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标题: 【求助】pcr引物二聚体条带很亮，没有目的条带 [打印本页]

作者: 987789 时间: 2015-8-5 15:18 标题: 【求助】pcr引物二聚体条带很亮，没有目的条带

各位战友，我做pcr扩增700多bp的条带，退火温度59°，延伸时间1分30秒，引物二聚体很亮，没有目的条带，不知道是怎么回事，我的引物碱基长度是26个bp.marker的最后一条是100bp

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作者: H2O 时间: 2015-8-5 15:19

会不会引物都结合成二具体了所以没有扩增出目的片断啊

作者: 987789 时间: 2015-8-5 15:19

引物我用oligo评价过，还可以啊，也在NCBI上blast过啊，应该没问题，现在就是说都是二聚体，没有目的条带

作者: youyou99 时间: 2015-8-5 15:19

我的情况和你一样，是不是要换引物呀，可我的引物是Takara设计的，后来我也Blast一下，也正确，不知道为什么就P不出来目的条带，真的很郁闷

作者: 987789 时间: 2015-8-5 15:20

此问题是常见的PCR无结果，建议楼主在本板块内搜索，有很多类似的帖子。
原因无外乎：
1. 退火温度设置不合理，采用梯度PCR可进行改进。
2.模板问题，如模板降解，浓度过低。
3.试验操作问题，操作不熟练。
4.机器问题，现在越来越多的问题好像是PCR仪的问题，呵呵
5.引物问题应该很小，有如此明显的2聚体，说明无降解，重新合成暂时无必要~

作者: 987789 时间: 2015-8-5 15:21

我退火温度59°，按照引物合成报告单上进行，
模板我扩增其它的目的基因是没问题，应该没有降解
实验操作熟练度话和机器应该还可以，其它的都能扩出来
我现在继续在扩，改变了一下条件，等出来结果看看

作者: 987789 时间: 2015-8-5 15:21

今天把引物浓度降低为终浓度0.5uM，可能以前浓度加的太多了大概今天的十倍，今天扩的到时没有引物二聚体了，但是又出来了非常亮的非特异性条带，不知道为啥么？我退火温度60° ，延伸时间为2min, 30循环

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作者: mickeylin 时间: 2015-8-5 15:22

有如此强烈的非特异条带，而目的条带如此之弱，可以试着添加辅剂，如10%DMSO以增加特异性。
楼主既然blast过，特异性结果如何？如果很好可以试着改进条件，如果不佳，尽快换引物~

作者: 987789 时间: 2015-8-5 15:22

但是阳性对照特异性还可以丫。这是比对的结果。

[ 本帖最后由 987789 于 2015-8-5 15:32 编辑 ]

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作者: ujne 时间: 2015-8-5 15:32

我也遇到同样的结果，内参照很亮很干净，可是没有目的条带，只有很亮的引物二聚体。以前同样的条件P出来过，为什么现在出现这样的结果？明天该怎么改进？求教！

作者: txwuyan 时间: 2015-8-5 15:33

你先看下设计，可能不太好，如能确定这个亮的是杂带，那就提高温度吧，一般小的杂带是比较麻烦点。你的阳性也有两条哦。还是看看设计吧！还有这样的BLAST结果什么都不能说明的！

作者: 987789 时间: 2015-8-5 15:33

今天又跑了，退火温度由60°升为62°，好像非特异少了一条。但是非特异还是比特异的亮

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作者: 987789 时间: 2015-8-5 15:35

我可以可以把目的条带切胶回收后再扩啊

作者: ujne 时间: 2015-8-5 15:36

目的条带很弱，不知道回收结果怎么样，可以不回收，直接当模板做一下。

作者: bring 时间: 2015-8-5 15:36

老兄你的问题现在解决了吗？我现在也遇到你这种问题了，引物二聚体条带特亮，就像你的一样，我得引物tm值是59.97，我跑过60和57度的结果和你的一样，引物是20um的，延伸1min

作者: 987789 时间: 2015-8-5 15:37

QUOTE:

原帖由 bring 于 2015-8-5 15:36 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
老兄你的问题现在解决了吗？我现在也遇到你这种问题了，引物二聚体条带特亮，就像你的一样，我得引物tm值是59.97，我跑过60和57度的结果和你的一样，引物是20um的，延伸1min ...

可以考虑减低引物的量，降引物终浓度05uM

作者: bring 时间: 2015-8-5 15:37

首先谢谢师兄的回复，我用的引物是稀释到20um的然后在20ul体系里面加0.8或1ul的，该是1um吧

作者: tudou85 时间: 2015-8-5 15:38

你可做一个梯度PCR，这样可以把退火温度的范围扩到10度左右，比如56℃～66℃或者60℃～70℃之间，如果还是没有结果，那么应该不是退火温度问题，可能是引物本身的问题。另外，体系要合理，特别是Mg与Taq的量过大，好像也可能扩非特异性条带的。细节也要注意，包括严格处理所用的管与枪头，加样准确，在干净的环境中加样，等等。

作者: bs4665 时间: 2015-8-5 15:38

多谢！呵呵!我得引物是从文献上找到的他能扩的出来按理我也应该可以把

作者: jude 时间: 2015-8-5 15:38

建议重新设计引物，没必要再做太多无谓的尝试

作者: cj_mondy 时间: 2015-8-5 15:39

建议做个巢氏PCR.

作者: greenbee 时间: 2015-8-5 15:39

支持楼上，重新设计引物

作者: toy 时间: 2015-8-5 15:39

我做的是一氧化氮合酶，不知道有哪位做过啊，你们跑出来没有啊，如果方便的话可不可以告诉我你用的引物序列呀？

作者: zbboom 时间: 2015-8-5 15:40

我也遇到了同样的问题，条件和引物浓度等是按照师姐做过的条件做的，以前师姐做出来过可现在我试了好几次了都是只有很亮的引物二聚体的条带哎很是郁闷不知道该从哪里重新做

作者: bs4665 时间: 2015-8-5 15:40

你好战友
我也遇到你的情况，，然后进行了降低引物浓度到0.4um，结果还是只看到二聚体，只是带暗一点，，就是没有目的呢，能请教下你吗？我的

作者: zhy平平 时间: 2015-8-5 15:41

我和你做的差不多，在100bp以下有很亮的带，不知道是二聚体还是非特异性扩增，麻烦你也帮我看一看？这个的退火温度是58℃

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