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标题: 【求助】提RNA过程影响纯度和质量的关键是否... [打印本页]
作者: H2O    时间: 2015-8-3 10:56     标题: 【求助】提RNA过程影响纯度和质量的关键是否...

用TRIZOL作用20分钟后,转裂解液入EP管,加入1/5体积氯仿, 剧烈振摇30秒,静置15分钟后,准备上离心机12,000 RPM之前,观察各EP管TRIZOL与氯仿分层情况, 发现很多管TRIZOL 与氯仿分层都不明显; 而只有1管分层明显; 提RNA结果分层不明显的管RNA比值都在1.3左右,而分层明显的管比值在2.0.这个对比说明什么问题呢?操作有什么技巧吗?提RNA的得率和纯度总是不稳定,有时高,有时低,而我们科室有个师姐每次提的比值都在1.9-2.0左右,原来看她提过一次,但也分析不出和用TRIZOL作用20分钟后,转裂解液入EP管,加入1/5体积氯仿, 剧烈振摇30秒,静置15分钟后,发现很多管TRIZOL 与氯仿分层都不明显; 而只有1管分层明显; 提RNA结果分层不明显的管RNA比值都在1.3左右,而分层明显的管比值在2.0.这个对比说明什么问题呢?操作有什么技巧吗?提RNA的得率和纯度总是不稳定,有时高,有时低,而我们科室有个师姐每次提的比值都在1.9-2.0左右,原来看她提过一次,但也分析不出和我的步骤有什么关键差别,现在我想,是不是差别主要在前边这几步呢?因为蛋白只会在TRIZOL和氯仿这两步除去,如果这两步效果差,那最后肯定有很多蛋白掺杂,导致纯度低.大家都是怎么做的呢?请讨论一下吧.
我的分析:
1 TRIZOL去蛋白水平不行; 可是以前还好啊,TRIZOL是前三个月前订的,应该不会失效这么快.
2 TRIZOL未充分裂解,加入TRIZOL后我就用枪吹打数次, 然后间断振荡, 不知大家怎么做的?到底该怎么让其充分裂解呢? 要是提组织RNA呢?怎么让TRIZOL充分裂解组织呢?
3 氯仿去蛋白水平不行; 可是以前还好啊,氯仿作为萃取溶剂,应该不存在污染失效的问题吧.
4 氯仿未充分与裂解液作用, 可是我剧烈振摇30秒,应该可以了吧?
5 加入氯仿静置时间短,导致分层不明显:同样10管,我都放了15分钟,有一管分层明显,就能够说明时间够了;
6 加入的组织过多?导致TRIZOL不能完全消化?我一般加入的组织是黄豆大小,加1毫升TRIZOL裂解,研磨消化完全后,加入氯仿,这样应该不会有问题呀?
作者: xevin    时间: 2015-8-3 10:57


为什么不离心呢？12000转 15分钟！RNA的提取涉及到每一步，应该按照规程做才能保证结果有效。
作者: H2O    时间: 2015-8-3 10:57


离啊,我的意思是说,氯仿离心之前观察一下分层情况,可能有助于判断RNA纯度;
可能没表达清楚,再改过了,请大家看看
作者: am10    时间: 2015-8-3 10:58


我也不是很清楚是否在离心前观察分层的情况意义很大
不过的确存在有时侯 提的好,有时后提的差,个人认为和组织或是细胞的量关系挺大的
作者: H2O    时间: 2015-8-3 10:58


纯度与组织或是细胞的量确实相关,不过前提是TRIZOL加的量少;

如果加与组织或细胞相适应的TRIZOL量就可以充分裂解,去除蛋白了
作者: gmt    时间: 2015-8-3 10:59

我也碰到这个情况，以前提得都挺好，加氯仿振摇，离心前看到明显分层，但后来做的都无明显分层，离心后上清也少，仔细回想分析也不知是何缘故。
作者: qianqin1977    时间: 2015-8-3 10:59


我也遇到类似问题，无明显分层，或离心后上清很少，会影响RNA提取结果吗？我也认为与细胞数量有关系。
作者: ending    时间: 2015-8-3 11:00

请问你提取的是细胞的还是组织的RNA吗？
如果是细胞我们的做法一般是加入1ml TRIZOL到EP管后，振荡，然后再冰上放置15－20分钟左右，后面就加0.2ml的氯仿，振荡器上剧烈振荡30秒，室温放置2、3min，再冰上放置20分钟，一般都可见到分层的，然后12000 离心20min，取上清，加等体积异丙醇-20度过夜，然后再12000 离心20min，去上清，加预冷的75％乙醇吹打漂洗，7500 离心10min，再去上清，晾干至半透明，加无RNA酶的水溶解。
如果是组织的，我们一般是取100mg的组织，加入1ml TRIZOL到匀浆管中，充分匀浆（冰上）至肉眼看比较均匀为止，大约1-2分钟吧，然后室温放置2、3分钟后，再加0.2氯仿，振荡，后续步骤就是一样的了。
每次做我们都可以看到明显的分层，如果是组织的，我们做的比较多些，第一次离心后一般可以取到500－600ul的上清的。我们实验室一直是这样做的，比值基本都在1.8-2.0左右。
我觉得TRIZOL和氯仿失效的可能性不大，由于我们的实验经费有限，有时我们用的都是师兄师姐剩下的没用完的TRIZOL，买来都有1年多的时间呢，一直在4度放着的，我做过提出的RNA也没有问题。
作者: 2541    时间: 2015-8-3 11:00


我在提取外周血单个核细胞RNA的时候也是出现RNA纯度不高且不稳定的情况，我用的是国产的Trizol，同样加1ml，加样器吹打1分钟（每次都吹得我手痛！），转移至Ep管，室温放20分钟，加氯仿200ul，剧烈振摇1分钟，冰上放置15分钟，每管均可见分层，故个人认为吹打是否充分和放置时间对RNA提取有影响；离心后可得上清600ul左右；再经异丙醇和75%乙醇处理后，1%琼脂糖电泳可见清晰28s和18s带，但RNA比率经常在1.3-1.6左右，我也为此苦恼，且下面的RT过程进行的并不顺利，连内参也扩的很淡，有大虾可否告我，我提的RNA有蛋白污染的话，对RT过程是否有影响？国产的Trizol是否提取效果不好？
作者: vvmmoy    时间: 2015-8-3 11:00


我的经验是，从组织中用TRIZOL提RNA时组织的量并不是越多越好，在一定范围内是正好相反。我曾经做过对比，同一块组织经匀浆后做一定稀释，分别取50、100、150、200ul匀浆液提RNA做反转录PCR，除了组织的量不同外其它条件都一致，结果只有50ul的样品扩出了所需要的目的片段，经克隆测序验证正确。
作者: u234    时间: 2015-8-3 11:01


1000000个细胞可以提出RNA吗？我提外周血单核细胞的，每次加异丙醇沉淀时可见到一层浑浊，但到最后测RNAOD值时就出现负值来，是降解了还是什么原因？
作者: 2541    时间: 2015-8-3 11:02

我觉得提RNA的关键是Trizol的量要足，一般是10*6~10*7细胞加1ml Trizol，细胞数太多，Trizol的量相对就不足，裂解不完全，影响RNA的质量。一定要充分吹打混匀直至溶液澄清！！这时可以加氯仿往下做，也可以放在－20℃下冻存起来，到需要时再往下做，我放过一个多月再提RNA还是好的。另外加氯仿后要充分振荡混匀呈乳状，然后在室温下静置3~5分钟再去低温离心，分层都很明显，一般都有500~600μl的水相。后面的步骤就是沉淀、洗涤的过程了，最后用DEPC水溶解，按照程序来就ok了！加入异丙醇后也要在室温下静置10分钟再去离心比较好，也有的说在－20℃下静置，我试过，差不多，我感觉在室温下效果还要好一些！
作者: whitesheep    时间: 2015-8-3 11:05

您指的“匀浆后做一定稀释”，是从匀浆后的裂解液中取50、100、150、或200ul出来吗，那么用什么稀释它呢？稀释到多大体积，加多少体积的氯仿呢？
另外1ml的裂解液取多大的组织块最好？说明书是50-100mg，我觉得这个范围还是大些？如果大家有这方面的经验，恳请指教！！！

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我的经验是，从组织中用TRIZOL提RNA时组织的量并不是越多越好，在一定范围内是正好相反。我曾经做过对比，同一块组织经匀浆后做一定稀释，分别取50、100、150、200ul匀浆液提RNA做反转录PCR，除了组织的量不同外其它条件都一致，结果只有50ul的样品扩出了所需要的目的片段，经克隆测序验证正确。
作者: mickeylin    时间: 2015-8-3 11:06


我觉得,提取RNA正如southern 战友所说的Trizol的量要足,特别是一些含内源性RNA酶丰富的组织如肝脏、脾脏和胰腺,如果Trizol的量不足将很难彻底抑制RNA酶,也不利于RNA的提取;还有对于那些胞浆蛋白丰富的可以适当增加氯仿的用量,能使中间的分层很明显,我有时加0.25~0.3毫升的氯仿,结果也挺好的;在吸取上清水相时我觉得一定要将移液器吸咀贴离心管壁轻吸,防止吸入蛋白成分.
加异丙醇的量我们一般和前面吸取的水相大概是1:1的比例,比如吸取0.5毫升水相就加0.5毫升的异丙醇.
反正主要还是要小心操作防止RNA酶污染,特别是从氯仿和异丙醇以后的步骤,因为这时的RNA已没有了保护.
作者: www.1    时间: 2015-8-3 11:06


我觉得上面的上面的师兄说的很好,"在吸取上清水相时我觉得一定要将移液器吸咀贴离心管壁轻吸"。
我现在试着从骨骼肌组织提RNA，跑电泳点样孔附近无明显亮带可见，但OD值始终在1.3-1.5,说明还是有蛋白或酚等污染对吗？
虽然琼脂糖电泳可见清晰三条带，无smear降解片状影出现，但5s最亮，28s最暗，逆转录后PCR也没有产物。我想可能就是RNA中混有了蛋白或酚，影响了逆转录过程，对吗？
最后用乙醇洗涤的步骤，是不是和OD值偏低也有影响？因为用异丙醇沉淀后，rna已成胶状沉淀，加乙醇后用不用轻弹管壁至RNA完全溶解后再去离心？
请多指教，谢谢！
作者: mickeylin    时间: 2015-8-3 11:07

我现在试着从骨骼肌组织提RNA，跑电泳点样孔附近无明显亮带可见，但OD值始终在1.3-1.5,说明还是有蛋白或酚等污染对吗？
虽然琼脂糖电泳可见清晰三条带，无smear降解片状影出现，但5s最亮，28s最暗，逆转录后PCR也没有产物。我想可能就是RNA中混有了蛋白或酚，影响了逆转录过程，对吗？
最后用乙醇洗涤的步骤，是不是和OD值偏低也有影响？因为用异丙醇沉淀后，rna已成胶状沉淀，加乙醇后用不用轻弹管壁至RNA完全溶解后再去离心？
请多指教，谢谢！
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一般来说,提取的RNA OD值偏低可能混有蛋白污染,RAN实际上在酒精洗涤时是不溶解的,应该看到的是白色沉淀,洗时我觉得应该把轻弹管壁弹能够充分洗涤.
逆转录后PCR没有产物的原因很多,不知道你有没有同时跑内参,如果能跑出内参说明你的反应体系是好的;有的RNA有轻度降解时照样能跑出内参， 但对于目的基因特别是长片段及表达不高的就困难了,能否跑出目的基因还要看退火温度,退火温度不合适,也跑不出,当然引物也有关系.
作者: milkdog    时间: 2015-8-3 11:07


我观察到氯仿异戊醇很容易从TIPS上滴落一滴，就这一滴很容易部分层
在加一滴后一会就分层
作者: langlang    时间: 2015-8-3 11:08

提RNA两个步骤最关键：一是组织的量和在TRIZOL中的溶解程度。100mg/1MLTRIZOL足够了。关键在于敲碎组织（一定要注意在室温中不要太久，期间可在液氮中冷却一下）和反复吹打组织块，使组织块反复通过枪头，直止看不到组织块，这个过程需要几分钟，看熟练程度了。这一步主要是保证有足够的RNA融出，保证量。第二，在加过氯仿离心吸取上清时，千万不要搅动中间的白色DNA膜状物。可50ul50ul地贴壁吸，大概总量在500UL，不要贪多，最后一下坏了一管，少50U，少不了多少RNA，这一步是保证质量。其实做的不够好是因为许多细节没有注意到。LUCK！
作者: woshi    时间: 2015-8-3 11:08


提RNA确实是有很大的操作差别的，不同人做的结果就算是同一试剂，同一材料，同时做都有可能结果差别很大。对于影响结果的原因有：
1.Trizol试剂的问题，因为Trizol里面有酚，而酚是会挥发的，所以试剂保存时间不能太长，尽量避免在较高温度条件下敞口放置。（我实验室一哥们把新订的Trizol室温放置了一个晚上，后来用就不太好了）
2.操作上的问题：1）裂解细胞时一定要把细胞轻轻吹打分散开，不要有成团的，但也不可使劲吹打；2）加入氯仿后的振荡很关键，要是votex的话就过于剧烈了，应该用手使劲的上下左右振荡，这样既能尽可能的把RNA萃取出来，又最大限度的避免了基因组DNA的污染。
基本上主要的影响就是这些了，一般注意了这些就可以得到较好的重现性了。
作者: whitesheep    时间: 2015-8-3 11:09


那如果组织用超声细胞仪粉碎和用匀浆有区别吗，超声粉碎会切断RNA吗
作者: zzzz    时间: 2015-8-3 11:09

我觉得提RNA的关键是Trizol的量要足，一般是10*6~10*7细胞加1ml Trizol，细胞数太多，Trizol的量相对就不足，裂解不完全，影响RNA的质量。一定要充分吹打混匀直至溶液澄清！！这时可以加氯仿往下做，也可以放在－20℃下冻存起来，到需要时再往下做，我放过一个多月再提RNA还是好的。另外加氯仿后要充分振荡混匀呈乳状，然后在室温下静置3~5分钟再去低温离心，分层都很明显，一般都有500~600μl的水相。后面的步骤就是沉淀、洗涤的过程了，最后用DEPC水溶解，按照程序来就ok了！加入异丙醇后也要在室温下静置10分钟再去离心比较好，也有的说在－20℃下静置，我试过，差不多，我感觉在室温下效果还要好一些！
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完全赞同。组织量令少勿多
RNA提取少不怕，就怕DNA污染
作者: zzzz    时间: 2015-8-3 11:10

请问加异丙醇后,需要混匀吗?
作者: xyw5    时间: 2015-8-3 11:10


请问：你们题mRNA时用的时那的EP管，在12000转时，出现破裂现象没？请问在那能买到好质量的EP管或者离心管？
作者: woshi    时间: 2015-8-3 11:11

我一直用国产的离心管，但也没有你说的那种情况，我认为你那肯定是本管有裂隙等，你应该也是偶尔出现的吧。
作者: woshi    时间: 2015-8-3 11:16

加异丙醇后来回颠倒几次即可，不需特殊方法混匀
作者: 33号    时间: 2015-8-3 11:17


今天折腾了一下午，没提出来。郁闷。可能太少了
作者: 33号    时间: 2015-8-3 11:17


我的是冰冻在培养瓶的细胞，加入TRIZOL后我就用枪吹打数次, 然后间断振荡, 不知大家怎么做的?到底该怎么让其充分裂解呢?时间久了会不会不好啊？
作者: gmjghh    时间: 2015-8-3 11:18


我主要做血浆的，加入TRIZOL后用枪吹打数次混匀，加入氯仿后上下颠倒数次就可，千万不可VORTEX,很容易不分层，再离心时间长也白费
作者: gmjghh    时间: 2015-8-3 11:18


给大家介绍用molecular research center 的TRI系列，比invitrogen的好的多，据说invitrogen是向它买的
作者: 2541    时间: 2015-8-3 11:19

有时,提取一瓶细胞的RNA,用2ml Trizol,然后分2个EP管,同时做,但只有一管做出来,操作都是一样的,不知为什么.
作者: dhpbj    时间: 2015-8-3 11:19

兄弟我最近在做有关脾脏组织的RT－PCR，在提取RNA的过程中几乎试遍了所有的RNA提取试剂，有一些经验与大家分享，脾脏组织的RNA提取采用TRIPURE最好，结果稳定，比值一般都在1.9－2.0左右，RNA电泳三条带清晰，而且即使5S带较亮不会影响PCR结果。脾脏组织在匀浆的时候很麻烦，一定要匀浆完毕后液体不能起丝（即匀浆棒取出时看不到明显的粘丝状），我也曾试过用超声细胞破碎仪进行匀浆效果不好，感觉RNA都被打断了，RNA电泳时只有5S带。我感觉RNA提取的关键在于匀浆这一步，其它步骤按说明书即可，最后的75％酒精洗涤最好2次。
作者: ending    时间: 2015-8-3 11:20


各位高手，有没有提取胰腺rna成功的，介绍一下经验，我都做三个月了，每次提取出来的都是一条降解带带，od值在1.5左右，今天下午我换肝组织试了一下，出来的rna三条带非常清楚，应该说明我的试剂、手法没什么问题吧，可为什么换了胰腺就提不出来呢，超级郁闷，再这样下去我快熬死了！
作者: mickeylin    时间: 2015-8-3 11:22

最近也抽提了一次肾系膜细胞RNA,但是以失败告终！
把我失败的教训说一下哈：
细胞数量太少！我用的是5cm*2的培养皿，先用胰酶消化细胞，PBS终止消化，离心，再用PBS吹打，离心。弃上请，加入1mlTRIZOL，吹打一分钟。然后放入-80保存过夜。（因为时间关系，第二天中午接着做的），加入氯仿0.2ml，混匀，室温放置三分钟，四度离心，转移上层水相，加入等体积的异丙醇，离心，再加入75％的乙醇，离心。发现没有白色沉淀！
指导老师说是因为细胞数太少了，各位大侠有什么高见，请指导一下吧！
作者: tudou85    时间: 2015-8-3 11:22

提了几次RNA，都遇到同一个现象。用75%酒精洗涤时，白色沉淀全部溶解，怎么离心也见不到了。最后离心十分钟，仅剩一点液体。加20ulte后跑电泳，可见三条带。od260是0.020，280是0.140。可以做rt吗？稀释倍数是1000倍
作者: remenb    时间: 2015-8-3 11:23



QUOTE:
原帖由 tudou85 于 2015-8-3 11:22 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
提了几次RNA，都遇到同一个现象。用75%酒精洗涤时，白色沉淀全部溶解，怎么离心也见不到了。最后离心十分钟，仅剩一点液体。加20ulte后跑电泳，可见三条带。od260是0.020，280是0.140。可以做rt吗？稀释倍数是1000倍 ...

0.02/0.14？od260是0.20吧！如果是应该可以做！
一般来说加入75%酒精时我遇到过两种情况：1.RNA沉淀不溶解，吹打后仍然见到小碎片。这种情况一般OD值都很好1.8－2.0，而且RNA浓度很高，一般有50ug以上。RT－PCR也没问题。2.RNA沉淀在加入75%酒精后沉淀肉眼不可见，这种情况下，实验的结果很不稳定。个人认为还是肉眼可见沉淀较好！
另外我认为加入TRIzol的量很重要，一般做细胞的抽提，细胞数不需要10*7,也很难有这么多！所以TRIzol我只加0.75ml，氯仿相应减少为0.15ml效果很好！加入氯仿之前室温静置就可以。异丙醇和75%酒精一定要预先冷冻处理！祝大家好运！
作者: H2O    时间: 2015-8-3 11:23

我做od时稀释倍数是1000倍，这样算下来总的rna量在16ug。细胞数用了铺满的19cm的培养瓶。电泳发现加样孔有红色荧光。说明有DNA污染。操作时很小 心的。怎么避免呢？



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