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标题: 【求助】荧光定量PCR扩增效率 [打印本页]

作者: 二丫头466 时间: 2015-8-5 15:48 标题: 【求助】荧光定量PCR扩增效率

荧光定量PCR
请问各位高手如何从扩增曲线上看出扩增效率呢？

作者: 1221 时间: 2015-8-5 15:48

引物的扩增效率要做专门的标准曲线里看。在扩增曲线里看不到。

作者: 二丫头466 时间: 2015-8-5 15:49

必须要做标准曲线才能看出扩增效率吗？

作者: cj_mondy 时间: 2015-8-5 15:49

cuturl('http://www.gene-quantification.de/efficiency.html') 多看看文献怎么操作的？

作者: cj_mondy 时间: 2015-8-5 15:49

cuturl('http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2665230/')

作者: 二丫头466 时间: 2015-8-5 15:49

必须得做标准曲线的
计算公式如下：
e=10-1/a-1
e为扩增效率
a为截距

作者: whitesheep 时间: 2015-8-5 15:50

还可以把扩增产物跑电泳，看条带的亮度和粗细，但很粗略，勉强算半定量，要计算具体的扩增效率还是要用标准曲线。。。

作者: 二丫头466 时间: 2015-8-5 15:50

这是我的产物跑的胶，第2到4个道是内参，最右边两个是目的基因，请问这能不能算扩增效率一致呢？

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http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=35926

作者: 二丫头466 时间: 2015-8-5 15:51

从电泳亮度比较扩增效率恐怕太牵强了吧，那还不如看同一个基因的Ct值，对于同一个基因而言，Ct值越小，扩增效率越高，但是只能比较，而不能计算具体数值。

作者: any333 时间: 2015-8-5 15:51

QUOTE:

原帖由 二丫头466 于 2015-8-5 15:48 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
荧光定量PCR
请问各位高手如何从扩增曲线上看出扩增效率呢？

1.是做相对还是绝对定量？
2.绝对定量是必须要。
3.相对定量，如果是delta delta Ct ,可以用1.8来代替2。
4.在最后给出的曲线中，我在SDS中没有找到可以导出原始数值的方法，只可以看到原始的扩增曲线图片，这个很难得到像文献中可以算出扩增效率的。

作者: 二丫头466 时间: 2015-8-5 15:52

谢谢各位战友，是做相对定量的。

作者: any333 时间: 2015-8-5 15:53

这是我的产物跑的胶，第2到4个道是内参，最右边两个是目的基因，请问这能不能算扩增效率一致呢？

......

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1.这个是终点的结果，而且用OD值存在着信号非线性放大，不能直接用这个来比较。

作者: qhyu 时间: 2015-8-5 15:53

扩增效率这个词是用来形容引物和模板结合及pcr反应的效率的。是反应本身的特质。
你的这个图里还有不同来源样品里模板量的差异。所以最终的结果是扩增效率和不同来源模板之间差异的综合结果。
所以是不能判定扩增效率，
比如也许你的引物结合也很特特异，pcr条件也不错。
但样品里模板量很少，导致扩增不要出来。这样不能说扩增效率不好。

作者: tudou85 时间: 2015-8-5 15:54

从电泳亮度比较扩增效率恐怕太牵强了吧，那还不如看同一个基因的Ct值，对于同一个基因而言，Ct值越小，扩增效率越高，但是只能比较，而不能计算具体数值。

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嗯，确实很粗略，要算具体值现目前知道标准曲线法。。。等高人解答。。。

作者: any333 时间: 2015-8-5 15:54

QUOTE:

原帖由 tudou85 于 2015-8-5 15:54 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
从电泳亮度比较扩增效率恐怕太牵强了吧，那还不如看同一个基因的Ct值，对于同一个基因而言，Ct值越小，扩增效率越高，但是只能比较，而不能计算具体数值。

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嗯，确 ...

1.没有想到这个问题居然有很多人都在纠结。
2.如果是绝对定量，则是可以根据标曲的斜率来计算。
3.如果是相对定量，相对统一还是可行的。但是如果一定要算出扩增效率也不是不可以。
只要把待测的样品中的一个进行几次稀释，通过计算斜率就可以了，不用非得去作标曲。有兴趣的同学可以用公式来算下，其实高中生的水平就可以得到这个结论的，本质上是把相对和绝对杂合起来，关心斜率。

作者: qianqin1977 时间: 2015-8-5 15:55

我仔细研究了下Roche Lightcycler 480那台PCR仪的说明书，发现其实相对定量分为相似相对定量和准确相对定量，如果做相似相对定量是不需要考虑扩增效率的，它默认各个样本扩增效率都是2.0。这样可以将多个目的基因与同一个看家基因进行比较。

作者: 蒲公英 时间: 2015-8-5 15:55

必须得做标准曲线的
计算公式如下：
e=10-1/a-1
e为扩增效率
a为截距
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a应该为标准曲线的斜率

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