下观测。
第三节结果
在所有的可以鉴别出的178只动物中，40%的动物属于野生型(48只)。杂合基因型以及纯合型的分别占40%和32.5%。表(11-1)列出了检测后获得的每一动物的基因型。
表(11-1)
每一动物的内容和基因型(DNA μg/μl)
编号  出生日期  性别  基因型  OD260/OD280  DNA
1  sem 43  M  */*  1.771  930
2  sem 43  F  */*  1.448  322
3  sem 43  M  wt/*  1.225  189
4  sem 43  F  */*  1.266  137
5  sem 43  M  wt/*  1.44  312
6  sem 43  F  wt/*  1.332  170
7  sem 43  M  */*  1.741  235
8  sem 43  F  wt/wt  1.862  270
9  sem 43  F  wt/wt  1.931  280
10  sem 43  F  */*  1.889  255
11  sem 45  M  */*  1.885  245
12  sem 45  F  wt/*  1.917  460
13  sem 45  M  wt/*  1.869  570
14  sem 45  F  wt/wt  1.957  450
15  sem 45  M  wt/*  1.885  510
16  sem 45  F  wt/wt  1.863  475
17  sem 45  M  wt/wt  1.792  475
18  sem 45  F  */*  1.901  380
19  sem 45  M  */*  1.815  490
20  sem 45  F  wt/*  1.792  430
21  sem 45  M  wt/wt  1.925  510
22  sem 45  F  */*  1.893  530
23  sem 45  M  wt/*  1.907  1020
24  sem 45  F  wt/*  1.878  845
25  sem 45  M  wt/wt  1.876  910
26  sem 45  F  wt/*  1.911  965
27  sem 45  M  */*  1.897  920
28  sem 45  F  wt/*  1.898  930
29  sem 45  M  wt/wt  1.797  575
30  sem 45  F  */*  1.783  410
31  sem 45  M  wt/wt  1.873  515
32  sem 45  F  wt/*  1.786  375
33  sem 45  M  */*  1.819  655
34  sem 45  F  wt/*  1.809  425
35  sem 45  M  wt/wt  1.679  470
36  sem 45  F  */*  1.75  525
37  sem 45  M  */*  1.789  635
38  sem 45  F  wt/wt  1.543  625
39  sem 45  M  */*  1.754  570
40  sem 45  F  wt/wt  1.774  550
41  sem 45  M  wt/wt  1.714  420
42  sem 45  F  wt/*  1.643  460
43  sem 45  M  */*  1.506  625
44  sem 45  F  wt/*  1.577  615
45  sem 45  M  wt/wt  1.718  670
46  sem 45  F  wt/wt  1.671  610
47  sem 45  M  wt/*  1.742  810
48  sem 45  F  */*  1.601  760
49  sem 45  M  wt/wt  1.02  1020
50  sem 45  F  */*  1.725  690
51  sem 45  M  wt/*  1.636  965
52  sem 45  F  wt/*  1.663  735
53  sem 45  M  wt/*  1.72  860
54  sem 45  F  wt/*  1.689  760
55  sem 45  M  wt/*  1.714  660
56  sem 45  F  wt/*  1.725  880
作者: 荷塘青蛙！ 时间: 2011-8-30 15:10

57  sem 45  M  */*  1.719  1100
58  sem 45  F  wt/*  1.772  930
59  sem 49  M  */*  1.875  300
60  sem 49  F  wt/*  1.669  1060
61  sem 49  M  wt/*  1.875  450
62  sem 49  F  wt/*  1.846  600
63  sem 49  M  */*  1.704  460
64  sem 49  F  wt/*  1.634  1235
65  sem 49  M  wt/wt  1.654  2100
66  sem 49  F  wt/*  1.731  580
67  sem 49  M  wt/wt  1.55  4410
68  sem 49  F  */*  1.689  1005
69  sem 49  M  wt/*  1.714  300
70  sem 49  F  */*  1.806  280
71  sem 49  M  wt/wt  1.812  435
72  sem 49  F  wt/wt  1.845  655
73  sem 49  M  wt/*  1.839  570
74  sem 49  F  wt/*  1.824  465
75  sem 49  M  */*  1.833  385
76  sem 49  F  wt/*  1.667  1500
77  sem 49  M  wt/*  1.841  810
78  sem 49  F  wt/wt  1.752  2795
79  sem 50  M  wt/*  1.693  1185
80  sem 50  F  */*  1.71  1180
81  sem 50  M  */*  1.692  1540
82  sem 50  F  wt/*  1.74  1305
83  sem 50  M  wt/*  1.686  1450
84  sem 50  F  */*  1.655  1175
85  sem 50  M  wt/wt  1.731  1350
86  sem 50  F  */*  1.717  1305
87  sem 50  M  */*  1.642  1100
88  sem 50  F  */*  1.669  2070
89  sem 51  M  wt/wt  1.311  990
90  sem 51  F  wt/wt  1.392  1155
91  sem 51  M  */*  1.406  745
92  sem 51  F  */*  1.345  780
93  sem 51  M  wt/wt  1.745  410
94  sem 51  F  wt/wt  1.682  555
95  sem 51  M  wt/*  1.702  485
96  sem 51  F  wt/*  1.843  645
97  sem 51  M  */*  1.657  895
98  sem 51  F  wt/*  1.676  855
99  sem 51  M  */*  1.797  530
100  sem 51  F  wt/wt  1.565  1205
101  sem 51  M  wt/wt  1.672  560
102  sem 51  F  wt/wt  1.737  825
103  sem 51  M  */*  1.602  1025
104  sem 51  F  wt/wt  1.664  1090
105  sem 51  M  */*  1.527  2115
106  sem 51  F  */*  1.667  375
107  sem 51  M  wt/wt  1.771  850
108  sem 51  F  wt/*  1.742  1045
109  sem 51  M  wt/wt  1.697  1205
110  sem 51  F  wt/wt  1.733  1300
111  sem 51  M  wt/*  1.761  1030
112  sem 51  F  wt/*  1.778  1565
113  sem 51  M  wt/*  1.863  615
114  sem 51  F  */*  1.569  455
115  sem 51  M  wt/wt  1.622  1200
116  sem 51  F  */*  1.323  655
117  sem 51  M  wt/*  1.662  1230
118  sem 51  F  */*  1.67  785
119  sem 51  M  wt/wt  1.672  1580
120  sem 51  F  */*  1.52  1885
121  sem 51  M  wt/*  1.831  815
122  sem 51  F  na  1.36  1775
123  sem 51  M  */*  1.505  1460
131  sem 2  M  wt/*  1.773  195
132  sem 2  F  wt/*  1.8  180
133  sem 2  M  wt/*  1.674  140
134  sem 2  F  wt/*  1.455  320
135  sem 2  M  wt/*  1.774  275
136  sem 2  F  wt/wt  1.525  305
137  sem 2  M  */*  1.609  370
138  sem 2  F  wt/wt  1.451  355
作者: 荷塘青蛙！ 时间: 2011-8-30 15:10

139  sem 2  M  */*  1.564  430
140  sem 2  F  wt/*  1.667  300
141  sem 2  M  wt/*  1.672  535
142  sem 2  F  */*  1.71  265
143  sem 2  M  */*  1.633  245
144  sem 2  F  wt/*  1.789  340
145  sem 2  M  wt/wt  1.509  400
146  sem 2  F  wt/*  1.457  255
147  sem 2  M  wt/wt  1.585  420
148  sem 2  F  wt/*  1.651  355
149  sem 2  M  wt/*  1.491  425
150  sem 2  F  wt/*  1.719  275
151  sem 2  M  wt/wt  1.875  225
152  sem 2  F  */*  1.662  300
153  sem 2  M  */*  1.625  455
154  sem 2  F  wt/*  1.623  430
155  sem 2  M  */*  1.606  795
156  sem 2  F  wt/*  1.741  505
157  sem 2  M  wt/*  1.601  280
158  sem 2  F  wt/wt  1.745  500
159  sem 2  M  wt/wt  1.623  430
160  sem 2  F  */*  1.673  435
161  sem 2  M  */*  1.667  475
162  sem 2  F  wt/wt  1.636  540
163  sem 2  M  wt/*  1.688  650
164  sem 2  F  wt/*  1.551  380
165  sem 2  M  wt/*  1.885  245
166  sem 2  F  wt/*  1.758  290
167  sem 2  M  wt/wt  1.619  680
168  sem 2  F  wt/*  1.667  125
169  sem 2  M  wt/*  1.733  390
170  sem 2  F  wt/*  1.681  605
171  sem 2  M  wt/*  1.657  1110
172  sem 2  F  */*  1.835  1110
173  sem 2  M  wt/*  1.694  1440
174  sem 2  F  wt/wt  1.842  875
175  sem 2  M  wt/wt  1.735  1405
176  sem 2  F  wt/wt  1.553  1165
177  sem 2  M  */*  1.651  875
178  sem 2  F  wt/*  1.729  415
179  sem 2  M  wt/wt  1.489  655
180  sem 2  F  */*  1.784  330
181  sem 2  M  */*  1.819  855
182  sem 2  F  */*  1.611  725
183  sem 2  M  wt/wt  1.802  1000
184  sem 2  F  */*  1.654  860
185  sem 2  M  wt/*  1.543  1020

基因型的比例
表(11-2)列出了野生型、杂合型、纯合型鼠的比例。
表(11-2)
总数  178 例 (89M ; 89 F)
wt/wt野生型  wt/*杂合型  */*纯合型  ?未检出
28 M  32 M  29 M
20 F  39 F  29 F  1
48  71  58  1
27%  40%  32.5%  0.50%
作者: 荷塘青蛙！ 时间: 2011-8-30 15:11

第四节结果分析及注意事项
本实验用PCR技术检测CDK4基因敲入小鼠的表现型成功率为99%。本方法成功率较高，但应注意如下问题：
1．设计引物时，引物的结合位点距离插入基因片段不能太远，否则由于片断太小，使目的基因所占的比例变小，与对照比较时不易拉开距离，效果不好。
2．实验中，常会出现当DNA浓度过高时，反而不能扩增出PCR产物，故应特别注意DNA浓度的控制，具体见本书有关章节。
3．如果PCR未获得扩增结果，需考虑如下问题：
(1) 引物问题：引物可通过电泳检测，有时PCR引物降解则无PCR扩增产物。可使用电泳直接检测引物，如果只有一条带，提示引物降解。
(2) DNA浓度：DNA浓度不能太低或太高。若浓度过高，电泳后，可见加样孔处有浓的DNA，但无特异带，此时需将样品逐级稀释后再扩增。
(3) 若如上均无问题，仍没有PCR产物，应考虑Taq酶活性有无问题。
(4) 反应条件、循环参数是否适宜靶基因的扩增。

邓兴力王廷华

参考文献
1  Pardee AB. A restriction point for control of normal animal cell proliferation. Proc Natl Acad Sci U S A, 1974,71(4): 1286-1290.
2  Serrano M, Hannon GJ,Beach D. A new regulatory motif in cell-cycle control causing specific inhibition of cyclin D/CDK4. Nature, 1993,366(6456): 704-707.
3  Hannon GJ,Beach D. p15INK4B is a potential effector of TGF-beta-induced cell cycle arrest. Nature, 1994,371(6494): 257-261.
4  Guan KL, Jenkins CW, Li Y, et al. Growth suppression by p18, a p16INK4/MTS1- and p14INK4B/MTS2-related CDK6 inhibitor, correlates with wild-type pRb function. Genes Dev, 1994,8(24): 2939-2952.
5  Hirai H, Roussel MF, Kato JY, et al Novel INK4 proteins, p19 and p18, are specific inhibitors of the cyclin D-dependent kinases CDK4 and CDK6. Mol Cell Biol, 1995,15(5): 2672-2681.
6  Chan FK, Zhang J, Cheng L, et al. Identification of human and mouse p19, a novel CDK4 and CDK6 inhibitor with homology to p16ink4. Mol Cell Biol, 1995,15(5): 2682-2688.
7  Guan KL, Jenkins CW, Li Y, et al. Isolation and characterization of p19INK4d, a p16-related inhibitor specific to CDK6 and CDK4. Mol Biol Cell, 1996, 7(1): 57-70.
8  Harper JW, Adami GR, Wei N, et al.The p21 Cdk-interacting protein Cip1 is a potent inhibitor of G1 cyclin- dependent kinases. Cell, 1993,75(4): 805-816.
9  el-Deiry WS, Tokino T, Velculescu VE, et al. WAF1, a potential mediator of p53 tumor suppression. Cell, 1993,75(4): 817-825.
10  Xiong Y, Hannon GJ, Zhang H, et al. p21 is a universal inhibitor of cyclin kinases. Nature, 1993,366(6456): 701-704.
11  Polyak K, Kato JY, Solomon MJ, et al. p27Kip1, a cyclin-Cdk inhibitor, links transforming growth factor-beta and contact inhibition to cell cycle arrest. Genes Dev, 1994, 8(1): 9-22.
12  Polyak K, Lee MH, Erdjument-Bromage H, et al. Cloning of p27Kip1, a cyclin-dependent kinase inhibitor and a potential mediator of extracellular antimitogenic signals. Cell, 1994,78(1): 59-66.
13  Toyoshima HHunter T. p27, a novel inhibitor of G1 cyclin-Cdk protein kinase activity, is related to p21. Cell, 1994, 78(1): 67-74.
14  Lee MH, Reynisdottir I,Massague J. Cloning of p57KIP2, a cyclin-dependent kinase inhibitor with unique domain structure and tissue distribution. Genes Dev, 1995,9: 639-649.
15  Matsuoka S, Edwards MC, Bai C, et al. p57KIP2, a structurally distinct member of the p21CIP1 Cdk inhibitor family, is a candidate tumor suppressor gene. Genes Dev, 1995,9: 650-662.
作者: 荷塘青蛙！ 时间: 2011-8-30 15:12

第一章聚合酶链式反应  2
第一节 PCR技术的原理  2
第二节 PCR反应体系  4
一、模板(template)  4
二、引物 (primers)  5
三、反应缓冲系统(reaction buffer system)  8
四、二价阳离子(divalent)——Mg2+  8
五、三磷酸脱氧核苷酸(deoxynucleotide triphosphates,dNTPs)  9
六、耐热DNA聚合酶(thermostable DNA polymerase)  9
七、 PCR促进剂  13
第三节 PCR的反应温度和循环参数  13
一、变性温度与时间  14
二、退火的温度与时间  14
三、延伸温度与时间  14
四、循环次数  15
第四节 PCR反应条件的优化  15
一、 PCR反应条件的选择  15
二、 PCR反应的忠实性  26
三、平台效应  28
第五节 PCR产物的检测  28
一、凝胶电泳检测  29
二、核酸探针杂交检测  29
三、酶谱分析法  31
四、 DNA酶免疫试验法(PCR-EIA)  31
五、 PCR-酶联免疫吸附法(PCR-ELISA)  31
六、颜色互补分析法  31
七、序列分析法  32
八、 PCR-HPLC法  32
九、单一核苷酸引物延伸法(SNUPE)  32
十、 PCR-寡核苷酸连接检测法(PCR-OLA)  32
十一、单链构型多态性分析法(PCR-SSCP)  33
第六节 PCR产物的纯化  33
第二章 DNA模板的制备及PCR技术  35
第一节 DNA模板的制备  35
一、有机提取法  35
二、 Chelex-100提取DNA  40
三、无机法提取DNA  41
四、差异裂解提取法  41
五、其他方法提取DNA  41
第二节 PCR常见问题及处理  43
一、 PCR扩增参数对扩增目的基因的影响  44
二、 PCR常见问题及处理  44
第三节 PCR技术中污染问题  46
一、污染原因  46
二、污染的监测  47
三、防止污染的方法  47
第四节 PCR技术实验室的质量控制  49
一、设备条件  49
二、人员条件  49
三、操作标准问题  49
第三章原位PCR相关技术  51
第一节原位PCR  51
一、原位PCR的基本原理  52
二、原位PCR的方法和原则  52
三、原位PCR中的问题和技术难点  59
四、应用前景  60
第二节原位PCR的分类  60
一、直接原位PCR  60
二、间接原位PCR  61
三、原位反转录PCR  62
作者: 荷塘青蛙！ 时间: 2011-8-30 15:13

第三节原位PCR技术  63
一、直接原位单拷贝PCR  63
二、在细胞和石蜡切片上检测低拷贝DNA序列的原位PCR方法  67
三、冰冻切片上的逆转录原位PCR  76
四、 HIV-1前病毒 DNA的原位PCR检测及流式细胞仪分析  81
五、细胞内mRNA的原位PCR扩增  86
六、组织切片上核酸序列的PCR扩增  93
第四章定量PCR 技术  100
第一节概述  100
第二节基本概念  101
第三节定量PCR 技术基本原理  101
第四节定量PCR技术的种类  102
一、外对照PCR定量  104
二、有限稀释PCR定量分析  104
三、内对照PCR 定量  105
四、非竞争性对照基因定量法  106
五、竞争性定量PCR  106
六、 PATTY定量分析mRNA法  107
七、 PCR－ELISA法：  107
八、荧光定量PCR  107
九、实时定量PCR技术  108
十、定量PCR的主要影响因素  108
第五节荧光定量PCR 技术及其在临床上的应用  109
一、荧光定量PCR  109
二、实时荧光定量PCR  121
第六节 PCR 产物的定量检测与技术  129
一、凝胶检测系统  129
二、 HPLC检测系统  129
三、固相测定系统  129
四、 SPA系统  130
五、杂交检测系统  130
六、电化学发光检测系统  130
七、 DNA酶免疫测定系统  131
八、激光诱导荧光检测法  131
第七节目前存在的问题及展望  131
第五章其它相关PCR技术  134
第一节逆转录—聚合酶链反应  134
一、原理  134
二、实验方法  134
三、常见问题处理  137
第二节套式PCR  139
一、原理  139
二、基本技术  140
三、套式PCR的应用与评价  141
第三节多重PCR(MULITIPLEX PCR)  142
一、原理  142
二、基本技术  142
三、多重PCR的应用与评价：  143
第四节 PCR结合等位基因特异性的寡核苷酸探针法(PCR-SSO)  144
第五节 PCR结合序列特异性引物技术(PCR-SSP)  146
第六节单链构型多态性分析(PCR-SSCP)  147
一、原理  147
二、基本技术  147
作者: 荷塘青蛙！ 时间: 2011-8-30 15:13

第七节限制性酶切片段长度多态性分析(PCR-RFLP)  149
第八节 MVR-PCR  150
一、原理  150
二、基本技术  151
三、应用和评价  152
第九节 RAPD技术  153
一、原理  153
二、基本技术  153
三、技术应用和评价  155
第六章 PCR技术用于构建CDNA文库、测序及基因突变的检测  159
第一节 CDNA文库构建的基本技术  159
一、经典cDNA文库的构建方法  159
二、用PCR 方法构建cDNA文库  167
第二节 PCR测序  168
一、 PCR产物直接测序法  168
二、 PCR循环测序法  169
第三节 PCR技术用于基因突变的检测  171
第七章 PCR技术分析DNA序列多态性  176
第一节 DNA的二种多态性和遗传标记分类  176
一、片段长度多态性(fragment length polymorphism，FLP)  176
二、序列多态性(Sequence polymorphism)  177
第二节 PCR技术分析DNA序列多态性  177
一、 PCR-RFLP(restriction fragment length polymorphism )技术  177
二、 PCR-SSO(sequence specific oligonucleotide-PCR，SSO-PCR)技术  178
三、 PCR测序  178
四、 PCR-SSCP(single strand conformation polymorphism，SSCP)技术  179
五、单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism ，SNP)及PCR分析  179
六、线粒体DNA(mitochondrial DNA,mtDNA)多态性及PCR分析  181
第八章用PCR技术分析VNTR和和STR  188
第一节概述  188
第二节扩增片段长度多态性分析分型技术基本原理  189
第三节用PCR技术分析小卫星VNTR基因座分型的基本技术  190
一、 VNTR基因座特征  190
二、试剂和器材  190
三、基本操作步骤  195
四、常用遗传学数据的统计处理  202
五、小卫星VNTR扩增分析的质量控制  205
六、小卫星VNTR扩增分析的应用  206
第四节用PCR技术分析微卫星(STR)基因座  206
一、 STR基因座特征  206
二、常用的STR扩增基本技术  207
三、 STR复合扩增(multiplex PCR)  212
四、 STR扩增分析的质量控制  214
五、 STR扩增分析注意的问题  214
六、 PCR分析STR技术的应用领域  217
作者: 荷塘青蛙！ 时间: 2011-8-30 15:13

第九章用PCR技术对性别染色体进行分析  223
第一节概述  223
第二节 PCR扩增的基本方法  223
一、 PCR扩增模板的制备  223
二、主要试剂及其配置、所使用仪器、DNA浓度和纯度的检测方法  224
三、 PCR反应  224
第三节讨论  226
第十章用PCR技术对动植物、微生物DNA  进行分析  228
第一节概述  228
一、特异性PCR  228
二、任何引物PCR  231
第二节实验方法与步骤  233
一、样品来源  233
二、主要试剂及其配制  233
三、基因组DNA的提取及其检测  235
四、 PCR反应：  236
第三节结果与讨论  238
第十一章 PCR技术检测CDK4敲入转基因鼠的基因型  240
第一节实验原理  240
第二节实验方法  240
一、仪器及试剂配制  240
二、实验方法  241
第三节结果  243
第四节结果分析及注意事项  248
作者: 牙牙 时间: 2011-8-30 15:15

你好！
我现在正在做PCR，包括一般PCR和RACE，您上传的文章对我非常需要，并且有一个具体的指导。谢谢啦~
作者: +田田+ 时间: 2011-8-30 15:18

真的很不错，内容翔实，具有可操作性。

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