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标题: 【转帖】【分享】realtime 咖啡屋 [打印本页]

作者: 园丁## 时间: 2015-8-3 18:12 标题: 【转帖】【分享】realtime 咖啡屋

咖啡者，香甘醇酸苦五味俱全，原始而又粗犷，深邃而又耐人寻味。
早期“科学咖啡馆”的雏型为J.J.汤姆森在19世纪末建立的卡文迪许物理学会，科学家每天午后茶时漫谈，他们谈他们看到、听到、测试、观察到的现象和发生的事件。卢瑟福在领导这个实验室时把午后茶漫谈变成他领导的科学家们每天最重要时刻。后来传于世的剑桥风格——“在悠闲中治学”、“自由和独立的工作”便源于此。
卡文迪许实验室为国际顶尖实验室，在物理、分子生物学方面培养了20多位诺贝尔奖获得者，和数以百计的优秀科学家，被誉为"现代物理学的发源地"。
PCR版开此咖啡吧，绝非奢望能望顶尖实验室之项背。PCR版只是希望借咖啡之名，网络广大战友，一同来畅谈实验经验、实验感受和实验生活。既能探讨科学，又能交朋访友，岂不快哉！
然而无规矩难以成方圆。PCR版就咖啡吧的发贴规定如下：
有以下情况者优先加分（1～3分）：
1. 原创
2.实验经验
3.实验感受
4.实验生活
5.文献阅读后感受或分析
6.反驳战友观点，且有理有据者
7.得票超过5且言之有物者
8.在咖啡屋系列帖子中前10个发贴，且言之有物者
咖啡吧容许争论、异议，但不欢迎漫骂、侮辱和灌水。为了保持园子和谐安宁的学术氛围，有以下情况者，版主保留删贴甚至扣分的权利，还请各位战友体谅：
1. 灌水（类似于纯“顶”、"支持"的帖子归为灌水之列）
2. 有漫骂侮辱性语言者
3.侵权性转贴
4.留email邮箱索要资源者
5.涉及评论国家政策者
6.涉及攻击或赞扬某些生物公司者
现在，请大家开始开始畅谈吧！

作者: yizhi 时间: 2015-8-3 18:13

相关疾病：
头痛先天性卵巢发育不全综合征
非常高兴看到版主在qPCR专区能成立“咖啡屋”,使我们在qPCR方面遇到问题可以相互讨论，互相学习，也便于在实验中的一些经验体会有一个交流的空间，更使我这样的
qPCR初学者多了一个“智囊团”。本人做qPCR的时间不是很长，也就是两个月吧，但其中遇到很多问题，但都一一解决，因为没有多少钱，我做的是荧光染料的PCR，这种方法最重要的一点就是对引物的要求高，我遇到的最头疼的问题就是引物经常不是出现杂带就是出现引物二聚体，温度调整了很多次都不是很好，所以换了三次引物，最后终于把引物试好了，对于引物来说，我觉得最好扩增长度在100-200之间，我们实验室几乎都是在这一范围之内，片段短了容易扩增，但也不是越短越好，如果小于100的话跑电泳可能会出现目的条带和引物二聚体重叠，这样也不利于判断有没有二聚体的存在，所以我建议如果是做染料的qPCR扩增片段最好不要小于100，然而做探针的就不存在这个问题了。扩增片段太短不好，太长也会出现一些问题，如果太长在延伸的过程中就要求延伸的时间长一些，这难免会出现杂带。从一开始做实验，向老师及同学咨询怎么摸条件的时候，他们都说在做qPCR的过程中，退火温度很重要，主要是看退火温度，出现了杂带或者二聚体就调整退火温度，所以我就一直围绕着退火温度来调整，但调了很多次仍然有一杂带，所以怀疑引物不好，但我一直忽略了延伸时间的问题，我的延伸时间用了45秒，感觉是不是太长了，所以就缩减了延伸时间，分别用30秒和25秒跑的，最后都跑出来了，并且杂带也消失了，所以我感觉在试引物的过程中，退火温度固然重要，但延伸时间也不能忽略。
这是我在做实验过程中的一点点体会，拿出来和大家分享，不知其中有没有不对的地方，也请大家给我提出宝贵意见。谢谢

作者: veiwu 时间: 2015-8-3 18:13

1、TaqMan探针法的试剂一般我都是自己配，不用买什么昂贵的专用试剂。用普通的Taq没也能得到很好的效果，Mg一般用4或4.5mmol的浓度。一般不用担心非特异性问题，因为探针法是引物和探针双特异性的，即使有非特异性扩增出现也检测不出荧光来。
2、染料法最好用ABI的试剂，我使用过几家国产的试剂和东洋坊的等消除非特异性扩增的效果都不如ABI的。当然，如果你的引物设计的足够理想的话也可以使用一般的试剂甚至非热启动的试剂都能得到很好的效果。所以引物设计也非常重要。
3、如楼上所说，染料法扩增片段最好不要设计太小，以100-200bp为宜，以方便与引物二聚体区分。
4、关于标准曲线，常见有国内文献说目的基因和内参基因共用内参基因的标准曲线来计算拷贝数的，理由是两条曲线的斜率相近云云。这是一个非常愚蠢的说法，表明此君并不很明白定量算法的原理，数学的指数也没学好。实际上这种做法得到的结果和比较Ct发得到的结果是一致的，可以通过原理来推算，大家也可以用实验数据去验证，不在这里详细解释了。所以要么就做双标准曲线，要么就用比较Ct法来进行定量分析。

作者: zhihui小新 时间: 2015-8-3 18:13

realtime pcr在加样时要比普通pcr更加小心
首先，由于不能做标记，如果是八连管还稍微好一点，样本少。如果是96孔板，最好是两个人一起加，一个人操作一个人监督，这样可以减少误差。当然在加样时不能聊天，分心，这是所有实验的要求。
其次，由于检测时，光是从管顶穿过，所以在盖管子时，一定要戴手套，尽量不要碰到。96孔板封口的时候也尽量要一次性的贴好。
最后，九十六孔板为了减低空泡对检测的影响，可以用离心机甩一下，要专门的离心机，注意要配平。我们一般2000转10分钟。

作者: feiya 时间: 2015-8-3 18:14

我经常做96孔板的Real time，楼上的建议不错，“最好是两个人一起加，一个人操作一个人监督，这样可以减少误差”，哈哈，但是我们如果2个人做的话，一说话更容易错。
根据我的经验，Real time实验最重要的还是实验的一致性，一般都要做2到3个重复，然后得出一个bar来，做得好的话，bar就比较小，从循环数上看，不同的重复误差在0.5个循环数之内。
为了把bar减小，通常要做Master MIX，然后把Primer留在最后加，因为Primer一般情况下是过量的。
另外，加样的时候都统一加到孔壁，最后在离心一下，不过好像没有必要10分钟那么久，2-3000rpm离心2分钟已经足够了。

作者: tianmei001 时间: 2015-8-3 18:14

我们实验室都是用384板做realtime，过程真是很痛苦。而且如果样本rna比较少不能做纯化，就要特别注意基因组dna污染。所以引物设计很重要。一定要保证跨内含子！否则结果是不可靠的。

作者: vvmmoy 时间: 2015-8-3 18:14

前一阶段做q-pcr的心得：我们实验室曾经设计的引物都是三、四百bp的产物，做q-pcr也没什么问题，相信很多人也这样做过，溶解曲线也ms没有什么问题，但前几天突然发现一个比较严重的问题，就是假阴性的结果：
此图中，我的目的产物是500bp左右，由于目的基因在该细胞中表达较少，从q-pcr上分析，两个泳道没有什么差异，但是我将产物取出跑了个电泳，发现还是有差异的，q-pcr所反应的只是总的结合了染料的双链dna的荧光强度，而如果非特异性的产物片段过大，则溶解曲线不能反应出问题。提醒大家注意。

图片附件: 67286493.jpg (2015-8-3 18:14, 50.3 KB) / 该附件被下载次数 5
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=35845

作者: vvmmoy 时间: 2015-8-3 18:15

相关疾病：
先天性卵巢发育不全综合征
在这里再给大家说一个内参的问题。如图，曾经我用的三个细胞系来看某基因在不同细胞系内的表达情况，结果总是很奇怪，后来用普通pcr一看，原来内参差异很大，gapdh和actin差的很多。我的经验是：一般肿瘤体系里，gapdh含量比较大，但是容易受药物和生长状态的影响，所以不推荐使用，而actin表达相对稳定一点，但在不同的细胞、组织里差异又比较大。至于18s，我也琢磨过一段时间，因为有人用，也有人说它没有polyA，不能用于q-pcr，我觉得，是不是在反转的时候不用OligdT而用随机引物就可以了。

图片附件: 45722230.jpg (2015-8-3 18:15, 10.03 KB) / 该附件被下载次数 6
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=35846

作者: txwuyan 时间: 2015-8-3 18:15

500bp，真够长的，我们实验室只试过400多的，还没有人试过500以上的。好像一般都是300一下的比较有保证，400以上成功的几率就大大下降了。

作者: purrr 时间: 2015-8-3 18:15

我是最近才开始做的q-pcr。我在第一次做的时候扩增片段有550bp结果做出来的曲线没有平台期。后来改了引物，扩增150bp。结果立马就好了。扩增曲线正常了。感觉只要做的时候细心点注意把管里面的气泡赶出来也没什么难的。

作者: feiya 时间: 2015-8-3 18:16

小弟最近也一直在做real time,我觉得引物很重要最好能在100到150bp之间，引物要经过软件验证没有发夹结构、二聚体和非特异性扩增，且尽量能够跨内含子，合成引物要是PAGE纯化级别，我觉得这点相当重要，还有就是操作要达到无菌无酶，尽可能大体积上样，两步法时，反转录时随机引物和oligo dT可以一起上，这样有助于得到全长的cDNA。

作者: abc816 时间: 2015-8-3 18:16

我觉得最好扩增长度在100-200之间，我们实验室几乎都是在这一范围之内，片段短了容易扩增，但也不是越短越好，如果小于100的话跑电泳可能会出现目的条带和引物二聚体重叠，这样也不利于判断有没有二聚体的存在，所以我建议如果是做染料的qPCR扩增片段最好不要小于100，然而做探针的就不存在这个问题了

作者: abc816 时间: 2015-8-3 18:16

用普通的Taq没也能得到很好的效果如楼上所说，染料法扩增片段最好不要设计太小，以100-200bp为宜，以方便与引物二聚体区分
小胶质细胞: 由于检测时，光是从管顶穿过，所以在盖管子时，一定要戴手套，尽量不要碰到。九十六孔板为了减低空泡对检测的影响，可以用离心机甩一下，要专门的离心机，注意要配平。我们一般2000转10分钟

作者: abc816 时间: 2015-8-3 18:17

合成引物要是PAGE纯化级别
对于以上的问题我根据我的经验说一下.
1、引物长度我并不觉得100～200是最好的。我们实验室的基本是80多BP，特异性很好。因为，即便是做荧光染料的。引物的特异性要好。可以多设计几对，选实际效果最好的。软件有专门的软件。最好不用P5. 再就是不好区别引物二聚体，说实话，好的引物就不应该出现引物二聚体！！再就是可以通过溶解曲线分析，荧光定量PCR的优点之一就是“不用跑电泳”！！！
2、Taq酶的选择，如果你是做定量用的话，不应该用普通的，要用热启动的。防治没有正式扩增前的本低扩增。
3、盖盖子不要碰，说实话很难盖紧，卡哇伊戴手套盖，其次，放进去后可以用干净擦镜纸或者其他纸或布擦一下。
4、对于处气泡。用大的，可离心酶联免疫板的那种离心机，低转速0.5～1min就差不多了。没必要那么长。
5、对于很多个样，如果条件允许的话可以用“自动加样工作站”。编好加样程序就不会错了。没有的话就要小心了，不能分心。加样的时候一边加一边可以默念样品与八连管的编号，例如：9号样对应2排1号管，就可以念：9对2.1.
6、现在的MasterMix都比较便宜了，比自己配的稳定，重复性好，我觉得买得起定量PCR仪的应该都可以买的起。
7、引物合成，根据我们实验室三四年的经验，按普通引物合成的那种就可以了，高规格的很贵，尤其是TAKARA的，上次跟我说做定量的要4块一个碱基。没那个必要浪费钱。
特异性高才是王道！！！
仅供参考！！
祝：实验顺利！

作者: eor 时间: 2015-8-3 18:18

请教一下“”是什么意思啊？谢谢了小弟想好好再学习一下。
　引物特异性高应该是基础吧，引物的其它限制条件都是建立在此基础之上的，但我还是觉得这是相辅相成的。

作者: abc816 时间: 2015-8-3 18:18

QUOTE:

原帖由 eor 于 2015-8-3 18:18 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
请教一下“”是什么意思啊？谢谢了小弟想好好再学习一下。
　引物特异性高应该是基础吧，引物的其它限制条件都是建立在此基础之上的，但我还是觉得这是相辅相成的。 ...

那些只是想加颜色突出一下，却没有加上。
抱歉我可能没有说清楚！各个条件确实是相辅相成的，谢谢你的提醒。
我想表达的意思是：只要引物设计好（特异性，二级结构、TM值。。。）了，其他的问题就好解决了。
建议：
1、用好点的引物或者探针设计软件：有的师兄是用的P5设计然后用Oligo6。0以上版本验证的。我也是同门师兄，研究生就做定量PCR，毕业了现在在 Bio-Rad 公司（成都）负责整个西南地区的技术支持。他们用的是Beacon Designer的软件设计的。
2、可以多设计几对，反正合成引物也不贵，因为那些东西比较只是软件评估的，跟实际情况还是有很大差别的，而且就算通过Blast比对之后没有同源性的，也有可能产生非特异性带。我们遇到过这样的情况。所以还是要通过实验检测实际的情况。选择比较好的那一对。而且节约实验，如果你设计一对等合成回来要1周，验证不行又要从新设计在合成，还不如一次多设计几对。
祝：节日快乐，实验顺利。

作者: yayya 时间: 2015-8-3 18:19

相关疾病：
46XX性发育睾丸疾病先天性卵巢发育不全综合征
推荐两篇经典qPCR数据统计文献。
METHODS 25, 402–408 (2001)
Analysis of Relative Gene Expression Data Using Real-Time Quantitative PCR and the 2-ddCT Method
cuturl('http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/11846609')
Nucleic Acids Research, 2001, Vol. 29, No. 9 e45
A new mathematical model for relative quantification in real-time RT–PCR
cuturl('http://nar.oxfordjournals.org/cgi/reprint/29/9/e45')
看完后应该就明白为什么qPCR产物要比较短，如果无法设计成比较短的产物，应该如何处理等等。（第一篇google一下篇名能查到，第二篇是免费的）
我觉得做qRT-PCR比常规跑胶传统RT-PCR还要省事，并且不光是省事，更重要的是准确。传统RT-PCR的一些要求在qRT-PCR上照样要求，并且省去了传统RT-PCR的好多要求，如：循环数的选择、上样量的准确、成像条件的一直等等可能干扰半定量准确性的因素，因为这些因素已经在qPCR中不存在了。
建议大家还是看一下qPCR的数学原理和化学原理，从理论上解决问题。
再者，对使用的qPCR仪性能和条件要有一定了解，比如，摄影家虽然对很多照相机都熟悉，但还是用自己熟悉的相机才能拍到好的相片，并且，相机只是工具，关键还是摄影家对摄影的理解。

作者: loli 时间: 2015-8-3 18:19

1，做realtime-pcr的时候好的引物是很重要的，如果引物好的话，就是实验的条件差点也可以做出来。你可以在一些好点的杂志上，如影响因子高的杂志上找别人做的引物去合成，实验成功的机会就会高点，如果没有人做，你可以多合成几个，这样就算一个不好，还可以接着用下一个，不用等合成的时间了。
2，realtime-pcr加样的时候要小心啊，最好在一个没人影响你的地方加样，这样就没有人打扰你了，加样错的机会就会小点，呵呵。

作者: veiwu 时间: 2015-8-3 18:19

也谈谈我的经验：
　　1、CDNA的质量要保证。
　　2、设计引物用primer express。引物跨外显子，引物不形成二聚体－－这一点在用SYBGreen法时很重要。
　　3、先在纸上画好要加样的管的编号，加样时每加一个样可读一下编号来防止误加（少加或多加）。
　　4、不同意Clongene关于加样的观点。加样准确很重要。要用好的枪头。
尽可能保证在内参管里所含的模板量与目的基因中管内的模板量相同。同意
bingsenxu的做法－－最后加引物。
5、上样结束后快速离心一下。
　　6、设运行程序后要确认无误后开始运行。

作者: loli 时间: 2015-8-3 18:19

不知不同意我什么观点？
我只在下面的帖子里面提了一下我的观点。
cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=67&id=10458714&sty=3&keywords=%BC%D3%D1%F9')
我依然依然建议这样的观点：尽量减少2ul以下操作，可以将引物和模板做一定的稀释，加5ul。
20ul体系
引物 5ul
模板 5ul
2xMix 10ul

作者: loli 时间: 2015-8-3 18:20

再说加样
谁都知道加样越准确越好，什么实验也是如此，关键是如何加准确，上面提到一些方式可以借鉴一下。
我觉得加样准不准与操作细节有一定的关系，有时细节直接导致结果的准确性，甚至“细节决定成败”。上面提到的方法基本都可以采用，可以根据自己对实验的理解，建立自己的加样方案，个人习惯而已。
我的几点建议：
1、上面提到的减少2ul以下操作，引物和模板做一定稀释后，可以根据自己的摸索的加样量，可以加3ul、4ul、5ul等，总比你取2ul以下好，只要终浓度是你想要的浓度即可。
2、固定使用移液器，虽然都是20ul的移液器，可能会有细微的差别，减少不同批次之间的差异，使结果更加准确。
3、取液体时，先在液体里面吸打一次液体，类似润洗作用，虽然进口枪头挂壁低，也不是没有挂壁的。对同一枪头吸取多次液体尤为重要。所以枪头是不是进口的并不重要，重要的是每一次、每一批加样量一致。
4、移液器要按照规范操作，尤其是调整刻度时，都要遵循由大到小调。
是不是加到管壁上，不同的人看法不一致，我都是加到管壁上的，不喜欢可以不这样操作，呵呵。
个人经验，供大家参考。

作者: shkudo 时间: 2015-8-3 18:20

楼上说的比较详细，也挺规范，不过我有些偷懒，所有孔都不润湿算了，一次做那么多样要加工，润湿麻烦了点，哈哈
3、先在纸上画好要加样的管的编号，加样时每加一个样可读一下编号来防止误加（少加或多加）。
这个办法挺好，我想试试，不过又怕说话唾沫星飞进加样板，不知道有没有更好的办法呀

作者: 555444 时间: 2015-8-3 18:20

如果仔细观察的话，有的PCR加样板上横排标有"1、2、3、4、5……"，竖排标有"A、B、C、D、E……"。我经常用Marker笔将它们涂上颜色，然后用酒精洗掉多余的颜色，那些标记就露了出来。
加样之前，先想好每一个PCR管加什么样；加样的时候在心里默念"A1、A2、A3、A4、A5……”。精神要集中，不然象数羊一样，一不小心就睡着了，呵呵。而且这时谁找我说话我都当没听见，不然一打岔，数到哪都不知道……
如此操作，经常几十、上百个的加样，倒还能得心应手。

作者: october7 时间: 2015-8-3 18:21

不知不同意我什么观点？
传统RT-PCR的一些要求在qRT-PCR上照样要求，并且省去了传统RT-PCR的好多要求，如：循环数的选择、上样量的准确、成像条件的一直等等可能干扰半定量准确性的因素，因为这些因素已经在qPCR中不存在了。
不同意上样量的准确在qPCR中不存在这个观点

作者: bring 时间: 2015-8-3 18:21

原理如下:
The assay takes advantage of an environmentally sensitive fluorescence dye, such as Sypro Orange, and follows its signal changes while the protein undergoes thermal unfolding. When Sypro Orange is added to a properly folded protein solution, it is exposed in an aqueous environment and its fluorescence signal quenched. As the temperature rises, the protein undergoes thermal unfolding and exposes its hydrophobic core region. Sypro Orange then binds to the hydrophobic regions and becomes unquenched. This will result in the increase of fluorescence signal of Sypro Orange.

作者: vvmmoy 时间: 2015-8-3 18:22

如果仔细观察的话，有的PCR加样板上横排标有"1、2、3、4、5……"，竖排标有"A、B、C、D、E……"。我经常用Marker笔将它们涂上颜色，然后用酒精洗掉多余的颜色，那些标记就露了出来。
加样之前，先想好每一个PCR管加什么样；加样的时候在心里默念"A1、A2、A3、A4、A5……”。精神要集中，不然象数羊一样，一不小心就睡着了，呵呵。而且这时谁找我说话我都当没听见，不然一打岔，数到哪都不知道……
如此操作，经常几十、上百个的加样，倒还能得心应手。
......

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我们实验室的那部机只能用八联管，标记比较麻烦，所以我们一般都是先拿张纸写好顺序，然后在八联管的一头写上编号，这样就不会混了。关于盖盖子的问题，我们一贯的做法是戴一新的薄膜手套来按压盖子，千万不能用胶手套，因为它上面有一层粉，很容易弄到盖子上面去，影响实验。
同样加样的时候坚决不跟人说话，这点很重要，不然很容易出错的。枪头个人认为还是进口的比较好，相对准一些，想想那些试剂那么贵（一个Mix，5ml就三千多），比起来枪头便宜多了，如果因为枪头的问题，浪费了其他试剂，不是更不划算。吸试剂之前要先看看枪上的刻度是不是自己想要的，吸的时候一定要慢，打的时候一定要一口气打到底，不然那么少的东西很容易就粘在枪头上打不出去。

作者: cbou876 时间: 2015-8-3 18:24

不知道有没有做多重荧光定量PCR (Taqman探针法的)，如果有的话，可以交流下。

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