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标题: 【求助】全血基因组DNA提取问题 [打印本页]

作者: bgf5 时间: 2015-8-1 17:09 标题: 【求助】全血基因组DNA提取问题

我用的是上海生工的血液基因组DNA小量抽提试剂盒（离心柱型）的，可是我提完之后跑电泳，看不到任何带子。我其中的问题可能是：
1）说明书---在500μl血液中加入800μl的TBP Buffer用1ml的Tip 头轻轻吹打使其彻底混匀，而后4,000转/分离心3分钟，弃上清。
本人做实验----离心转数8000转/分；弃上清时，我没有用枪头吸出，而是轻轻将上清液倒出，只留下管底一点点无色透明的沉淀，特别少。这样对吗？是不是上清去除的太多了？也不应该直接倒？我发现用枪头吸的话有时会吸到最底层的沉淀。
2）说明书---在准备好的200μl样品中加入500μl TBM Buffer，混匀；再加入4μl Proteinase K，混匀，55℃保温10~20分钟。
本人做实验---保温30-40分钟。因为我的血标本时间最长的可到14个月。是不是保温时间太长了？
3）我跑电泳的琼脂糖胶浓度为1%，我加的电压是250V,时间是20分钟。紫外灯下观察，什么也没有。
其他步骤完全是按照试剂盒说明书进行的。我已经连续做了6个，都不行！心里很难过。我们实验室的分光光度计不能用。现在放假，别的科室也没有人。我真是...
大家看看我到底是哪一步出问题了？还有，今天我怕是我采的血时间太长，DNA降解了，我直接抽自己的新鲜血提的DNA,还是不可以。实验室就我自己，我急的都哭了！明年就毕业了，可是连个DNA都提不出来，PCR更是别说！
更附：DNA提取试剂盒说明书，我实在找不出我失败的原因。

作者: veiwu 时间: 2015-8-1 17:09

建议你不用生工的试剂盒，我们碰到过类似的问题，生工的人说是离心柱的问题。你可以买更好的试剂盒或用手提（加蛋白酶、RNA酶）

作者: bgf5 时间: 2015-8-1 17:37

你好，我买生工的试剂盒还是别人介绍的。我原来买的赛百盛的，更是不行。你知道哪个公司的试剂盒比较好吗？还有，增加消化时间会不会好一些呢？是不是基因组DNA释放，不仅要破坏细胞膜又要破坏核膜，比较不容易呢？真是愁煞我了！
你说的用手提是什么意思，是用酚-氯仿的方法吗？我的邮箱是zhaomeixing@yahoo.com.cn。可以多介绍介绍吗？万分感谢！
别人都说DNA特别好提，而且我看了大家的提问，没有几个人问提DNA的问题，是不是我太笨了啊？哎...

作者: nn255 时间: 2015-8-1 17:38

建议您用碘化钾的方法提取外周血DNA，这个方法简便、快速、经济，我实验了几次，结果比较理想。

作者: nn255 时间: 2015-8-1 17:38

QUOTE:

原帖由 bgf5 于 2015-8-1 17:37 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
你好，我买生工的试剂盒还是别人介绍的。我原来买的赛百盛的，更是不行。你知道哪个公司的试剂盒比较好吗？还有，增加消化时间会不会好一些呢？是不是基因组DNA释放，不仅要破坏细胞膜又要破坏核膜，比较不容易呢？真是愁煞我了！
你说 ...

适当增加消化时间确实利远大于弊，我们经常消化半小时到两三个小时，因为前面的溶液里面有EDTA，所以基本不用担心DNA降解，放心消化。
另外，我也不推荐生工的试剂盒，但也相信他们的试剂盒会到这种程度，可能是样品本身或者操作有什么问题。

作者: bgf5 时间: 2015-8-1 17:39

看到你真是高兴，刚才我在核酸技术版就得到你的答复了，我今天又提了两个，增加了消化时间（由原来的30分钟提到2个小时），我觉得效果好了很多。而且我新配制了电泳液和琼脂糖凝胶，带子跑的很好。
我想问你另一个问题：我提出DNA来，做PCR,然后酶切，我用的限制性内切酶是RsaⅠ和HindⅢ，这两种都是比较常见的酶，我买的是赛百盛的，可以吗？原来是想买生工的，可是看了大家说生工的酶不好，吓的我不敢买了。呵呵，我这回没有买错吧？

作者: nn255 时间: 2015-8-1 17:39

一些大品牌进口的试剂盒说明书，通常把时间、产量等数据写的比较保守，而国产试剂盒喜欢写上他们做出来过的“最优”数据，来显示试剂盒性能多么的好。比如说半个小时就能提完****，反应5min就能****，实际上那些说半个小时就能提完DNA的，通常三步水浴时间加起来就是半个小时，除非别的操作不占用时间，那些反应5min的，经常是各种条件都是最合适的时候做出来的。

作者: bgf5 时间: 2015-8-1 17:39

你说的可真对啊，我是自己做过才知道国产的是怎么样吹的，可真是害人啊！哎。。。白浪费我的眼泪了！

作者: bgf5 时间: 2015-8-1 17:44

我最近又连续做了30多个，跑胶总是15个出8个，11个出6个，而且荧光特别弱，在普通紫外灯下根本看不到，在凝胶成像仪上也是特别弱。怎么会这样呢？难道非要我换试剂盒啊？苦！

作者: www.1 时间: 2015-8-1 17:44

换个试剂盒吧
QIAGEN 的不错啊

作者: DCS 时间: 2015-8-1 17:45

价钱也不一样啊，QIAGEN的价钱估计是生工的10倍-20倍吧，摊便宜的结果，再说就不会学着变通一点，多加点PK，多消化一会，毕竟人的全血中DNA本来就不多

作者: mickeylin 时间: 2015-8-1 17:46

很多国产试剂盒都不错的,如上海申能博彩,天根公司的都不错,我们一直用,肯定没有问题,我今天还刚抽那

作者: mickeylin 时间: 2015-8-1 17:46

生工主要引物和测序不错,其他不一定了,每个公司都有自己的特色嘛,不能迷信!

作者: bgf5 时间: 2015-8-1 17:46

你用的是天根的溶液型的，还是离心柱型的？我试着用别人的天根的溶液型的提的，DNA是提出来了，跑胶也比较亮，可就是杂带比较多。因为下一步我做完PCR后，还要酶切，怕杂带多了，影响我后续的试验。但是离心柱型的，我真是用怕了。不敢轻易去买了。。。我看了几个公司提DNA的试剂盒，都差不多，关键是哪个环节容易出问题呢？离心柱的成分？

作者: bgf5 时间: 2015-8-1 17:47

我今天把我原来提的DNA（跑电泳也不出结果的）做了一下PCR，结果也是特别弱，而且我还不确定是不是真的目的DNA被扩增出来的，还是被污染了，本来今天想把结果给大家看的，可惜的是我没有带优盘，没有拷下来。明天上传给大家看吧！

作者: bgf5 时间: 2015-8-1 17:49

价钱也不一样啊，QIAGEN的价钱估计是生工的10倍-20倍吧，摊便宜的结果，再说就不会学着变通一点，多加点PK，多消化一会，毕竟人的全血中DNA本来就不多

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呵呵，你说的可真是实在，要是便宜的话，我二话不说就买QIAGEN的了！我明天就按你说的多加点PK,不过消化时间我可不能再加了，我已经是37度消化过夜了。还有，如果真是因为全血中DNA很少的话，我再怎么消化也不出，怎么办？呵呵，不管怎样，做做再说！

作者: baidukk 时间: 2015-8-1 17:50

QIAGEN 的血液小抽50次的1300元
天根的也要三百多呢
其实如果QIAGEN的提的很好的话对后续的实验都是有好处的
会省很多的心
就是多了一千块钱
相信老板会出这个钱的
关键是自己省心啊。

作者: ero11 时间: 2015-8-1 17:51

推荐天根的！国标

作者: bgf5 时间: 2015-8-1 17:51

QUOTE:

原帖由 ero11 于 2015-8-1 17:51 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

推荐天根的！国标

你一定是用过天根的是吗？你用的是溶液型的还是离心柱型的？我试着用我同学的天根的溶液型的提的，量是多很多了，可是我感觉杂带很多。嗯。。。。我也说不好。。。呵呵，战友，你为什么这么挺天根啊？

作者: bgf5 时间: 2015-8-1 17:52

帮我看看我的PCR,怎么这样啊？第一泳道为marker,最上是1000bp,我没有完全跑完。第二和第三泳道模板为DNA提的特别少的（电泳在凝胶成像仪上也看不到的）;第四泳道是DNA提的比较好的。我PCR扩出来的主带怎么旁边那么多杂带啊？是非特异条带，还是什么？

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http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=35791

作者: www.1 时间: 2015-8-1 17:52

基因组DNA 还是很好提的，根本不需要用什么试剂盒，1ml的全血足够了，提之前先用氯化铵溶血，然后分离出相对纯的白细胞，然后SDS/NaOH很容易就能提出来（具体步骤就不啰嗦了）。大了我不敢说，10kb还是有保证的。从你的电泳图可以看出，你的基因组DNA体的很差劲的，1000bp的都不多，另外你的电泳缓冲液可能也不行，连DNA ladder 都没有跑好，

作者: www.1 时间: 2015-8-1 17:53

再啰嗦一句，所有的试剂盒都是根据最土的方法建立的，仅仅是加一些其他的物质而已，仅能对实验结果有些许的改善，不要指望他能提供多大的帮助，最多也是使用上节省时间和操作简便一些而已。如果你不搞科研，还是可以破财消灾的，呵呵（自己不会优化，只能如此)

作者: 3N4G 时间: 2015-8-1 17:54

土方法或者我用AXYGEN，原来也是国内的公司被收购了不错我DNA,基因组，质粒，较回收都用他家的便宜好用还沾国际大牌

作者: bgf5 时间: 2015-8-1 17:55

这是我前段时间提的DNA,其中4，7，14泳道没有加样，其他泳道都加样了，只有8个勉勉强强能看，其他的根本就什么也没有啊。

作者: bgf5 时间: 2015-8-1 18:00

基因组DNA 还是很好提的，根本不需要用什么试剂盒，1ml的全血足够了，提之前先用氯化铵溶血，然后分离出相对纯的白细胞，然后SDS/NaOH很容易就能提出来（具体步骤就不啰嗦了）。大了我不敢说，10kb还是有保证的。从你的电泳图可以看出，你的基因组DNA体的很差劲的，1000bp的都不多，另外你的电泳缓冲液可能也不行，连DNA ladder 都没有跑好

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谢谢批评！只是我上面发的图不是DNA电泳图，我发的是用提出来的DNA做的PCR的图。因为有人建议我用提出来的DNA做做PCR看行不行！大家都说DNA很好提。我真是羞惭啊！刚才我又上传了一份我前段时间提的DNA电泳图。请指教！
我的缓冲液，呵呵，不是它的原因，是我的原因，我加的电压太小了，我们试验室的电泳槽是27cm的，我跑电泳时才加了60v电压。呵呵，marker没有跑完，而我看我的目的条带出来了，就没有继续！
不是不想用原始的方法提DNA，而是好多试剂也要自己买，一是怕麻烦，再者是怕提出来杂质多，影响后续试验！

作者: nn255 时间: 2015-8-1 18:00

你照的图片又问题，可以尝试调调凝胶成像仪的光度对比。

作者: bgf5 时间: 2015-8-1 18:00

你是说我没有出现条带的是因为光度比值没有调好吗？我当时调了，怎么样也没有。不过我采的图是挺丑的。下次一定注意！

作者: junhun 时间: 2015-8-1 18:01

请问：我对你的方法很感兴趣，能分享下吗？尤其对你能那么简便分离出较纯的白细胞。

作者: dhpbj 时间: 2015-8-1 18:01

天根用的离心柱的膜就是QIAGEN 的，所以肯定没有问题的！

作者: ero11 时间: 2015-8-1 18:01

QUOTE:

原帖由 bgf5 于 2015-8-1 18:00 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
基因组DNA 还是很好提的，根本不需要用什么试剂盒，1ml的全血足够了，提之前先用氯化铵溶血，然后分离出相对纯的白细胞，然后SDS/NaOH很容易就能提出来（具体步骤就不啰嗦了）。大了我不敢说，10kb还是有保证的。从你的电泳图可以看 ...

酚/氯仿法提取血液DNA纯度是很高的，做PCR绰绰有余。

作者: remonte 时间: 2015-8-1 18:05

我是个新手，我要提的是血浆里的DNA，哪位好心的xdjm能给我推荐一下用哪个公司的什么型号的试剂盒比较好，多谢多谢！

作者: remenb 时间: 2015-8-1 18:06

PCR作完有的会有杂带，样本多的情况下尤其可能，建议将目的条带切下纯化然后再酶切。当然，你的目的带要够亮才好。

作者: 2541 时间: 2015-8-1 18:06

我用的是天根公司的感觉用起来比较好！

作者: bgf5 时间: 2015-8-1 18:07

QUOTE:

原帖由 remenb 于 2015-8-1 18:06 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

PCR作完有的会有杂带，样本多的情况下尤其可能，建议将目的条带切下纯化然后再酶切。当然，你的目的带要够亮才好。

谢谢你的回复，呵呵，我已经发现这个问题了，我用PCR产物没有纯化就直接酶切，结果什么也没切出来！我已经买了胶回收试剂盒，下一步就是切胶回收再酶切！谢谢回复！我会继续努力。有进展及时与大家沟通！

作者: bgf5 时间: 2015-8-1 18:09

我这个问题放在这也许不太合适：我怎么最近做PCR跑出来的带子没有原来的亮？我分析的可能原因是：1）DNA降解；2）引物脱嘌呤（这个是因为我无意中测了一下我用的无菌超纯水的pH值，是6.18-6.22，可能对引物不好）；3）实验室条件变化；4）所用的试剂反复从冰箱中取出放回，性能下降。
我想到的可能是这样，不知道对不对！请大家指正！
还有，大家溶解引物时是用水溶，还是TE溶，区别很大吗？

作者: junhun 时间: 2015-8-1 18:13

天根什么型号的呢。试剂公司给我推荐用DP315，但较贵，也没用过，不知道提取效果会怎样

作者: junhun 时间: 2015-8-1 18:14

我这个问题放在这也许不太合适：我怎么最近做PCR跑出来的带子没有原来的亮？我分析的可能原因是：1）DNA降解；有可能2）引物脱嘌呤（这个是因为我无意中测了一下我用的无菌超纯水的pH值，是6.18-6.22，可能对引物不好）；这个pH已经不错了，水不利于引物保存，但还不至于脱嘌呤，合成引物过程中还要用到三氯乙酸呢
3）实验室条件变化；4）所用的试剂反复从冰箱中取出放回，性能下降。主要是引物和dNTP、模板
我想到的可能是这样，不知道对不对！请大家指正！
还有，大家溶解引物时是用水溶，还是TE溶，区别很大吗？建议母液用TE，工作也用水或者Tris-HCl
......

作者: bgf5 时间: 2015-8-1 18:14

呵呵，谢谢你的回复！我己经把引物用TE溶了，用水还是不放心！能再问你一个问题吗？我下边这对引物：上游： 5’-CAGCAGAGCCAACTTCTGACCC-3’；（Tm 63.8℃）下游：5’-CCCTTGTAAGGCAAGTCTGG-3’（Tm 59.4℃），扩增片段长度1800bp.我的PCR条件是94℃预变性5分钟，94℃变性60秒，退火58℃，50秒，延伸72℃，60秒，30个循环。最后延伸72℃5分钟。什么也跑不出来。是（1）退火温度太高了？（2）延伸时间不够？（3）最可怕，也是我最不想认为的是引物设计不合理。。。。。。。？

作者: junhun 时间: 2015-8-1 18:15

首先，我认为引物设计的重要性要高于PCR条件的摸索；如果说你的这个PCR条件有什么要摸索的，我想，既然现在没有产物，那退火温度往低了调，先不管特异性，先有东西再说，有了产物，特异性不好，再考虑温度高一点，如果退火温度降下来也没有产物，那就要考虑试剂等原因了。
其次，不清楚你扩增的什么模板，看前面的帖子，应该是人基因组吧？我以前做过Taq酶质量控制，一般公司的普通Taq酶扩增人基因组到2k多大小的片段已经接近极限了，也就是说处于扩增出来和不出来之间，条件稍微不好就失败，所以Taq酶质量在你的实验中应该比较重要。
另外，引物我只是建议贮存液用TE溶，工作液如果也用TE溶，既要顾及到PCR体系中加入引物的体积，不能太大，否则引入太多EDTA，会螯合镁离子，抑制PCR。
最后，引物设计的好坏，可以用oligo6.0评价一下。

作者: bgf5 时间: 2015-8-1 18:15

不好意思，上面的回复中（我今天又做了一次PCR，呵呵，我没有把退火温度降低，反而升高了由原来的58℃升到60℃，竟然有带子跑出来了，不过有“非”特异性条带，我明天准备再升一度，再调一下。）我少打了一个“非”字。

作者: bgf5 时间: 2015-8-1 18:17

我的试验做完了，我最终是采用了园子里战友的建议老老实实的用苯酚-氯仿提的DNA，效果相当好，做出来的PCR也很好！所以请大家不要盲目相信什么试剂盒了！浪费金钱，浪费时间，浪费感情！现将我用的方法上传，希望对师弟师妹们有所帮助。我的一些建议都以绿色笔标出。

作者: ukonptp 时间: 2015-8-1 18:18

建议您用碘化钾的方法提取外周血DNA，这个方法简便、快速、经济，我实验了几次，结果比较理想。

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我试过几次，不是很理想啊！你能把你的详细步骤发给我吗？我为什么提的DNA 里老有黄色的杂质，是碘化钾分解的碘吗？不过，倒是很方便快捷啊！

作者: dhpbj 时间: 2015-8-1 18:18

可是要用5ML血提的话KI方法就很繁琐了啊！
最近也在用酚氯仿法提DNA，可不是没结果就是产量特别少，我做了好多次了，不知道是什么原因，很崩溃，哪位前辈可以帮帮我吗？

作者: iii_ii 时间: 2015-8-1 18:19

不要低估盒子，有些问题还是操作的问题。
整个基因组在吸附柱洗脱很难，需要很长时间。酚氯仿提取法，不用洗脱，加水直接溶解。
采取吸附柱，需要把基因组打碎成片断，才容易洗脱。柱提，纯净，含杂质少，不影响后续操作，是其优势。
推荐一款不用蛋白酶K的快提方法，20分钟提取高纯度的基因组DNA
cuturl('http://www.galaxybio.net/NewsShow.asp?id=26895')

作者: greenbee 时间: 2015-8-1 18:19

按你们的方法做出来了，呵呵

作者: zhihui小新 时间: 2015-8-1 18:19

这么简单的实验就是不买盒子也能做的很好~

作者: chengjie79 时间: 2015-8-1 18:20

我们用的全血试剂盒很好用

作者: chengjie79 时间: 2015-8-1 18:20

华因康的血液DNA提取试剂盒，很好用

作者: niangao1980 时间: 2015-8-1 18:20

我是个新手，最近老板要我自己提人类基因组的DNA，手提法好呢还是试剂盒提好呢？试剂盒的话用什么试剂盒比较好呢？求高手指导？

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