Board logo

标题: 甲基化检测方法（亚硫酸氢盐修饰后测序法） [打印本页]
作者: finger    时间: 2011-8-31 15:07     标题: 甲基化检测方法（亚硫酸氢盐修饰后测序法）

甲基化检测方法（亚硫酸氢盐修饰后测序法） [转自 丁香园论坛]



甲基化是目前的研究热点，就我所做的一点工作并其中一点心得，与大家分享。希望能够对大家有所帮助。
第一部分 基因组DNA的提取。
这一步没有悬念，完全可以购买供细胞或组织使用的DNA提取试剂盒，如果实验室条件成熟，自己配试剂提取完全可以。DNA比较稳定，只要在操作中不要使用暴力，提出的基因组DNA应该是完整的。
此步重点在于DNA的纯度，即减少或避免RNA、蛋白的污染很重要。因此在提取过程中需使用蛋白酶K及RNA酶以去除两者。
使用两者的细节：
1：蛋白酶K可以使用灭菌双蒸水配制成20mg/ml；
2：RNA酶必须要配制成不含DNA酶的RNA酶，即在购买市售RNA酶后进行再处理，配制成10mg/ml。否则可能的后果是不仅没有RNA，连DNA也被消化了。两者均于-20度保存。
验证提取DNA的纯度的方法有二：
1：紫外分光光度计计算OD比值；
2：1%-1.5%的琼脂糖凝胶电泳。
我倾向于第二种方法，这种方法完全可以明确所提基因组DNA的纯度，并根据Marker的上样量估计其浓度，以用于下一步的修饰。
作者: finger    时间: 2011-8-31 15:07

第二部分 亚硫酸氢钠修饰基因组DNA
如不特别指出，所用双蒸水（DDW）均经高压蒸汽灭菌。
1：将约2ugDNA于1.5mlEP管中使用DDW稀释至50ul；
2：加5.5ul新鲜配制的3M NaOH；
3： 42℃水浴30min；
水浴期间配制：
4：10mM对苯二酚（氢醌），加30ul至上述水浴后混合液中；（溶液变成淡黄色）
5： 3.6M亚硫酸氢钠（Sigma，S9000），配制方法：1.88g亚硫酸氢钠使用DDW稀释，并以3M NaOH滴定溶液至PH 5.0，最终体积为5ml。这么大浓度的亚硫酸氢钠很难溶，但加入NaOH后会慢慢溶解，需要有耐心。PH一定要准确为5.0。加520ul至上述水浴后溶液中。
6：EP管外裹以铝箔纸，避光，轻柔颠倒混匀溶液。
7：加200 ul 石蜡油，防止水分蒸发，限制氧化。
8：50℃避光水浴16h。
一般此步在4pm开始做，熟练的话不到5pm即可完成，水浴16h正好至次日8am以后收，时间上很合适。
这一步细节：
1：基因组DNA的量不需十分精确，宁多勿少，因为在以后纯化回收步骤中会有丢失，且此方法修饰最多可至4ug。
2：所有试剂均须新鲜配制，所以配液的技术要过关，既要快，又要精确。
3：亚硫酸氢钠溶液呈强酸性，一定用碱将PH调制5.0，否则PH不合适会影响后续纯化吸收。
4：水浴最好达16小时，虽可以短至8小时，但后者修饰会有不完全。
作者: 不懂    时间: 2011-8-31 15:19

手工修饰么？
学习中！！
请楼主继续！
作者: 爱哭鬼    时间: 2011-8-31 15:20

很有用！希望继续讲下纯化步骤。
作者: 阿福    时间: 2011-8-31 15:21



QUOTE:
原帖由 不懂 于 2011-8-31 15:19 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
手工修饰么？
学习中！！
请楼主继续！  

显然是手工修饰。
作者: finger    时间: 2011-8-31 15:22

第三部分 修饰后DNA纯化回收
EP管如无特别说明均为高压蒸汽灭菌的。
1. 将移液器枪头伸入石蜡油层下，先轻轻加压使其中一小段石蜡油排出，然后吸取混合液至一洁净1.5mlEP管中。
2：以下使用Promega Wizard Cleanup DNA纯化回收系统（Promega，A7280）
1）70℃水浴预热DDW；配制80%异丙醇；
2）加1ml Promega’s Wizard DNA Clean-up resin，轻柔颠倒混匀，使DNA充分与树脂结合；
3）由于该试剂盒中仅配备针筒没有针栓，如果有真空负压吸引器，使用起来很方便；如果没有，需要自备3ml-5ml注射器。将注射器针筒与试剂盒提供的回收小柱紧密连接后，将上述混合物用移液器移至针筒内，用2ml以上的EP管放置小柱下接收废液。加针栓，轻轻加压，将液体挤出，此时可见小柱内有白色的树脂沉积。
4）将注射器与小柱分离后拔出针栓，再将针筒与小柱连接，向针筒内加入2ml 80％的异丙醇，插入针栓，轻轻加压，将异丙醇挤出。此为洗涤步骤。
5）将注射器与小柱分离，将小柱置于洁净1.5ml洁净EP管上，离心12000rpm，2min，以甩去残余异丙醇成分，使树脂干燥。此时，修饰后DNA处于与树脂结合状态。
6）将小柱取下置于另一洁净1.5mlEP管上，移液器加50ul预热好的DDW，室温放置5min。
7）离心12000rpm，20s，此为洗脱步骤，此时EP管内液体即为洗脱的修饰后DNA溶液，终体积为50ul。
3：加5.5ul 新鲜配制的3M NaOH，室温放置15min。
4：加33ul 10M乙酸铵，以中和NaOH，使溶液PH于7.0左右。
5：加4ul 10mg/ml糖原，此作为沉淀指示剂，因为其与乙醇混合后可产生沉淀，便于以后离心后辨别回收物的位置，以防在吸取残余乙醇时将回收物吸走。其实，加入这些糖原究竟能起多大作用，不好说。不过有国产糖原卖，包装不大，也很便宜，买来一用，算严格遵守文献的步骤吧。
6：加270ul 冰无水乙醇，置于-20度，过夜沉淀。有人为沉淀最短可至2小时，但我认为时间长些可能会更好。并且做到此步骤时，一般会到中午，如果样本多的话要到下午，不妨放置过夜，日程可以轻松些，顺便做些其他试验。如果想当天做完，没有问题，但我认为最好多沉淀些时候，至少6小时吧（这是经验，我做过最少6小时，也是可以的，再短就不敢发表意见了）
7：4度，12000rpm离心，30min，倒去上清液，收集沉淀。不必吸净。
8：加500ul 70%乙醇，不要将沉淀吹打起来，只要把乙醇加上即可。轻柔倾斜EP管，旋转一圈，再次离心，4度12000rpm，5min。离心后倒掉上清，再加同量乙醇，同样再做一遍。此为洗涤步骤，共2次。
作者: finger    时间: 2011-8-31 15:22

9：倒掉上清，并常温简短离心后，将附壁乙醇离至EP管底，移液器小心将残余液体吸净，室温干燥5min，或沉淀由不透明变为半透明或透明时，加入20ul-30ulDDW，溶解沉淀。至此，已完成了修饰后DNA的纯化回收，所得为修饰后DNA溶液，可用于此后的进一步实验。
10：-20℃保存DNA溶液。

此步细节：
1：在使用注射器时，一定要用力均匀且轻，如使用暴力，会将小柱内的薄膜挤破，失去作用。
2：乙酸铵、糖原不需新鲜配制，糖原配好后放在-20度保存，乙酸铵室温即可，因为这样浓度的乙酸铵非常难溶，一旦放在4度，取出用时也会有很多溶质析出。
3：异丙醇、70%乙醇都不需要新鲜配制，但如果用量大，现场配也很方便。
此步关键是在树脂与DNA的结合上，这就再次强调第二部分调亚硫酸钠PH值得重要性。因为树脂与DNA结合需要有一个适当的PH，如前一步没做好，此步树脂不能与DNA很好结合，将会带来灾难性后果，即DNA随着液体被挤出了，洗脱时实际已没有任何DNA了。
作者: 花裙子    时间: 2011-8-31 15:23

谢谢楼主，很好的protocol。
请问你的阳性对照用的什么呢？怎么做的继续给大家讲下吧！
作者: finger    时间: 2011-8-31 15:24

第四部分 修饰后DNA用于PCR
这一步也没有悬念。我主要谈一下这里面的几个比较棘手的问题：
1：引物问题：我感觉自己设计引物有相当的难度，我曾设计过几对引物，并且试验了一下，但以失败告终。如果时间充裕、作的又是比较新的基因文献不多，自己设计引物没有问题。如果不是这样，还是参考文献更好些。首先查阅SCI分值高的文献，然后是著名实验室的文献，如果国内有做的，更好了，可以直接联系咨询。查到序列后，一定要和Genbank中的序列进行比对，防止有印刷错误造成的个别碱基的差别。然后再到google上搜一下，看用的人多否，体系条件是否一样。用的人多、体系条件一样，表明可重复性比较强。我也是按此行事，算比较顺利。
2：Taq酶问题：有文献用高保真的金牌Taq（Platinum），但我感觉只要体系正确、变性退火等条件合适，一般的热启动酶是可以的。我开始使用的是Takara的LA Taq，很好用，配有10x含mg++的LA缓冲液。有时候用没了，暂时以Takara 的普通Taq酶也可以。如何选择，可以根据自己的情况。初作者还是用好一点的酶。
3：PCR的条件：变性一般都选择95度，3min。其余我感觉还是根据文献，退火可以根据你的引物的退火温度在小范围内尝试。一般和文献报道差别不大。只是扩增片断特异性的问题。建议根据文献。
4：做PCR的EP管最好选择进口的，壁薄且厚度均匀，这可以保证温度的迅速变化可以及时传递给管内的反应液，使体系真正在所设定的温度下运行。
5：PCR仪：如果在某一个仪器上作出来了，最好一直用此仪器继续。不同的仪器“脾气”也不一样，但EP管必要和仪器内的插孔紧密结合方好，留有空隙，我认为会影响温度的传递。
这一部分有些啰嗦，只是个人一些不成熟经验。有疑问处，请大家指出，交流。今天先到这里，现写一些内容，比较费劲，总是不能一挥而就。望见谅。歇息一会准备写最后蓝白斑筛选克隆这一部分。
作者: finger    时间: 2011-8-31 15:25



QUOTE:
原帖由 花裙子 于 2011-8-31 15:23 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
谢谢楼主，很好的protocol。
请问你的阳性对照用的什么呢？怎么做的继续给大家讲下吧！  

回答：我做的是测序的方法，没有使用阳性对照。只有阴性对照，不加模版。比较顺利的扩出了目的片段，并且经测序证实。查阅文献，此方法也少有阳性对照。如果做MSP，可能是需要的。
作者: 细水长流    时间: 2011-8-31 15:26

楼主你好.谢谢你的帖子,给大家的实验帮助很大.我现在发现在甲基化扩增时,会出现假阳性的情况,该怎样解决呢?
作者: 嗡嗡    时间: 2011-8-31 15:26

楼主对DNA处理完全的概率有多大把握？
作者: finger    时间: 2011-8-31 15:27



QUOTE:
原帖由 嗡嗡 于 2011-8-31 15:26 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
楼主对DNA处理完全的概率有多大把握？

回答：完全按照上述步骤进行的话，修饰时间达16小时，我认为处理完全的概率可在90%以上。仅仅是经验，没有数据支持。
作者: +田田+    时间: 2011-8-31 15:28

请问楼主：我以前做出来过，现在用同样的标本，同样的试剂和退火温度做不出来了，怎么回事啊？现在把退火温度降了六度，还是偶尔能跑出来，引物是参考文献上的，修饰使用的QIAGEN的试剂盒，酶是Takara 的普通Taq酶，因为扩增的片断很短，不知道是哪一步出了问题，到现在都做不出来。请多指教！
作者: 小葵    时间: 2011-8-31 15:29



QUOTE:
原帖由 finger 于 2011-8-31 15:24 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
第四部分 修饰后DNA用于PCR
这一步也没有悬念。我主要谈一下这里面的几个比较棘手的问题：
1：引物问题：我感觉自己设计引物有相当的难度，我曾设计过几对引物，并且试验了一下，但以失败告终。如果时间充裕、作的又是比较新的基 ...

谢谢楼主的protocol,我是初学者,刚接触这部分实验.我在文献上查到了一对引物，但是PCR结果不论是正常组织还是癌组织M带都是阳性,偶尔U区有阳性带,我怀疑是U 引物的问题,现在想验证一下这对引物,但是不知道怎么和Genebank比对,请楼主指教,谢谢!
作者: finger    时间: 2011-8-31 15:30     标题: 回复 #11 细水长流 的帖子

回答：做阴性对照~~~~~~~
作者: 年轮    时间: 2011-8-31 15:30

楼主，你好！我现在也准备做这方面试验，有个弱问题：U引物和M引物是分开P还是同一管P？先谢谢你了
作者: finger    时间: 2011-8-31 15:32



QUOTE:
原帖由 +田田+ 于 2011-8-31 15:28 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
请问楼主：我以前做出来过，现在用同样的标本，同样的试剂和退火温度做不出来了，怎么回事啊？现在把退火温度降了六度，还是偶尔能跑出来，引物是参考文献上的，修饰使用的QIAGEN的试剂盒，酶是Takara 的普通Taq酶，因为扩增的片断很短，不 ...

回答：如果曾经做出来过，提示引物没有问题。由于甲基化的步骤比较多，涉及的因素也会比较多。
首先，您指的“同样的标本”是指未修饰的基因组DNA么？如果是，必然还要进行修饰。我觉得修饰前可以将DNA跑个电泳，重新估计一下修饰的量。
其次，使用试剂盒修饰应该是没有问题，完全按照步骤操作应该结果是稳定的，并且曾经有过结果，表明修饰一定是成功的。在这里比较重要的就是修饰的DNA的量了。我认为还是“宁多勿少”，因为不管紫外方法也好、电泳估量也好，都不是十分精确，尤其前者，有时结果会偏高，按此计算的话，实际进入修饰的DNA可以说微乎其微。我也曾用过试剂盒，不管什么试剂盒都会有纯化回收的步骤，只是方法可能有差别，但只要有这一步必然伴随着或多或少DNA的丢失，因此，如果初始DNA量就少，加上损失的，最后根本没有多少模版可供进一步实验了。
3：再有就是在PCR体系上。必要保证每种成分量的准确性。有书上说，新手之所以不能重复结果，很大一部分原因是由于加样的问题。所以我觉得在配制PCR体系上要保证几ul就是几ul，量要准确。
综上，我感觉主要还在修饰这一步上。
1：基因组DNA量大一些。
2：严格按照操作手册修饰。
3：配制PCR体系时保证各种成分的准确。
再试试，应该没问题的。
作者: finger    时间: 2011-8-31 15:33



QUOTE:
原帖由 年轮 于 2011-8-31 15:30 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
楼主，你好！我现在也准备做这方面试验，有个弱问题：U引物和M引物是分开P还是同一管P？先谢谢你了

回答：分开做好些。我看的文献都是分开的。
作者: finger    时间: 2011-8-31 15:33



QUOTE:
原帖由 年轮 于 2011-8-31 15:30 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
楼主，你好！我现在也准备做这方面试验，有个弱问题：U引物和M引物是分开P还是同一管P？先谢谢你了

回答：分开做好些。我看的文献都是分开的。
作者: finger    时间: 2011-8-31 15:34



QUOTE:
原帖由 小葵 于 2011-8-31 15:29 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')




谢谢楼主的protocol,我是初学者,刚接触这部分实验.我在文献上查到了一对引物，但是PCR结果不论是正常组织还是癌组织M带都是阳性,偶尔U区有阳性带,我怀疑是U 引物的问题,现在想验证一下这对引物,但是不知道怎么和Ge ...

回答：首先要有DNAman这个软件；其次，找到这个基因的Genbank号，一般文献上会提供，在G
作者: finger    时间: 2011-8-31 15:36

如果做测序，请继续往下看。
第五部分 PCR产物的凝胶回收
这一步比较简单，可以购买一个凝胶PCR产物回收试剂盒，国产的就很好、价格也合理，比如TIANGEN的产品（用过）。把切下来的胶按说明书操作即可。
几个细节：
1：PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，要使用新配的电泳液。凝胶浓度1%-2%均可。
2：凝胶DNA回收时在300nm紫外灯下观察条带位置，切取目的片断所在位置的凝胶，尽量小，保证特异性。
3：紫外照射时间不能过长，否则对DNA有损伤。
4：回收后的DNA如不马上用就储存于-20度，在数月内是很稳定的。

第六部分 PCR产物与T载体的连接和转化、蓝白斑筛选
1：连接T载体（本实验使用的是Promega的试剂盒）
15ul体系
T-easy 1ul
Ligase 1ul
2xbuffer 7.5ul
DNA 5.5ul
4度，过夜。  
2：连接产物的转化
1）-70度冰箱内取出感受态细菌，融化后置于冰上；
2）连接产物15ul 全部加入，至于冰上30分钟；
3）42度， 90秒钟；
4）冰上2分钟；
5）800ul LB培养基；
6）280rpm，37度，摇床45分钟（将管放水平了摇，保证菌液摇匀）；
7）8000rpm，1分钟；在超净台内去上清，留100-150ul；
8）涂板：37度孵箱过夜；（板为含有氨苄青霉素的固体LB培养基）
先涂：X-gar 35ul
IPTG 25ul
后涂：混悬液
过夜后可见板上长出很多蓝色或白色斑点，取白色斑点，尤其是蓝色斑点周围的白色斑点，此处自联率较低。
作者: finger    时间: 2011-8-31 15:36

3：取白斑，划种于新板上
新板：先涂：X-gar 35ul
IPTG 25ul
然后于板底划出分区，进行标记。根据需要，一般一板作50个克隆没有问题。
针头挑白斑划2道于板上相应区域内。
37度，孵箱过夜。
4：联系测序公司送测序。一般一个克隆在35-45元。

这一部分的细节：
1：涂板要均匀，保证Xgar和IPTG均匀分布在板面上；
2：不要让蓝白斑长得太满，否则选取克隆时容易一下挑2个。

以上是我实验的全部过程，终于写完了和大家分享，希望对大家有帮助。如有疑问，敬请提出，以便交流。并请不吝斧正。
作者: 阿拉蕾    时间: 2011-8-31 15:37

看了第一、二部分，有个问题提出来与楼主和同道商榷。
“基因组DNA的量不需十分精确，宁多勿少，因为在以后纯化回收步骤中会有丢失，且此方法修饰最多可至4ug”，楼主的这一句话可有依据？据我的经验正好相反，为了保证修饰的质量DNA一定不能多，道理很简单，资源限定了，有多少的亚硫酸氢盐只能对应相应的DNA，实际上1996年PNAS上的那篇经典文章用到的DNA还只有1微克，即使这样也不能达到去甲基化的C完全转化。我自己曾经BSP测序比较过，超过2微克，修饰的不完全现象就比较明显了。不要被加大起始DNA量出带的假想蒙蔽，带是可以出，但是如果没有高质量修饰的保证，出来的带只能误导自己。要提高灵敏度，可以通过减少修饰过程中的DNA损耗以及加大你上样的模版体积来达到。
另外，对于用来修饰的DNA，其实完整性是不用过多考虑的，因为碱变性的过程除了分开双链，打断DNA链也是强烈的，而且楼主用的42度，30分钟很强的碱变性条件了。
下回再分解。
作者: 大猫    时间: 2011-8-31 15:38

请问楼主和tibeteagle，MSP和BSP两种方法中，在PCR扩增之前的DNA提取修饰纯化回收的操作是可以通用的吗？谢谢！我是新手，也许问题比较弱智。
作者: finger    时间: 2011-8-31 15:39



QUOTE:
原帖由 阿拉蕾 于 2011-8-31 15:37 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
看了第一、二部分，有个问题提出来与楼主和同道商榷。
“基因组DNA的量不需十分精确，宁多勿少，因为在以后纯化回收步骤中会有丢失，且此方法修饰最多可至4ug”，楼主的这一句话可有依据？据我的经验正好相反，为了保证修饰的质量D ...

感谢您的问题。之所以提到初始dna量的问题，我也是经过考虑的。这是因为目前定量的方法不甚准确。不知您有什么很好的定量方法吗？我曾经比较过紫外分光光度仪测定的量和电泳跑带估计量是有一定差距的。减少修饰过程中dna的损失是很好的建议，但请详细说说如何做到，给大家一个参考。
作者: @花开花落@    时间: 2011-8-31 15:40

我做修饰的时候碱变性条件为37度10分钟,另外我用的是2M的NaOH做碱变性,而用3M的NaOH调亚硫酸氢钠PH值,这是我查文献看到的,不知道不同浓度的NaOH有什么作用?
还有加糖原助沉时我用2ul,是不是量越大越好呢?
怎么才能减少修饰过程中DNA的损耗呢?
作者: @花开花落@    时间: 2011-8-31 15:41

我还有一个问题请教楼主,如何通过电泳跑带估计DNA的浓度呢?
作者: 微笑的海豚    时间: 2011-8-31 15:42

楼主问到怎么解决减少DNA的损失问题，其实这没有更多的东西，关键的是两步，其一是过柱过程，分次冲洗，加温过柱是基本办法；其二是沉淀，尽量用保守的方法，加盐，低温到负80度等都可以做，还有就是沉淀时间，总之，在正常提取DNA中认为是对DNA得率影响不大的步骤现在都要考虑到，毕竟我们的起始量就只有1-2微克。
说到设计引物甚至探针的问题，这才是MSP让人头疼的，先说一句我的体会，你想有点自己的东西，忘掉你记得的常规PCR设计的大多数规则吧，MSP和BSP大多数情况下都不会遵循这些规则。满足一些主要的关键点就是了，比如3‘端互补不能太多，诸如此类的问题，其他你不能要求太多。
而说道PCR，一个字“摸”，以你的设想大胆设计引物，然后摸PCR条件，其实PCR是很人性的，大多数时候他能顺从你的要求。
酶是关键，这点我以前并不感觉，因为我崇尚摸条件，不过最近在铁的事实面前不得不承认，好酶就是有效果，可能是小农意识惯了，呵呵。但是，还是强调，做MSP时候先找主观原因，再找客观的。
作者: 胖小妮子    时间: 2011-8-31 15:42

请教一下楼主，DNA经亚硫酸盐修饰后，必须得经过纯化回收吗？若纯化，您用的这个试剂盒大约多少钱？什么规格的？
作者: HOT兔    时间: 2011-8-31 15:44

我也在做甲基化转化方面的实验,楼上的提问DNA经亚硫酸盐修饰后，必须得经过纯化回收吗？如果按照楼主的实验方案,那么就必须要使用纯化试剂盒,具体什么价格和规格,我不是太清楚,我这边实验室是找实验室管理员老师,直接去订的.对于转化的DNA用量,我也觉得不能太大,我个人的看法是用量不能太大,1μg左右,此外,对于亚硫酸盐溶液的配制过程中,关键是要注意避光和低温,亚硫酸氢钠和氢醌的溶解是一个问题,尤其是氢醌,本身微溶于水,所以稍大浓度就不能完全溶解,我的经验是将氢锟溶于提前低温处理的双蒸水中,锡纸包裹后振荡可以加速溶解.对于亚硫酸氢钠的溶解,的确,较大浓度配制时溶解也不容易,加入NaOH可以有助于其溶解,但是个人认为尽量不要使用.对于引物设计的问题,我也一直在寻找,因为我要做的基因比较新,文献上面还没有关于这个基因的MSP或者基因芯片检测甲基化方面的文章,按照我的理解,因为我做的是针对启动子区的甲基化,首先找到整个基因的完整DNA序列,找到启动子区,然后了解其CpG岛情况,针对CpG岛设计引物,MSP的引物一般是含CpG岛的,而基因芯片检测一般是不含CpG岛的,至于退火温度,可以参考所研究的基因的普通PCR的相关文献.
作者: HOT兔    时间: 2011-8-31 15:44

申请专利号  03160283.5 　  专利申请日  2003.08.28 　
名称  亚硫酸氢盐处理的改进方法   公开（公告）号  1495192
公开（公告）日  2004.05.12 　  颁证日  　
优先权  2002.8.29 EP 02019097.1;2002.12.18 EP 02028114.3  申请（专利权）  霍夫曼-拉罗奇有限公司 　
地址  瑞士巴塞尔　  发明（设计）人  C•马克特-哈恩;D•布洛克 　
国际申请     国际公布   
专利代理机构  中国专利代理(香港)有限公司 　  代理人  温宏艳;徐雁漪 　
专利摘要
本申请涉及一种进行亚硫酸氢盐反应从而在核酸即甲基化或非甲基化的胞嘧啶中确定甲基化位点的方法，其中在亚硫酸氢盐反应的去氨基和/或去磺化步骤中，核酸被结合于固相。固相优选地是含有玻璃或硅石的材料，更优选的是玻璃棉、玻璃膜或者是磁性的玻璃颗粒。更进一步地，公开了固相在亚硫酸氢盐反应的去氨基和/或去磺化步骤中用于结合核酸的用途，以及一种含有亚硫酸氢盐试剂和固相的试剂盒。 　
专利主权项
1.一种将核酸中胞嘧啶碱基转化为尿嘧啶碱基的方法，其特征在于核酸在去氨基和/或去磺化步骤中被与固相结合。 　
这是一个比较好的转化方法,但是不了解外国人是怎么样将单链DNA吸附与固相的物质(含有玻璃或硅石的材料或者玻璃棉、玻璃膜或者是磁性的玻璃颗粒),个人认为比较有研究价值,只是不是学工科的,材料和化学方面知识太贫乏,不知道该如何下手.
作者: 明天的明天    时间: 2011-8-31 15:45

哎呀，终于找到组织了！这里先请教各位，在引物设计时，应该是将序列中的除cpg岛中的c碱基换成U碱基，但是这时会出现一个问题，由于u碱基对应的也是T碱基，这样设计出的引物往往会含有大量的T出现问题，我在设计时用各种软件都找不到合适的引物，根本就没有结果，不知各位怎么解决这个问题？已经做成的大侠请指点一下啊。这应该是个普遍问题。
作者: 阿福    时间: 2011-8-31 15:45



QUOTE:
原帖由 明天的明天 于 2011-8-31 15:45 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
哎呀，终于找到组织了！这里先请教各位，在引物设计时，应该是将序列中的除cpg岛中的c碱基换成U碱基，但是这时会出现一个问题，由于u碱基对应的也是T碱基，这样设计出的引物往往会含有大量的T出现问题，我在设计时用各种软件都找不到 ...

问题就是这样，没有办法。
但是，也没有多严重。甚至把连续重复序列、检测CpG位点不能改变、片断不能过长等等一系列因素都考虑进去，MSP的引物简直就是经典引物设计原则的反面教材，不过，都没关系。把握主要原则，想到修饰后DNA脆、单链状态、模板数低、错配严重等这些基本特点，然后就大胆去摸去试。千万注意，做MSP就是要设计大量的引物来验证，请打消想一蹴而就的念头，除非两种情况：用别人的引物或运气好。
作者: 椰子叶子    时间: 2011-8-31 15:46

同意楼上的观点。起始DNA量不要太大，我一般1－2ug起始。修饰前的碱变性楼主的条件很强烈，我感觉37度左右，15min也就足够了。另外我也不用糖原做指试剂，冷乙醇沉淀－70以下2小时也是足够的，可以缩短时间，呵呵。
我也觉得MSP关键是PCR。引物，酶，循环条件，这才是摸索MSP的时候最头疼的问题。
作者: 椰子叶子    时间: 2011-8-31 15:46

NaHSO3和对苯二酚的配制似乎没有各位说得这么困难。我一般下午在修饰DNA之前一两个小时开始配溶液，NaHSO3直接配成3M的，对苯二酚先配成100mM的，溶解得都不算慢。NaHSO3加水之后先用枪头来回抽吸吹打一下，可以快点溶解。对苯二酚我用Ep管配，加水之后弹一下管底让其分散，溶解也比较快。临近使用的时候用10M的NaOH调节NaHSO3的pH至5然后定容（其实这个时候才是3M，此前留有定容空间的时候浓度还稍高，也溶得挺好），对苯二酚则稀释10倍，然后就OK了。至于乙酸铵等各类普通试剂，一次配完存于4度是没有问题的。我只用7.5M的乙酸铵，在4度不会析出结晶，呵呵。
作者: 许愿精灵    时间: 2011-8-31 15:48

请教楼主,如何通过电泳跑带估计DNA的浓度呢?
作者: =菓子=    时间: 2011-8-31 15:48

谢谢楼主和我们分享你的经验！请问你用2ugDNA经过修饰后就可以看得到沉淀吗？我做过5ugDNA都没看到什么啊，不知道是什么原因？？？而且用M引物做的pcr什么都没扩出来，U引物扩的却出现很长的一段不知道什么东西，从500bp延伸到100bp，却没有明显的条带，提高了退火温度也没有用，不知道是哪里出了问题？？烦请各位指点一下迷津吧！！先谢过了！！由于我做的这个基因还没有文献支持，一点头绪都没有，请大家多帮帮忙吧
作者: +田田+    时间: 2011-8-31 15:49

请问阿福：
你说的回收过程中减少DNA 损失的问题，我没有看明白，“其一是过柱过程，分次冲洗，加温过柱是基本办法；”是什么意思啊？再过柱之前要让给柱子加温马？多少度？问什么？其二是沉淀，尽量用保守的方法，加盐，低温到负80度等都可以做，还有就是沉淀时间，我使用的是试剂盒里的柱子，过柱时就是要脱硫和漂洗吗？怎样才能增加回收量呢？
作者: 阿福    时间: 2011-8-31 15:50

问题一：道理很简单，跟洗衣服一样，如果你只有一桶水用来清洗衣服，一次用完的效果一般来说不如分成两次；温水洗当然也比冷水洗干净，柱子是不加温的。
问题二：过柱就是洗去盐成分及强碱等不利于DNA稳定的物质，保守的方法，我的理解就是沉淀时加盐、更低的温度、更长的时间、更轻柔的操作，总之，一些一般DNA提取中认为影响不大的细节，在修饰过程及以后的回收过程中都要关注。
作者: 冷太阳    时间: 2011-8-31 15:50

想问一下，大家测PH值都是用的PH仪呢？还是根据经验来的？？谢谢
作者: 夕阳    时间: 2011-8-31 15:51

请问处理过夜后，能够不用那个纯化试剂盒吗？因为价格很贵啊，能够不用的话有啥经济的办法可以脱盐吗？谢谢高手回答啊
作者: 大猫    时间: 2011-8-31 15:52

可以做透析啊，本来用柱子回收损失就大。
作者: 冰激凌小姐    时间: 2011-8-31 15:53

我按照楼主的方法做了DNA的修饰，但之后PCR都没有扩出东西来，引物是参照文献的。每份用1.5微克左右的DNA，修饰回收之后溶于25微升水中，取3微升跑琼脂糖电泳，结果什么都没有，请高手帮我分析一下，问题出在哪里，谢谢！
作者: 小困    时间: 2011-8-31 15:53

请问亚硫酸氢钠修饰后，必须要纯化回收么？有没有这样的纯化试剂盒的。价格大概在多少价位？烦请知道的朋友多多指教啊！  
作者: finger    时间: 2011-8-31 15:54

回答：是的，只是方法略有不同。Promega有这样的试剂盒。如经济条件好些，可试试Takara的甲基化修饰试剂盒，一次修饰成功，价格大约要4000元左右。可以致电代理公司查询。
作者: finger    时间: 2011-8-31 15:55

我按照楼主的方法做了DNA的修饰，但之后PCR都没有扩出东西来，引物是参照文献的。每份用1.5微克左右的DNA，修饰回收之后溶于25微升水中，取3微升跑琼脂糖电泳，结果什么都没有，请高手帮我分析一下，问题出在哪里，谢谢！

------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------

回答：谈点浅见：1：回收后可不必跑电泳，因为量少可能会什么也没有。2：进入修饰的量请确认，除了测定OD值外，跑个电泳试试，看一下提取的基因组DNA的质量。3：PCR体系尝试调整一下，如退火温度。
作者: @木木@    时间: 2011-8-31 15:55

有的文献上说使用玻璃奶法回收DNA,但是它的亚硫酸氢盐修饰方法跟楼主的方法有所不同,请问,有什么不一样的吗?可不可以使用楼主的亚硫酸氢盐修饰方法而使用玻璃奶法回收呢?因为楼主的回收方法实在是好麻烦啊,呵呵,本人是新手,提的不成熟的问题。主要是我们是两年的研究生,自己研究的话真怕到时候作不出实验结果呢!!谢谢各位大侠的帮助!!!肯盼回复。
作者: 嘉年华    时间: 2011-8-31 15:56

教下楼主：
关于引物，我查的文献中有很多种不同的版本，实在不知该用哪一种。而且，这些引物在gene bank中都没比对到，是不是甲基化的引物就是跟正常的不一样，在库里比对不到啊？好急，谢谢啦！！！
作者: finger    时间: 2011-8-31 15:57



QUOTE:
原帖由 @木木@ 于 2011-8-31 15:55 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
有的文献上说使用玻璃奶法回收DNA,但是它的亚硫酸氢盐修饰方法跟楼主的方法有所不同,请问,有什么不一样的吗?可不可以使用楼主的亚硫酸氢盐修饰方法而使用玻璃奶法回收呢?因为楼主的回收方法实在是好麻烦啊,呵呵,本人 ...

回答：没有使用过您说的方法，不敢妄言。如欲使实验简便，可使用甲基化修饰试剂盒，修饰回收一次完成，比较方便，Takara好像有此产品，可以查一下目录。回收的目的是去除修饰过程中的盐分，否则将影响后续试验。您说的方法如有成熟的Protocol，不妨参照做一下。
实验是非常耗费时间和精力的，还要有一颗敢于面对失败的心。
作者: finger    时间: 2011-8-31 15:57



QUOTE:
原帖由 嘉年华 于 2011-8-31 15:56 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
教下楼主：
关于引物，我查的文献中有很多种不同的版本，实在不知该用哪一种。而且，这些引物在gene bank中都没比对到，是不是甲基化的引物就是跟正常的不一样，在库里比对不到啊？好急，谢谢啦！！！  ...

回答：甲基化PCR使用的引物中未甲基化的C一般转化为U，而DNA中没有U，即为T。下游引物因与序列互补，故而C对应的G变为了A。简言之，上游引物中非CG相连的C应为T，下游引物中非CG相连的C对应的为A。我觉得可以转化后比对一下。引物多，可选择被普遍使用的那一对更好些。
作者: mogu    时间: 2011-8-31 15:58

请教一下：我用Zymo的试剂盒进行的甲基化处理，作后经过测序效果都很好。最近我有几个模板经过处理以后，条件都没有发生改变,却无论如何也做不出来.而且为了排除试剂问题，我把引物，buffer, dNTP ,hotstar,统统都进行了更换，而且对初始DNA进行了纯化处理，可还是没有结果。我的引物的Tm值为60，片段约400bp.反应体系和反应程序如下：10*buffer 1ul, Q* buffer 2ul, MgCl2 0.6ul, dNTP0.2 ul,hotstar 0.1ul,primerF/R 0.5ul(100ng/ul) ,
template 3ul,终体积10ul.反应程序：95度，15分钟，
94度30秒，62度40秒（每个循环降落0.5度），72度1分钟，共12个循环。94度30秒，50度40秒，72度1分钟，28个循环。
请指导一下，我目前存在的问题在哪里？如何才能尽快扩出我的目的产物？
谢谢
作者: Darcy    时间: 2011-8-31 15:59

我想问一下楼主，有没有试过不用Clean up kit，直接纯化修饰后的DNA阿？有可行的方法吗？
作者: finger    时间: 2011-8-31 15:59

请教一下：我用Zymo的试剂盒进行的甲基化处理，作后经过测序效果都很好。最近我有几个模板经过处理以后，条件都没有发生改变,却无论如何也做不出来.而且为了排除试剂问题，我把引物，buffer, dNTP ,hotstar,统统都进行了更换，而且对初始DNA进行了纯化处理，可还是没有结果。我的引物的Tm值为60，片段约400bp.反应体系和反应程序如下：10*buffer 1ul, Q* buffer 2ul, MgCl2 0.6ul, dNTP0.2 ul,hotstar 0.1ul,primerF/R 0.5ul(100ng/ul) ,
template 3ul,终体积10ul.反应程序：95度，15分钟，
94度30秒，62度40秒（每个循环降落0.5度），72度1分钟，共12个循环。94度30秒，50度40秒，72度1分钟，28个循环。
请指导一下，我目前存在的问题在哪里？如何才能尽快扩出我的目的产物？
谢谢

--------------------------------------------------------------------------------------------------------

回答：原因不太好说。按照能做出的步骤每一步的对照一下，而不要急于更换试剂，更换试剂相当于条件的一次小变动。也不要轻易改变开始的PCR条件，否则容易陷入摸索条件的汪洋大海。我感觉如果不是初始进入修饰的DNA量太少、回收过程中丢失的太多，就是PCR步骤看似不起眼的小细节了，如PCR试管和PCR仪最好选用以前的，加样保证各成分的均匀、一致。
作者: finger    时间: 2011-8-31 16:00

我想问一下楼主，有没有试过不用Clean up kit，直接纯化修饰后的DNA阿？有可行的方法吗？

------------------------------------------------------------------

回答：建议看一下《分子克隆》中的相关章节。
作者: 红豆冰    时间: 2011-8-31 16:00

我用的是上海杰美的甲基化检测试剂盒。其基本步骤和春雨濛濛前辈发的帖子

上所描述的基本一样。现在所遇到的问题是，加入反应体系的DNA量约为3ug，加

入前经过琼脂糖凝胶电泳证实DNA量比较大，但是经过一系列反应和提纯后，最终

得到的20ul的经过修饰的DNA在琼脂糖凝胶电泳中没有任何条带（点了5ul），用

引物M和U扩增后，电泳没有目的条带。
需要补充的是：1.我修饰前的DNA是用试剂盒提的，用分光光度仪测提示蛋白

污染，但是在跑胶时显示条带很特异。2.刚经过16小时的修饰从水浴中拿出后，

立即用其中的5ul点样跑胶，没有任何条带（不知道这样做对不对，急疯了才这样

做的）。3.在用树脂吸附DNA这一步，用柱子分离丢弃的液体进行跑胶，没有任何

条带。4.加入无水乙醇，－20度沉淀6小时后，离心20分钟，看到似乎有片状沉淀

，乳白色，但加入溶解液却不溶。
那么，1.蛋白污染对修饰和DNA的回收影响大么？如果大要怎么进一步提纯？

2.我可能做了一些很可笑的事，但是DNA似乎在经过16小时的修饰后就消失了？3.

乙醇沉淀中的不溶于水的沉淀是什么？是糖元么？
求求各位前辈，给指条明路吧！！在下不胜感激！
作者: finger    时间: 2011-8-31 16:03



QUOTE:
原帖由 红豆冰 于 2011-8-31 16:00 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
我用的是上海杰美的甲基化检测试剂盒。其基本步骤和春雨濛濛前辈发的帖子

上所描述的基本一样。现在所遇到的问题是，加入反应体系的DNA量约为3ug，加

入前经过琼脂糖凝胶电泳证实DNA量比较大，但是经过一系列反应和提纯 ...

回答：试验总是面临着失败，慢慢锻炼一颗耐心吧。针对您的问题，就我所知回答一下：
1：去除蛋白污染可参考我在第一部分写的方法，即加入蛋白酶K ，终浓度可适当加大些。
2：我个人认为只要进入修饰的基因组DNA的量足够，修饰后是不会丢失的。主要的损失是在回收这一步。观看您的步骤，修饰16小时后不必跑电泳，况且当时是高盐状态不确定对电泳是否有影响。回收如果使用的是树脂，请一定注意修饰时亚硫酸氢盐的PH值，最终的PH值一定是5.0，不可以高，否则DNA与树脂的结合率会很低。另外在回收时可以不用TE缓冲液，使用预热到70度的灭菌双蒸水即可，因为洗脱液的PH也会影响洗脱的效率。
3：一般来讲加入的那些糖原能形成明显沉淀的可能性较小。如果这些不溶物经室温干燥后逐渐变得透明了应该是DNA了。
4：最后跑PCR没有结果除了DNA的问题外，我感觉还有很大的问题出在PCR这一步，包括反应体系、各种反应的温度、循环次数等。我在做MSP时也以失败告终，个人感觉与引物也不无关系。
总之，我感觉DNA修饰纯化注意了DNA的量、各种溶液正确的PH值，是不会有问题的。也请摸索一下PCR的条件。
作者: 幸福无罪    时间: 2011-8-31 16:03

您好！想向楼主请教一下，做亚硫酸氢钠—PCR和亚硫酸氢钠-测序法所用的引物一样吗？如果不一样，测序法的引物该如何设计？我做的是结肠癌HT29细胞hTERT基因甲基化方面的，请帮忙设计一下，毕业在即，论文的实验还没完成，惭愧！
作者: 开心蔬菜帮    时间: 2011-8-31 16:04

赞!
我也这样觉得. 我所见过的protocol都要求不能超过2ug, 否则转化不完全(好象说和变性不完全有关,bisulfite倒是够用). 现在有不少的改进方法可以提高效率, 也有很多kit卖, 比较好的是zymo research和Qiagen的,个人感觉, 但是也不能完全follow别人的protocol.
作者: finger    时间: 2011-8-31 16:05

您好！想向楼主请教一下，做亚硫酸氢钠—PCR和亚硫酸氢钠-测序法所用的引物一样吗？如果不一样，测序法的引物该如何设计？我做的是结肠癌HT29细胞hTERT基因甲基化方面的，请帮忙设计一下，毕业在即，论文的实验还没完成，惭愧！

-----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------

回答：设计引物可采用： cuturl('http://www.ucsf.edu/urogene/methprimer/')
免费在线设计。不过引物的可行性需要实验方可验证。建议还是查找文献为主
作者: 我是一片云    时间: 2011-8-31 16:06

大家好，想请教各位老师一下，在NCBI中查到基因序列后，怎么样确定哪段是启动子，哪段是外显子啊，
作者: 米米    时间: 2011-8-31 16:06

最近也在作MSP，用的ZYMO的甲基化试剂盒，PCR引物是参考文献的（所见文献几乎用的相同引物），其中一个基因甲基化和未甲基化引物均未P出东西，另外一个基因甲基化引物有条带，但未甲基化引物出现弥散带，提高退火温度也未分出特异性条带。有以下问题请教版主：
1、MSP出现弥散带是何原因，该如何进一步优化条件？
2、考虑其中一个基因已有结果，是否可以认为酶和DNA模板应该没有问题，而未PCR成功的基因该如何调整PCR条件呢？
3、MSP引物到底应该如何查对？实在是搞不懂这个东东，根本无法比对，文献也并未标出引物所对应序列的具体位置，头痛！
版主说：“甲基化PCR使用的引物中未甲基化的C一般转化为U，而DNA中没有U，即为T。下游引物因与序列互补，故而C对应的G变为了A。简言之，上游引物中非CG相连的C应为T，下游引物中非CG相连的C对应的为A。我觉得可以转化后比对一下。引物多，可选择被普遍使用的那一对更好些。”
我也不大明白，引物并未经过修饰怎么会有碱基的转化？按此比对也完全对不上啊，能否简单说明MSP引物与原序列的对应关系。万分感谢！  
作者: fangxiang    时间: 2011-8-31 16:07

楼主：向你请教，我的模版用TAKARA的ExTaq酶做PCR是光板，但用别人的QIAGEN的酶，却可以做的出来。我看你发的帖子用的也是TAKARA的酶，所以想了解一下你的PCR体系，万分感谢！！！
作者: 何去何从    时间: 2011-8-31 16:07

本人觉得用 promaga的柱子回收DNA效果远不如用 QIAGEN的 DNA纯化回收试剂盒效率高。QIAGEN的盒子是用到玻璃粉回收法。回收效率能达到80－90％  
作者: finger    时间: 2011-8-31 16:08

本人觉得用 promaga的柱子回收DNA效果远不如用 QIAGEN的 DNA纯化回收试剂盒效率高。QIAGEN的盒子是用到玻璃粉回收法。回收效率能达到80－90％

------------------------

很好的经验。
作者: finger    时间: 2011-8-31 16:08

楼主：向你请教，我的模版用TAKARA的ExTaq酶做PCR是光板，但用别人的QIAGEN的酶，却可以做的出来。我看你发的帖子用的也是TAKARA的酶，所以想了解一下你的PCR体系，万分感谢！！！

---------------------------------------

回答：我的体系仅供参考。
修饰后DNA  2μl
10x LA buffer  2μl
2.5mM dNTP   1μl
10uM 引物
（上游+下游） 1 μl +1μl
LA Taq酶   0.3μl
DDW   12.7μl/共20ul。
作者: finger    时间: 2011-8-31 16:09

最近也在作MSP，用的ZYMO的甲基化试剂盒，PCR引物是参考文献的（所见文献几乎用的相同引物），其中一个基因甲基化和未甲基化引物均未P出东西，另外一个基因甲基化引物有条带，但未甲基化引物出现弥散带，提高退火温度也未分出特异性条带。有以下问题请教版主：
1、MSP出现弥散带是何原因，该如何进一步优化条件？
2、考虑其中一个基因已有结果，是否可以认为酶和DNA模板应该没有问题，而未PCR成功的基因该如何调整PCR条件呢？
3、MSP引物到底应该如何查对？实在是搞不懂这个东东，根本无法比对，文献也并未标出引物所对应序列的具体位置，头痛！
版主说：“甲基化PCR使用的引物中未甲基化的C一般转化为U，而DNA中没有U，即为T。下游引物因与序列互补，故而C对应的G变为了A。简言之，上游引物中非CG相连的C应为T，下游引物中非CG相连的C对应的为A。我觉得可以转化后比对一下。引物多，可选择被普遍使用的那一对更好些。”
我也不大明白，引物并未经过修饰怎么会有碱基的转化？按此比对也完全对不上啊，能否简单说明MSP引物与原序列的对应关系。万分感谢！

--------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------

回答：抛砖引玉谈一下引物比对的问题吧。我的办法比较原始。即：1文献中往往会提示目的片段的位置，根据其使用的Genbank号找到相应的基因序列。2：先看上游引物，因上游引物与原序列一致。引物中的T可能是T，也可能是C。尝试将T变为C，反复比对。需要一定的时间。3：可以根据目的片段的长短找到下游引物的位置，然后将原序列中的C变为T，与引物中的A匹配。这个办法比较简单。另一个比较复杂的办法：因下游引物序列与原序列是匹配关系。所以引物中A对应的碱基可能是T，也可能是C。因此，需要反复还原比对。
不知道是否还有更好的办法，因为没有自己设计引物，所以只好费些事研究别人的引物了。呵呵。
作者: 大虾米    时间: 2011-8-31 16:09

您好!
我正在做人类基因SFRP1的甲基化测序检测:针对亚硫酸盐处理的DNA样本P出SFRP1 的第一个预测CPG岛,然后割胶回收,装载体测序.关键问题:p不出任何条带
能帮我分析一下引物吗？
作者: finger    时间: 2011-8-31 16:10     标题: 回复 #75 大虾米 的帖子

回答：引物应该没有问题。但我感觉您的目的片段有些长，因为修饰后DNA中TA比例增加，片段太长不是很好扩增，您的目的片段有600多个bP。多数文献扩增的片段都在200bp左右，较长片段多用巢式PCR分次扩增。建议：1：目的片段放短；2：做巢式PCR。
作者: 章鱼小丸子    时间: 2011-8-31 16:11

楼主：你好！
有几个问题想请教。

欲做甲基化实验，本打算用参考文献中的引物，但发现文献中的RT-PCR引物有问题，因害怕甲基化引物也有问题，麻烦帮着看一下。
该基因为cyclind2，我查的有两个甲基化区，请看序列，[]内为甲基化区

AGAGCGAGCAGGGGAGAGCGAGACCAGTTTTAAGGGGAGGACCGGTGCGA
GTGAGGCAGCCCCGAGGCTCTGCTCGCCCACCACCCAATCCTCGCCTCCC
TTCTGCTCCACCTTCTCTCTCTGCCCTCACCTCTCCCCCGAAAACCCCCT
ATTTAGCCAAAGGAAGGAGGTCAGGGGAACGCTCTCCCCTCCCCTTCCAA
AAAACAAAAACAGAAAAACCTTTTTCCAGGCCGGGGAAAGCAGGAGG[GAG
AGGGGCCGCCGGGCTGGCCATGGAGCTGCTGTGCCACGAGGTGGACCCGG
TCCGCAGGGCCGTGCGGGACCGCAACCTGCTCCGAGACGACCGCGTCCTG
CAGAACCTGCTCACCATCGAGGAGCGCTACCTTCCGCAGTGCTCCTACTT
CAAGTGCGTGCA]GAAGGACATCCAACCCTACATGCGCAGAATGGTGGCCA
CCTGGATGCTGGAGgtaggtcggggggtggcgctcgccaggagccaggac
ccctccggatgctcgggtccccggccggagccctaaacctgggagagggc
aatccccgcgccggcctcccggctcctgtgcgggagtttaccgcgcgcct
tctggcgagacgcgtggctttatttctgttcctctccagataaactgggg
aggcagaggggggaggaaaatctgggagaagcgaggctgtcctgggcggg
ggtaggggagcatcccgcgcgcgtgttcctgcatgtggctgcctcttctt
cccacccccctcgcgacctgtcttttgcgaagccgccgcggctgcttgcg
ctgcggccaggaagagagtcggggcctgaaatcgggaccccgagtagaaa

另一个
gactgagattctgcggttccaacaagctcgcaggtgatgctgatgctgcc
agcccatggaccccacctggagtagtgaggttccttggcactttaagaac
atccctcctttacttcacatttatttctactggaaactagcacagactta
tgcaagctaaattacgcatgttttctccgtaggatgctctatgtcctgtt
cctcttactaacaactctggtctggaccattgttctagGATTGTCTCAAA
GCTTGCCAGGAG[CAGATTGAGGCGGTGCTCCTCAATAGCCTGCAGCAGTA
CCGTCAGGACCAACGTGACGGATCCAAGTCGGAGGATGAACTGGACCAAG
CCAGCACCCCTACAGACGTGCGGGATATCGACCTGTGAGGATGCCAGTTG
GGCCGAAAGAGAGAGACGCGTCCAT]AATCTGGTCTCTTCTTCTTTCTGGT
TGTTTTTGTTCTTTGTGTTTTAGGGTGAAACTTAAAAAAAAAATTCTGCC
CCCACCTAGATCATATTTAAAGATCTTTTAGAAGTGAGAGAAAAAGGTCC
TACGAAAACGGAATAATAAAAAGCATTTGGTGCCTATTTGAAGTACAGCA
TAAGGGAATCCCTTGTATATGCGAACAGTTATTGTTTGATTATGTAAAAG
TAATAGTAAAATGCTTACAGGAAAACCTGCAGAGTAGTTAGAGAATATGT
ATGCCTGCAATATGGGAACAAATTAGAGGAGACTTTTTTTTTTCATGTTA
TGAGCTAGCACATACACCCCCTTGTAGTATAATTTCAAGGAACTGTGTAC
GCCATTTATGGCATGATTAGATTGCAAAGCAATGAACTCAAGAAGGAATT
GAAATAAGGAGGGACATGATGGGGAAGGAGTACAAAACAATCTCTCAACA
TGATTGAACCATTTGGGATGGAGAAGCACCTTTGCTCTCAGCCACCTGTT
作者: 章鱼小丸子    时间: 2011-8-31 16:11

文献中的引物：
Primers specific for unmethylated DNA were 5'-GTTATGTTATGTTTGTTGTATG-3' (sense, -1616 to -1594) and 5'-TAAAATCCACCAACACAATCA-3' (antisense, -1394 to -1414) and yielded a 222-bp PCR product.
Primers specific for methylated DNA were 5'-TACGTGTTAGGGTCGATCG-3' (sense, -1427 to -1409) and 5'-CGAAATATCTACGCTAAACG-3' (antisense, -1152 to -1171) and yielded a 276-bp PCR product.
1、不知文献引物是否可用。
2、设计甲基化引物是不是最好在5‘端的甲基化区（上面第一个甲基化区是5’端的，第二个是3‘端的）
3、还有一问题：
我用MethPrimer 设计，软件给出好几对甲基化引物，可不知该怎样选择，希望能赐教。能否帮我推荐一下cyclind2基因的甲基化引物。谢谢大家了。
作者: 橘子水儿    时间: 2011-8-31 16:46

请教:
我现在做MSP拉出的要么是引物二聚体,要么什么也没有,急急急啊,怎么办?请教各位大虾!
作者: finger    时间: 2011-8-31 16:48     标题: 回复 #79 橘子水儿 的帖子

回答：1：改变PCR条件；
2：更换引物。
反复查阅文献，并不断实践。
作者: 如影随形    时间: 2011-8-31 16:48

多谢各位的分享！请高手们把溶液的配方和各试剂的作用介绍一下啊！谢谢！！
作者: 喵咪    时间: 2011-8-31 16:50

现在用的是Chemicon的甲基化试剂盒，1ug的DNA模板，做20个25ul的PCR反应没问题，修饰后不需要clean up，阳性对照（0.2ug）的条带很明显，但未甲基化的引物中也有2条目的片段大小的条带，还是甲基化修饰的问题？从14小时到15小时条带还是存在，今天正在尝试修饰16小时，很期待明天的结果。按理说，阳性对照是比较稳定的，对于这种现象，请问LZ有什么高见？（用的是PCR后电泳的方法）
作者: 蓝蜗牛    时间: 2011-8-31 16:51

有的文献上说使用玻璃奶法回收DNA,但是它的亚硫酸氢盐修饰方法跟楼主的方法有所不同,请问,有什么不一样的吗?可不可以使用楼主的亚硫酸氢盐修饰方法而使用玻璃奶法回收呢?因为楼主的回收方法实在是好麻烦啊,呵呵,本人是新手,提的不成熟的问题。主要是我们是两年的研究生,自己研究的话真怕到时候作不出实验结果呢!!谢谢各位大侠的帮助!!!肯盼回复。  
作者: 假小子    时间: 2011-8-31 16:51

请教楼主：
关于引物，我查的文献中有很多种不同的版本，实在不知该用哪一种。而且，这些引物在gene bank中都没比对到，是不是甲基化的引物就是跟正常的不一样，在库里比对不到啊？好急，谢谢啦！！！
作者: 葡萄籽    时间: 2011-8-31 16:52

刚开始做这个实验，请问您们用的是这个亚硫酸氢钠吗？要加水后反应生成亚硫酸氢钠？下面是说明：
S9000
Sigma-Aldrich Sodium bisulfite ReagentPlus®, ≥99%

As a solid, this product is sodium metabisulfite,.
When dissolved in water, it yields sodium
bisufite NaHSO3.
Na2S2O5 + H2O ® 2 NaHSO3
Sodium bisulfite is a reagent that is used in a variety of
large scale applications. These include the removal of
chlorine from bleached fibers in paper manufacture, as
a disinfectant and bleaching agent for wool, the
preparation of hot and cold indigo vats for dyeing, the
coagulation of rubber latex, and the manufacture of
sodium hydrosulfite.
请做过的朋友帮忙看一下，给点意见，谢谢！
作者: 小蜜蜂    时间: 2011-8-31 16:53

请问，甲基化扩增的片段克隆后送测序，每次都是没信号，我自己做质粒PCR结果很好，请问春雨濛濛等专家是什么原因，我该怎么办？这件事已经耽搁3个月了。谢谢！
作者: 格格巫    时间: 2011-8-31 16:54

请问各位，当你们得到甲基化测序结果以后，把结果作成很多文献上那种黑白小圆点的图，来说明你的那段序列里有多少甲基化的CpG，大家都是怎么做图的呢？自己手画还是有什么小软件可以用？谢谢！
作者: 阿拉蕾    时间: 2011-8-31 16:56

这是我的DNA NaHSO3处理方法：
第1部分：配试剂

1. .配制溶液为高温、高压消毒后无菌双蒸水。（37℃加热后用）
2. NaHSO3和氢醌即用即配，且避光配置和保存。
3.先加部分溶液，溶质溶化后补足溶液体积。
4.NH4OAc配制后需用稀醋酸或氢氧化铵调PH=7.0。
6MNH4OAc： 0.462g +1ml ddH2O
2M NaHSO3： 0.038g + 1ml ddH2O
0.2M氢醌 ： 0.022g + 1ml ddH2O
3.5M NaOH： 0.14 g + 1ml ddH2O
3.0M NaOH： 0.12 g + 1 ml ddH2O
我没有对 NaHSO3的PH值进行调节
作者: 阿拉蕾    时间: 2011-8-31 16:56

我的DNA NaHSO3处理方法：
第2部分：DNA NaHSO3的修饰
1.45ul（一般DNA绝对值2-4ug，加双蒸水定量至45ul）DNA中加5ul 3.5M NaOH，37℃水浴20min。
2.加入517ul 2M NaHSO3及30ul 0.2M氢醌，混匀点离。
3.轻轻覆盖150ul矿物油，EP管口贴封口膜，55℃水浴18小时（或过夜），注意避光。

有个疑问：
实际操作中，我以前曾用石蜡油代替矿物油，但是最终结果都没有DNA，个人觉得可能是石蜡油中的某些物质与DNA产生了结合。后来使用矿物油，其他步骤没有改变的情况下，最终可见沉淀。 所以想请问楼主这个问题是否会对实验结果产生影响？
作者: 阿拉蕾    时间: 2011-8-31 16:56

我的DNA NaHSO3处理方法：
第3部分：DNA NaHSO3修饰及DNA沉淀
1.吸掉矿物油，吸取300ulDNA至新1.5ml EP管。（剩余DNA-20℃保存）
2.摇匀树脂（可至37℃加热），加1ml到DNA，颠倒混匀。
3.将真空柱和微型柱连接好。（使用Promega Wizard Cleanup DNA纯化回收系统A7280）
4.将混合液加入真空柱中，负压抽吸。
5.80%酒精洗涤3次，弃真空柱。
6.取下微型柱放至新EP管中，10000g，离心2min。
7.将微型住放至新EP管中，加45ul双蒸水（对着微型柱正中白色处深入加液，避免触碰），等待1min。
8.13000g，离心5min，收集EP管中DNA至新EP管，弃微型柱。
9加5ul 3M NaOH 37℃（小枪轻柔混匀） 水浴15min。
10.加50ul 6M NH4OAc（PH 7.0），混匀，加入1ul糖原，250ul 95%酒精，-80℃，2-18h。

由于实验场地的关系，我在-80℃的状况下只能孵育3h左右，不知道会不会对试验产生影响，而且也没对糖原的能否使用进行评价（因为我每次都加了）
作者: 阿拉蕾    时间: 2011-8-31 16:57

我的DNA NaHSO3处理方法：
第4部分：收集DNA及测浓度和纯度
1.13000g，10min，快速吸干上清，点离，吸上清，收集沉淀（切勿丢失）。
2.加1ml 70%酒精，颠倒混匀，13000g，5min。
3.快速吸干上清，点离，吸干上清（沉淀切勿丢失），稍干燥（管壁上无明显水珠）。
4.加30-50ul 双蒸水重溶（37℃水浴助溶），振荡。
5.测DNA浓度和纯度。
6.-20℃保存

问题：
1。每次沉淀为乳白色，半个芝麻大小，个人怀疑有蛋白污染，但处理前DNA 浓度和纯度都不错，不知道什么原因
2.有人提示TE缓冲液溶解DNA比DDH更好，因为DNA会更稳定，但也有人说TE缓冲液溶解DNA的话会影响DNA的PCR，不知道楼主怎么看？
作者: 阿拉蕾    时间: 2011-8-31 16:58

请教楼主几个问题：

我的课题是DNA NaHSO3处理后，巢氏PCR产物甲基化测序
引物摘自一篇SCI高影响文章，但现在巢氏PCR的陷于瘫痪状态，条件完全摸不出来，我现在怀疑是我的DNA NaHSO3处理有问题，从而导致DNA模板质量不行，我的方法来源于国外回国一老师，我没动脑筋，完全照搬。不知道是否有问题，而对相关的步骤请教楼主几个问题：
1.是否NaHSO3的配制一定要加碱中和？
2.我的矿物油已经不足，难以继续试验，水浴过程中可以使用石蜡油吗？
3.-80℃的孵育你觉得多少时间比较合适？
4.试验步骤中有什么不对的请指出
5.每次看到沉淀，我就认为是DNA，因为浓度和纯度都不是很理想。18个样本，浓度为5-10ng/ul，个别200ng/ul（可能试验误差），浓度，1.8-2.0的有3个，2.21个，余都为1.2-1.5，不知道大家的结果怎么样？
这样的DNA模板是不是会非常消极的影响巢氏PCR结果？
6.现在试验停滞不前，面临很大压力，每日惴惴不安，不知道大家有什么建议，到底是DNA NaHSO3处理不好还是PCR中要注意什么呢？
7.现在做巢氏PCR的人似乎不多，请问大家在摸条件时有什么经验可以传授，谢谢大家了。  
作者: finger    时间: 2011-8-31 16:58

针对楼上的问题，我试着谈谈个人看法：
1：NaHSO3应加碱中和，否则PH值太低。
2：我使用的是石蜡油，从结果上看，似乎没有影响。文献上一般是“mineral oil" 。
3：从文献上看，NH4OAc不必调PH至7.0，而是加入相应浓度的NH4OAc后混合液的PH在7.0，起中和作用。因此不同浓度的NH4OAc使用的体积是不同的。您将其PH调节后，应该不能发挥中和作用了。
4：-80℃2小时也应该没有问题，前面有战友回帖，似乎这个时间也是可以的。
5：关于DNA的纯度，除获得其OD的比值外，建议跑一下琼脂糖电泳，观察DNA的纯度。
6：巢式PCR首次扩增的片段一般比较长，个人看法，扩增也不是特别容易，先按照文献所说的条件尝试一下。
另外观看您的体系，与我所使用的修饰体系不同。就一些问题谈谈我的看法。
1：“45ulDNA中加5ul 3.5M NaOH”，一般文献是将DNA稀释至50ul，加3MNaOH5.5ul。如您所述，溶液的中NaOH的浓度似乎大了些。
2：“加入517ul 2M NaHSO3及30ul 0.2M氢醌”，您使用的NaHSO3没有调PH，但使用的体积与常规使用的体积520ul很接近，我认为这会影响整个混合液最终的PH值。
3：“55℃水浴18小时（或过夜）”，个人认为18小时有些长，一般不超过16小时，时间过长，碱基修饰会有逆转。
4：“吸取300ulDNA至新1.5ml EP管。（剩余DNA-20℃保存）”，不知道为何要留一部分？
5：“95%酒精”，应该是3倍体积的无水乙醇。
综上所述，我感觉您的溶液PH可能会对纯化回收有影响。 PCR是下游步骤，只有在保证有足够量的、足够纯度的DNA模板的情况下方能成功。
作者: finger    时间: 2011-8-31 16:59

请问各位，当你们得到甲基化测序结果以后，把结果作成很多文献上那种黑白小圆点的图，来说明你的那段序列里有多少甲基化的CpG，大家都是怎么做图的呢？自己手画还是有什么小软件可以用？谢谢！

--------------------------------------------------------------------------

回答：比对测序的序列后，找出各克隆各位点的甲基化状态，使用画图中的圆形作图。未甲基化的内填充色为白色，甲基化的为黑色，横向为位点，纵向为克隆。
作者: finger    时间: 2011-8-31 16:59

请问，甲基化扩增的片段克隆后送测序，每次都是没信号，我自己做质粒PCR结果很好，请问春雨濛濛等专家是什么原因，我该怎么办？这件事已经耽搁3个月了。谢谢！

----------------------------------

回答：您的意思是已经有目的片段，并经过凝胶DNA回收，导入质粒扩增，并选取了相应的克隆送检么？ 如果是这样，可能：
1：选取的克隆是空克隆，或自连的，没有您的目的片段。
2：因含有高的T，测序可能发生错误。
建议和测序公司沟通一下，或换家测序公司试试。
作者: finger    时间: 2011-8-31 17:00

刚开始做这个实验，请问您们用的是这个亚硫酸氢钠吗？要加水后反应生成亚硫酸氢钠？下面是说明：
S9000
Sigma-Aldrich Sodium bisulfite ReagentPlus®, ≥99%

As a solid, this product is sodium metabisulfite,.
When dissolved in water, it yields sodium
bisufite NaHSO3.
Na2S2O5 + H2O ® 2 NaHSO3
Sodium bisulfite is a reagent that is used in a variety of
large scale applications. These include the removal of
chlorine from bleached fibers in paper manufacture, as
a disinfectant and bleaching agent for wool, the
preparation of hot and cold indigo vats for dyeing, the
coagulation of rubber latex, and the manufacture of
sodium hydrosulfite.
请做过的朋友帮忙看一下，给点意见，谢谢！

------------------------------------------------------

回答：S9000 没有问题。  
作者: loli    时间: 2011-8-31 17:00

楼主你好,我现在正作修饰,用的是chemicon公司的试剂合,总是不成功,不知道你是否有这方面的建议
作者: finger    时间: 2011-8-31 17:01



QUOTE:
原帖由 loli 于 2011-8-31 17:00 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
楼主你好,我现在正作修饰,用的是chemicon公司的试剂合,总是不成功,不知道你是否有这方面的建议  

回答：没有使用过，不过您可以把遇到的主要问题发上来，大家共同探讨一下。
作者: dreaming    时间: 2011-8-31 17:02

楼主好，我今天刚又作了一次还是一点条带都没有。我用的是chemicon公司的试剂盒，实验室条件有限无法知道修饰的效果如何，作PCR的条件也是我自己看书设的。有几个问题还请楼主帮小弟看看：
1 我用的引物上面有两个退火温度，上游引物中一个是1M钠离子时的65.7，另一个是50mM钠离子时的44.1,下游引物也有两个,我该怎么用?
2我做不出来的情况下怎么分析是修饰的问题还是PCR的问题.
3修饰是剧烈的化学反应,修完后的基因就都是单链了,用紫外分光测浓度都是些小片段居多,而且跑电泳不结合EB了,是不是这样?
4做甲基化的PCR是不是除了退火温度不一样,反应条件可以差不多吧?我用的是95-3分钟,/95-30'.58-30'.72-30',35个循环,最后72-10分钟.楼主您觉得行不?
5还有一个就是请楼主帮小弟来点自信吧,我都失败的麻木了,不知道那的原因就是做不出来.
谢谢楼主了!
作者: dreaming    时间: 2011-8-31 17:02

楼主好，我今天刚又作了一次还是一点条带都没有。我用的是chemicon公司的试剂盒，实验室条件有限无法知道修饰的效果如何，作PCR的条件也是我自己看书设的。有几个问题还请楼主帮小弟看看：
1 我用的引物上面有两个退火温度，上游引物中一个是1M钠离子时的65.7，另一个是50mM钠离子时的44.1,下游引物也有两个,我该怎么用?
2我做不出来的情况下怎么分析是修饰的问题还是PCR的问题.
3修饰是剧烈的化学反应,修完后的基因就都是单链了,用紫外分光测浓度都是些小片段居多,而且跑电泳不结合EB了,是不是这样?
4做甲基化的PCR是不是除了退火温度不一样,反应条件可以差不多吧?我用的是95-3分钟,/95-30'.58-30'.72-30',35个循环,最后72-10分钟.楼主您觉得行不?
5还有一个就是请楼主帮小弟来点自信吧,我都失败的麻木了,不知道那的原因就是做不出来.
谢谢楼主了!
作者: finger    时间: 2011-8-31 17:02

楼上：
回答：试着谈一下。
1：怎么分析是修饰的问题还是PCR的问题？
修饰用试剂盒应该带有对照，以判断您修饰成功与否，请修饰时同时使用对照。修饰后DNA成为单链，比较脆弱，所以每一步操作像对待RNA一样对待它-轻柔、细致，才感觉比较保险。避免剧烈的吹打、振荡，尤其是使用漩涡振荡，一般是颠倒、旋转混匀溶液即可。
2：用的引物上面有两个退火温度，上游引物中一个是1M钠离子时的65.7，另一个是50mM钠离子时的44.1,下游引物也有两个？
您做的是甲基化特异PCR，即MSP吧？是两对引物吗？感觉退火温度不会相差这么多。如果您的引物来自文献，请参考文献。
3：95-3分钟,/95-30'.58-30'.72-30',35个循环,最后72-10分钟？
这个条件一般来讲是可以的。还要看您扩增片断的长短。如果是MSP，扩增片断较短，30sec是可以的。
我感觉是这样：
1：使用试剂盒修饰还是可以的，不知道其修饰后纯化回收的步骤采用的是什么方法，会不会有较多的DNA的丢失？请注意这个步骤。
2：进入修饰的DNA的量和纯度是否良好？ 直接决定您修饰后还能有多少用来进行PCR！我总是反复强调这一点，我认为是非常重要的，只有足够多、足够纯，才能最终保证修饰后剩足够量用于PCR。
3：MSP有相当的难度，请多查阅文献，更换引物试试。
实验非常考验耐心，研究就是这样-不要期望一蹴而就，有种境界：众里寻它千百度，蓦然回首，它在灯火阑珊处。这就是我的实验感言。
作者: loli    时间: 2011-8-31 17:03

谢谢楼主的分析！！！
我这个试剂盒中没有对照，里面只有四种试剂，其中两种粉剂，一种吸附剂，我按说明书说得在50度下修饰16个小时后用5微升的吸附剂吸附，吸附以后要反复用酒精洗涤，10000转1分钟离心震荡，您上面说要避免剧烈吹打震荡，我想吸附以后是不是就可以离心震荡，否则离心后的吸附剂很难有效洗涤。
我做得确实就是MSP，有甲基化和非甲基化两种引物，每种引物的退伙温度确实是差这么多，我就是取得他的平均值，跟参考的文献差不多。
我的目的片断是347大。您说的修饰后纯化回收是不是说的修饰后怎么从吸附剂里把基因洗脱下来，我是按照说明书用PH值7.5的TE液，50到60度15分钟，然后高速离心，其中有多少丢失就不知道了。
我的基因提取是用试剂盒提取的，量和纯度都是挺好的，我加了20微升的基因，自我感觉量还可以。
非常感激楼主的解释，我做实验完全是个菜鸟，希望多多帮忙。
作者: loli    时间: 2011-8-31 17:03

谢谢楼主的分析！！！
我这个试剂盒中没有对照，里面只有四种试剂，其中两种粉剂，一种吸附剂，我按说明书说得在50度下修饰16个小时后用5微升的吸附剂吸附，吸附以后要反复用酒精洗涤，10000转1分钟离心震荡，您上面说要避免剧烈吹打震荡，我想吸附以后是不是就可以离心震荡，否则离心后的吸附剂很难有效洗涤。
我做得确实就是MSP，有甲基化和非甲基化两种引物，每种引物的退伙温度确实是差这么多，我就是取得他的平均值，跟参考的文献差不多。
我的目的片断是347大。您说的修饰后纯化回收是不是说的修饰后怎么从吸附剂里把基因洗脱下来，我是按照说明书用PH值7.5的TE液，50到60度15分钟，然后高速离心，其中有多少丢失就不知道了。
我的基因提取是用试剂盒提取的，量和纯度都是挺好的，我加了20微升的基因，自我感觉量还可以。
非常感激楼主的解释，我做实验完全是个菜鸟，希望多多帮忙。
作者: 菠萝菠萝蜜    时间: 2011-8-31 17:03

楼主了解MSAP技术分析甲基化水平的试验吗？我遇到的问题是酶切连接后预扩和选扩的片段太小，只有100到200bp左右。这种片段太小，希望你能帮我，谢谢
作者: 白鸟之翼    时间: 2011-8-31 17:04

这里用Epigentek 的 Modification kit，因为，做了不同的sample， 所以，不知道甲基化率怎么样。但是real time 已经做出几个primer的了，只是ct值很靠后（31-35之间），跟一般的DNA不一样，不知道这是不是MSP的特点呢？
作者: loli    时间: 2011-8-31 17:05

战友们有做过试剂盒修饰基因的吗，我怎么还是没结果啊，有跟我有同样经历的战友一块讨论一下啊。。。。。。。。
作者: 去看海    时间: 2011-8-31 17:05

你好：
想请教一下，哪一位学者做过定量pcr呀？想问一下都买哪个厂家什么么型号的试剂盒啊？谢谢
作者: 去看海    时间: 2011-8-31 17:06

你好：
想请教一下，哪一位学者做过定量pcr呀？想问一下都买哪个厂家什么么型号的试剂盒啊？谢谢
作者: 过路甲    时间: 2011-8-31 17:07

非常感谢春雨濛濛，按照你提供的protocol，我的COBRA终于也成功了，几个月了，第一次在PCR后看到了目的条带，真是欣喜若狂，本来已经快绝望的实验终于也看到了光明的前途。个人的经验认为在甲基化的实验中，PH值一定要准确，这也关系着处理后能够回收的DNA的量。其实DNA量还是1～2ug比较适宜，多了可能处理不完全。双蒸水本身PH值也要注意一下，原来我配制试剂用的双蒸水都是自己实验室蒸馏的，最近蒸馏器坏了，换了设备科领的双蒸水，而自从换了后实验就成功了，实验中的其他条件及试剂均没有变换过。
个人的经验亚硫酸氢钠还是比较好溶的，而且一般溶的比较快的，也不需要用NaOH调节PH值。
总之，再次衷心地感谢春雨濛濛。
作者: 嗨皮    时间: 2011-8-31 17:08

请教一下，我也要做dna甲基化，我想问一下再dna地区的过程中必须进行RNA酶的处理吗？如果不处理的话会导致什么样的后果？  
作者: 嗨皮    时间: 2011-8-31 17:08

请教一下。要配制3M亚硫酸氢钠怎么配制阿？上面只描述的3.6M的亚硫酸氢钠，谢谢！
作者: finger    时间: 2011-8-31 17:09

请教一下，我也要做dna甲基化，我想问一下再dna地区的过程中必须进行RNA酶的处理吗？如果不处理的话会导致什么样的后果？


不知道你问的时RNA还时RNA酶？

就我所知道的，DNA提取过程中必须加RNase对RNA进行处理。因为MSP的原理是：该法用 HSO3-处理单链DNA，使所有未甲基化的C脱氨转变为U,而甲基化的C则保持不变。然后经特异性扩增放大，测序。C位点就是甲基化位点，C的量即甲基化量。而且甲基化都是对DNA的其中的一条链进行扩增，那么有RNA的话就会对反应有影响。

看有的战友问纯化用的什么试剂盒，我们实验室用的是 QIAGEN DNeasy Tissue Kit 编号 69504 50个反应的，除了有一点改动外，基本就是按上面纯化的步骤俩遍(是我们老板在国外就这么用的）。

我们实验室配的是4.8M 的 sodium bifufite 配方：9.1g sodium bisulfite 19ml H2O 950ul 5N NaOH (adjust pH to 5.0)
作者: @木木@    时间: 2011-8-31 17:10

甲基化MSP后再半巢式PCR对启动子区进行扩增，最后测序，可否。
作者: loli    时间: 2011-8-31 17:10

有没有用过chemicon公司的CpGenome modification kit试剂盒的战友啊，我用了快两个月了还没出结果，有这方面经验的战友给点建议吧。
DNA没问题，都说做的时候要轻柔，但不知道要怎么轻阿，酒精洗的时候白色沉淀用不用打碎？？？？还是只轻轻弹起就行？pH只是不是要求很严格阿，包括亚硫酸氢纳和洗脱用的TE液.还有那些非常敏感要严格注意注意的地方。请战友们帮兄弟分析分析阿！
作者: loli    时间: 2011-8-31 17:10

有没有用过chemicon公司的CpGenome modification kit试剂盒的战友啊，我用了快两个月了还没出结果，有这方面经验的战友给点建议吧。
DNA没问题，都说做的时候要轻柔，但不知道要怎么轻阿，酒精洗的时候白色沉淀用不用打碎？？？？还是只轻轻弹起就行？pH只是不是要求很严格阿，包括亚硫酸氢纳和洗脱用的TE液.还有那些非常敏感要严格注意注意的地方。请战友们帮兄弟分析分析阿！
作者: 小鼹鼠    时间: 2011-8-31 17:11

你好：
再请教一下，在进行DNA提取过程中如果加入RNase对RNA进行处理，大多数都要求RNA酶必须要配制成不含DNA酶的RNA酶，即在购买市售RNA酶后进行再处理，配制成10mg/ml。我想请教一下，所谓的进行再处理具体指什么？怎么样才能判定RNA酶中不含有DNA酶？
还有想请问一下淡泊以明志 宁静而致远 ，你们做的是荧光定量pcr吗？ 你们用的QIAGEN DNeasy Tissue Kit 的试剂盒，效果如何？我要做荧光定量pcr是不是也可以选用呢？谢谢！
作者: finger    时间: 2011-8-31 17:12

你好：
再请教一下，在进行DNA提取过程中如果加入RNase对RNA进行处理，大多数都要求RNA酶必须要配制成不含DNA酶的RNA酶，即在购买市售RNA酶后进行再处理，配制成10mg/ml。我想请教一下，所谓的进行再处理具体指什么？怎么样才能判定RNA酶中不含有DNA酶？
还有想请问一下，你们做的是荧光定量pcr吗？ 你们用的QIAGEN DNeasy Tissue Kit 的试剂盒，效果如何？我要做荧光定量pcr是不是也可以选用呢？谢谢！

---------------------------

你好：
首先回答你的问题，我在做细胞DNA的甲基化修饰时，买的就是公司里没有DNA酶的那种RNase，生工BBI的，没有做什么后处理。

我们当然也做荧光定量PCR，是加TRIZO后送给公司做的。细胞我是拿QIAGEN的试剂盒抽提和纯化的。效果还行，能保证修饰后DNA丢失不多，我都能做出来，主要是你修饰一定要完全，如果修饰不完全，你第一轮的模板可以加到4ul（50ul体系），也能做出来，只不过重复性不好。
作者: 王六六    时间: 2011-8-31 17:13

各位高手帮我分析一下，我也正在做甲基化实验，PCR扩增出的条带很特异，就是大小比预期的小大概80~90bp，不知是什么原因，这种现象正常吗？下面还要回收，连T载体，不敢往下做呀！帮帮忙吧！
作者: 阿拉蕾    时间: 2011-9-1 09:01     标题: 回复 #111 王六六 的帖子

楼上说的情况，我没遇到过。你说比预期的小大概80－90bp，是拿软件对照maker计算出来的吗？如果是，可以说明，那肯定不是你要的目的条带了。那你还连T载体就没意义了。

首先，比对一下你的引物有没有设计错。其次，你的pcr的条件是不是摸索好了。你的引物是文献报道过的，还是自己设计的？
作者: 岸上的鱼    时间: 2011-9-1 09:08

只是目测的，并没有用软件分析。？？？
作者: 阿拉蕾    时间: 2011-9-1 09:09

用跟你一样的试剂盒（从生物谷抄过来的），感觉会对你有帮助。

1. 我溶NaOH的水PH值大概在6.5左右，所以我每次调Reagent I的时候3MNaO0H

基本都要加150uL左右。

2. 解链时用50度水浴15分钟。

3. 加入Reagent I后，50度水浴16小时。

4. 加入Reagent II和III后，室温孵育10分钟

5. 第一次离心用9000 rpm 5分钟。

6. 70%乙醇清洗3次，每次9000rpm 1 分钟，最后一次13000rpm2min。

7. 加入20mM NaOH/90%EtOH后，反映5分钟。

8. 不要去掉20mM NaOH/90%EtOH，直接加入90%乙醇后离心，9000rpm 1min

9. 90%乙醇清洗2次，每次9000 rpm 1 min，最后一次13000rpm 3min

10. PH 7.5 TE buffer 65度 溶解 15 min

PS: 如果发现ＰＣＲ结果中M,U,W都有产物，则提高些退火温度，因为毕竟这几对引物都只由几次位点甚至只有一个位点的差异，故非特异结合的可能性很大。

另外，每次PCR前一定把处理的DNA离心一下，因为会有残留的小珠，即Reagent III，它会影响PCR的结果。
作者: 小荷尖尖    时间: 2011-9-1 09:09

请教一下各位高手，为什么做MSP时亚硫酸盐处理不完全会有假阳性结果啊？很困惑！谢谢回复！
作者: HOT兔    时间: 2011-9-1 09:10

可能个人的经验不一样，我调Reagent I 的PH 3MNaO0H加50uL左右
作者: @花开花落@    时间: 2011-9-1 09:11

请问您是怎么调亚硫酸氢钠的PH值的？是用PH计呢还是试纸？以您的经验，如果用3M NaOH调的话，配5ml加多少比较合适？如果偏酸或偏碱，分别会有什么后果呀？
作者: 绿茶公子    时间: 2011-9-1 09:12

第三步当中提到石蜡油啊,请问是从石蜡标本中提取DNA么?希望尽快回答啊.谢谢了
作者: 牙牙    时间: 2011-9-1 09:13

楼主好!
请问如果我研究的基因序列启动子区没有CpG岛,选择一段CG含量多的序列设计引物作MSP有意义吗?
作者: 跳跳糖    时间: 2011-9-1 09:15

楼上的，我们研究甲基化，主要是看这种表观遗传现象对基因有什么影响，一般研究启动子区，可以看甲基化后，基因的mRNA有上调还是下降，在和样本的信息联系，看这种上调或下降对某基因的表达有什么影响，当然mRNA的表达有的时候和蛋白的表达不成线性关系的。

你的问题，假如选这一段GC含量高的，那你即使测出有甲基化，怎么和表达联系，或者你可以和cDNA联系，在和该基因表达的蛋白联系？甲基化只不过是5'端多了个CH3，但这种改变会不会导致该基因表达蛋白的变化，还没有确证，因为碱基是没变的。还有就是甲基化的间接作用：基因5′端调控序列甲基化后与核内甲基化CG序列结合蛋白(methyl CG-binding p rotein)结合,阻止了转录因子与基因形成转录复合物(大多是靠近转录起始区）

所以你随便找个高GC的区域研究是一般是没有意义的！（个人见解，请大家指正！）
作者: 冷眼相对    时间: 2011-9-1 09:16

总算找到甲基化组织了，不容易。
这里我有些问题想请教各位战友，特别是春雨楼主。

我的情况很许多人一样。做的是kit提组织DNA，zymo的甲基化修饰试剂盒，一般的Taq酶跑巢式MSP。引物依据文献。
原先用两个样本摸条件，目的条带也都出来了。以为条件已经成熟，上了大批量，结果pcr第一轮什么都没有了。

之后DNA重新提过，修饰过，酶，等PCR材料都换过了条件也没变，还是老样子。
很苦恼一直找不到原因。请大侠帮忙分析一下，明天打算轻柔的再仔细试一下。

甲基化修饰后的DNA，－20℃保存时间有多长？所说单链不稳定，容易降解，我想－20℃应该还可以吧，4℃是一个礼拜就降解没了的，吃过苦头了。
作者: 冷眼相对    时间: 2011-9-1 09:16

总算找到甲基化组织了，不容易。
这里我有些问题想请教各位战友，特别是春雨楼主。

我的情况很许多人一样。做的是kit提组织DNA，zymo的甲基化修饰试剂盒，一般的Taq酶跑巢式MSP。引物依据文献。
原先用两个样本摸条件，目的条带也都出来了。以为条件已经成熟，上了大批量，结果pcr第一轮什么都没有了。

之后DNA重新提过，修饰过，酶，等PCR材料都换过了条件也没变，还是老样子。
很苦恼一直找不到原因。请大侠帮忙分析一下，明天打算轻柔的再仔细试一下。

甲基化修饰后的DNA，－20℃保存时间有多长？所说单链不稳定，容易降解，我想－20℃应该还可以吧，4℃是一个礼拜就降解没了的，吃过苦头了。
作者: finger    时间: 2011-9-1 09:17



QUOTE:
原帖由 跳跳糖 于 2011-9-1 09:15 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
楼上的，我们研究甲基化，主要是看这种表观遗传现象对基因有什么影响，一般研究启动子区，可以看甲基化后，基因的mRNA有上调还是下降，在和样本的信息联系，看这种上调或下降对某基因的表达有什么影响，当然mRNA的表达有的时候和蛋白 ...


同意此意见
作者: 年轮    时间: 2011-9-1 09:17

NaHSO3和对苯二酚的具体配制过程能讲一下吗？我从好多文献上看过其配制都觉得很麻烦，觉得您的配置方法好像不错，想请教一下您的具体方法，谢谢。
作者: 葡萄籽    时间: 2011-9-1 09:18

大家好
想请教一下各位，甲基化特异性的引物序列，文献上都只有其具体的序列，但是有一个问题我一直不明白，究竟哪个位点进行了甲基化修饰，有文献上说是在5‘端，可是序列上并没有标明哪一碱基进行了甲基化，进行序列合成时也只是按照文献上说的序列进行合成，也没有标明具体对哪一个碱基进行修饰而为什么就认为那样的序列就是甲基化特异性的呢？问题可能有点幼稚，但真的很想知道。敬请各位指点迷津， 谢谢
作者: 天蓝蓝    时间: 2011-9-1 09:19

请教各位
我刚接触试验,问一个弱的问题,就是DNA提取后,跑了电泳,下一步取2ug进行试验,这个2ug是怎么定量的呀?
作者: 阿福    时间: 2011-9-1 09:19

先用紫外分光光度计测量你的基因组模版浓度，得出个数值，在按你的数值加××ul 就可以了。如模版浓度500ng/ul，那么你就加4ul模版，在加46ul ddH2O就可以（这里我们实验室是按50ul做的）
作者: 阿福    时间: 2011-9-1 09:20



QUOTE:
原帖由 葡萄籽 于 2011-9-1 09:18 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
大家好
想请教一下各位，甲基化特异性的引物序列，文献上都只有其具体的序列，但是有一个问题我一直不明白，究竟哪个位点进行了甲基化修饰，有文献上说是在5‘端，可是序列上并没有标明哪一碱基进行了甲基化，进行序列合成时也只是 ...

甲基化是胞嘧啶的5‘端发生甲基化。甲基化引物序列是根据你模版修饰改变后设计的，如果你没修饰前的引物结合区假设是：AGCG****，那么修饰后还是AGCG****,如果是AACG****，那么修饰后就变成AAUG****，这样的话你的甲级化引物要和其想对应。非甲级化引物就不考虑上述变化。
作者: 冰激凌小姐    时间: 2011-9-1 09:21

大家好!
再次提问:基因启动子区域若无CpG岛是否没必要做MSP?
换做MS-SSCA法行吗?
作者: 阿福    时间: 2011-9-1 09:22

楼上的~
首先你要明确MS-SSCA原理：甲基化敏感性单链构象分析（MS-SSCA）又称重亚硫酸盐甲基化-PCR-SSCP（Single-Strand Conformation Polymorphism，SSCP）（BiPS），由Maekawa等1999年报道。方法是：先用重亚硫酸盐处理待测片段，针对非CG二核苷酸区设计引物进行PCR扩增，扩增产物变性后作非变性的聚丙酰胺凝胶电泳，由于DNA电泳时的移动性取决于其二级结构即DNA的空间构象，而后者又由DNA碱基的序列决定。因此，经处理后变性的单链DNA将停留在聚丙酰胺膜的不同位置上，这样甲基化与非甲基化的就被分离开，随后行单链构象多态性分析加以明确。

这种方法的优点是：1.能够方便的应用于任何序列的甲基化状态分析；2.能够对甲基化的等位基因进行半定量；3.可以提示甲基化状态分布的不均匀性；缺点是：1.只有甲基化水平较高的单链才能明显的区分开，而较低水平的则不易分开，有时会因甲基化的CpG位点随机和不均匀分布导致电泳条带出现拥挤、拖尾的现象，故敏感性及准确性略低；2.检测片段不宜过长。

也是基于对CpG岛的甲基化研究！不管哪种甲基化研究方法，如果你要研究的区域没有CpG岛，都是没有意义的。但可以研究该启动子区域，单核苷酸多态对启动子的影响！
作者: 冰激凌小姐    时间: 2011-9-1 09:22

另外,2006年底nature上一篇文献提到:非CpG岛序列的甲基化状态发生改变也可以影响基因表达.正是基于此,导师坚持要继续做甲基化,苦于目前研究的方法都涉及CpG岛,实验毫无进展.请问liuzeyi2002,有没有具体方法可行呀?
作者: 阿福    时间: 2011-9-1 09:24

学习了，能否把你的这篇文章发给我！因我们实验室主要研究是肿瘤遗传易感性的，主要是甲基化和SNP。还真不知道非CpG岛序列的甲基化的研究方法！
作者: 麻瓜    时间: 2011-9-1 09:25

楼主，你好！我最近也准备做甲基化这方面的东西。虽然看了些资料但对这个技术还不是很了解。有个问题想请教：你做的是组织提取DNA吗？可以做单个细胞的DNA提取？亚硫酸盐修饰DNA的一系列的过程比较繁琐，步骤较多，如果我采用此方法提取单个细胞的DNA是不是困难加大，进一步做PCR的话是不是比较难跑出带？因为是以前完全是门外汉，提的问题可能有点幼稚，希望能得到尽快你的答复，谢谢！
作者: 阿福    时间: 2011-9-1 09:28



QUOTE:
原帖由 麻瓜 于 2011-9-1 09:25 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
楼主，你好！我最近也准备做甲基化这方面的东西。虽然看了些资料但对这个技术还不是很了解。有个问题想请教：你做的是组织提取DNA吗？可以做单个细胞的DNA提取？亚硫酸盐修饰DNA的一系列的过程比较繁琐，步骤较多，如果我采用此方 ...

我们实验室是做的癌组织的，最近也做细胞的。隔壁实验室做的是血样的。

不知道你说单个细胞DNA是什么？
作者: 格格巫    时间: 2011-9-1 09:28

我想做的早期胚胎的细胞，早期的胚胎细胞数目较少，不知提取DNA是否有困难？
作者: 阿福    时间: 2011-9-1 09:29

因为甲基化模板初始要求2ug，你的胚胎细胞数目少（不知道少到什么程度），可能很难达到要求量！因为我做肿瘤细胞抽提DNA，也要求培养细胞达到5×10的6次方（QIAGEN试剂盒）
作者: 格格巫    时间: 2011-9-1 09:31

只有2-8个细胞左右， 这样可以提到2ug？现在还没开始实验还不是很清楚能不能提到2ug？
作者: fangxiang    时间: 2011-9-1 09:33

我用Chemicon的盒子还没做出来，想试试手工的。请问搂主您手工修饰的试剂除了亚硫酸盐以外都是国产的普通试剂吗？提纯的试剂盒多少钱啊?
作者: 阿拉蕾    时间: 2011-9-1 09:34

我就在这里回答楼上的问题了，不PM了！

试剂对苯二酚最好是国外的，我们用的是sigma的。亚硫酸盐用的是MERCK的，产品号K33542428.其他的就用的国内的。

纯化试剂盒，用的是QIAGEN Tissue Kit cat no :69504
（效果很好）
作者: 竹蜻蜓    时间: 2011-9-1 09:35

大家好！！有个关于引物的问题，希望帮忙看看。有战友说过可以用普通引物扩扩修前的目的基因片断看看，那修饰后得甲基化引物也是针对因为甲基化而没有变化的目的基因因片段的，这两种引物能通用吗？有什么区别？？？另外，有用chemicon修饰试剂盒的战友吗??? 他的说明书后面关于引物设计的描述提到了W引物，这是不是说的扩修饰前基因的普通引物？？
谢谢了
作者: 竹蜻蜓    时间: 2011-9-1 09:36

比较菜，还是不太明白，甲基化是说整个CpG岛的C都变成U了还是只有部分碱基变化了？？？？您上面的例子为什么只有一个碱基变化了？？如果都甲基化了，那么修饰后的目的区应该没变啊？？不知道我这样理解对不对。
作者: 阿拉蕾    时间: 2011-9-1 09:36

修饰后基因的甲基化，我们一般是这样认为的，因为CpG岛已经发生甲基化，那修饰后这里是不变的，但不是CpG岛的C要被化学修饰成U
作者: 竹蜻蜓    时间: 2011-9-1 09:38

对阿，那CpG岛是说C和G特别集中的部分把，我的引物不就是针对这片不变的甲基化区吗？与非CpG岛的地方有关系吗？  
作者: 还是孩子    时间: 2011-9-1 09:39

你好！请问楼主，在DNA用亚硫酸氢盐处理之前你是否酶切过？另外，不同个体的DNA能否混合在一起进行处理？谢谢！
作者: finger    时间: 2011-9-1 09:40

回复楼上：

酶切？没有。不知道你说的酶切由什么目的？我们倒是要进行RNase处理一下RNA。

不同个体的DNA混在一起，那你最后怎么区分啊？我们是每个样本单独修饰！
作者: 按秒计算    时间: 2011-9-1 09:50

楼主好!
能帮我看看我的MSP引物吗?是在线软件设计的.源序列为 1 cgaggatgtg cgtgggggct cggcggctgg gccgcgggcc gtgtgcggct ctgctcctcc
61 tgggcctggg gctgagcacc gtgacggggc tccactgtgt cggggacacc taccccagca
121 acgaccggtg ctgccacgag tgcaggccag gtgaggcctc aggaggggtc gccacgcacg
181 ggcactccag ggactggggg ctggggcagg gatgggccag ccaggaggct ggtcctgggg
241 agggggcggg tgaggggccg gccaagcctg gcagaggagc cgcctggggg ggtccacggg
301 cgcaagcctg gggcctgacc gctgcctgac gccggcctct gctgcaggca acgggatggt
361 gagccgctgc agccgctccc agaacacggt gtgccgtccg tgcgggccgg gcttctacaa
421 cgacgtggtc agctccaagc cgtgcaagcc ctgcacgtgg tgtaacctca gtgagctccc
481 acctggcccc acagccccac ccagcacagg gggcggcagc ctggcaccca cattcccacg
541 cagcagcatg gggctcccac agccgcagaa acgaacctca aaccacagcg gggtctgctc
601 cgccacaggg gtccttcgag gagctgaggc gtctcccagg ggcaccccct ctccctccgg
661 gggcccagac tcggcccagg ccacgtggag tcggggagac cacgctggcc atgtggcctg
721 gccttgctgg cctgagcagt gaggctgggg ggttgggcca tggagaccct gccgcaggcg
781 gggctggcgg ctggaggcgg tggaggggta gggaagggtg gctggggctg ccacggaacc
841 agccccaggt tgtggccagg aagggagggc ccaggagcct cgggggctgc aggggctcca
901 agtctcaggg gaggccgcag acccctgccc acggccctct gtgtggtggg gaggccaacc
961 tgtcctccag tgcccacgct tcctgaggac cctgtccaca gcccccacct gaccaccccc
1021 ccatccggcc cctgctcagg aagtgggagt gagcggaagc agctgtgcac ggccacacag
1081 gacacagtct gccgctgccg ggcgggcacc cagcccctgg acagctacaa gcctggagtt
1141 ggtgagctcg gtggctgcgg ccggcggttg ggggtgtgca tagcggctgt ctgtgacgca
1201 gatgggccgt gggccgcagg gacctggccc caccggtgcc tcctctggca tcctcaagac
1261 cgagctcccg ggtcagggcc cacgggtggg atgtgggcag ggagggcttc cagaggccaa
1321 acccaccacc cagccatggg gggcaagtgc ctgccccaca ggctctgccc catgtcccca
1381 gcacccgggg cctgtgggca gcccctgacc accctatctt tgttgcagac tgtgccccct
1441 gccctccagg gcacttctcc ccaggcgaca accaggcctg caagccctgg accaagtgag
1501 gggcctggcc aggggctggg aggggctggg ggggggttgg ggtggttagg agggcggagg
1561 agctggggag ctgggagggg ctgggggggc aggtggggtg ggggcagttt tgggggaagg
1621 ggaggtgctg gtggccctgg gggcctggct atgtggctgg acctggttgg ggagcaggaa
1681 gctgctgcct gggggcagcc tttccctgtg ggtggagctg ggtgtgtggg accctcaccc
1741 tccgcagctg ggaggccctg ggggcacagg acagggaggt gctggtgggg ggtgtagatg
1801 tgggagaagg gtgtgtggcc ttggaggccc ctgtgggggg cacgtggggc tgggcagcgt
1861 ccttggctgt cactggcctg gtgtctgtgg tagatgctgc ctgtggctgg ccagcgtgga
1921 ccctgttatc cccaccgcat ctcccgggtc ccagggggtt tctggcctga gcaacacctc
1981 ctgttcccca acagctgcac cttggctggg aagcacaccc tgcagccggc cagcaatagc
2041 tcggacgcaa tctgtgagga cagggacccc ccagccacgc agccccagga gacccagggc
2101 cccccggcca ggcccatcac tgtccagccc actgaagcct ggcccagaac ctcacaggga
2161 ccctccaccc ggcccgtgga ggtccccggg ggtaagggcg cctggcccag cccagcgggg
2221 cccccaaccc gaataggaga aggggagggc ggcatggggg cccctcctgt ggaccccacc
2281 cagcagaccc cttcctgcag gccgtgcggt tgccgccatc ctgggcctgg gcctggtgct
2341 ggggctgctg ggccccctgg ccatcctgct ggccctgtac ctgctccgga gggaccagag
2401 gctgcccccc gatgcccaca agccccctgg tgagtgcctc atggccctgc cgcactgctc
2461 ctggcgggtg aggcccaccc accaatctct ccttttttcc tccccagggg gaggcagttt
2521 ccggaccccc atccaagagg agcaggccga cgcccactcc accctggcca agatctgacc
2581 tgggcccacc aaggtggacg ctgggccccg ccaggctgga gcccggaggg tctgctgggc
2641 gagcagggca ggtgcaggcc gcctgccccg ccacgctcct gggccaactc tgcaccgttc
2701 taggtgccga tggctgcctc cggctctctg cttacgtatg ccatgcatac ctcctgcccc
2761 gcgggaccac aataaaaacc ttggcagacg ggagtctccg accggca
引物为rimer Start Size Tm GC% 'C's Sequence
Left M primer 259 23 58.40 73.91 6 CGGTTAAGTTTGGTAGAGGAGTC
Right M primer 442 23 59.65 65.22 5 CGACTTAAAACTAACCACGTCGT
Product size: 184, Tm: 77.4
Left U primer 257 25 58.34 76.00 7 GTTGGTTAAGTTTGGTAGAGGAGTT
Right U primer 443 25 55.40 60.00 5 ACAACTTAAAACTAACCACATCATT
作者: 牙牙    时间: 2011-9-1 10:34

大家好,我是新手,想请教大家,设计甲基化引物用的是DNA还是mRNA序列,需要区别吗?
作者: 柠檬籽    时间: 2011-9-1 10:35

当然是DNA，主要是研究DAN5‘调控区的甲基化。甲基化设计引物网站：cuturl('www.urogene.org/methprimer/'),可搜索文献：methyprimer: designing primers for methylation PCRs
作者: Darcy    时间: 2011-9-1 10:43

大家好。我刚接触这方面的东西，很多问题都不了解。请教各位：用福尔马林泡过的肺癌组织还可以用来做MSP么？DNA提取方法与新鲜的组织有何不同么？还有各位前辈能否上传一份MSP所需试剂清单？多谢啦！  
作者: 阿福    时间: 2011-9-1 10:45

大家好。我刚接触这方面的东西，很多问题都不了解。请教各位：用福尔马林泡过的肺癌组织还可以用来做MSP么？DNA提取方法与新鲜的组织有何不同么？还有各位前辈能否上传一份MSP所需试剂清单？多谢啦！

---------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------

我们一般把肺癌组织放液氮中，没有泡福尔马林，所以不知道能不能做MSP，不知道对MSP有什么影响（一般我们选择的是放化疗前的病人），我也给你在园子里找了，没人做过。ID：依依的战友老早就提出你这个问题了，没有人解决。

你的第二人问题，提供一个链接给你，希望对你有帮助！
(甲基化的一些旧贴总结整理，希望对新人有帮助！)
cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=67&id=9184927&sty=1&tpg=1&age=0')
作者: dreaming    时间: 2011-9-1 10:46

另外,2006年底nature上一篇文献提到:非CpG岛序列的甲基化状态发生改变也可以影响基因表达.正是基于此,导师坚持要继续做甲基化,苦于目前研究的方法都涉及CpG岛,实验毫无进展.请问liuzeyi2002,有没有具体方法可行呀?

学习了，能否把你的这篇文章发给我！因我们实验室主要研究是肿瘤遗传易感性的，主要是甲基化和SNP。还真不知道非CpG岛序列的甲基化的研究方法！
这篇文献的相关线索是：Brena RM， Huang THM，Plass C Toward ahuman epigeneme Nature Genetics 2006，38（12）：1359-1360
抱歉！导师给的是纸质版材料。若你有兴趣，可上网查查看。敬待交流指导！
作者: 花裙子    时间: 2011-9-1 10:47

大家好。我刚接触这方面的东西，很多问题都不了解。请教各位：用福尔马林泡过的肺癌组织还可以用来做MSP么？DNA提取方法与新鲜的组织有何不同么？还有各位前辈能否上传一份MSP所需试剂清单？多谢啦！

------------------------------------------------------------------------------------------

我正好做过这方面的实验，不过结果并不太好，这要还是提取DNA那一步，消化比较困难，我曾经有过把解剖教研室拿来的肝组织加强消化液和蛋白酶K两周没有消化掉的记录，呵呵，想起来都有意思。
从亚硫酸盐修饰DNA测定甲基化的原理上来说，我认为福尔马林浸泡的组织也好，其他什么处理的组织也好，都不会影响检测，因为修饰前的强碱变型的那一步对DNA的打断和变性都应该比这些处理的过程对DNA损伤严重，这点你可以从仔细阅读发展这个方法的早期文献得到。所以，原则上，你只要提出DNA，哪怕质量差点，MSP是能做的。当然，我说的是一个理论问题，实际操作要困难些，比如我上面说到的我的经历。
作者: 过路甲    时间: 2011-9-1 10:48



QUOTE:
原帖由 dreaming 于 2011-9-1 10:46 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
另外,2006年底nature上一篇文献提到:非CpG岛序列的甲基化状态发生改变也可以影响基因表达.正是基于此,导师坚持要继续做甲基化,苦于目前研究的方法都涉及CpG岛,实验毫无进展.请问liuzeyi2002,有没有具体方法可行呀?

...

一直在做BSP和MSP，对基因组整体甲基化的研究向来望而却步，但是，据我所知这方面文章是不少的，特别你去看看甲基化检测方法学方面的综述，很多要提到这点，我记得的方法包括：酶切、DHPLC、MS等等，应该不难找。不过抱歉我就不能直接找来给你了。
作者: 绵绵    时间: 2011-9-1 10:48

请问楼主我的水对照的U那管总出现两条带，与阴性对照的那管区分不开，请问这是怎么回事，谢谢！
作者: 微笑的海豚    时间: 2011-9-1 10:50

楼上：
我来回答你这个问题吧，你这不是甲基化检测的问题，是PCR污染的问题。正好做过PCR污染方面的培训，所以回答一下，希望对你有帮助。
这种情况就是PCR污染了，英文多数时候称为‘carry-over contamination '。一般来说PCR污染分为三种情况：样本间交叉污染(inter-sample contamination)；质粒污染（cloned vector contamination)和PCR扩增产物污染（PCR amplicons contamination, amplicon carryover）。通常情况你比较容易排除前两种可能，PCR产物污染最为常见。出现污染最可能的原因有哪些呢？一般情况下有：操作错误或者误差造成的样品间交差污染；PCR试剂的污染；PCR实验器材的污染；
气溶胶（Amplicon Aerosol）。那你看看你是那种情况，再对症下药。如果你只是想快点解决问题，不想过多追究原因，也有一个比较简单的办法，那就是：1）换试剂，把你所有PCR的试剂都换掉；2）换地方和器材。
最后说一句，PCR污染是个大问题，我个人甚至认为没遇到过PCR污染，你不能说懂得PCR。
作者: 细水长流    时间: 2011-9-1 10:50

大家好，我也在做dna甲基化方面的课题，在对基因组dna进行亚硫酸氢盐修饰的过程中，大家都一致提到调节pH的重要性，我在做试验的过程中用PH计检测PH值，用氢氧化钠来调节PH值，但是每次调节都在4.99－5.05之间，很少有刚好为5.0的时候，我想知道这样对修饰有没有影响？还有一个问题就是，我们做修饰时要用3M的亚硫酸氢钠，这个单纯配制时比较容易，但是配制好的溶液在用氢氧化钠调节PH值时他的物质的量浓度好像也会发生改变吧？有人告诉我，开始配制时水量可以适量少一点，调好pH值后再定容，但是这样的话pH值会发生改变吗？并且配制好，调节好PH值的溶液加到50ul的dna溶液中后，其PH值好像也不是5.0了吧，不知道我们需要的是单纯PH值为5.0的亚硫酸氢钠，还是要求整个修饰反应体系的PH值为5.0，一直搞不懂这几个问题，自己修饰出来的dna也扩增不出东西来，不知道什么原因，很着急，麻烦各位高手指点一下迷津，非常非常感谢！！！！！
作者: 许愿精灵    时间: 2011-9-1 10:51

希望大家多多发言交流！

cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=67&id=9295899&sty=1')

cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=67&id=9184927&sty=3')
作者: 王六六    时间: 2011-9-1 10:51

请教大家,我提取好的DNA测浓度,稀释后测定,与放置时间有关吗,我怎么稀释好的DNA放置时间越长,测得的浓度越高呀?测定了三次,一次比一次高?

还有我修饰后DNA测浓度,应该安单链DNA还是双链DNA算呀?

请大家多多指导
作者: finger    时间: 2011-9-1 10:52     标题: 回复 #159 王六六 的帖子

越来越高，可能的原因是放置时间长了，DNA降解，所以OD有变化，致使你换算成浓度增高，放－70度冰箱，尽量小份分装，防止多次反复冻溶。

修饰后的DNA因化学修饰的原因，按单链DAN算！

祝试验顺利！
作者: 细水长流    时间: 2011-9-1 10:52

再请教,我的三次不是放置一段时间测定的,就是连续三次测定的,中间间隔大约才一分钟.  
作者: 微笑的海豚    时间: 2011-9-1 10:53     标题: 回复 #161 细水长流 的帖子

那你三次由没由打匀，比色皿用的是一样的进光面吗？我上次测，一样的比色皿进光面不一样，测的OD有不样！
作者: 大猫    时间: 2011-9-1 10:53

进光面是一样的,就是比色皿是黑色的,根本没法看见里面,我先在外面混匀在加进去测定行吗?我是稀释了35倍测的
作者: 微笑的海豚    时间: 2011-9-1 10:53

我也是在外面混匀加进去，但我先拿蒸馏水清洗比色皿，拿稀释好得模板（我一般稀释100倍，便于计算）润洗一下，在测浓度！
作者: 胖小妮子    时间: 2011-9-1 10:54

请教大家一个问题,如果样品非常非常少的话,如何抽DNA,这样获得的DNA量,够修饰用吗?有什么方法能分析样品特别少的甲基化方法吗
作者: finger    时间: 2011-9-1 10:54     标题: 回复 #165 胖小妮子 的帖子

DNA能达到1ug，就可以做修饰。提取DNA的方法都是一样的，提取后可以纯化，纯化的步骤各有不同。我使用的离心柱最少洗脱要50ul，少了不能完全洗脱。量如果太少，这种方法获得的DNA溶液会太稀。可参考分子克隆试验指南中关于DNA纯化的步骤。如提取的量不能达到1ug，不能修饰。
作者: 胖小妮子    时间: 2011-9-1 10:55

谢谢!
但是我的样品量实在太少了,我担心用常规方法抽提DNA,会损失太多!
有不有什么能抽得较纯的DNA,而DNA量损失又较少?
还有,我能不能直接加蛋白质酶K和SDS来裂解,然后取上清进行修饰?
作者: finger    时间: 2011-9-1 10:55     标题: 回复 #167 胖小妮子 的帖子

不能直接用上清进行修饰，不知你的课题是否有相关文献可以参考，可以多查阅一下文献。
作者: 胖小妮子    时间: 2011-9-1 10:56

谢谢!
我课题在这方法没有相关的报道,都还处在摸索阶段,但材料来源太少,又珍贵,所以不容得我去浪费.
所以想听听各位大侠的意件.
那么说,我只能通过微量抽提DNA试剂盒提得大于1ug的DNA量,材能进行我后序的实验了,是吗?
还有,有没有除了亚硫酸氢盐处理后测序列的方法外,还有不有其它方法,能检测微量DNA的甲基化水平的方法啊?即,只要DNA,就能检测出的敏感方法.
谢谢了!
作者: 不懂    时间: 2011-9-1 10:56

谢谢楼主。
我用的是美国chemicon公司的DNA修饰试剂盒(CpGenometm DNA modification KIT)，引物是参照文献的，结果现在就是扩增不出来。
作者: =菓子=    时间: 2011-9-1 10:57

测基因组DNA时，稀释1000倍后还能测出浓度么，因为我的DNA量不多只能加大稀释倍数。谢谢啦！！！
作者: 哇啦    时间: 2011-9-1 10:58

我是 上海杰美基因公司的 通用型DNA甲基化检测试剂盒(属于亚硫酸氢盐修饰的方法),遇到一个很棘手的问题:
加2ug进行转化实验,转化之后再做PCR,结果什么也没有.再回头一步步找问题.转化之前跑电泳,条带非常好,转化之后再跑电泳,结果什么也没有.查资料发现亚硫酸氢盐修饰的方法 会 造成DNA碎裂降解.
请问高手,如何避免转化实验时DNA的碎裂降解!!!
望各位帮帮忙!
作者: 飞天小鹿    时间: 2011-9-1 10:59

请问楼主，我处理后想扩2-3kb的产物，不知道是否可能？因为我现在一直P不出来。  
作者: 阿拉蕾    时间: 2011-9-1 11:00     标题: 回复 #172 哇啦 的帖子

我只知道这个是无法避免的！
作者: 微笑的海豚    时间: 2011-9-1 11:04

大家好，我也在做dna甲基化方面的课题，在对基因组dna进行亚硫酸氢盐修饰的过程中，大家都一致提到调节pH的重要性，我在做试验的过程中用PH计检测PH值，用氢氧化钠来调节PH值，但是每次调节都在4.99－5.05之间，很少有刚好为5.0的时候，我想知道这样对修饰有没有影响？还有一个问题就是，我们做修饰时要用3M的亚硫酸氢钠，这个单纯配制时比较容易，但是配制好的溶液在用氢氧化钠调节PH值时他的物质的量浓度好像也会发生改变吧？有人告诉我，开始配制时水量可以适量少一点，调好pH值后再定容，但是这样的话pH值会发生改变吗？并且配制好，调节好PH值的溶液加到50ul的dna溶液中后，其PH值好像也不是5.0了吧，不知道我们需要的是单纯PH值为5.0的亚硫酸氢钠，还是要求整个修饰反应体系的PH值为5.0，一直搞不懂这几个问题，自己修饰出来的dna也扩增不出东西来，不知道什么原因，很着急，麻烦各位高手指点一下迷津，非常非常感谢！！！！！

----------------------------------------------------------------------

有文献提到，PH4.5-5之间都可以，没有太大的影响。
作者: 小葵    时间: 2011-9-1 11:05

甲基化是目前的研究热点，就我所做的一点工作并其中一点心得，与大家分享。希望能够对大家有所帮助。
第一部分 基因组DNA的提取。
这一步没有悬念，完全可以购买供细胞或组织使用的DNA提取试剂盒，如果实验室条件成熟，自己配试剂提取完全可以。DNA比较稳定，只要在操作中不要使用暴力，提出的基因组DNA应该是完整的。
此步重点在于DNA的纯度，即减少或避免RNA、蛋白的污染很重要。因此在提取过程中需使用蛋白酶K及RNA酶以去除两者。
使用两者的细节：
1：蛋白酶K可以使用灭菌双蒸水配制成20mg/ml；
2：RNA酶必须要配制成不含DNA酶的RNA酶，即在购买市售RNA酶后进行再处理，配制成10mg/ml。否则可能的后果是不仅没有RNA，连DNA也被消化了。两者均于-20度保存。
验证提取DNA的纯度的方法有二：
1：紫外分光光度计计算OD比值；
2：1%-1.5%的琼脂糖凝胶电泳。
我倾向于第二种方法，这种方法完全可以明确所提基因组DNA的纯度，并根据Marker的上样量估计其浓度，以用于下一步的修饰。

----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------

即在购买市售RNA酶后进行再处理，楼主的这句话我想请教一下：如何再处理？能否将步骤列出或PM我。谢谢。
作者: 丸子妹    时间: 2011-9-1 11:06

哇塞，学到很多，打算实验也是做MSP，但是却什么都不懂，以后要请教各位大虾
作者: finger    时间: 2011-9-1 11:07

即在购买市售RNA酶后进行再处理，楼主的这句话我想请教一下：如何再处理？能否将步骤列出或PM我。谢谢。

------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------

回答：我实验中所用的RNA酶是比较便宜的国产RNase A，为保险起见参考《细胞实验指南》第二版P1391的处理方法将其处理。简述如下：
RNase 加0.01M乙酸钠（PH 5.2）稀释至10ug/ml，100度加热15分钟，冷却至室温后加1/10体积1M的Tris-cl（PH 7.4），调节ph。分装后储存于-20度避免微生物生长。
作者: finger    时间: 2011-9-1 11:08

请问楼主，我处理后想扩2-3kb的产物，不知道是否可能？因为我现在一直P不出来。

------------------------------------------------------------------------------------------------------------------

回答：扩增如此之大的片段，难度太大。分为小片段扩增，长度在400bp以下，我感觉比较容易。
作者: finger    时间: 2011-9-1 11:09

大家好，我也在做dna甲基化方面的课题，在对基因组dna进行亚硫酸氢盐修饰的过程中，大家都一致提到调节pH的重要性，我在做试验的过程中用PH计检测PH值，用氢氧化钠来调节PH值，但是每次调节都在4.99－5.05之间，很少有刚好为5.0的时候，我想知道这样对修饰有没有影响？还有一个问题就是，我们做修饰时要用3M的亚硫酸氢钠，这个单纯配制时比较容易，但是配制好的溶液在用氢氧化钠调节PH值时他的物质的量浓度好像也会发生改变吧？有人告诉我，开始配制时水量可以适量少一点，调好pH值后再定容，但是这样的话pH值会发生改变吗？并且配制好，调节好PH值的溶液加到50ul的dna溶液中后，其PH值好像也不是5.0了吧，不知道我们需要的是单纯PH值为5.0的亚硫酸氢钠，还是要求整个修饰反应体系的PH值为5.0，一直搞不懂这几个问题，自己修饰出来的dna也扩增不出东西来，不知道什么原因，很着急，麻烦各位高手指点一下迷津，非常非常感谢！！！！！

----------------------------------------------------------

回答：根据文献，亚硫酸氢盐的配置如下：
1.88g亚硫酸氢钠使用DDW稀释，并以3M NaOH滴定溶液至pH 5.0，最终定容为为5ml。
由此可见，亚硫酸氢钠的PH调为5.0，而非整个修饰体系的PH为5.0。
最后定容加的水很少，影响应该不大。
作者: =菓子=    时间: 2011-9-1 11:10

回答：DNA在修饰的过程中是单链状态，颇似RNA，断裂不可避免。操作中不要剧烈的吹打、振荡，可减少DNA的损失。修饰后电泳常常没有什么条带，我也曾经跑过，具体原因我也不太清楚，所以我感觉不跑电泳也是可取的。

-----------------------------------------------------------------------------------------------------------

但是我转化实验后在做 梯度PCR 结果还是什么也没有.请你帮我分析一下,我该从哪个方面去找问题,急急!!!
再次非常感谢大家的帮助!!!
作者: HOT兔    时间: 2011-9-1 11:12

大家好，我正用MSP做甲基化研究，初次试验不太顺利！
我前部分亚硫酸氢钠处理基本按照春雨濛濛老师的的方法进行，但纯化处理后测其纯度很低，1.0左右，处理前模板DNA 纯度基本达标（1.76~2.00），不知为何？处理后纯度低是否影响后边的PCR扩增？我用处理后的DNA跑PCR摸索了好多条件多没有出来目的条带，只有引物二聚体！是PCR反应体系和条件不对，还是前边的处理出了问题？我的反应体系和条件如下：
10×PCR buffer 2.5μl
25mM MgCl2 1.5μl
2.5mM dNTP 1.0 μl
10μM 引物（上游） 1.0μl
10μM引物（下游） 1.0μl
NaHSO3处理后的基因组DNA 4.0μl （约100ng）
5U/μl Taq DNA聚合酶 0.5μl
无菌双蒸水 至25μl

95℃ 5min
加Taq酶(热启动）
95 ℃ 30s
51～62℃（摸索温度范围） 30s （引F Tm＝56℃，引RTm＝60℃）
72℃ 30s
35cycles
72℃ 10min

结果只有引物二聚体！

望各位老师指点！谢谢！
作者: 麻瓜    时间: 2011-9-1 11:12

请问大家在用Sss1甲基化酶处理DNA做阳性对照时是如何纯化回收处理好的DNA的啊?我用苯酚/氯仿抽提损失太大,有啥好办法吗?急!
作者: HOT兔    时间: 2011-9-1 11:13

回答：扩增如此之大的片段，难度太大。分为小片段扩增，长度在400bp以下，我感觉比较容易。

----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------

我也明知楼主所说的，无奈老板想出来的主意，总得做，我现在扩出来的基本都是1KB以下的，还没有扩出3KB的目标条带，估计是人基因组上的错配吧！
作者: 假小子    时间: 2011-9-1 11:14

我们终于做出来了，用宝生物的热启动酶，真正体会到用好酶的重要性！
作者: 嘉年华    时间: 2011-9-1 11:14

请教：我最近也在做甲基化PCR，还算顺利，但是有一对非甲基化引物在相同的模板，相同的PCR反应条件下，总是有时有杂带，虽然目的条带很清晰，杂带也离的较远，相对弱，但多数时候都存在，虽然不断改条件，退火温度，Mg离子，热启动等方法，但那条杂带总是多数时候存在，请问有什么办法？
作者: finger    时间: 2011-9-1 11:15

但是我转化实验后在做 梯度PCR 结果还是什么也没有.请你帮我分析一下,我该从哪个方面去找问题,急急!!!
再次非常感谢大家的帮助!!!

--------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------

回答:如果做测序,修饰DNA 的纯度和模板量应更为重视.如果您做MSP,在保证DNA纯度和量的基础上,可以在摸索退火温度\更换良好的热启动酶等条件未果的情况下,尝试更换引物!MSP看起来简单,做起来不易出结果,我感觉很大一部分与引物有关.
作者: 阿福    时间: 2011-9-1 11:16

你好，“我用处理后的DNA跑PCR摸索了好多条件多没有出来目的条带，只有引物二聚体！是PCR反应体系和条件不对，还是前边的处理出了问题？” 我的建议是这样的：应该先检验你的引物是否有问题，如果没有问题的话，最有可能的是反应条件了，退火温度有些高了，再降低一些试试。有些DNA的退火温度会偏低一些。祝试验顺利。
作者: 菠萝菠萝蜜    时间: 2011-9-1 11:16

楼主，我在成功P出条带后拿去直接测序，但成功率非常低。我看文献，很多是去做克隆的，这是不是因为bsp直接测序本身就比较困难，还是因为引物的缺陷。  
作者: 冰激凌小姐    时间: 2011-9-1 11:17

请教：按照春雨濛濛提供的方法处理了DNA,但是跑电泳时却什么也没有，这样的样品能P出来吗？
作者: 蓝蜗牛    时间: 2011-9-1 11:18

楼主，我在成功P出条带后拿去直接测序，但成功率非常低。我看文献，很多是去做克隆的，这是不是因为bsp直接测序本身就比较困难，还是因为引物的缺陷。

--------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------

用BSP产物去测序是很困难的，原因有两点：1）BSP产物本身是杂合状态，造成这个的原因又是由于CpG site可能存在不完全甲基化或者反过来说不完全去甲基化的状态，所以在Bisulfite conversion过程中这些位点可能是“C"也可能是”T"，测序仪和测序员都会被搞糊涂的，就测不下去了；2）Bisulfite conversion后大量连续的“T"或”A"出现，这是测序的大忌，也会造成测序不成功。
至于用克隆测序为什么被普遍采用也就因为有经验的前面的研究者他们知道这两个问题的严重性，克隆可以避免第一个问题。另外，克隆测序还可以较为精确定量的算某CpG site甲基化或去甲基化程度，而PCR产物直接测序只能看个大概。
个人的经验，你如果拿PCR产物直接测序，测序公司跟你说测不出来的时候，你千万不要说你是做甲基化，不然他们以后会理直气壮的拒绝帮你重试，呵呵。因为，多测几次甲基化PCR产物是有可能成功的。
嘿嘿，不厚道了，不要外传哦。
作者: 大仙    时间: 2011-9-1 11:18



QUOTE:
原帖由 假小子 于 2011-9-1 11:14 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
我们终于做出来了，用宝生物的热启动酶，真正体会到用好酶的重要性！  

请问，你用的哪款热启动酶？体系和条件是什么？多谢指教！
作者: 如影随形    时间: 2011-9-1 11:19

大家好我们可以提供甲基化研究方面的试剂盒，可以解决这里好多老师发现的问题。
请看网站；cuturl('http://www.qwbio.com/Chinese/Bs_NewsInfo.asp?Action=Co&ID=78')
作者: free    时间: 2011-9-1 11:19

大家好，我是一个即将做亚硫酸氢盐法研究DNA甲基化实验的新手，以前从未接触过分子实验，真的很希望得到高手指点！因为我真的从未涉及过，所以问出比较弱的问题大家请不要见笑！我现在有个问题想不明白，我们老师让我研究羊的DNA甲基化程度，可我查文献及同学都说应该对某个基因进行研究，但是我们老师就说不用找具体基因，就是测甲基化程度，我想不通的是，不找具体基因怎么设计引物，再进行PCR，而且同学说PCR也不可能批出很长的序列。我现在也不知老师说的对不对，以前我是搞数量遗传的，对分子一窍不通，我鼓起很大勇气才敢问这么弱的问题，请指教是否研究DNA甲基化需要找基因，如果需要如何找？又如何知道是否存在甲基化呢？非常非常感谢！
作者: 冰激凌小姐    时间: 2011-9-1 11:21

请教楼主，做BSP 时sense引物是PCR反应开始时就加入，还是几个循环结束后好些呢？热启动酶必须在95度5min后加吗？谢谢  
作者: 冷太阳    时间: 2011-9-1 11:21

请问阳性和阴性对照该怎么设置呢？
是否有现成的可买？或是自己制作？
春雨蒙蒙老师前面没有提到，可是herman 的文章中有，而且很多人也提到了，我现在不知道该怎么设置，麻烦问一下。
作者: finger    时间: 2011-9-1 11:21

请教楼主，做BSP 时sense引物是PCR反应开始时就加入，还是几个循环结束后好些呢？热启动酶必须在95度5min后加吗？谢谢

----------------------------------------

回答:我是在一开始就加好的.
作者: 冰激凌小姐    时间: 2011-9-1 11:23

楼主，可不可以留下您的联系方式啊，我现在遇到了许多的问题，但我们这里没有做甲基化的，没有可以交流的人。所以想和你请教，不知这样可以不，无论如何都在这里先谢谢您了！
作者: finger    时间: 2011-9-1 11:24

请问阳性和阴性对照该怎么设置呢？
是否有现成的可买？或是自己制作？
楼主老师前面没有提到，可是herman 的文章中有，而且很多人也提到了，我现在不知道该怎么设置，麻烦问一下。

---------------------------------------------------------------------------------------------------

回答:BSP不需要阳性和阴性对照,MSP需要,有试剂盒出售.请根据文献选择.
作者: finger    时间: 2011-9-1 11:24

请教：处理的DNA 50度过夜后，加入1ml Promega’s Wizard DNA Clean-up resin后，DNA与树脂结合，混合液是清亮的还是混浊的？？急需 答案，非常感谢！

-----------------------------------------------------------------------------------------------------

回答:树脂是颗粒感的,颠倒混匀后慢慢会沉淀,沉淀后上层液体基本是清亮的.
作者: finger    时间: 2011-9-1 11:25

楼主，可不可以留下您的联系方式啊，我现在遇到了许多的问题，但我们这里没有做甲基化的，没有可以交流的人。所以想和你请教，不知这样可以不，无论如何都在这里先谢谢您了！

-------------------------------------------------------

回答:可以在这里发短信给我.尽我所能.
作者: loli    时间: 2011-9-1 11:26

楼主，你好：读了你的甲基化实验方法，受益匪浅，有一个弱的问题想请教你，最后PCR反映体系里需要加入模板吗？谢谢！
作者: 小米虫子    时间: 2011-9-1 11:27

谢谢楼主的protocol,我是初学者,刚接触这部分实验，请问用石蜡组织标本做MSP怎么样？

作者: 哇啦    时间: 2011-9-1 11:27

请教楼主：
修饰后DNA的纯度也应在1.8左右吗?我做的修饰后只有1.2左右,对后续PCR好像没影响.
是不是就可以不去管纯度的问题了呀?
作者: 橘子水儿    时间: 2011-9-1 11:29

请教版主：
我一直用石蜡组织提的DNA做MSP，曾经5月份的时候做出来过，条带也不错（但当时M条带有点偏多，不知是否存在假阳性。U条带都有的）。后来再也出不来了，重复以前做出来的，M条带也出不来了，U还在的，而且仍然很亮。阳性对照和新鲜标本M条带还是能出来的。难道我的DNA降解了？没有经过处理的DNA也会这么容易降解吗？可是U条带还在呀。眼看毕业在即，还做不出来，怎么办呀？帮帮我吧，呜呜~
作者: @木木@    时间: 2011-9-1 11:30

谢谢各位前辈的指点，我正要开始做MSP，受益匪浅啊，以后我会经常关注这里！  
作者: 小鼹鼠    时间: 2011-9-1 11:30

LZ你好，我今天MSP没跑出M条带，只跑出了U条带和阳性对照的M条带，是什么出现了问题？谢谢  
作者: 饭团团    时间: 2011-9-1 11:31

楼主：
我现在也在做甲基化方面的实验，现在遇到一个问题，就是甲基化引物都能跑出条带，但非甲基化就是没有条带，我尝试换了很多PCR条件如MgCL2浓度，Tm值，就是只有二聚体。我做的基因只在肿瘤组织表达，正常组织都是甲基化的，我也问了很多人，一直也没作出结果来，郁闷透顶，是亚硫酸修饰不完全吗？我现在准备用细胞DNA再摸下条件。不知你有什么好的建议，请不吝赐教，万分感谢！另外我准备更换引物，是不是非甲基化引物的原因？
作者: 冰激凌小姐    时间: 2011-9-1 11:31

请教各位：

大家在调解sodium bisulfite PH值时，用什么方法啊？是PH试纸还是PH计？我现在是在用PH计，但是感觉我们实验室的PH计不是很准！要是用试纸的话会准吗？请大家帮忙解答，在此先谢谢了！
作者: 假小子    时间: 2011-9-1 11:32

我想分析一个基因的甲基化状态与疾病的关系，但现在不知道在哪段序列有甲基化或甲基化程度高，请问用什么软件可以预测？或者通过什么方法鉴定？这个基因的序列是知道的。
作者: 清风风铃    时间: 2011-9-1 11:32

大家好！
我想请教一个问题：用荧光定量MSP的话，设计引物只有一对吗？我看好多文献中只给出一对甲基化的引物和探针或SYBR-Green mix，是他们没列出来呢，还是就只用一对就可以了？谢谢！
作者: 清风风铃    时间: 2011-9-1 11:32

大家好！
我想请教一个问题：用荧光定量MSP的话，设计引物只有一对吗？我看好多文献中只给出一对甲基化的引物和探针或SYBR-Green mix，是他们没列出来呢，还是就只用一对就可以了？谢谢！
作者: 兔纸    时间: 2011-9-1 11:33

楼主，您好，我也刚开始作甲基化方面的实验，您可以帮我推荐几篇关于整个领域比较经典的文献吗？非常感谢！！！
作者: 开心蔬菜帮    时间: 2011-9-1 11:35

楼主，想问一下，测序结果怎么比对？比如说一个CpG岛上有二十个CG位点，测序结果中只要有没变的CG位点存在就能证明甲基化吗？还是要占什么比例？  
作者: finger    时间: 2011-9-1 11:35

搂主，你好：读了你的甲基化实验方法，受益匪浅，有一个弱的问题想请教你，最后PCR反映体系里需要加入模板吗？谢谢！

-------------------------

OF COURSE！
作者: finger    时间: 2011-9-1 11:36

楼主，想问一下，测序结果怎么比对？比如说一个CpG岛上有二十个CG位点，测序结果中只要有没变的CG位点存在就能证明甲基化吗？还是要占什么比例？

-----------------------------------------------------------------------------------------------

如果使用亚硫酸氢盐修饰的方法做，没变的CG位点存在就能证明甲基化。
比例问题与您选择的目的片段有关。
作者: finger    时间: 2011-9-1 11:36

大家好！
我想请教一个问题：用荧光定量MSP的话，设计引物只有一对吗？我看好多文献中只给出一对甲基化的引物和探针或SYBR-Green mix，是他们没列出来呢，还是就只用一对就可以了？谢谢！

----------------------------------------------------------

没做过，建议多参考一些文献。
作者: finger    时间: 2011-9-1 11:37

我想分析一个基因的甲基化状态与疾病的关系，但现在不知道在哪段序列有甲基化或甲基化程度高，请问用什么软件可以预测？或者通过什么方法鉴定？这个基因的序列是知道的。

-------------------------------------------------------------------------------------------

http://www.ucsf.edu/urogene/methprimer/index1.html ，尝试一下！
作者: finger    时间: 2011-9-1 11:38

请教各位：

大家在调解sodium bisulfite PH值时，用什么方法啊？是PH试纸还是PH计？我现在是在用PH计，但是感觉我们实验室的PH计不是很准！要是用试纸的话会准吗？请大家帮忙解答，在此先谢谢了！

-------------------------------------------------------------------

PH计测定，试纸肯定是不准确的。
作者: finger    时间: 2011-9-1 11:38

我现在也在做甲基化方面的实验，现在遇到一个问题，就是甲基化引物都能跑出条带，但非甲基化就是没有条带，我尝试换了很多PCR条件如MgCL2浓度，Tm值，就是只有二聚体。我做的基因只在肿瘤组织表达，正常组织都是甲基化的，我也问了很多人，一直也没作出结果来，郁闷透顶，是亚硫酸修饰不完全吗？我现在准备用细胞DNA再摸下条件。不知你有什么好的建议，请不吝赐教，万分感谢！另外我准备更换引物，是不是非甲基化引物的原因？

--------------------------------

可能存在引物的问题。
作者: finger    时间: 2011-9-1 11:38

LZ你好，我今天MSP没跑出M条带，只跑出了U条带和阳性对照的M条带，是什么出现了问题？谢谢

----------------------------------

建议退火温度调整一下。
作者: finger    时间: 2011-9-1 11:39

请教版主：
我一直用石蜡组织提的DNA做MSP，曾经5月份的时候做出来过，条带也不错（但当时M条带有点偏多，不知是否存在假阳性。U条带都有的）。后来再也出不来了，重复以前做出来的，M条带也出不来了，U还在的，而且仍然很亮。阳性对照和新鲜标本M条带还是能出来的。难道我的DNA降解了？没有经过处理的DNA也会这么容易降解吗？可是U条带还在呀。眼看毕业在即，还做不出来，怎么办呀？帮帮我吧，呜呜~

--------------------------------------------------------------------------

换用新鲜的PCR试剂，或者重新提取DNA，修饰后再做。
作者: finger    时间: 2011-9-1 11:39

修饰后DNA的纯度也应在1.8左右吗?我做的修饰后只有1.2左右,对后续PCR好像没影响.
是不是就可以不去管纯度的问题了呀?

------------------------------------------------------------------

修饰后变成单链。我感觉应该不是1.8了。因为没有测过，不好评论。如果能做出结果，应该没有问题。
作者: 荷塘青蛙！    时间: 2011-9-1 11:40

我用石蜡做的MSP，一开始还可以，现在怎么也作不出来了。目前换了新鲜组织试试看。首先排除一下PCR的体系中的问题，然后再看是不是还是因为模版不好的缘故
作者: 荷塘青蛙！    时间: 2011-9-1 11:40

还要请教楼主，用BSP扩的测序结果可以直接与原始序列在NCBI的BLAST中进行比对吗？刚回来的测序图中有很多套峰，比对的时候还需要进行什么转换吗？能发一份图例吗？不胜感激！
作者: 森林木    时间: 2011-9-1 11:41

大家好!我是刚入门的研究生，我的课题涉及到甲基化检测,我现在才刚刚接触到这方面知识,有好多问题向前辈门请教.
我要做大鼠胃黏膜Runx3基因甲基化检测.查了一些资料,理出了一个大概过程:1、组织DNA的提取；
2、亚硫酸氢盐修饰基因组DNA；
3、修饰后DNA纯化回收；
4、特异性甲基化检测MSP；
1）引物的设计与合成；
2）特异性甲基化PCR；
5、PCR产物的凝胶回收；
6、BE染色，紫外灯观察结果。
我的问题：
1、引物的设计问题，可以参照文献资料吗？我对比了几处文献提供的引物，但不完全一样。
2、实验步骤问题，请问以上我设计的步骤正确吗？合理吗？需要进一步改进吗？
3、试剂和问题，我大致查了一下，了解到各步都有专门的试剂盒，如DNA提取试剂盒、DNA纯化试剂盒、亚硫酸氢盐修饰试剂盒、甲基化PCR扩增试剂盒、甲基化检测试剂盒等。其中，有的试剂盒内容又是相互包含的。请问：我要把整个实验做下来，究竟要用到哪些试剂盒？哪些步骤是不必要用试剂盒的？从经济高效果的角度考虑，该怎样做？
4、PCR之后，如何判断结果好？
作者: finger    时间: 2011-9-1 15:44

还要请教楼主，用BSP扩的测序结果可以直接与原始序列在NCBI的BLAST中进行比对吗？刚回来的测序图中有很多套峰，比对的时候还需要进行什么转换吗？能发一份图例吗？不胜感激！

-----------------------------------------------------

可以用BLAST比对，把测序结果与原始序列比对，但因为修饰后碱基变了，会发现原来的C变成了A。甲基化的C没变。另外可观察修饰的效果。
作者: finger    时间: 2011-9-1 15:45

1、引物的设计问题，可以参照文献资料吗？我对比了几处文献提供的引物，但不完全一样。--参照文献或自己设计，两者均有风险，建议先做前者，选择知名实验室的引物。
2、实验步骤问题，请问以上我设计的步骤正确吗？--如果做MSP，不需要切胶回收，即第5步。。
3、试剂和问题--DNA提取试剂盒既便宜又好用，其他都可以不用试剂盒
4、PCR之后，如何判断结果好？--参考文献！
作者: wawa    时间: 2011-9-1 15:46

请问各位战友，
1. 那个在线设计引物的网站设计的引物是不是都能P出来啊，我得到的5组候选引物，前2组是100多BP的，后3组是200多BP的，每组间只有前后一个碱基的差别，就是只挪动了一位，我同BP数的引物各取了一组，结果M很快就P出来，但U条带都没P出来来，还有必要试一下另外3个么，
2. 设计引物之前，那个网站的参数怎么调啊，最后产物包含CG量对PCR效率有影响么
3. 大家摸U条件的时候，用的是什么模板呢，如果用癌组织，有没有可能高度甲基化而P不出U条带来呢
4. 到底是白金酶好，还是LA Taq好啊
作者: dreaming    时间: 2011-9-1 15:47

请教楼主：

刚开始摸条件
我的甲基化和未甲基化引物扩增片断的大小一样,是在线网站设计的,相应的
上游引物序列3端有三个碱基有差异,序列中只相差一个CG的差别,

下游引物序列3端也是有三个碱基有差异,序列中也只相差一个CG的差别,

我今天做了十份肿瘤标本,甲基化和未甲基化引物扩增都出现了条带,两对引物用的扩增条件差不多,都是64度的退火温度,电泳结果也很好,都没任何杂带,我不知道这样的结果有没有问题,请多多指教
作者: dreaming    时间: 2011-9-1 15:48

请问一下各位战友，
1.用软件预测的CpG岛有500多bp，而甲基化PCR扩增的引物只有200多bp，是否需要同样涉及其它部分的引物？

2.我觉得只能说明引物包含的位点有甲基化，能否说明CpG岛中所有可能甲基化的位点都出现甲基化了吗？反过来说，这一段引物M条带P不出来，就算这个位点没有甲基化，是不是也不能说明其它位点没有甲基化？所以，摸条件的时候是否需要用阳性对照呢?

3.我现在用肿瘤组织DNA摸M条带，用人血DNA摸U条带，结果一组引物中用LA Taq作出了M，另一组引物中用白金Taq作出了U，各位战友有何建议，谢谢
作者: finger    时间: 2011-9-1 15:48

请问一下各位战友，
1.用软件预测的CpG岛有500多bp，而甲基化PCR扩增的引物只有200多bp，是否需要同样涉及其它部分的引物？

2.我觉得只能说明引物包含的位点有甲基化，能否说明CpG岛中所有可能甲基化的位点都出现甲基化了吗？反过来说，这一段引物M条带P不出来，就算这个位点没有甲基化，是不是也不能说明其它位点没有甲基化？所以，摸条件的时候是否需要用阳性对照呢?

3.我现在用肿瘤组织DNA摸M条带，用人血DNA摸U条带，结果一组引物中用LA Taq作出了M，另一组引物中用白金Taq作出了U，各位战友有何建议，谢谢


回答：1：引物要根据你选择的目的片段设计，如果你需要所有的都测定，最好有两个不同的引物；
2：需要阳性对照；
3：为何这样做？
作者: finger    时间: 2011-9-1 15:49

请教楼主：
刚开始摸条件
我的甲基化和未甲基化引物扩增片断的大小一样,是在线网站设计的,相应的
上游引物序列3端有三个碱基有差异,序列中只相差一个CG的差别,

下游引物序列3端也是有三个碱基有差异,序列中也只相差一个CG的差别,

我今天做了十份肿瘤标本,甲基化和未甲基化引物扩增都出现了条带,两对引物用的扩增条件差不多,都是64度的退火温度,电泳结果也很好,都没任何杂带,我不知道这样的结果有没有问题,请多多指教

---------------------------------------------------------------------------------------------------

回答：MSP要有阳性和阴性对照，如果对照是正常的，结果就没有问题。
作者: 去看海    时间: 2011-9-1 15:49

请教楼主：

我用水做的空白对照也出现了目的条带,东西都换过了还是存在,只不过淡了点,怎么办呢,希望您能指导一下
作者: finger    时间: 2011-9-1 15:51

请教春雨濛濛
我用水做的空白对照也出现了目的条带,东西都换过了还是存在,只不过淡了点,怎么办呢,希望您能指导一下

----------------------------------

回答：所用的水也需要换。
作者: 微笑的海豚    时间: 2011-9-1 15:52

当时我也按照您的建议试试，结果还是不行，最后跟引物合成公司联系，他们同意重新合成引物。结果引物换了后目的条带就出来了。看来公司的引物也不是那么保险的哦！建议大家如果怎么也做不出来时，一定记得考虑引物设计或合成的问题哦！
作者: 白鸟之翼    时间: 2011-9-1 15:52

我还没开始做实验，有几个疑问想向大家请教!
我想同时甲基化修饰A基因和另一条染色体上的B基因，然后对甲基化修饰后的这两个基因进行实时定量扩增，从而比较两者之间的量的比例。样本里面的DNA含量较少。
问题:
1.修饰后两者的量的比例跟修饰前的比例是否一样？
2.会不会因为样本DNA量太少了影响A基因实时定量扩增结果？
3.如果甲基化修饰的A基因，和未经修饰的C基因进行实时定量扩增，两者之间的量的比例会不会因为修饰损失部分A基因而不同于未经修饰时的两者之间量的比例？
4.做比较实时定量扩增还需要设置对照吗?该如何设置呢？
不好意思，我基础不好，可能问题问得很弱智，还请大家指点！
作者: 假小子    时间: 2011-9-1 15:53

请教一下楼主，MSP的PCR体系如何？和普通PCR 体系相同么？对mg2+浓度和引物有无特殊要求？
作者: 胖小妮子    时间: 2011-9-1 15:53

to楼主：我想请教您的阳性对照修饰的详细步骤，我买了NEB的甲基化酶，做过一次修饰没成功。
作者: 喵咪    时间: 2011-9-1 15:54

我准备做MSP了，请问有用过TIANGEN的DNA提取试剂盒和回收试剂盒的吗？效果怎样呀？一般用什么的比较好？谢谢  
作者: finger    时间: 2011-9-1 15:55

我想同时甲基化修饰A基因和另一条染色体上的B基因，然后对甲基化修饰后的这两个基因进行实时定量扩增，从而比较两者之间的量的比例。样本里面的DNA含量较少。
问题:
1.修饰后两者的量的比例跟修饰前的比例是否一样？
2.会不会因为样本DNA量太少了影响A基因实时定量扩增结果？
3.如果甲基化修饰的A基因，和未经修饰的C基因进行实时定量扩增，两者之间的量的比例会不会因为修饰损失部分A基因而不同于未经修饰时的两者之间量的比例？
4.做比较实时定量扩增还需要设置对照吗?该如何设置呢？
不好意思，我基础不好，可能问题问得很弱智，还请大家指点！

------------------------------------------------------------------------------------

回答：1：修饰前进行DNA定量，比例是一致的。
2：进入修饰的DNA量至少1ug，太少肯定会影响后续结果；
3：修饰的不修饰的进行比较，且不是同一个基因，这样的设计是否合理？有类似文献报道吗？
4：前一个问题如果解决，有这样的报道，请参考相应文献。  
作者: finger    时间: 2011-9-1 15:55

请教一下楼主，MSP的PCR体系如何？和普通PCR 体系相同么？对mg2+浓度和引物有无特殊要求？

------------------------------------------------------------------------------------------------

回答：体系差不多。对镁离子浓度无特殊要求。Taq酶要用好一些的。
作者: 清风风铃    时间: 2011-9-1 15:56

老板打算叫我检测某一基因的启动子区是否有甲基化。由于没有关于该基因甲基化情况的文献报道，因此没有现成的引物可以借用，只好自己设计。

本人刚刚接触甲基化，能否请大虾们耐心讲解如下几个问题：
1.如何设计？最好是有步骤，一步一步跟着学？
2.BSP与MSP有什么区别和联系？在做MSP之前，必须要做BSP吗？目的是什么？
3.甲基化实验摸条件要用细胞株吗？最少需要几株呢？细胞株包括表达所研究的基因的和不表达所研究的基因吗？
4.如果我要提取胃癌组织的DNA来研究甲基化，是否细胞株也必须是胃癌细胞株呢？平时大家还研究癌旁组织DNA的甲基化吗，不知道有没有意义？
5.BSP后，好像多数要做测序，测序后怎么知道设计MSP的引物呢？
6.要是哪位大侠有空，最好能举个例子，做个详细图解，让大家study step by step？
7.设计引物包括三对：野生型、甲基化和非甲基化。野生型的引物如何设计？

一大堆问题，主要是自己实在不懂。先谢谢大家了 。
作者: 不懂    时间: 2011-9-1 15:56

我也是新手，现在什么都不懂，楼上的问题也是我想问的...
作者: @木木@    时间: 2011-9-1 15:57

大家能帮我解释一下这几个问题吗?
1.什么时候用BSP,什么时候用MSP,两者有什么区别吗?我在园子里搜索了一下,还是没看明白,不知道两者操作过程有什么区别.文献里查的做BSP的很少.
2.扩增已知基因上游的启动子序列,文献里只给出来野生型引物,MSP引物和BSP引物,没有给非甲基化引物,我能从给出的引物和已知基因上游启动子序列推断出非甲基化引物吗?
3.如果正常情况下该基因甲基化程度低,异常情况下的该基因甲基化程度低,可不可以在亚硫酸氢盐修饰后用MSP引物扩增结果阳性判定高甲基化,而用BSP引物扩增结果阳性判定为正常基因低度甲基化?
4.亚硫酸氢盐修饰前需要酶切吗,我看到你的protocal上面没有酶切,我的参考文献上却有酶切的,用BAMHI酶切,这个酶切的位点有什么特点吗?.
谢谢!
作者: 微笑的海豚    时间: 2011-9-1 15:57

我在进行甲基化扩增时，空白对照（以无菌双蒸水代替模板），阴性对照（以未经亚硫酸氢钠修饰处理的DNA代替模板）和所有处理过的样本均得到了与目的条带相同大小的片段（143bp），而且很亮。怀疑是污染，换过PCR相关的所有试剂和水，且经其他人验证过，引物经同一公司重新合成过，结果也还是一样。（引物是参考国外影响因子10.0多的文献，也对比了多篇文献）
不知该如何是好？
作者: Darcy    时间: 2011-9-1 15:59

请教楼主，我正在做MSP,我是按照你刚开始发的贴子做的。可是你说亚硫酸氢钠的用NAOH滴定为PH5.o，而且要求精确。你是用试纸测的吗，只有5ml，PH计很难测准，而且探头进出也有损耗。那么你是用试纸吗，我对这个问题感到很困惑。我跑了一次PCR，什么都没有。当然原因可能很多。假如修饰的时间大于16小时，是不是就不行了。我今天有事恰好给弄久了。另一个问题是一般都是边修饰边跑的吧？实在多谢了！
作者: Darcy    时间: 2011-9-1 16:00

对了，我用的PCR的酶是MIX,PROMGA的，不知道这样是不是在摸条件的时候减少一些影响因素。  
作者: finger    时间: 2011-9-1 16:01

本人刚刚接触甲基化，能否请大虾们耐心讲解如下几个问题：。。。

------------------------------------------------------------------------------------------------

回答：1.如何设计？-当然这是您自己的工作。
2.BSP与MSP有什么区别和联系？在做MSP之前，必须要做BSP吗？目的是什么？-BSP为测序PCR，即PCR后跑电泳，切胶获得PCR产物，送去测序，可以检测目的基因片段中所有甲基化位点的甲基化情况；MSP为甲基化特异性PCR，做到PCR这一步就结束了，是根据引物中甲基化情况不同来判断各引物扩增的情况，是步骤比较简单、但结果比较笼统地办法。两者方法选一种即可，都可以说明甲基化这个问题。
3.甲基化实验摸条件要用细胞株吗？最少需要几株呢？细胞株包括表达所研究的基因的和不表达所研究的基因吗？--研究的是目的基因，这由您设计的引物决定您做的是哪个基因。细胞株比较好，可以提取比较多的DNA供实验用，一株即可。有结果再大范围的做。
4.如果我要提取胃癌组织的DNA来研究甲基化，是否细胞株也必须是胃癌细胞株呢？平时大家还研究癌旁组织DNA的甲基化吗，不知道有没有意义？--取决于您研究的对象是什么，如果是胃癌，细胞株和组织当然都是胃癌的。癌旁组织的需要同时研究。
5.BSP后，好像多数要做测序，测序后怎么知道设计MSP的引物呢？--BSP是所有都测序，而不是多数要测序。它与MSP的引物是不一样的。是不同的两种方法。
6.要是哪位大侠有空，最好能举个例子，做个详细图解，让大家study step by step？--您可以完成这个工作。
7.设计引物包括三对：野生型、甲基化和非甲基化。野生型的引物如何设计？--关于甲基化的引物只有甲基化和非甲基化，野生型可能与非野生型基因序列不同，需要野生型、非野生型各设计甲基化和非甲基化引物。
做实验就是多阅读文献，勇于实践。祝成功！
作者: finger    时间: 2011-9-1 16:01

大家能帮我解释一下这几个问题吗?。。。

----------------------------------------------------------------

回答
1.什么时候用BSP,什么时候用MSP,两者有什么区别吗?--BSP即测序方法，做完PCR需要对PCR产物进行测序。这样可以明确所研究的目的片段中所有甲基化位点的甲基化情况。费用较高，测序一个克隆大约要30-40元。引物只有一对。MSP做到PCR就结束了，相对比较简单，费用低廉，引物有两对，即甲基化引物和非甲基化引物。
2.扩增已知基因上游的启动子序列,文献里只给出来野生型引物,MSP引物和BSP引物,没有给非甲基化引物,我能从给出的引物和已知基因上游启动子序列推断出非甲基化引物吗?--MSP必有两对引物！非野生型的根据其基因序列可自行设计。
3.如果正常情况下该基因甲基化程度低,异常情况下的该基因甲基化程度低,可不可以在亚硫酸氢盐修饰后用MSP引物扩增结果阳性判定高甲基化,而用BSP引物扩增结果阳性判定为正常基因低度甲基化?--MSP和BSP的结果基本一致，一般不会有矛盾结果。
4.亚硫酸氢盐修饰前需要酶切吗,我看到你的protocal上面没有酶切,我的参考文献上却有酶切的,用BAMHI酶切,这个酶切的位点有什么特点吗?--酶切是另一种方法！所用基本都是识别CG位点的酶。有的识别甲基化的，有的识别未甲基化的，请查阅酶之说明书。
作者: finger    时间: 2011-9-1 16:02

我在进行甲基化扩增时，空白对照（以无菌双蒸水代替模板），阴性对照（以未经亚硫酸氢钠修饰处理的DNA代替模板）和所有处理过的样本均得到了与目的条带相同大小的片段（143bp），而且很亮。怀疑是污染，换过PCR相关的所有试剂和水，且经其他人验证过，引物经同一公司重新合成过，结果也还是一样。（引物是参考国外影响因子10.0多的文献，也对比了多篇文献）
不知该如何是好？

-----------------------------------------------

回答：更换新的目的片段！
作者: finger    时间: 2011-9-1 16:02

请教春雨濛濛，我正在做MSP,我是按照你刚开始发的贴子做的。可是你说亚硫酸氢钠的用NAOH滴定为PH5.o，而且要求精确。你是用试纸测的吗，只有5ml，PH计很难测准，而且探头进出也有损耗。那么你是用试纸吗，我对这个问题感到很困惑。我跑了一次PCR，什么都没有。当然原因可能很多。假如修饰的时间大于16小时，是不是就不行了。我今天有事恰好给弄久了。另一个问题是一般都是边修饰边跑的吧？实在多谢了！

----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------

回答：
1：使用PH 计测定PH，在5ml小量筒内配液，是可以测定的。另外您的PH计的头端不能太大。或者将配液体积加大，这样会浪费一些试剂，但可以解决您的问题。
2：修饰时间大于16小时，修饰的位点部分会逆转。
3：边修饰边跑的？--？？
作者: 微笑的海豚    时间: 2011-9-1 16:03

回答：更换新的目的片段！---------------------------------------

问 finger：
该图上引物二聚体上边是什么呢，也是引物二聚体吗？
更换新的目的片段得重新设计引物？但未查到该基因有另外的引物序列，自己设计的很难成功啊？
如果不更换目的片段，能否通过优化条件解决这一问题，该怎样优化呢？谢谢！
现附上“假阳性”示意图
左一为Marker，最下边一条带为100bp
左二为空白对照（M）
左三为正常未经处理的DNA（阴性对照），平行样1
左四为正常未经处理的DNA（阴性对照），平行样2

图片附件: 14009254.jpg (2011-9-1 16:04, 4.59 KB) / 该附件被下载次数 7
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=8482

作者: 丸子妹    时间: 2011-9-1 16:06

请教一下各位老师，甲基化实时定量PCR能对目的基因拷贝数进行准确定量吗？我看到一篇权威杂志的文献，它用亚硫酸氢盐修饰高度甲基化的A基因和低度甲基化的B基因，两基因在不同的染色体上，再使用针对两基因的引物做一个实时定量扩增，得出两基因的拷贝数，理论上讲这两个基因的拷贝数反映了基因所在染色体的拷贝数，因为都是单拷贝基因，所以拷贝数应该是一样的，因为人类不同染色体之间量的比例应该是2：2，可是实际上定量结果两基因的拷贝数存在很大差别，波动值很大，通过两基因对染色体定量的结果分别为10：1，2：1，7：1 ，等等……，所以我现在很迷茫，甲基化实时定量PCR是不是只能说明定性的问题吗？  
作者: 丁香@@    时间: 2011-9-1 16:06

楼主：
你好！我用亚硫酸氢盐修饰完基因组DNA以后，跑了个琼脂糖电泳检测了一下，可是什么也没有，是不是说明我没有修饰成功呢？我看到论坛中 有说因为变性后是单链所以检测不出来，是这样吗？请指教，谢谢了！
作者: 阿拉蕾    时间: 2011-9-1 16:07

楼主：
你好！我用亚硫酸氢盐修饰完基因组DNA以后，跑了个琼脂糖电泳检测了一下，可是什么也没有，是不是说明我没有修饰成功呢？我看到论坛中 有说因为变性后是单链所以检测不出来，是这样吗？请指教，谢谢了！

----------------------------------------------------------------------------------------------------------

是这样的，我做完都不检测的，直接P去了，我用KIT修饰，取2UL去P足够了。
作者: 阿拉蕾    时间: 2011-9-1 16:08

对了，我用的PCR的酶是MIX,PROMGA的，不知道这样是不是在摸条件的时候减少一些影响因素。

--------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------

MIX当然可以减少影响，但关键是修饰的效率和引物的特异性，酶没什么特别高的要求，热启动就可以了。
作者: 阿拉蕾    时间: 2011-9-1 16:08

问 春雨濛濛老师：
该图上引物二聚体上边是什么呢，也是引物二聚体吗？
更换新的目的片段得重新设计引物？但未查到该基因有另外的引物序列，自己设计的很难成功啊？
如果不更换目的片段，能否通过优化条件解决这一问题，该怎样优化呢？谢谢！
现附上“假阳性”示意图
左一为Marker，最下边一条带为100bp
左二为空白对照（M）
左三为正常未经处理的DNA（阴性对照），平行样1
左四为正常未经处理的DNA（阴性对照），平行样2

--------------------------------------------------------------------------

空白对照都有，引物肯定有问题。
作者: 阿拉蕾    时间: 2011-9-1 16:09

PH计测定，试纸肯定是不准确的。

---------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------

PH值精确点当然重要，但也没死到这么高的程度，4-5之间一般对修饰没什么问题，我就用试纸测的，因为没PH计，人是活的。
作者: 阿拉蕾    时间: 2011-9-1 16:09

PH计测定，试纸肯定是不准确的。

------------------------------------------------------

PH值精确点当然重要，但也没死到这么高的程度，4-5之间一般对修饰没什么问题，我就用试纸测的，因为没PH计，人是活的。
作者: 阿拉蕾    时间: 2011-9-1 16:10

第三部分 修饰后DNA纯化回收
EP管如无特别说明均为高压蒸汽灭菌的。
1. 将移液器枪头伸入石蜡油层下，先轻轻加压使其中一小段石蜡油排出，然后吸取混合液至一洁净1.5mlEP管中。
2：以下使用Promega Wizard Cleanup DNA纯化回收系统（Promega，A7280）
1）70℃水浴预热DDW；配制80%异丙醇；
2）加1ml Promega’s Wizard DNA Clean-up resin，轻柔颠倒混匀，使DNA充分与树脂结合；
3）由于该试剂盒中仅配备针筒没有针栓，如果有真空负压吸引器，使用起来很方便；如果没有，需要自备3ml-5ml注射器。将注射器针筒与试剂盒提供的回收小柱紧密连接后，将上述混合物用移液器移至针筒内，用2ml以上的EP管放置小柱下接收废液。加针栓，轻轻加压，将液体挤出，此时可见小柱内有白色的树脂沉积。
4）将注射器与小柱分离后拔出针栓，再将针筒与小柱连接，向针筒内加入2ml 80％的异丙醇，插入针栓，轻轻加压，将异丙醇挤出。此为洗涤步骤。
5）将注射器与小柱分离，将小柱置于洁净1.5ml洁净EP管上，离心12000rpm，2min，以甩去残余异丙醇成分，使树脂干燥。此时，修饰后DNA处于与树脂结合状态。
6）将小柱取下置于另一洁净1.5mlEP管上，移液器加50ul预热好的DDW，室温放置5min。
7）离心12000rpm，20s，此为洗脱步骤，此时EP管内液体即为洗脱的修饰后DNA溶液，终体积为50ul。
3：加5.5ul 新鲜配制的3M NaOH，室温放置15min。
4：加33ul 10M乙酸铵，以中和NaOH，使溶液PH于7.0左右。
5：加4ul 10mg/ml糖原，此作为沉淀指示剂，因为其与乙醇混合后可产生沉淀，便于以后离心后辨别回收物的位置，以防在吸取残余乙醇时将回收物吸走。其实，加入这些糖原究竟能起多大作用，不好说。不过有国产糖原卖，包装不大，也很便宜，买来一用，算严格遵守文献的步骤吧。
6：加270ul 冰无水乙醇，置于-20度，过夜沉淀。有人为沉淀最短可至2小时，但我认为时间长些可能会更好。并且做到此步骤时，一般会到中午，如果样本多的话要到下午，不妨放置过夜，日程可以轻松些，顺便做些其他试验。如果想当天做完，没有问题，但我认为最好多沉淀些时候，至少6小时吧（这是经验，我做过最少6小时，也是可以的，再短就不敢发表意见了）
7：4度，12000rpm离心，30min，倒去上清液，收集沉淀。不必吸净。
8：加500ul 70%乙醇，不要将沉淀吹打起来，只要把乙醇加上即可。轻柔倾斜EP管，旋转一圈，再次离心，4度12000rpm，5min。离心后倒掉上清，再加同量乙醇，同样再做一遍。此为洗涤步骤，共2次。
9：倒掉上清，并常温简短离心后，将附壁乙醇离至EP管底，移液器小心将残余液体吸净，室温干燥5min，或沉淀由不透明变为半透明或透明时，加入20ul-30ulDDW，溶解沉淀。至此，已完成了修饰后DNA的纯化回收，所得为修饰后DNA溶液，可用于此后的进一步实验。
10：-20℃保存DNA溶液。

此步细节：
1：在使用注射器时，一定要用力均匀且轻，如使用暴力，会将小柱内的薄膜挤破，失去作用。
2：乙酸铵、糖原不需新鲜配制，糖原配好后放在-20度保存，乙酸铵室温即可，因为这样浓度的乙酸铵非常难溶，一旦放在4度，取出用时也会有很多溶质析出。
3：异丙醇、70%乙醇都不需要新鲜配制，但如果用量大，现场配也很方便。
此步关键是在树脂与DNA的结合上，这就再次强调第二部分调亚硫酸钠PH值得重要性。因为树脂与DNA结合需要有一个适当的PH，如前一步没做好，此步树脂不能与DNA很好结合，将会带来灾难性后果，即DNA随着液体被挤出了，洗脱时实际已没有任何DNA了。

-------------------------------------------------------------------------------------------

请问在
3：加5.5ul 新鲜配制的3M NaOH，室温放置15min。
中NaOH的作用是什么啊？
还有在
第二部分 亚硫酸氢钠修饰基因组DNA
如不特别指出，所用双蒸水（DDW）均经高压蒸汽灭菌。
1：将约2ugDNA于1.5mlEP管中使用DDW稀释至50ul；
2：加5.5ul新鲜配制的3M NaOH；
3： 42℃水浴30min；
中NaOH的作用是什么呢？
作者: 阿拉蕾    时间: 2011-9-1 16:10

第一次加NAOH是将DNA变性成单链，，第二次是去磺酸基。
-------------------------------------------------------------------------------------

jgc95 wrote:
请问在
3：加5.5ul 新鲜配制的3M NaOH，室温放置15min。
中NaOH的作用是什么啊？
还有在
第二部分 亚硫酸氢钠修饰基因组DNA
如不特别指出，所用双蒸水（DDW）均经高压蒸汽灭菌。
1：将约2ugDNA于1.5mlEP管中使用DDW稀释至50ul；
2：加5.5ul新鲜配制的3M NaOH；
3： 42℃水浴30min；
中NaOH的作用是什么呢？
作者: 阿福    时间: 2011-9-1 16:11

第一次加NAOH是将DNA变性成单链，，第二次是去磺酸基。
----------------------------------------------------------------------------------

呵呵 非常感谢！
在第二次的反应中您有相应的图片，或者反应式吗？
作者: mogu    时间: 2011-9-1 16:11

同胞们，我做了很久，一直没有结果呢。由于我做的是P16的甲基化，引物的设计相对是比较成熟的，我选了出现率比较高的引物，用的是PROMEGA的MIX.做了很久，只有一管出了条带，我的目的条带是150BP的，出来的是50－60个BP左右的，同学说是引物二聚体，那么就是说还是没有条带了。我觉得很郁闷。我PCR用过梯度和touchdown两种，一直都没有结果。请问现在该怎么办呢。
单链的DNA模板始终没有办法检测，不知怎么办了？另外就是修饰了的模板可以拿来定量吗？我定过一次，量很低，才1点几，修饰前是50多的。所以是不是模板量太低了呢。我是按照楼主的方法修饰的。
作者: 小米虫子    时间: 2011-9-1 16:12

请教楼主及各位老师:
甲基化抑制剂5-Azacytidine 与5-Aza-2′-deoxycytidine 有什么区别阿?各有什么特别的作用么?
查了很久都没有查到这方面的信息
作者: +田田+    时间: 2011-9-1 16:13

呵呵 非常感谢！
在第二次的反应中您有相应的图片，或者反应式吗？

图片附件: 95899646.jpg (2011-9-1 16:13, 41.28 KB) / 该附件被下载次数 8
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=8483

作者: 微笑的海豚    时间: 2011-9-1 16:14

急！我用SssI甲基化转移酶处理纯化的DNA要不要再用亚硫酸盐和氢醌修饰啊？
作者: HOT兔    时间: 2011-9-1 16:15

请教各位老师:
在最初的步骤提取基因组DNA后,以蛋白酶K与RNA酶处理,这两者的作用浓度,作用时间与反应温度分别是多少呢?
谢谢拉!
作者: free    时间: 2011-9-1 16:15

我用chemicon fast DNA modification kit s7824修饰，有一批次结果不错，但后来处理了几批都P不出来，基因组DNA的OD值都差不多，我想肯定是修饰出了问题，想问一下各位战友修饰时间到底要大于16小时，还是小于16小时，试剂盒说明书要求16－20个小时，而帖子里建议小于16个小时。有点混。还有修饰最重要的是PH值么？还是修饰时间？
作者: =菓子=    时间: 2011-9-1 16:16

请教各位前辈：
实验遇到困难，做不下去了，十分着急郁闷中，请各位前辈指教。
我也是做的msp。开始条带还算比较漂亮。只是最近水对照（模板用灭菌纯水替代也P出了目的条带，重复了几次结果一样。昨天体系中成分全部更换新的，耗材也换了，结果还是P出来了，今天又重复了一次，还是一样。快要崩溃了，真不知道该怎么办了。请各位高手指点：可能原因？有何好的建议？我下一步该怎么做啊？多谢了！
作者: =菓子=    时间: 2011-9-1 16:16

请教各位前辈：
实验遇到困难，做不下去了，十分着急郁闷中，请各位前辈指教。
我也是做的msp。开始条带还算比较漂亮。只是最近水对照（模板用灭菌纯水替代也P出了目的条带，重复了几次结果一样。昨天体系中成分全部更换新的，耗材也换了，结果还是P出来了，今天又重复了一次，还是一样。快要崩溃了，真不知道该怎么办了。请各位高手指点：可能原因？有何好的建议？我下一步该怎么做啊？多谢了！
作者: =菓子=    时间: 2011-9-1 16:17

TO:jzg1318,zhaozdxy,我也遇到了同样的问题，水对照P出目的条带，十分着急。你们问题解决没？我的QQ 81021922，请多指教。
作者: =菓子=    时间: 2011-9-1 16:17

TO:jzg1318,zhaozdxy,我也遇到了同样的问题，水对照P出目的条带，十分着急。你们问题解决没？我的QQ 81021922，请多指教。
作者: 羊咩咩    时间: 2011-9-1 16:18

请问甲基化引物的软件中第11部分怎么没有啊,解不开啊,麻烦再传一次嘛.谢谢
作者: fangxiang    时间: 2011-9-1 16:20

请问如何检测经亚硫酸盐修饰后DNA的浓度和纯度呢
如何判断修饰后的DNA是合格的呢
谢谢！
作者: 冰激凌小姐    时间: 2011-9-1 16:20

求助：我的BSP测序结果中有一部分非CPG island的C也没有被转化，可以通过改变实验中的哪些条件来提高转化效率呢？我的实验是完全按照楼主的方法做的。请各位帮解答，多谢！！急盼回复！！
作者: finger    时间: 2011-9-1 16:22

求助：我的BSP测序结果中有一部分非CPG island的C也没有被转化，可以通过改变实验中的哪些条件来提高转化效率呢？我的实验是完全按照楼主的方法做的。请各位帮解答，多谢！！急盼回复！！

------------------------------------------------------------------------------

回答：转化时间不要过短或者过长；DNA的量不能太大。
作者: finger    时间: 2011-9-1 16:22

请问如何检测经亚硫酸盐修饰后DNA的浓度和纯度呢
如何判断修饰后的DNA是合格的呢
谢谢！

--------------------------------------------------------------------------------

回答：修饰后的DNA已经变性，尚无很好的方法进行测定。
作者: finger    时间: 2011-9-1 16:23

我用chemicon fast DNA modification kit s7824修饰，有一批次结果不错，但后来处理了几批都P不出来，基因组DNA的OD值都差不多，我想肯定是修饰出了问题，想问一下各位战友修饰时间到底要大于16小时，还是小于16小时，试剂盒说明书要求16－20个小时，而帖子里建议小于16个小时。有点混。还有修饰最重要的是PH值么？还是修饰时间？

-----------------------------------------------------------------------

回答：一般不大于16小时，请按照16小时进行。
作者: finger    时间: 2011-9-1 16:23

请教各位老师:
在最初的步骤提取基因组DNA后,以蛋白酶K与RNA酶处理,这两者的作用浓度,作用时间与反应温度分别是多少呢?
谢谢拉!

---------------------------------------------------

回答：请参考我protocol的第一部分。
作者: finger    时间: 2011-9-1 16:24

急！急！急！，我用SssI甲基化转移酶处理纯化的DNA要不要再用亚硫酸盐和氢醌修饰啊？

--------------------------

回答：需要！
作者: finger    时间: 2011-9-1 16:24

我也遇到了同样的问题，水对照P出目的条带，十分着急。你们问题解决没？
------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------

回答：是否需要更换引物？是否因引物特异性不高？请参考！并请反馈实验结果，共同讨论！
作者: 阿福    时间: 2011-9-1 16:25

过一段时间再做看看,我大概换了所有的东西,又用紫外灯连续照射了好几天,空白就好了
作者: 冰激凌小姐    时间: 2011-9-1 16:25

好的。多谢。我再重新更换消毒看看：）
作者: 荷塘青蛙！    时间: 2011-9-1 16:26

请问有没有关于蛋白质的四基化这方面的检测啊！
作者: 七彩星星    时间: 2011-9-1 16:28

我刚做完启动子的甲基化分析,用的是MSP的方法,基因组的修饰用的是韩国出的甲基化试剂盒,还蛮好用的,基因组处理两三个月了,还可以用.修饰的效果还不错,因为测序回来如果是未甲基化的C全部都变成了T,而甲基化的C并没有变为T
作者: 年轮    时间: 2011-9-1 16:28

大家好，我是一个即将做亚硫酸氢盐法研究DNA甲基化实验的新手，以前从未接触过分子实验，真的很希望得到高手指点！因为我真的从未涉及过，所以问出比较弱的问题大家请不要见笑！我现在有个问题想不明白，我们老师让我研究羊的DNA甲基化程度，可我查文献及同学都说应该对某个基因进行研究，但是我们老师就说不用找具体基因，就是测甲基化程度，我想不通的是，不找具体基因怎么设计引物，再进行PCR，而且同学说PCR也不可能批出很长的序列。我现在也不知老师说的对不对，以前我是搞数量遗传的，对分子一窍不通，我鼓起很大勇气才敢问这么弱的问题，请指教是否研究DNA甲基化需要找基因，如果需要如何找？又如何知道是否存在甲基化呢？非常非常感谢！


全基因组的甲基化检测是可以的，07年nature上有篇文献可以学习下：cancer epigenomics:dna methylomes and histone-modification maps.至于特定基因甲基化检测的文章非常的多，建议多读文献。
作者: dreaming    时间: 2011-9-1 16:30

请教各位，做MSP用的DNA提取过程中未加RNase会对后续PCR结果有影响吗？
作者: dreaming    时间: 2011-9-1 16:30

请教各位，做MSP用的DNA提取过程中未加RNase会对后续PCR结果有影响吗？
作者: 小蜜蜂    时间: 2011-9-1 16:31

老师好，小弟有2个小问题想问问：
第二步的步骤4：10mM对苯二酚（氢醌），加30ul至上述水浴后混合液中；（溶液变成淡黄色）
其中提到的10mM的氢醌浓度是否很低呀？如果按这个浓度来算的话，就是1ml的液体里加0.11mg哦，几乎没有似的？因我见有人用0.1M的，也有人写1M的，但我试过1M的，根本溶解不了。所以比较纳闷，具体应用多少，能否请楼主确认一下？谢谢。

此外：第三部分步骤4：加33ul 10M乙酸铵，以中和NaOH，使溶液PH于7.0左右。其中提到的PH定于7.0如何测得出来？因在1.5ml的EP管里，不好用PH计来测吧？还是根据经验估计？谢谢。
作者: 胖小妮子    时间: 2011-9-1 16:35

请问大家买的糖原是哪个公司的呀？货号是多少？我刚查了一下，糖原也有好几种，需要买哪种呢？谢谢了。
作者: finger    时间: 2011-9-1 16:36

楼主老师好，小弟有2个小问题想问问：
第二步的步骤4：10mM对苯二酚（氢醌），加30ul至上述水浴后混合液中；（溶液变成淡黄色）
其中提到的10mM的氢醌浓度是否很低呀？如果按这个浓度来算的话，就是1ml的液体里加0.11mg哦，几乎没有似的？因我见有人用0.1M的，也有人写1M的，但我试过1M的，根本溶解不了。所以比较纳闷，具体应用多少，能否请楼主确认一下？谢谢。

此外：第三部分步骤4：加33ul 10M乙酸铵，以中和NaOH，使溶液PH于7.0左右。其中提到的PH定于7.0如何测得出来？因在1.5ml的EP管里，不好用PH计来测吧？还是根据经验估计？谢谢。

--------------------------------------------------------------

回答：1：10mM对苯二酚，浓度没有问题！配置的时候体积可大一些，这样称量相对容易，但是用不了的要浪费了。
2：33ul 10M乙酸铵，乙酸铵的量是根据将溶液PH=7计算出来的，无需再测。
作者: finger    时间: 2011-9-1 16:36

请教各位，做MSP用的DNA提取过程中未加RNase会对后续PCR结果有影响吗？

---------------------------------------------------------------------------------------------------------------

回答：我认为有影响，会导致提取的DNA混杂有RNA，纯度下降。我曾在某一文献中看到，第一步提取的DNA的纯度也影响了后续试验，其中可能还有一层含义，即纯度不够，会影响浓度和DNA提取量的计算。供参考！
作者: finger    时间: 2011-9-1 16:37

请问大家买的糖原是哪个公司的呀？货号是多少？我刚查了一下，糖原也有好几种，需要买哪种呢？谢谢了。

------------------------------------------------------------------------

回答：买国产的和Sigma的均可。根据您试验室的条件。
作者: 蒲公英    时间: 2011-9-1 16:37

LZ你好： 请问MSP是否需要做双重PCR，我的单一PCR 有目的条带，但双重PCR的条件怎么也摸不出来，请教， 谢谢！！
作者: finger    时间: 2011-9-1 16:38

LZ你好： 请问MSP是否需要做双重PCR，我的单一PCR 有目的条带，但双重PCR的条件怎么也摸不出来，请教， 谢谢！！

-----------------------------

双重PCR所指为何？
作者: 蒲公英    时间: 2011-9-1 16:38

To 楼主:

我做的是15号染色体，正常人的15号的同源染色体，分别来自父方和母方，来自父方的出于非甲基化状态，而来自母方的为甲基化状态，这样分别设计引物，正常人P出来就是来两条带。
而若15号同源染色体的来自父方或母方的甲基化状态出现异常都会导致相应的疾病，这样P出来的就只有一条带。
做双重PCR就是为了使结果更有说服力，相当于设了一个内参。
作者: 小困    时间: 2011-9-1 16:39

请问版主，有没有做过提取血浆的DNA，用什么牌子，哪个型号的试剂盒，我要做这方面的东西，不知道哪个试剂盒更好一点
作者: 麻瓜    时间: 2011-9-1 16:39

我是新手，烦劳版主帮忙！！！

请问版主，有没有做过提取血浆的DNA，用什么牌子，哪个型号的试剂盒，我要做这方面的东西，但不知道哪个试剂盒更好一点 ！！
还有可能问题有点弱智，肝素酶一般的试剂公司都有吧，一般有卖小包装的肝素酶吗？？？
多谢多谢！！！！
作者: @花开花落@    时间: 2011-9-1 17:08

楼主，您好！你的帖子非常好！我做甲基化PCR的结果非常好，
但还有些问题想向你请教一下：

（1）但PCR产物直接测序效果不好，改用TA克隆测序，但是在LB-kana版上基本全部都是白色克隆，已经涂了X-gal, 最大的问题可能出在哪里呢？

（2）做亚硫酸氢钠—PCR和亚硫酸氢钠-测序法所用的引物一样吗？如果不一样，测序法的引物该如何设计？

（3）老板分别在CpG集中区域设计了methylated引物和unmethylated引物，然后又在不含CpG的片断内设计了引物，这样做的目的是什么呢？

为引物设计的问题很伤脑筋，仅能找到有限的引物设计原则，methyPrimer老板引物设计老板不赞同。

恳请赐教！！！
作者: 大虾米    时间: 2011-9-1 17:08

劳驾XDJM帮帮忙，我问了试剂公司都没有找到合适的血浆DNA提取试剂盒，不知道有没有哪位XDJM知情，望多多关照  
作者: mogu    时间: 2011-9-1 17:09

做甲基化特异PCR，需要用甲基化酶处理正常DNA设置阳性对照，我看文献用的比较多的是美国New England 公司的甲基化酶Sss I,不知国内哪里能买到，试验急用，请知情者帮忙指点啊
作者: 阿拉蕾    时间: 2011-9-1 17:09

劳驾XDJM帮帮忙，我问了试剂公司都没有找到合适的血浆DNA提取试剂盒，不知道有没有哪位XDJM知情，望多多关照

----------------------------------------------

这个很多啊，我用的是TIANGEN
作者: 嗨皮    时间: 2011-9-1 17:10

尊敬的各位老师，XDJM们，终于找到关于MSP的帖子了！万分感谢！
我是临床专业的，可导师给的课题是关于甲基化的，由于没有任何基础，所以有很多弱智问题急需解答，望大家给予帮助！
首先，我的课题是基因启动子甲基化的研究，查阅了文献，在NCBI中查到基因序列后，由于基因有4个启动子，所以不知道怎么定位启动子。
二，石蜡组织是否可以做msp?
三，看了相关的文献，感觉溶液的配制比较复杂，哪位老师可否提供溶液配制的方子？
四，引物用甲基化引物设计软件设计是否可行？
五，亚硫酸氢钠-MSP法和亚硫酸氢钠—测序法以及亚硫酸氢盐-限制性酶切法，哪种更省钱，由于经费有限。
问的问题也许很幼稚，还是希望给予解答，谢谢！
作者: finger    时间: 2011-9-1 17:11

但还有些问题想向你请教一下：

（1）但PCR产物直接测序效果不好，改用TA克隆测序，但是在LB-kana版上基本全部都是白色克隆，已经涂了X-gal, 最大的问题可能出在哪里呢？

答：1：避免直接测序！2：可能是连接问题，即你的片段没有连接到TA克隆中，重新连接。

（2）做亚硫酸氢钠—PCR和亚硫酸氢钠-测序法所用的引物一样吗？如果不一样，测序法的引物该如何设计？
答：不一样。具体前面有叙述，可参考。

（3）老板分别在CpG集中区域设计了methylated引物和unmethylated引物，然后又在不含CpG的片断内设计了引物，这样做的目的是什么呢？
答：要做两种方法：MSP和BSP。一般文献先做MSP，便宜、省时、可批量；在进一步选择做BSP，精确观察目的位点。

为引物设计的问题很伤脑筋，仅能找到有限的引物设计原则，methyPrimer老板引物设计老板不赞同。
看来你的老板设计引物挺在行，掌握一些原则后建议直接向他请教！老板就是很好的资源啊，他既然不同意你用软件，总要给个constructive 建议吧。问他，应该没有问题！
恳请赐教！！！
作者: finger    时间: 2011-9-1 17:11

我是临床专业的，可导师给的课题是关于甲基化的，由于没有任何基础，所以有很多弱智问题急需解答，望大家给予帮助！
首先，我的课题是基因启动子甲基化的研究，查阅了文献，在NCBI中查到基因序列后，由于基因有4个启动子，所以不知道怎么定位启动子。
答：选择一个或几个你的目的启动子。

二，石蜡组织是否可以做msp?
答：可以。

三，看了相关的文献，感觉溶液的配制比较复杂，哪位老师可否提供溶液配制的方子？
答：自己计算一下，很简单的，要对自己有信心。配溶液是做实验的第一步。

四，引物用甲基化引物设计软件设计是否可行？
答：可行，但需要多次实验挑出一对可用的引物。如果不是搞基础出身，最好参考文献。

五，亚硫酸氢钠-MSP法和亚硫酸氢钠—测序法以及亚硫酸氢盐-限制性酶切法，哪种更省钱，由于经费有限。
答：MSP省钱，其次是酶切，BSP最费钱。

问的问题也许很幼稚，还是希望给予解答，谢谢！
作者: =菓子=    时间: 2011-9-1 17:11

那具体是天根的什么型号，我现在正犹豫中，不知道哪个好，如果您有经验的话，可不可以共享一下
作者: 夕阳    时间: 2011-9-1 17:13

我是新手,我要肿瘤一特定基因的甲基化程度,看过各位专家师哥师姐的介绍,知道做甲基化第一步要提取组织DNA,但由于取标本时,标本可能包括正常组织和肿瘤组织,我所需要的是肿瘤组织的DNA ,请问各位高人有什么好的方法能单纯的只提肿瘤组织的DNA?谢谢!
作者: 夕阳    时间: 2011-9-1 17:13

我是新手,我要肿瘤一特定基因的甲基化程度,看过各位专家师哥师姐的介绍,知道做甲基化第一步要提取组织DNA,但由于取标本时,标本可能包括正常组织和肿瘤组织,我所需要的是肿瘤组织的DNA ,请问各位高人有什么好的方法能单纯的只提肿瘤组织的DNA?谢谢!
作者: finger    时间: 2011-9-1 17:14

我是新手,我要肿瘤一特定基因的甲基化程度,看过各位专家师哥师姐的介绍,知道做甲基化第一步要提取组织DNA,但由于取标本时,标本可能包括正常组织和肿瘤组织,我所需要的是肿瘤组织的DNA ,请问各位高人有什么好的方法能单纯的只提肿瘤组织的DNA?谢谢!

-----------------------------------------------------------------------------------------------------------------

回答：有条件进行显微切割获得肿瘤组织。参观过，没实际操作过，可以参考文献！
作者: 糊涂虫    时间: 2011-9-1 17:15

你怎么好意思误导别人，你修饰的方法太原始，太复杂了。
作者: finger    时间: 2011-9-1 17:16

你怎么好意思误导别人，你修饰的方法太原始，太复杂了。

------------------------------------------------------------------------------

可以谈谈你的新方法。
作者: 蝴蝶结子    时间: 2011-9-1 17:17

您好。
最近我一直在摸条件，发现一个问题就是配10M的乙酸氨，我当时打算配5ml，方法是加了3.85g的乙酸氨（分子量为77），然后加2ml的水就变成5ml了，因为当时考虑到溶质也占一定的体积，所以之前特定用5ml的液体来作了个刻度，加到刻度的地方就只需加2ml的水。后来我拿来测PH值，发现是大于7.0的。
有个步骤就是：在修饰完了以后加50ul的水把DNA离心出来，然后加了3MNaOH后，再加33ul10M的乙酸氨，要求PH值在7.0左右，是吧。然后我模拟这几个液体的比例放大20倍（没有DNA的），即加水1ml，3M的NaOH110ul，10M的乙酸氨330ul，然后用PH计测PH值发现大于7，好像当时测得8.6左右，后来至少又加了330ul乙酸氨，PH值也就在8.2。所以想请教您这步骤的液体量是如何加的。谢谢！
作者: finger    时间: 2011-9-1 17:18

春雨蒙蒙老师，您好。
最近我一直在摸条件，发现一个问题就是配10M的乙酸氨，我当时打算配5ml，方法是加了3.85g的乙酸氨（分子量为77），然后加2ml的水就变成5ml了，因为当时考虑到溶质也占一定的体积，所以之前特定用5ml的液体来作了个刻度，加到刻度的地方就只需加2ml的水。后来我拿来测PH值，发现是大于7.0的。

回答：您做的很细。

10M乙酸铵溶液我曾检测过PH值1次，大于6，是弱酸。没有重复检测。

上网搜了一下，5%乙酸铵溶液（25度）PH 值 6.7~7.3。
（参见：cuturl('http://www.aladdin-reagent.com/thir.asp?Rea_SubID=10053')）
如果您加水后ph远远大于7，建议您测一下水的ph值。

有个步骤就是：在修饰完了以后加50ul的水把DNA离心出来，然后加了3MNaOH后，再加33ul10M的乙酸氨，要求PH值在7.0左右，是吧。然后我模拟这几个液体的比例放大20倍（没有DNA的），即加水1ml，3M的NaOH110ul，10M的乙酸氨330ul，然后用PH计测PH值发现大于7，好像当时测得8.6左右，后来至少又加了330ul乙酸氨，PH值也就在8.2。所以想请教您这步骤的液体量是如何加的。谢谢！

回答：乙酸铵用量参照的是文献，没有亲自计算过。
（Frommer, M., L. E. McDonald, D. S. Millar, C. M. Collis, F. Watt, G. W. Grigg, P. L. Molloy, and C. L. Paul. 1992. A genomic sequencing protocol that yields a positive display of 5-methylcytosine residues in individual DNA strands. Proc. Natl. Acad. Sci, USA. 89:1827-1831.）
作者: 蝴蝶结子    时间: 2011-9-1 17:18

非常感谢楼主老师的回复，我根据文献计算了一下，发现如果是加10M乙酸氨的话 应该是加24ul哦，达到终浓度为3M。文献中所提到的PH值是指乙酸氨的PH值为7.0，而不是终止反应以后的最后PH值。
根据那篇文献提供的资料，采用TE溶液来洗脱，而且是加100ul，洗脱的液体量相对多些，估计效果更好吧？
作者: 蝴蝶结子    时间: 2011-9-1 17:18

非常感谢楼主老师的回复，我根据文献计算了一下，发现如果是加10M乙酸氨的话 应该是加24ul哦，达到终浓度为3M。文献中所提到的PH值是指乙酸氨的PH值为7.0，而不是终止反应以后的最后PH值。
根据那篇文献提供的资料，采用TE溶液来洗脱，而且是加100ul，洗脱的液体量相对多些，估计效果更好吧？
作者: 格格巫    时间: 2011-9-1 17:19

请问楼主，
1，怎么使用sss1甲基化酶修饰标本做阳性对照？？具体步骤是什么啊？？
2，用甲基化酶修饰过的标本再进行亚硫酸氢钠修饰，是要先沉淀出DNA再修饰，还是直接用含有甲基化酶等的混合物修饰呢？？

万分感谢！！
作者: 红豆冰    时间: 2011-9-1 17:19

您好：
文献说在设计甲基化引物时需要设计甲基化（M）、非甲基化(U)、野生型(W),三对引物，M、U两对引物基本上是在DNA同一部位设计的，那W引物是否可以在其他部位设计？如果在M\U引物部位设计W引物，有时候很难符合引物设计原则，而选择其他部位设计也许更好，W引物只是作为判断基因是否修饰成功的一个方法，以区别加阳性结果，所以我认为可以在启动子其他部位设计，您看我的想法是否正确？
另外，提取的细胞DNA一般都比较完整，是否需要进行酶切使其变成，以利于碱变性呢？
谢谢哦！
作者: 冷眼相对    时间: 2011-9-1 17:20

我是新手，最近也是在开始做甲基化亚硫酸氢盐测序，有个问题想问下您，我抽DNA过程中如果没加入RNase A 去除RNA 的话对后面PCR及测序会有影响吗？我个人认为RNA 不是很容易降解嘛在接下去的连续修饰操作中DNA都降解大多数,RNA 更应该无影无踪了吧，不知道我的想法有没错，还望指导下，谢谢了
作者: 大猫    时间: 2011-9-1 17:22

还想请问下楼主老师，关于亚硫酸氢盐修饰时间16h，我有看到文献上的研究，4h的修饰效果是和16h一样的，而且DNA的降解是随着时间延长而推进，如果4h可以的达到完全修饰的我们是不是可以不用16h从而尽量保证DNA过分降解呢？
作者: finger    时间: 2011-9-1 17:23

请问楼主，
1，怎么使用sss1甲基化酶修饰标本做阳性对照？？具体步骤是什么啊？？
2，用甲基化酶修饰过的标本再进行亚硫酸氢钠修饰，是要先沉淀出DNA再修饰，还是直接用含有甲基化酶等的混合物修饰呢？？

万分感谢！！

---------------------------------------------------------

回答：抱歉，我没有做过上述步骤！
根据文献和经验，甲基化酶修饰过的标本应先进行沉淀，然后进行修饰。
作者: finger    时间: 2011-9-1 17:23

.......我抽DNA过程中如果没加入RNase A 去除RNA 的话对后面PCR及测序会有影响吗？我个人认为RNA 不是很容易降解嘛在接下去的连续修饰操作中DNA都降解大多数,RNA 更应该无影无踪了吧，不知道我的想法有没错，....

回答：RNA似乎不像我们想象的那样容易降解。当我们需要它时，它很容易降解，显得很少；当我们不需要它时，它却显得很多！有点相对论啊。我建议还是要去除RNA，否则也影响你的DNA定量。

........关于亚硫酸氢盐修饰时间16h，我有看到文献上的研究，4h的修饰效果是和16h一样的，而且DNA的降解是随着时间延长而推进，如果4h可以的达到完全修饰的我们是不是可以不用16h从而尽量保证DNA过分降解呢？

回答：不小于4小时，不多于16小时。试剂盒可以是8小时，再短我没有做过，不好说。建议：如果有精力，你可以试验一下，做个对比；如果时间紧，就按照文献做吧！
作者: finger    时间: 2011-9-1 17:23

您好：
文献说在设计甲基化引物时需要设计甲基化（M）、非甲基化(U)、野生型(W),三对引物，M、U两对引物基本上是在DNA同一部位设计的，那W引物是否可以在其他部位设计？如果在M\U引物部位设计W引物，有时候很难符合引物设计原则，而选择其他部位设计也许更好，W引物只是作为判断基因是否修饰成功的一个方法，以区别加阳性结果，所以我认为可以在启动子其他部位设计，您看我的想法是否正确？

回答：由于我只做过一点MSP，所以根据文献和仅有的一点经验，认为您的看法是正确的！

另外，提取的细胞DNA一般都比较完整，是否需要进行酶切使其变成，以利于碱变性呢？

回答：不需要酶切即可很好的变性，碱变性的强度还是很大的。
作者: wawa    时间: 2011-9-1 17:24

还想请问下楼主老师，关于亚硫酸氢盐修饰时间16h，我有看到文献上的研究，4h的修饰效果是和16h一样的，而且DNA的降解是随着时间延长而推进，如果4h可以的达到完全修饰的我们是不是可以不用16h从而尽量保证DNA过分降解呢？

-------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------


正在做甲基化实验，用的是CHEMICON的修饰试剂盒，上边的修饰时间是16-24小时啊，看了以前的春雨蒙蒙老师的帖子，好像也说的16小时，当然修饰时间过
作者: finger    时间: 2011-9-1 17:27

正在做甲基化实验，用的是CHEMICON的修饰试剂盒，上边的修饰时间是16-24小时啊，看了以前的春雨蒙蒙老师的帖子，好像也说的16小时，当然修饰时间过长也会过分修饰。如果太短的时间就是不完全修饰为单链DNA了，谢谢
顺便请教春雨梦梦老师，我的引物的GC比例是大于60%，能否用，您用的退火温度一般是多少？还有就是TAE的使用影响以后的测序吗？

-----------------------------------------------------------------------------------

回答：请教不敢当，大家共同讨论吧。
1：针对修饰时间问题，这个问题好像困扰很多人。而我觉得这不应该是个问题！
1）目前文献上普遍一致的时间是不超过16小时，上限以16小时为准。下限似乎没有明确的说明，就我曾用过的试剂盒而言（methylEase），最短可以8小时。但是如果不是试剂盒，是否可以8小时，我没有看到类似的文献，不敢乱说。
2）超过16小时，因为修饰是可逆的，所以又会出现修饰不完全的情况。一般严格按照16小时来做是不存在任何问题的！是16小时好，还是8小时好，还是8-16小时之间任何一个时间均好，我觉得这是发明这个方法的人应该做的事，如果有时间、又是基础出身的研究生，可以深究一下，或者可以和这个方法的发明人通讯探讨，而对于临床出身的研究生，照章办事无疑是最省力的，前人已经种好大树了，为什么不“拿来主义”好好乘凉呢？而且对于临床学生而言，实验的时间其实是很少的，完成实验的主体思路才是更重要的，对于这样一个成熟的方法为什么还非要弄出许多枝节呢？如果有疑问，关于时间问题和修饰效率的问题，我建议如果实在过不去这个坎儿，请直接和最初发表这个方法的作者进行联系，我想他们的资料一定是很全的！如果实在不愿意联系，而这个疑问又困扰非常，那么不妨亲自做做，反正不麻烦，这样就可以得到一手资料了，不是很好么？
这个不是针对晨雨战友说的，我是指这一类的问题，好像太多人在追究这个问题了，我感觉有必要谈谈我的看法。见仁见智吧！
3）另外，我感觉16小时在操作性上也是比较好的！比如你在下午4点或者5点做上修饰，修饰上16小时就可以到第二天早上的8-9点，后续DNA纯化回收会比较从容，一般到第二天下午就完成了。而作修饰这一天的上午你可以安排别的实验，比如western，都很好。如果你上午开始作修饰，如果用试剂盒，最短可以是8小时，早上做，要到下午收，而后纯化什么的要干到晚上了，感觉比较匆忙。不过这看个人习惯，见仁见智吧！

2：您的引物应该可以用，MSP的退火温度比较高，一般在60度左右，最低一般不低于57度。我曾经做MSP做过touchdownPCR，可惜也没有结果。如果您觉得退火温度不好掌握，最后一招是做个touchdownPCR。

3：TAE是哪一部用的？我怎么没有印象呢？是指电泳液么？如果指电泳液，没有影响！如果您指的是TE，溶解DNA的，似乎也没有影响，我溶解DNA多用DDW。
作者: 明天的明天    时间: 2011-9-1 17:30

请问楼主：
你做BSP时扩增的片段是多大？我扩增出500bp的片段，超过BSP产物一般不超过450bp的一般原则。但克隆测序时遇到困难，部分克隆测序非常困难。

测序时你用的是正向还是反向引物？

另外，你试过PCR产物直接测序吗？
谢谢！
作者: 小荷尖尖    时间: 2011-9-1 17:30

我最近做MSPCR,扩增出目 的条带,但一直很弱,片段是100多点,有什么高招啊
作者: 小荷尖尖    时间: 2011-9-1 17:31

我最近做MSPCR,扩增出目 的条带,但一直很弱,片段是100多点,有什么高招啊  
作者: @木木@    时间: 2011-9-1 17:34

3）老板分别在CpG集中区域设计了methylated引物和unmethylated引物，然后又在不含CpG的片断内设计了引物，这样做的目的是什么呢？

我想作为内参照吧
作者: finger    时间: 2011-9-1 17:36

请问楼主：
你做BSP时扩增的片段是多大？我扩增出500bp的片段，超过BSP产物一般不超过450bp的一般原则。但克隆测序时遇到困难，部分克隆测序非常困难。

回答：我的片段是187bp，曾经做300bp多一点的也可以。最长的是800bp，本来想做巢式PCR，可惜，后来扩不出来了。同样的条件、同一个标本、同一个PCR仪，却没能重复成。所以，太长片段扩增有一定的困难。

测序时你用的是正向还是反向引物？

另外，你试过PCR产物直接测序吗？

回答：我的测序是拿到公司做的。没有做直接测序，请教了一下专业人士，认为直接测序结果不太可靠，另外，参考文献，都作载体连接后作测序。就我的结果看，效果是不错的。
作者: finger    时间: 2011-9-1 17:36

我最近做MSPCR,扩增出目 的条带,但一直很弱,片段是100多点,有什么高招啊
回答：调整一下体系，如退火温度可以调低。

（3）老板分别在CpG集中区域设计了methylated引物和unmethylated引物，然后又在不含CpG的片断内设计了引物，这样做的目的是什么呢？

我想作为内参照吧
回答：可能作为修饰成功与否的对照。
作者: finger    时间: 2011-9-1 17:37

非常感谢春雨蒙蒙老师的回复，我根据文献计算了一下，发现如果是加10M乙酸氨的话 应该是加24ul哦，达到终浓度为3M。文献中所提到的PH值是指乙酸氨的PH值为7.0，而不是终止反应以后的最后PH值。
根据那篇文献提供的资料，采用TE溶液来洗脱，而且是加100ul，洗脱的液体量相对多些，估计效果更好吧？

回答：
首先在您的严谨态度的影响下，我仔细察看了几篇有关修饰方法的文献，认为您说的“PH值是指乙酸氨的PH值为7.0，而不是终止反应以后的最后PH值。”是非常正确的！

其次，关于乙酸氨问题，你的结果是有道理的。

再次，TE洗脱量大，效果会好，不过DNA溶液的浓度会下降。取决于您DNA的量。因为PCR体系中对DNA的量也有一定的要求，不小于50ng。供参考！
作者: finger    时间: 2011-9-1 17:37


我认为做实验是一种奇特的经历，是一个面对困难、挑战自我、战胜自我的过程！经历了很多很多不眠之夜，沉浸在瓶瓶罐罐里，有时面对屡屡的失败身心俱疲。不过我记得有一个词：自淬自励！等回过头看，就是这么一个感觉！

这样的机会不多，一生也许就这一次，应该好好珍惜！

于是掺杂着复杂情感得来的经验教训，无意也无法独享，希望和大家一起讨论交流。不揣我的浅陋，给大家建立一个平台！希望困顿其中的同志能看到一些希望，鼓足勇气，屡败屡战！
作者: 飞天小鹿    时间: 2011-9-1 17:39

谢谢楼主的回答

如果目的片段CG含量密集的话，BSP的引物设计就比较困难。有时不得不去扩增大片段，虽然扩增的成功率远不及小片段，但国外也有牛人扩增了1000bp的。

克隆测序虽然能准确分析单一链的甲基化位点，但一般认为要分析10个克隆才能代表样本的甲基化状态，其工作量与费用可想而知。

所以目前做PCR产物直接测序研究的也不少，有关这方面的论文近年也有发表。直接测序虽然比较困难，但一般认为能半定量分析样本的真实甲基化状态，也具有高通量分析的优势。

我也试过直接测序，上游引物及下游引物都试过了，的确困难，难倒测序公司的人了，呵呵。
作者: 饭团团    时间: 2011-9-1 17:40

最近我一直在摸条件，以前是一直没有结果，有一天我换了一个p16基因来做，发现成功了：经过修饰的肿瘤细胞的DNA，M引物能扩增出条带，U引物没有条带，而未修饰的DNA,M,U都扩增不出来；另外找了个正常人的标本，修饰后U引物能扩增出来，但M引物不能扩增。但我的基因一直是没有条带扩增出来，自从p16基因的扩增结果证实我修饰成功后，我的目的基因的M引物能扩增出有很多杂带，也包括目的片段在内，但正常人的和肿瘤的组织都能扩增出来，感觉特异性不好，而且U引物一直没有扩增出来，但别人的发表论文就没有杂带，我感觉很纳闷，而且我的pCR温度条件都是跟文献的一样的，不知道为什么？
另外，我在做限制性内切酶的实验，买了MBI的MSP I ,HpaII ,HhaI等三个酶，按照试剂说明书来做的，肿瘤细胞的总DNA一直切不断，于是我拿PCR产物来做酶切，又可以把产物切断，证明我的酶是没有问题的，我怀疑是总DNA的问题，但我经过再次纯化后，仍然是消化不了，不知道是什么原因？
各位大虾老师能否帮指点一下迷津？我摸了很久了，郁闷哦。
作者: 饭团团    时间: 2011-9-1 17:40

另外我还打算做亚硫酸氢盐修饰后的DNA测序，设计了一对BSP引物可以扩增400bp的片段，按照我的设想，首先我的DNA修饰成功了，应该可以扩增的吧，但最近做了好几次，都没见任何条带，是不是扩增的片段比较长呢？有什么体系需要优化？我买的酶是天根的LA taq酶，Takara的也用过，都没成功。或是否需要把扩增的片段设计短先？
作者: 我是一片云    时间: 2011-9-1 17:41

推荐一本好的书《表观遗传学实验手册》，吴超群等翻译的！
作者: 不懂    时间: 2011-9-1 17:41

请问一个不成熟的问题：
我想用DNA提取试剂盒来题DNA，然后能否用甲基化试剂盒做呢？
做的是细胞方面的甲基化实验。
因为毕业时间临近，怕做不出来啊！
谢谢您了！
作者: 章鱼小丸子    时间: 2011-9-1 17:42

楼主老师，您好！
最近在摸甲基化PCR的条件，从49到58，每2°一个梯度，都试过了，只有51度有个很浅的带，不过同样条件，又没有跑出来，我是预变性94度5分钟，变性94度10sec，退火30sec，72度1min，40循环，72度10分钟延伸。看了一篇文献，说变性时间要延长，不知道正确与否？我的实验条件是否存在问题，还望赐教！谢谢！
作者: finger    时间: 2011-9-1 17:42

谢谢楼主的回答

如果目的片段CG含量密集的话，BSP的引物设计就比较困难。有时不得不去扩增大片段，虽然扩增的成功率远不及小片段，但国外也有牛人扩增了1000bp的。

克隆测序虽然能准确分析单一链的甲基化位点，但一般认为要分析10个克隆才能代表样本的甲基化状态，其工作量与费用可想而知。

所以目前做PCR产物直接测序研究的也不少，有关这方面的论文近年也有发表。直接测序虽然比较困难，但一般认为能半定量分析样本的真实甲基化状态，也具有高通量分析的优势。

我也试过直接测序，上游引物及下游引物都试过了，的确困难，难倒测序公司的人了，呵呵。


回答：我想直接测序有一个很大的问题就是扩增序列中TA成分过多，与普通测序不同。就我所知，还是克隆测序更普遍些。费用的确昂贵，如不是非需要测序，MSP是很好的办法。
作者: finger    时间: 2011-9-1 17:43

春雨濛濛老师，您好！
最近在摸甲基化PCR的条件，从49到58，每2°一个梯度，都试过了，只有51度有个很浅的带，不过同样条件，又没有跑出来，我是预变性94度5分钟，变性94度10sec，退火30sec，72度1min，40循环，72度10分钟延伸。看了一篇文献，说变性时间要延长，不知道正确与否？我的实验条件是否存在问题，还望赐教！谢谢！

------------------------------------------

回答：首先和你交流一下我的PCR条件：
95ºC，3min（预变性）
94ºC，45sec
52ºC，45sec ×35cycles
72ºC，45sec
72ºC，10min

其次，我感觉曾经出过结果，当时条件应该是可以参考的。请注意所用的试剂是否一致，所加的试剂的量是否准确。我的一个感觉，PCR之所以不能重复，有时候与每次操作时加入体系中的各成分的量不准确有关。因为PCR体系一共才20-25ul，1ul所占比例就很大了，如果每样都多个或少个零点几微升，估计整个体系内的成分比例就改变了。在这方面我有教训，仅供参考。
作者: finger    时间: 2011-9-1 17:43

请问一个不成熟的问题：
我想用DNA提取试剂盒来题DNA，然后能否用甲基化试剂盒做呢？
做的是细胞方面的甲基化实验。
因为毕业时间临近，怕做不出来啊！
谢谢您了！

----------------------------------------------------------------------------------------

回答：就我的经验看，没有问题！主要看您的实验室资金是否充裕，甲基化试剂盒一般在4000元左右，能做20例（2006年的信息，近期有无进展不清楚）。甲基化试剂盒解决的只是DNA修饰和回收的问题，后续的PCR还要自己做。我感觉，使用试剂盒，不用配试剂，步骤上是减少了，您可以尝试。
作者: finger    时间: 2011-9-1 17:44

最近我一直在摸条件，以前是一直没有结果，有一天我换了一个p16基因来做，发现成功了：经过修饰的肿瘤细胞的DNA，M引物能扩增出条带，U引物没有条带，而未修饰的DNA,M,U都扩增不出来；另外找了个正常人的标本，修饰后U引物能扩增出来，但M引物不能扩增。但我的基因一直是没有条带扩增出来，自从p16基因的扩增结果证实我修饰成功后，我的目的基因的M引物能扩增出有很多杂带，也包括目的片段在内，但正常人的和肿瘤的组织都能扩增出来，感觉特异性不好，而且U引物一直没有扩增出来，但别人的发表论文就没有杂带，我感觉很纳闷，而且我的pCR温度条件都是跟文献的一样的，不知道为什么？

回答：您可以提高一下退火温度，看是否能解决杂带问题。

另外，我在做限制性内切酶的实验，买了MBI的MSP I ,HpaII ,HhaI等三个酶，按照试剂说明书来做的，肿瘤细胞的总DNA一直切不断，于是我拿PCR产物来做酶切，又可以把产物切断，证明我的酶是没有问题的，我怀疑是总DNA的问题，但我经过再次纯化后，仍然是消化不了，不知道是什么原因？

回答：我想您所说的没切开应该是没有扩增到酶切后的DNA片段。我曾用过上述酶，效果还不错，注意一下酶反应的温度。总DNA纯化后使用水溶解，试试看。

我还打算做亚硫酸氢盐修饰后的DNA测序，设计了一对BSP引物可以扩增400bp的片段，按照我的设想，首先我的DNA修饰成功了，应该可以扩增的吧，但最近做了好几次，都没见任何条带，是不是扩增的片段比较长呢？有什么体系需要优化？我买的酶是天根的LA taq酶，Takara的也用过，都没成功。或是否需要把扩增的片段设计短先？

回答：可以做个小片段试试，400bp能做，但是不容易。
作者: 米米    时间: 2011-9-1 17:44

“另外，我在做限制性内切酶的实验，买了MBI的MSP I ,HpaII ,HhaI等三个酶，按照试剂说明书来做的，肿瘤细胞的总DNA一直切不断，于是我拿PCR产物来做酶切，又可以把产物切断，证明我的酶是没有问题的，我怀疑是总DNA的问题，但我经过再次纯化后，仍然是消化不了，不知道是什么原因？

回答：我想您所说的没切开应该是没有扩增到酶切后的DNA片段。我曾用过上述酶，效果还不错，注意一下酶反应的温度。总DNA纯化后使用水溶解，试试看。”

春雨朦朦老师您好：
我说“DNA没切开”的意思是总DNA加酶消化过夜后直接跑电泳，结果加了酶和没加酶的电泳结果都一样，片段很完整，说明DNA没有消化成功，即使目的片段中的酶切位点发生了甲基化而切不开，但总DNA的上述酶切位点肯定很多，应该有位点可以切开的，跑电泳的条带应该是很分散的那种吧？我提的DNA测OD值260/280=1.81，应该纯度还可以，也是用水来溶解的。体系是按说明书加的：
三蒸水（或注射用水） 15ul
10×buffer 2ul，
DNA <1ug（一般2ul）
酶 1ul
酶消化的温度是37度，消化16小时，然后直接跑电泳。如果电泳图为酶切后分散的条带，那证明成功，再打算做PCR来证明是否有目的片段的甲基化。
作者: 米米    时间: 2011-9-1 17:45

补充电泳图谱：


图片附件: 62077992.jpg (2011-9-1 17:45, 9.72 KB) / 该附件被下载次数 6
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=8484

作者: 米米    时间: 2011-9-1 17:46

最左边为Mark（50-500bp），从左往右，第1、5孔为未加酶的对照，其余为加了酶的消化后的样品直接跑电泳。可见DNA是完整的。不知道为啥？
作者: 米米    时间: 2011-9-1 17:46

补充图2：
该图是用限制性内切酶PCR的那对引物直接扩增DNA后，所得的产物进行酶消化，其中第1孔为未加酶的对照，其他2个标本均为加了酶（Msp I）进行消化的样品。可见酶是没有问题的，能够将含有酶切位点的pCR产物切断。

图片附件: 14337076.jpg (2011-9-1 17:47, 6.72 KB) / 该附件被下载次数 6
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=8485

作者: 小葵    时间: 2011-9-1 17:47

回答：就我的经验看，没有问题！主要看您的实验室资金是否充裕，甲基化试剂盒一般在4000元左右，能做20例（2006年的信息，近期有无进展不清楚）。甲基化试剂盒解决的只是DNA修饰和回收的问题，后续的PCR还要自己做。我感觉，使用试剂盒，不用配试剂，步骤上是减少了，您可以尝试。

------------------------------------------------------------------------------------------------------

我买的是chemicon的甲基化修饰试剂盒，3200左右，可以做100份左右的标本。
作者: 小葵    时间: 2011-9-1 17:48

请问哪位xdjm做过LA Taq with GC buffer的，我用的buffer1不怎么跑的出来，需要换buffer2吗？
还有就是琼脂糖电泳时候，是否需要加上1ul的buffer2？谢谢
作者: 小葵    时间: 2011-9-1 17:48

请问哪位xdjm做过LA Taq with GC buffer的，我用的buffer1不怎么跑的出来，需要换buffer2吗？
还有就是琼脂糖电泳时候，是否需要加上1ul的buffer2？谢谢
作者: =菓子=    时间: 2011-9-1 17:48

谢谢您了！
我的老师给我设计了一对引物，听说是要做pcr，然后测序，针对测序结果，设计甲基化引物，我也不太懂！想请教您一下，亚硫酸氢盐修饰后测序法与msp特异性甲基化pcr区别是什么啊？（不太懂，见笑了）
作者: 开心蔬菜帮    时间: 2011-9-1 17:49

我买的是chemicon的甲基化修饰试剂盒，3200左右，可以做100份左右的标本。

-------------------------------

效果怎么样呢？
作者: 嗡嗡    时间: 2011-9-1 17:49

请教楼主和各位高手！！
我做MS-PCR已经四个月了还是没有结果，条件总是摸不好！！
说说我的实验步骤：
1. 我用欧米伽的组织DNA提取试剂盒提取人体新鲜组织标本，测DNA浓度基本都在200-300ng/ul.
2. 应用大约2ug DNA进行亚硫酸盐修饰----这一步直接应用Takara的甲基化检测试剂盒。
3. 按操作说明修饰纯化后的DNA进行PCR,反应体系为：
DNA 4 ul
dH2O X ul
Primer 各0.5 ul, 共1 ul
dNTP mixture (2.5mM each dNTP) 2.0 ul
10 X PCR Buffer 3.0 ul
Taq (5 U/ul) 0.3 ul
总体积 30ul
反应条件为：94度 3min；（94度 30s，51-59度 30s，72度 30s）35个循环；72度 4 min, hold at 4度.
结果试剂盒里所给的阳性对照可以做出来，但就是目的基因出不来，大多数时候都是引物二聚体，少数时候什么都没有。我已经尝试将退火温度一再调整！
自己分析其原因1. 引物浓度过高？？我的引物是按照OD值十倍稀释，从而使引物浓度能够达到10uM,如 1OD=0.0050umol, 加水500ul. 不知道这样合理否？？
2. 引物设计有问题？？我一共设计了8个基因的甲基化引物，都是参照影响因子在5以上的杂志的文章，结果几乎一一尝试了，均得到几乎相同的结果（引物二聚体），不知道这样可否排除引物的问题？？
附上我今天失败的结果，希望大家能够帮忙分析分析，小弟感激不尽，眼瞅着就要毕业，这结果。。。哎！！

图片附件: 41727375_snap.jpg (2011-9-1 17:50, 19.57 KB) / 该附件被下载次数 11
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=8486

作者: 嗡嗡    时间: 2011-9-1 17:50

迟迟出不来结果！！急啊！！大家帮助帮助小弟么！！
看到文献中的描述：
有一篇文献的作者提到在进行PCR前，先应用universal primer that covers no CpG sites in either the forward or reverse primer. 请问这个universal primer 是什么，怎么设计？作者文中并未提及。。。
另外一篇文献的作者没有应用universal primer.但却是在PCR结束之后，将PCR产物加入5units 的限制酶中消化，将消化后的PCR产物进行电泳？？这个消化作用是什么？是否必须？？
我估计我的结果出不来，可能与这两处之一有关系？？请各位高人指点！！小弟不胜感激阿！！
作者: 微笑的海豚    时间: 2011-9-1 17:51

请教楼主和各位高手！！
我做MS-PCR已经四个月了还是没有结果，条件总是摸不好！！
说说我的实验步骤：
1. 我用欧米伽的组织DNA提取试剂盒提取人体新鲜组织标本，测DNA浓度基本都在200-300ng/ul.
2. 应用大约2ug DNA进行亚硫酸盐修饰----这一步直接应用Takara的甲基化检测试剂盒。
3. 按操作说明修饰纯化后的DNA进行PCR,反应体系为：
DNA 4 ul
dH2O X ul
Primer 各0.5 ul, 共1 ul
dNTP mixture (2.5mM each dNTP) 2.0 ul
10 X PCR Buffer 3.0 ul
Taq (5 U/ul) 0.3 ul
总体积 30ul
反应条件为：94度 3min；（94度 30s，51-59度 30s，72度 30s）35个循环；72度 4 min, hold at 4度.
结果试剂盒里所给的阳性对照可以做出来，但就是目的基因出不来，大多数时候都是引物二聚体，少数时候什么都没有。我已经尝试将退火温度一再调整！
自己分析其原因1. 引物浓度过高？？我的引物是按照OD值十倍稀释，从而使引物浓度能够达到10uM,如 1OD=0.0050umol, 加水500ul. 不知道这样合理否？？
2. 引物设计有问题？？我一共设计了8个基因的甲基化引物，都是参照影响因子在5以上的杂志的文章，结果几乎一一尝试了，均得到几乎相同的结果（引物二聚体），不知道这样可否排除引物的问题？？
附上我今天失败的结果，希望大家能够帮忙分析分析，小弟感激不尽，眼瞅着就要毕业，这结果。。。哎！！

-----------------------------------------------------------------------------------

以下是我甲基化的条件（MSP）你可以参照一下！
Final Conc

10×buffer 5 1*
25uM MgCl2 3 (1.5mM)
2.5uM primer F 5 (0.25uM)
2.5uM primer R 5 (0.25uM)
dNTPs 2.5uM 4 4 (200uM)
Taqgold 5U/ul 0.2 (1.0U)
ddH2O 25.8
Modified DNA 2 (0.1ug)
Final Uolume 50

我修饰用的试剂盒，DNA一般浓度控制在500ng,不超过1ug.

引物文献报道的一般是可行的，但也有P出的（酶，模板都是不一样），要自己摸条件。

根据自己的经验做特异性甲基化主要是：

1. 引物一定要正确
2. 模板最好是能用试剂盒修饰
3. PCR酶很重要。
作者: 嗡嗡    时间: 2011-9-1 17:51

以下是我甲基化的条件（MSP）你可以参照一下！
Final Conc

10×buffer 5 1*
25uM MgCl2 3 (1.5mM)
2.5uM primer F 5 (0.25uM)
2.5uM primer R 5 (0.25uM)
dNTPs 2.5uM 4 4 (200uM)
Taqgold 5U/ul 0.2 (1.0U)
ddH2O 25.8
Modified DNA 2 (0.1ug)
Final Uolume 50

我修饰用的试剂盒，DNA一般浓度控制在500ng,不超过1ug.

引物文献报道的一般是可行的，但也有P出的（酶，模板都是不一样），要自己摸条件。

根据自己的经验做特异性甲基化主要是：

1. 引物一定要正确
2. 模板最好是能用试剂盒修饰
3. PCR酶很重要。

----------------------------------------------------------

谢谢斑主啊！！问您一个比较弱的问题，
但是我想知道你的引物是怎么稀释的？？
因为引物说明上只给了1OD=###umol.那应该加多少水稀释才可以达到10uM阿？？----这个我一直搞得有些模糊？？？
多谢不吝赐教！！
作者: 阿拉蕾    时间: 2011-9-1 17:54

谢谢斑主啊！！问您一个比较弱的问题，
但是我想知道你的引物是怎么稀释的？？
因为引物说明上只给了1OD=###umol.那应该加多少水稀释才可以达到10uM阿？？----这个我一直搞得有些模糊？？？
多谢不吝赐教！！


-----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------


引物合成后会附带一张说明书，按说明书一般是配成100uM的引物，然后拿部分已经溶解成100uM的引物再稀释10倍就可以了。
作者: 蒲公英    时间: 2011-9-1 17:54

回答：就我的经验看，没有问题！主要看您的实验室资金是否充裕，甲基化试剂盒一般在4000元左右，能做20例（2006年的信息，近期有无进展不清楚）。甲基化试剂盒解决的只是DNA修饰和回收的问题，后续的PCR还要自己做。我感觉，使用试剂盒，不用配试剂，步骤上是减少了，您可以尝试。

---------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------

谢谢！
我做的是细胞方面的甲基化实验，细胞成分是离心之后的沉渣，请问您提取DNA的细胞量应该是多少呢？
作者: 蒲公英    时间: 2011-9-1 17:54

回答：就我的经验看，没有问题！主要看您的实验室资金是否充裕，甲基化试剂盒一般在4000元左右，能做20例（2006年的信息，近期有无进展不清楚）。甲基化试剂盒解决的只是DNA修饰和回收的问题，后续的PCR还要自己做。我感觉，使用试剂盒，不用配试剂，步骤上是减少了，您可以尝试。

---------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------

谢谢！
我做的是细胞方面的甲基化实验，细胞成分是离心之后的沉渣，请问您提取DNA的细胞量应该是多少呢？
作者: 小米虫子    时间: 2011-9-2 10:34

请问各位大侠，下面是我跑的甲基化-PCR电泳图，这是模板问题还是PCR条件有问题或者是PCR体系污染了，请同行们指点！十分感谢！

图片附件: 76932652.jpg (2011-9-2 10:35, 14.69 KB) / 该附件被下载次数 6
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=8489

作者: free    时间: 2011-9-2 10:39

我的也是这样,不知是提取DNA的问题,修饰的问题还是PCR反应条件的问题,同样郁闷中
作者: 大虾米    时间: 2011-9-2 10:39

应该是非特异性条带，说明你的pcr没有成功
作者: mogu    时间: 2011-9-2 10:40

请教大家个问题，你们的DNA经修饰沉淀后，还能看到沉淀吗？
问什么我们的什么也看不到了，是不是DNA都被洗脱掉了呢？我们用的是春雨濛濛老师所说的那种DNA纯化回收试剂盒。
谢谢！
作者: 王六六    时间: 2011-9-2 10:43

各位朋友，BSP刚做一个多月了，至今没什么结果，来这报个到，和大家一起学习！
我是从动物组织中提DNA 做BSP，有个问题，基因组酶切这一步许多PROROCOL说可有可无，我看一本甲基化电子书说基因组DNA最好酶切一下，不知道哪位前辈有切身体会？
我的实验不出结果，就试了试酶切，流程分享如下：
1。将过夜酶切产物用DDW稀释到500微升，加等体积的酚氯仿异戊醇，混匀，12000RPM ，5min,4度
2. 小心吸上清，加入等体积的氯仿异戊醇，混匀，12000RPM，5MIN,4度
3. 小心吸上清, 加入0.2 倍体积的醋酸铵和2倍体积的冰无水乙醇，4度，静置10min
4. 12000RPM ，10min,4度
5. 小心弃上清，70%乙醇洗DNA，室温10min ,挥发酒精
6。20微升TE或DDW溶解DNA，注意管壁，用枪头吸溶液吹洗几下

不知道各位酶切后纯化方案是什么？或许您对我的方案有疑义，欢迎批评指正！希望能与大家一起进步！
作者: 幸福无罪    时间: 2011-9-2 10:46

请教楼主：
你定的SIGMA s9000分子式是NaHSO3 还是Na2S2O5，我从网上看到的s9000分子式Na2S2O5，而我定的SIGMA s9000 是NaHSO3，晕！
作者: finger    时间: 2011-9-2 10:47     标题: 回复 #364 幸福无罪 的帖子

回答：你定的没有问题
作者: Darcy    时间: 2011-9-2 10:49

各位战友，BSP刚做一个多月了，至今没什么结果，来这报个到，和大家一起学习！
我是从动物组织中提DNA 做BSP，有个问题，基因组酶切这一步许多PROROCOL说可有可无，我看一本甲基化电子书说基因组DNA最好酶切一下，不知道哪位前辈有切身体会？
我的实验不出结果，就试了试酶切，流程分享如下：
1。将过夜酶切产物用DDW稀释到500微升，加等体积的酚氯仿异戊醇，混匀，12000RPM ，5min,4度
2. 小心吸上清，加入等体积的氯仿异戊醇，混匀，12000RPM，5MIN,4度
3. 小心吸上清, 加入0.2 倍体积的醋酸铵和2倍体积的冰无水乙醇，4度，静置10min
4. 12000RPM ，10min,4度
5. 小心弃上清，70%乙醇洗DNA，室温10min ,挥发酒精
6。20微升TE或DDW溶解DNA，注意管壁，用枪头吸溶液吹洗几下

不知道各位酶切后纯化方案是什么？或许您对我的方案有疑义，欢迎批评指正！希望能与大家一起进步！

------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------

本人也做过总DNA的酶切，采用的酶是甲基化敏感性内切酶MSP I ,Hpa II，
Hha I,但电泳证实未能将总DNA切断。不知道您是否遇到过这种情况？
作者: 牙牙    时间: 2011-9-2 10:50

我是新手，烦请各位高手详解MSP和BSP的区别。谢谢！
作者: 岸上的鱼    时间: 2011-9-2 10:50

第二部分 亚硫酸氢钠修饰基因组DNA
如不特别指出，所用双蒸水（DDW）均经高压蒸汽灭菌。
1：将约2ugDNA于1.5mlEP管中使用DDW稀释至50ul；
2：加5.5ul新鲜配制的3M NaOH；
3： 42℃水浴30min；
水浴期间配制：
4：10mM对苯二酚（氢醌），加30ul至上述水浴后混合液中；（溶液变成淡黄色）
5： 3.6M亚硫酸氢钠（Sigma，S9000），配制方法：1.88g亚硫酸氢钠使用DDW稀释，并以3M NaOH滴定溶液至PH 5.0，最终体积为5ml。这么大浓度的亚硫酸氢钠很难溶，但加入NaOH后会慢慢溶解，需要有耐心。PH一定要准确为5.0。加520ul至上述水浴后溶液中。
6：EP管外裹以铝箔纸，避光，轻柔颠倒混匀溶液。
7：加200 ul 石蜡油，防止水分蒸发，限制氧化。
8：50℃避光水浴16h。
一般此步在4pm开始做，熟练的话不到5pm即可完成，水浴16h正好至次日8am以后收，时间上很合适。
这一步细节：
1：基因组DNA的量不需十分精确，宁多勿少，因为在以后纯化回收步骤中会有丢失，且此方法修饰最多可至4ug。
2：所有试剂均须新鲜配制，所以配液的技术要过关，既要快，又要精确。
3：亚硫酸氢钠溶液呈强酸性，一定用碱将PH调制5.0，否则PH不合适会影响后续纯化吸收。
4：水浴最好达16小时，虽可以短至8小时，但后者修饰会有不完全。

---------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------

请问楼主以及各位高手我查了Sigma公司的产品目录，好像‘Sigma，S9000’是Sodium metabisulfite 即焦亚硫酸钠，而楼主所说的‘3.6M亚硫酸氢钠（Sigma，S9000）’是怎么回事呢？是不是焦亚硫酸钠加水生成亚硫酸氢钠呢？
作者: 兔纸    时间: 2011-9-2 10:51

大家好，我也是做肿瘤甲基化研究的，做的是粪便中提取DNA，然后做甲基化研究，用的是Qiagen的粪便Dna提取试剂盒，里面有很多的杂质（可能是细菌），提取后电泳，有一条很亮的，但是也有很多的其他小的条带，下一步要做亚硫酸盐处理，是否有影响，还有就是2ug的DNA怎么来判定，如果用分光光度计测浓度好像不准（有很多的杂质），用电泳的话如何判断浓度。毕业在即，实验刚刚开始，甚急，请高手指点。
下图是我提完DNA后做的电泳，应该不是降解了吧。请大家帮忙看看。

图片附件: 84845350_snap.jpg (2011-9-2 10:52, 23.29 KB) / 该附件被下载次数 5
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=8490

作者: 胖小妮子    时间: 2011-9-2 10:53

小妹现在在做MSP,用的是TOYOBO的PCR试剂盒，但是电泳啥也没有，试剂盒上的反应条件是：94℃ 2分钟，94℃15秒，（TM-（5-10））30秒，68℃1分钟，35个循环；72℃6分钟。退火温度我试过50，55，58，60，65，68。都什么也没有。引物是P16的。TM=55.6.反应体系是50ul的。：10Xbuffer 5ul, dNTPs 5il, mgso4 2.5ul, 引物各1.5ul, DNA 1ul, 酶1ul,。
有一点很奇怪，当我设置退火低时任何条带都没有，但是把退火温度打到65℃以上时，还有几条非特异性条带。真的是不知道为什么。郁闷死掉了。真想撞墙啊 。
对了，我的DNA是人胎盘的，用SssI酶转化过的，老板说按原理来说这个DNA就算不经过亚硫酸氢钠处理也应该有甲基化的条带的。亚硫酸氢钠处理我是买的北京天漠的试剂盒。
求大侠们指点一下啊，我真不知道是为什么了。。
作者: +田田+    时间: 2011-9-2 10:53

大家好，我也是做肿瘤甲基化的，已经半年了，不出结果，郁闷。希望做甲基化的同学能够互相联系，交流下实验情况。
作者: wawa    时间: 2011-9-2 10:55

不知道你问的时RNA还时RNA酶？

就我所知道的，DNA提取过程中必须加RNase对RNA进行处理。因为MSP的原理是：该法用 HSO3-处理单链DNA，使所有未甲基化的C脱氨转变为U,而甲基化的C则保持不变。然后经特异性扩增放大，测序。C位点就是甲基化位点，C的量即甲基化量。而且甲基化都是对DNA的其中的一条链进行扩增，那么有RNA的话就会对反应有影响。

我所在的实验室提取DNA从来都不用RNase，这与我在国内不太一样，我问过他们为什么，回答是在提取过程中RNA会自然降解，无需专门特殊处理。我看他们做了这么多MSP结果的确是没有影响。
作者: 旋转木马    时间: 2011-9-2 10:56

新手报个到。
刚开始准备做MSP，以后还望各位师兄师姐指教！
作者: 旋转木马    时间: 2011-9-2 10:57

请问各位师兄师姐，哪个厂家的甲基化修饰试剂盒比较好？
作者: 阿拉蕾    时间: 2011-9-2 10:58

请问各位大侠，下面是我跑的甲基化-PCR电泳图，这是模板问题还是PCR条件有问题或者是PCR体系污染了，请同行们指点！十分感谢！

-------------------------------------

设置不加模板的阴性对照吧
作者: 红豆冰    时间: 2011-9-2 10:59

看了半天甲基化还真是复杂的啊，眼都花了！我也在做细胞株的甲基化实验，也很头大啊!今晚找到这个甲基化的论坛，真好啊！
作者: 丁香@@    时间: 2011-9-2 11:00

请教各位大侠：
在DNA提取过程中用的， RNA酶必须要配制成不含DNA酶的RNA酶

现在一般公司买的RNA酶溶液是不含DNA酶的吗？我们现在用的是TIANGEN公司的RNAaseA RT405-02，请问是能直接使用还是需要进行处理？如何处理呢？

我们是用的用试剂盒做的修饰，引物是参考文献的（所见文献用的几乎相同），同一批修饰的模板，两个基因都是有时阳参能P出来，但引物二聚体很多，阴参一个是在引物二聚体的位置成模糊一片，还有一个只有引物二聚体，试跑过温度梯度，也没有很明显的改变，希望各位能指点一下，到底还能怎么做下去
万分万分的感谢！！
作者: 许愿精灵    时间: 2011-9-2 11:01

刚要开始做甲基化的实验，很多东西不懂。看来论坛里这类的高手还真是很多啊。先看着多学点！
作者: 椰子叶子    时间: 2011-9-2 11:02

一个新手弱弱的问题
想问一下楼主 MSP 中引物设计这一点 有一个要求就是M 和 U pair 引物中必须要有一样的CG 位点 这是为什么
作者: 羊咩咩    时间: 2011-9-2 11:02

个人认为MSP与位点特异性PCR有异曲同工之处，不过是位点特异性PCR检测的是单个的SNP位点，而MSP检测了多个CpG位点的状况。MSP中M和U有一样的CG位点，主要是为了更为准确地反应一个基因的某一区域的CpG状态究竟如何。两组引物扩增同样的区域，其结果才能更好地反应问题。
作者: 假小子    时间: 2011-9-2 11:03

于找到组织了，小妹我刚开始做肿瘤的甲基化，用的是天莫的甲基化试剂盒，说明书上说加20ul差不多200-500ng的DNA就行了，大家是遵照说明书呢还是将提取的DNA纯化了然后加的样啊。期待大家指点，谢谢
作者: 假小子    时间: 2011-9-2 11:05

还有啊，阳性对照是如何弄的？唉问题还真是多啊。请大家帮帮小妹啊，感激不尽！
作者: 假小子    时间: 2011-9-2 11:05

还有不好意思了，我从肿瘤患者外周血中提取DNA，大约在35ng/ul左右,用天莫的甲基化试剂盒，按照楼主说的修饰要加1-2ulDNA,我是不是先要把提取的DNA纯化一下啊，因为试剂盒要求加20ul。是不是我提的DNA有点太低了？
作者: 大仙    时间: 2011-9-2 11:06

楼主也提到，可以用电泳的方法大概估计浓度，现在有售精准定量的DNA marker.基因组DNA稀释几个梯度，和Marker比较就可以大概估计浓度了
作者: 微笑的海豚    时间: 2011-9-2 11:17

不知道你的单个细胞指的是什么，我们做小鼠胚胎的，细胞量很少，DNA提取、亚硫酸氢盐处理、PCR模板都有不同，你可以查两篇文献看看，方法写的比较明白，具体的就要自己再查了。

《亚硫酸氢盐测序法检测小鼠胚胎Oct4启动子区甲基化[1]》
作者: =菓子=    时间: 2011-9-2 11:18

可能是引物的问题，我之前出现过电泳只点1微升引物出现两条带的情况，合成引物的公司说是与引物序列有关，电泳一下引物试试
作者: 阿福    时间: 2011-9-2 11:20

可能是引物的问题，我之前出现过电泳只点1微升引物出现两条带的情况，合成引物的公司说是与引物序列有关，电泳一下引物试试

-------------------------------------------------------------------------

请问你说的拿引物电泳是采用琼脂糖电泳还是PAGE?
作者: 阿福    时间: 2011-9-2 11:21

还有不好意思了，我从肿瘤患者外周血中提取DNA，大约在35ng/ul左右,用天莫的甲基化试剂盒，按照楼主说的修饰要加1-2ulDNA,我是不是先要把提取的DNA纯化一下啊，因为试剂盒要求加20ul。是不是我提的DNA有点太低了？

===========================================================================================================

我最近在做甲基化,用的也是ZYMO的试剂盒,感觉质量没有问题,你完全按他们的protocol做就ok了.按照你的浓度,加10ul左右,补水至20ul 就好.
还有,我个人感觉亚硫酸氢盐转化对DNA的质量要求并不是特别高,因为我曾经用很差的
DNA做出来过.事实上,ZYMO公司据称有试剂盒能直接在细胞内进行亚硫酸氢盐转化.
作者: 葡萄籽    时间: 2011-9-2 11:21

请问有什么方法可以做石蜡包块的甲基化分析？

石蜡包块的年份有要求吗？

从石蜡包块提取DNA有什么比较好的protocol或者试剂盒吗？？得率高不高？DNA质量如何？？

后续的甲基化检测用什么方法比较恰当？

我想做大量本的石蜡DNA甲基化分析
作者: 小困    时间: 2011-9-2 11:22

楼主您好，你用的亚硫酸氢钠是sigma的s9000有的文献上说的是s8890，刚刚又去查了一下，s9000是Sodium metabisulfite，而s8890是Sodium bisulfite ，请问有区别吗？？  
作者: free    时间: 2011-9-2 11:22

楼主您好，你用的亚硫酸氢钠是sigma的s9000有的文献上说的是s8890，刚刚又去查了一下，s9000是Sodium metabisulfite，而s8890是Sodium bisulfite ，请问有区别吗？？

================================================================================================================

当然有啦，s9000：Na2S2O5, s8890: NaHSO4。所以在配制bisulphite solution 时候，如果是S9000摩尔数应该是s8890的一半，因为按照S的摩尔浓度算的。
cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=67&id=9184927&sty=1&tpg=1&age=0')
作者: 绵绵    时间: 2011-9-2 14:48

你的MSP实验做得怎么样了？我的课题也是提肿瘤患者外周血DNA做MSP，希望多多交流！QQ:313214010
阳性对照你找到了吗？据文献上说：
MSP阳性对照选取的方法有以下几种：（1）查文献找目的序列MSP阳性的细胞，用其修饰后DNA做阳性对照。（2）购买商品化的MSP阳性对照，但较昂贵。（3）自制MSP阳性对照：用CpG甲基化酶(M.SssI)处理胎盘DNA做阳性对照。因为CpG甲基化酶M.SssI能识别并甲基化CpG识中所有C,使其与MSP方法所理想的DNA状态一致，可模拟生物基因组的修饰模式，故可用来做阳性对照。方
作者: 绵绵    时间: 2011-9-2 14:48

你的MSP实验做得怎么样了？我的课题也是提肿瘤患者外周血DNA做MSP，希望多多交流！QQ:313214010
阳性对照你找到了吗？据文献上说：
MSP阳性对照选取的方法有以下几种：（1）查文献找目的序列MSP阳性的细胞，用其修饰后DNA做阳性对照。（2）购买商品化的MSP阳性对照，但较昂贵。（3）自制MSP阳性对照：用CpG甲基化酶(M.SssI)处理胎盘DNA做阳性对照。因为CpG甲基化酶M.SssI能识别并甲基化CpG识中所有C,使其与MSP方法所理想的DNA状态一致，可模拟生物基因组的修饰模式，故可用来做阳性对照。方法如下：先用CpG甲基化酶（NEB公司）在37℃下处理胎盘组织DNA 1h,再经亚硫酸氢钠修饰后，即可做阳性对照用于优化MSP的反应。
作者: 夕阳    时间: 2011-9-2 14:51

大家好，我最近用BSP法想看一下基因启动子区的甲基化状态，刚开始的时候扩增产物比较亮，测序也显示亚硫酸盐处理成功，可是后两批亚硫酸盐修饰的20个样本中只有9个能够扩增出弱的条带，感觉操作步骤都是一样的，不知道什么原因后面处理的标本最后得到的DNA中都有象树脂一样的白色东西，但是能够溶解到TE里，扩增效果不好会不会跟这个因素有关？为什么会有树脂样的东西呢？
作者: 明天的明天    时间: 2011-9-2 14:52

有谁知道人或其他哺乳动物的线粒体基因上那些基因存在甲基化位点啊？？或者相关文章给小弟推荐下？？
作者: 荷塘青蛙！    时间: 2011-9-2 14:54

大家好，我准备做MSP，是否需要设置对照，阳性还是阴性？还是都要？如何设置？我是从肿瘤患者全血中提取DNA，检测一种抑癌基因的甲基化表达情况。谢谢
作者: 阿拉蕾    时间: 2011-9-2 14:54

该方法说来容易，做起来有难度，成功率低。  
作者: 细水长流    时间: 2011-9-2 14:54

请问甲基化阳性对照的具体操作方法？甲基化酶处理后用什么试剂盒纯化呢？Promega的Clean up 试剂盒可以吗？
作者: 菠萝菠萝蜜    时间: 2011-9-2 14:55

我最近准备做甲基化，买的ZYMO的甲基化修饰试剂盒，但我从细胞中提取的DNA量仅为3-8ng/ul，量非常低，我看试剂盒要求的最佳量为200ng-500ng，请问怎样处理一下啊？新手上路，指点一下吧。谢谢！
作者: 天蓝蓝    时间: 2011-9-2 14:56

有没有人FOXP3启动子甲基化 水平的啊
作者: @木木@    时间: 2011-9-2 14:56

各位大侠，最近在做MSP，四个细胞株，结果三个细胞株是U有，M没有，一个是M和U都有，且M条带少亮些，我想问一下如果是细胞株，是不是不会出现部分甲基化的问题，而是假阳性？？
作者: 麻瓜    时间: 2011-9-2 14:57

请教：做下来要多少钱  
作者: 微笑的海豚    时间: 2011-9-2 14:57

大家好，我最近准备做甲基化，买的ZYMO的甲基化修饰试剂盒，但我从细胞中提取的DNA量仅为3-8ng/ul，量非常低，我看试剂盒要求的最佳量为200ng-500ng，且试剂盒要求体积为20ul，请问怎样处理一下啊？新手上路，指点一下吧。谢谢！

================================================================================================================

你的起始细胞数量是不是很少？建议用全细胞处理的盒子就好。
作者: 阿拉蕾    时间: 2011-9-2 14:58

呵呵，楼主好像是抄袭网上的，其实我一直在做，这种方法纯化出来的DNA质量并不好，效率也不怎么高。没有promega的那个纯化试剂盒的同志，可以试试DNA提取试剂盒的柱子试试，效果差不多，我现在都不用了，直接QIAGEN的盒子，呵呵，好用，有甲基化的朋友一起探讨啊，我一直在做MS-HRM。
作者: 阿拉蕾    时间: 2011-9-2 14:58

楼主甲基化方面的知识很丰富，我想请教几个问题，因为本人做甲基化不是常规的MSP，而是使用MS-HRM的技术来做CpG岛甲基化的。
由于MS-HRM技术基于的是高分辨溶解曲线的变化来确定样本是否有甲基化，所以灵敏度很高。我在常规的亚硫酸氢钠处理出来的DNA样本来做MS-HRM，曲线不是很好。
我分析，在样本纯化回收过程中加入了糖原，使原来的DNA样本浓度失真，导致曲线杂乱，请问楼主，能不能在纯化时候不加入糖原，还有，糖原不加的话，会不会影响回收效率。
作者: finger    时间: 2011-9-2 14:59

我现在使用QIAGEN的EpiTect Bisulfite kits的盒子在试，结果还可以。
作者: HOT兔    时间: 2011-9-2 14:59

急问野生型引物什么意思吗？怎样设计？
作者: loli    时间: 2011-9-2 15:00

请教一下楼主，我是个初学者我最近要做一个肿瘤抑制基因的甲基化PCR，但是这个基因比较新这方面的文献较少，现在主要是甲基化引物设计的问题。我自己尝试过自己设计但是以失败而告终。请问找公司设计可以吗？应该找哪个公司？先谢谢啦哈哈！！
作者: 何去何从    时间: 2011-9-2 15:00

我都做快两个月了，可U/M都不出来，只见引物二聚体哦。
作者: @木木@    时间: 2011-9-2 15:01

谢谢楼主的回答,其真是高人一个，！
从此版中弄懂了些问题，收获不少，感谢感谢！
我也正在摸索中，也只见引物二聚体哟！
作者: 橘子水儿    时间: 2011-9-2 15:02

msp的巢式PCR第一轮外侧引物怎么设计啊
作者: 如影随形    时间: 2011-9-2 15:04

急需阳性对照制作文献，盼各位提供，在这里谢过了
作者: 冰激凌小姐    时间: 2011-9-2 15:05

谢谢楼主开辟此贴，我在接近绝望中P出了M带。
作者: 大仙    时间: 2011-9-2 15:05

您指用人血制作IVD 吗？
作者: 不懂    时间: 2011-9-2 15:06

各位大哥：我想请教一个问题，我做的是MSP，在文献上查到引物，文献上就说是启动子区甲基化的引物，我说按文献上的做了，条带也出了，但是我现在把引物放到Methyl Primer Express里对照，怎么查出来是在第一外显子上呢？真晕了，难道外显子也发生甲基化吗？
作者: 嘉年华    时间: 2011-9-2 15:07

请问楼主，为什么纯化回收后过夜没有沉淀呢？我没用糖原，是不是不用糖原就不会产生沉淀？
作者: 飞天小鹿    时间: 2011-9-2 15:07

我是新手，现在想要做miRNA的MSP,请问也是先提取DNA吗？引物也没有查到文献，也是按照DNA设计引物的软件吗？试剂也还没有买，大概要买哪些试剂盒啊？非常感谢高手能指点
作者: 麻瓜    时间: 2011-9-2 15:07

各位师兄师姐：我想请教个问题，MS-HRM中标准曲线是怎样制作？见一些文献写到用一个甲基化程度100%和0%的标准品，按不同的比例配成0%，1%，5%，10%，20%，40%，60%，80，100%。这样梯度的标准品。但有些用到的标准品序列与待测序列不是同一个序列。如果标准品与待测序列不是同一序列,那序列本来就不一致怎能说明是由于甲基化的不同经盐修饰后的序列改变?
谢谢各位大哥大姐指教！
作者: 嗨皮    时间: 2011-9-2 15:08

MS-SSCA甲基化与否经亚硫酸氢盐修饰后，转为序列的不同，从而在聚丙酰氨凝胶中的位置不同，甲基化与非甲基化DNA的两条链经变性后出现两条带，而部分甲基化的为什么会出现三条带呢？谢谢指教！
作者: 白鸟之翼    时间: 2011-9-2 15:12

请教各位老师，我用的zymo的甲基化试剂盒，修饰后的DNA电泳没有条带，不知道是加入的DNA 量少还是修饰的过程中降解过多。请问有没有用过这个试剂盒的同学，请教一下，不胜感激！！！
作者: mogu    时间: 2011-9-2 15:12

最近准备做甲基化了，关于试剂盒高手们能不能帮忙推荐下，纯化试剂盒用PROMEGA的树脂纯化比较好吗，为什么？
作者: 王六六    时间: 2011-9-2 15:13

用 QIAGEN试剂盒做的修饰，之后按照绝大多数文献上的引物做MSP,结果却只有引物二聚体，试了TaKaRa的LATaq酶withGC Buffer（1和2），也试了GC酶，同时试了退火温度60、62、64，都是只有引物二聚体，难道要重新设计引物吗



欢迎光临 分析测试百科 (http://bbs.antpedia.com/) Powered by Discuz! 5.5.0