分析测试百科

标题: [讨论]做完荧光定量后如何统计数据 [打印本页]

作者: 春雨 时间: 2011-9-2 15:24 标题: [讨论]做完荧光定量后如何统计数据

[讨论]做完荧光定量后如何统计数据[转自丁香园论坛]

大家好,最近本人做了几种肝癌细胞的某一目的基因和内参GAPDH的相对定量的表达，数据出来了，但是本人不知该用哪种统计方法统计数据比较合适，请大家不吝赐教，谢谢！

作者: @花开花落@ 时间: 2011-9-2 15:25

请问楼上用的是标准曲线法还是ΔΔCT法呢？我做的是ΔΔCT法，实验已经做完，但是也是不知道怎么处理数据，是将几组ΔCT值拿来统计分析还是分析ΔΔCT值？如果是分析ΔΔCT值的话，问题是我的几个组是随机组，没有配对设计，那该如何相减得到ΔΔCT值呢？急需得到大家的帮助，谢谢！

作者: @花开花落@ 时间: 2011-9-2 15:28

鼓励大家畅谈标准曲线法和ΔΔCT法的分组和统计方法。

同样征集各位已发表文章、或已完成论文当中所使用的实验分组和统计方法。
同样将与以鼓励。希望各位战友积极参与。

[ 本帖最后由 @花开花落@ 于 2011-9-2 15:29 编辑 ]

作者: 冰激凌小姐 时间: 2011-9-2 15:31

是啊，现在在做RT，不知道数据怎么处理。

作者: 阿福 时间: 2011-9-2 15:32

相对定量简介
分析方法： ①双标曲法 ②2 － △Ct ③2 － △△Ct ④Pfaffi法
①双标准曲线法简介
公式：

优点：分析简单，实验优化简单
缺点：对每一个基因，每一轮实验都必需做标准曲线；必需有固定的标准品做标准曲线；这些标准品并不代表样品扩增的真实状态
应用：基因表达调控研究中最常用与公认的两种相对定量方法之一

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http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=8493

作者: 阿福 时间: 2011-9-2 15:33

②2－△Ct法应用举例：测定Jun基因在某因子作用前后的表达变化

假设扩增效率（E=10－1/斜率）为2（即每个循环模板量翻倍）
比率（处理后/处理前）＝2 － Ct（处理后）－Ct（处理前）
＝2 － △Ct＝2 －（16－18）＝4
所以Jun基因在处理后表达水平比处理前高4倍
实验数据：

图片附件: 65490841.jpg (2011-9-2 15:34, 4.29 KB) / 该附件被下载次数 22
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=8494

作者: 阿福 时间: 2011-9-2 15:34

③2－△△Ct法应用举例：测定Jun基因在某因子作用前后的表达变化

假设目的和参照基因扩增效率都接近100％且相对偏差不超过5％
△Ct（处理前）＝18－17＝1 △Ct（处理后）＝16－17.4=－1.4
△△Ct=△Ct（处理后）－△Ct（处理前）＝－1.4－1＝－2.4
比率（处理后/处理前）=2－△△Ct＝2－（－2.4）＝5.3
所以Jun基因在处理后表达水平比处理前高5.3倍
修正方法：如果我们知道目标基因和参照基因有相同的或增效率，但扩增效率不等于2，那么2－△△Ct可以修正为：E－△△Ct，例如扩增效率为1.95，那么计算公式可修正为1.95－△△Ct

实验数据：

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http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=8495

作者: 阿福 时间: 2011-9-2 15:35

④Pfaffi法应用举例：测定Jun基因在某因子作用前后的表达变化
实验数据：

图片附件: 59946632.jpg (2011-9-2 15:35, 8.72 KB) / 该附件被下载次数 27
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=8496

作者: 阿福 时间: 2011-9-2 15:36

假设目标基因和参照基因扩增效率不同但目标基因间扩增效率相同

图片附件: 58988960.jpg (2011-9-2 15:36, 7.71 KB) / 该附件被下载次数 29
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=8497

作者: 阿福 时间: 2011-9-2 15:36

待测样本基因表达差异分析原始数据

图片附件: 93666074.jpg (2011-9-2 15:36, 32.74 KB) / 该附件被下载次数 20
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=8498

作者: 微笑的海豚 时间: 2011-9-2 15:39

我现在正在做Real time PCR，使用折是Takara Cycler Dice TP800
之前复习了一下资料，结合现在做的实时，与大家分享一下体会：
1.定量的方法有两种：2－△△Ct法和标准曲线法。就我总结相关论文而言，2－△△Ct法要求比较的各基因的扩增效率相同，从实际上来说，即使结果出来，也会受到很多质疑——你为什么使用2－△△Ct，请给出扩增效率的证据来！因此虽然2－△△Ct法可以免去做标准曲线的步骤，但结果的可信度会较标准曲线法降低。而且2－△△Ct法在Takara软件上可以直接计算出结果，如果有人像我这样不是基础专业，只要知道结果是怎么样的，为什么用这样的方法，这就足够了，而不用具体去运算。
2.标准曲线法，可能大家觉的很麻烦。我制作这相对简单，我采用在Real time PCR扩增的产物，如果产物不纯，溶解曲线有多个峰，经过凝胶电泳后可切割下来目的基因的扩增band，用QIAquick Gel Purification Kit将产物纯化并提高浓度。如果溶解曲线只有峰并经电泳证实PCR产物只有目的长度的band，我用QIAquick PCR Purification Kit直接纯化PCR产物。然后用PCR产物纯化后的DNA按10的倍数稀释制作标准曲线，一般纯化后的，我使用的稀释浓度由10的4次方至10的9次方。直线相关非常完美，然后用这个标准曲线定量。用此方法制造标准曲线的方法就是可以节省cDNA模板和得到最高浓度的DNA以制作标准曲线。然后Real time PCR上带的软件可以自动给出相对定量值等。只有代入SPSS进行方差分析或t检验就可以了。
总之，为了省略可信度的质疑，我建议采用标准曲线，标准曲线可以采用Real time PCR的产物纯化后制作。

作者: 阿拉蕾 时间: 2011-9-2 15:42

我现在正在做Real time PCR，使用折是Takara Cycler Dice TP800
之前复习了一下资料，结合现在做的实时，与大家分享一下体会：
1.定量的方法有两种：2－△△Ct法和标准曲线法。就我总结相关论文而言，2－△△Ct法要求比较的各基因的扩增效率相同，从实际上来说，即使结果出来，也会受到很多质疑——你为什么使用2－△△Ct，请给出扩增效率的证据来！因此虽然2－△△Ct法可以免去做标准曲线的步骤，但结果的可信度会较标准曲线法降低。而且2－△△Ct法在Takara软件上可以直接计算出结果，如果有人像我这样不是基础专业，只要知道结果是怎么样的，为什么用这样的方法，这就足够了，而不用具体去运算。
2.标准曲线法，可能大家觉的很麻烦。我制作这相对简单，我采用在Real time PCR扩增的产物，如果产物不纯，溶解曲线有多个峰，经过凝胶电泳后可切割下来目的基因的扩增band，用QIAquick Gel Purification Kit将产物纯化并提高浓度。如果溶解曲线只有峰并经电泳证实PCR产物只有目的长度的band，我用QIAquick PCR Purification Kit直接纯化PCR产物。然后用PCR产物纯化后的DNA按10的倍数稀释制作标准曲线，一般纯化后的，我使用的稀释浓度由10的4次方至10的9次方。直线相关非常完美，然后用这个标准曲线定量。用此方法制造标准曲线的方法就是可以节省cDNA模板和得到最高浓度的DNA以制作标准曲线。然后Real time PCR上带的软件可以自动给出相对定量值等。只有代入SPSS进行方差分析或t检验就可以了。
总之，为了省略可信度的质疑，我建议采用标准曲线，标准曲线可以采用Real time PCR的产物纯化后制作。

作者: 阿拉蕾 时间: 2011-9-2 15:43

前段时间研究了相对定量的几种分析方法,个人认为,虽然标准曲线法最早出现也比较经典,但和2ΔΔCt法一样存在扩增效率可信度的问题.
1.2ΔΔCt法默认扩增效率为100%,实际上扩增效率往往在80%~120%之间,从这个角度来说,标准曲线计算出的扩增效率要比用2更准确些;
2.从另一个角度来看,也是一直以来的一个困惑,我认为扩增曲线从起峰开始到达到平台期的循环数,即扩增曲线在拐点处的曲度,体现了反应体系的扩增能力,也就是扩增效率.但从多次实验结果来看,一组曲度很大的扩增曲线(从扩增开始到达到平台期大概7个循环左右)和曲度很小的标扩增曲线(扩增曲线从扩增开始缓缓的上升,始终达不到平台期),在通过标准曲线计算扩增效率时,往往是接近的,差异最多也就是10%左右,远远没有扩增曲线体现的那么明显,从这个角度来说,标准曲线法和2ΔΔCt法的差异也就在相对定量的表达差异是(1+E)ΔΔCt,即1.8ΔΔCt左右还是2ΔΔCt.
除非有另一种新方法,否则在我看来,这两种方法差别不大.

作者: 小葵 时间: 2011-9-2 15:44

REST （the Relative Expression Software Tool）软件, 该软件根据公式amount of target = 2-ΔΔCT的基本原理进行运算，但可以同时使用多个内参照基因和分析多个目的基因，并且允许看家基因和目的基因有不同扩增效率，可以进行精确的运算和统计检验。

作者: HOT兔 时间: 2011-9-2 15:48

我最近在做定量，各种方法我进行了比较，绝对定量、相对定量，附件是我阅读的一些文章，总之相对定量是大部分人所采用的方法，绝对定量需要做许多标准曲线，虽然没有扩增效率的要求。我现在采用的方法是用扩增效率校正的Ct比较方法，就是2－△△Ct方法的校正版本，具体见论文，这篇文章发表在核酸研究，应该是有很好的保证的。

作者: 葡萄籽 时间: 2011-9-2 15:52

请问2-ΔΔCT中,-ΔΔCT是2的-ΔΔCT幂次方计算，还是按2减去ΔΔCT来计算呢？

作者: mogu 时间: 2011-9-2 15:53

请问2-ΔΔCT中,-ΔΔCT是2的-ΔΔCT幂次方计算，还是按2减去ΔΔCT来计算呢？

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当然是2的-ΔΔCT幂次方计算哦！

作者: 微笑的海豚 时间: 2011-9-2 15:53

一般而言，荧光定量PCR在无须得到精确的数值时是可以采用2的-ΔΔCT幂次方计算进行简便计算。但是前提是两者的扩增效率应该一致。所以在引物设计和片段的扩增长度应该大致一样，约50-150bp左右。一般实验室中对于荧光定量PCR做多个片段扩增，为省钱采用sybr green方法，这只是相对粗略计算，完全可用sybr green方法代替探针精确定量。

作者: 阿福 时间: 2011-9-2 15:54

那请问ΔCT法也是用2的ΔCT的幂次方来计算不同样品的目的基因与内参的ΔCT的数据吗?谢谢!

作者: dreaming 时间: 2011-9-2 15:56

我做实时荧光定量PCR，使用相对定量的方法，待测目的基因与标准目的基因的CT比值为A，待测内参照基因与标准内参照基因的CT比值为B。A与B的比值就是目的基因的相对定量。再进行统计学比较。

作者: 跳跳糖 时间: 2011-9-2 15:56

弱弱的问一句，2的-ΔΔCT幂次方怎么计算，用什么软件吗？我有CT值，但是不知道2的-ΔΔCT幂次方用什么软件算

作者: 冷太阳 时间: 2011-9-2 15:58

我最近在做定量，各种方法我进行了比较，绝对定量、相对定量，附件是我阅读的一些文章，总之相对定量是大部分人所采用的方法，绝对定量需要做许多标准曲线，虽然没有扩增效率的要求。我现在采用的方法是用扩增效率校正的Ct比较方法，就是2－△△Ct方法的校正版本，具体见论文，这篇文章发表在核酸研究，应该是有很好的保证的。

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其实就是Pfaffl法。这种方法我觉得是比较准确的。

作者: =菓子= 时间: 2011-9-2 15:58

我是用双标准曲线法做的，我实验大体做法是，往铜绿假单胞菌加入同一种药物，不同浓度梯度，用实时荧光定量PCR法来定量不同浓度梯度中某个酶的mRNA,我是用双标准曲线法做的，现在的问题是，不知道用什么统计方法。请高手指点一下，谢谢。

作者: 丁香@@ 时间: 2011-9-2 15:59

拿到定量数据、拿到这些比值之后，各位战友又是如何进行统计的呢？是怎么来说明你的实验结果，说明你的一个指标与另一个指标之间有统计学意义还是没有统计学意义的呢？

各位都考虑了哪些因素～

作者: 大虾米 时间: 2011-9-2 16:00

待测样本基因表达差异分析原始数据

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请教一个问题，比如6个样本，123为对照，456为处理组，得到了以上结果，在进行数据统计时应该用哪一个数值进行统计？dtCT,ddtCT还是2-ddtCT？不同的数值统计出来应该不同吧

图片附件: 69517566.jpg (2011-9-2 16:01, 32.93 KB) / 该附件被下载次数 14
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=8499

作者: 果冻也酸 时间: 2011-9-2 16:02

应该是将2-ddtCT进行统计分析吧各组间可行方差分析

作者: 椰子叶子 时间: 2011-9-2 16:02

发帖之前先对以上战友表示感谢！你们的辛勤劳动辛苦了！
在此，在对数据处理上提出我的理解和疑惑，希望能够得到大家的解答，谢谢！
1.针对双delta方法，其前提是目的基因和内参基因的扩增效率最好是一样的（且在90％－105％之间）。那么在标准曲线上看，可信度R的平方要求>0.980、或者是相关系数r>I-0.990I。
2.改进的Pfaffl法，前提也是要求有一个明确的内参和目的基因的扩增效率。
3.我们做实验的最后一步是对实验数据的处理，因此在进行实验之前就应该对后续的数据处理的“前提”有一个必需的了解和掌握。要是懵懵懂懂的做完了实验，再去处理数据肯定是不行的！前提都不具备，怎么去处理呢！
4.就我们得到的基因表达差异的“数据”，无论绝对定量的数据或者是相对定量的倍比数据几乎都可以看作是定量资料，其后续统计处理，我认为总的原则是：根据自己的实验设计选用不同的统计方法，不一定就定某一种或者是几种统计方法，这可能与上面的战友看法有点不一样。无论是方差分析或者是t检验等等，都应该满足相应的统计分析方法的前提了！
5.针对常用的双delta方法。我的问题就是：
第一要是简单的去满足扩增效率一样的话（且在90％－105％之间），我们是不是可以把目的基因和内参基因分开来扩增（就是不一起上机）？我知道有实验室就是这样做的，不知道这样做是否科学？
第二要是分开上机扩增的话，我们能不能用不同的条件（即针对内参和目的基因用不同的退火温度乃至循环次数等）去达到“相同”的扩增效率？因为我感觉，单从数学逻辑角度去理解，这样做应该是可以满足数据处理前提－－－扩憎效率一致的。
感谢各位不吝赐教！

作者: 年轮 时间: 2011-9-2 16:03

REST （the Relative Expression Software Tool）软件, 在哪里下载啊，我搜了半天都找不到，可以上传一个吗？

作者: free 时间: 2011-9-2 16:06

我第一次做定量PCR,
我用的方法是CT法，想检测基因在不同组织，不同时期，不同品种的mRNA表达量变化
1. 样本有400个，（样本有3个重复，既相同的品种组织和年龄，采了三个不同的样本
但是做定量时候没有重复）
2. 使用了2个内参基因

问题：
1.使用方法如果是2-ΔΔCT，我的2个内参应怎么算啊？！
2. 我不太明白公式中的“处理前”和“处理后”
如果是我这个实验，在不同时间的表达量，怎么用“处理前”-“处理后”啊？

作者: 阿福 时间: 2011-9-2 16:08

我看了一篇文章关于参照基因作为标准进行相对定量分析方法选择，
1. 2-ΔΔCT
2-ΔΔCT条件是目标基因和参照基因扩增效率都接近100％，相互效率偏差在5％之内
如果扩增效率不相近，可以优化或者重新设计实验，或者使用Pfaffi法

突然扩增效率接近，但不等于2，那么2－△△Ct可以修正为：E－△△Ct，例如扩增效率为1.95，那么计算公式可修正为1.95－△△Ct

2 ΔCT
它是2-ΔΔCT一种变化形式，更容易掌握且结果相同。虽然操作步骤简单，但同样可以真实衡量基因表达水平。如果这个方法得到的表达值处以所学的校准样本的表达量，他的结果和 2-ΔΔCT是一样的

3 Pfaffi法
当目标基因和参照基因扩增效率相近时候，用 2-ΔΔCT最合适不过了，但是如果两个扩增子扩增效率不同，必须选择这个方法了
但是前提是，每个基因（目标基因和内参基因）在实验样本和校准样本中有相同的扩增效率，但目标基因和内参基因的扩增效率可以不同

作者: 如影随形 时间: 2011-9-2 16:09

其实 2-ΔΔCT是Pfaffi法一种简单的特例，大家可以试试。如果当目标基因和内参基因都等于2时候，Pfaffi法的公式，可以换算成2-ΔΔCT

综上所述，个人认为，你选择方法还是得根据自己实验具体分析来选择，不一定用哪个才是最好的，适合你实验的才是好的

如果上面有错误的，请各位战友指出，我也是新手，也刚刚开始学着分析，呵呵～～～～上面的是我在文章里面看着，加以自己的说法，～～～～～～～

作者: 微笑的海豚 时间: 2011-9-2 16:15

问题：
1.使用方法如果是2-ΔΔCT，我的2个内参应怎么算啊？！
2. 我不太明白公式中的“处理前”和“处理后”如果是我这个实验，在不同时间的表达量，怎么用“处理前”-“处理后”啊？
最近查看了相关的资料。就楼上说的问题，给点参考意见如下：
我现在使用的伯乐的real－timePCR仪器。

作者: 花裙子 时间: 2011-9-2 16:17

我也有个问题,我做的是绝对定量~得出拷贝值的数据后,用本帖中的方法1双曲线法计算基因差异性,如图,但是将浓度改成拷贝数!

然后又用双delta 方法计算.使用实际扩增效率,即Pfaffi法.

但是得出的两组结果却差别比较大,我很困惑,有哪位朋友遇见过这样的问题吗?我觉得两种方法计算出的结果应该不会差别很大呀~计算的结果数据如下:

A ........ .......... B
1: 0.595 ........ 1.267
2: 0.893 ........ 1.044
3: 0.521 ........ 0.526
4: 0.798 ........ 0.550
5: 1.91 ........ 1.41
6: 1.05 ........ 0.669

其中A是用得双曲线法(将浓度改为拷贝数计算)
B用的 2 -delta delta Ct 方法

感觉两组结果相差挺大,又使用按实际扩增效率计算的Pfaffi法,结果又会变化为:
1: 0.96
2: 0.99
3: 1.11
4: 1.10
5: 1.01
6: 1.05
同样的标本,同样的反应,用不同方法分析的基因表达差异性,怎么有的样本相差这么多呢?

谢谢热心朋友帮忙解答~~~不胜感激!!!!

图为双曲线法,计算时将浓度改为拷贝数(绝对定量使用拷贝数计算基因差异性的方法就这一种么?)

图片附件: 44103237.jpg (2011-9-2 16:18, 9.69 KB) / 该附件被下载次数 18
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=8502

作者: 假小子 时间: 2011-9-2 16:18

我是RT-PCR的初学者，请问脂肪组织与别的组织做RT-PCR一样的程序吗？它的总RNA提取有特殊要求吗？请各位高手给予指点！不胜感激！

作者: 阿拉蕾 时间: 2011-9-2 16:19

2-△△Ct法简便易行，但其应用是有前提条件的，目标序列和内参序列的扩增效率必须相等，PCR反应体系和过程是复杂的，任何微小的影响因素都会造成扩增效率不能一直相同；且随着反应的进行，反应体系中的dNTP消耗，酶活性的降低等因素作用下，扩增效率常常不是1，通常会低于0.6 。因此在实际应用中，2-△△Ct法误差较大,计算出的相对定量结果通常比实际结果偏高。双标准曲线法比较准确可靠，但需要克隆目的基因和管家基因的扩增片段，构建两种质粒获得已知拷贝数的标准品，用于构建标准曲线，这些过程增加了实验的难度和复杂度。
Weihong Liu和David A. Saint推导出了反映PCR早期指数扩增的公式，并且由此推导出了新的相对定量方法。

作者: 冷眼相对 时间: 2011-9-2 16:20

不需要那么复杂吧。一般考虑两种方法。

一是标准曲线法。在内参基因和目标基因扩增效率不一致的情况下，每次实验都带上两个基因的标准曲线，根据标准曲线推断扩增的量。

二是delta delta Ct法。如果内参基因和目标基因扩增效率一致，那么对于一个sample1，用（X1=目标基因Ct值-内参基因Ct值）进行标准化。比较不同sample时，用标准化后的值，即Xi间的差值进行比较，如（Y=X1-X2)。最后转化成RNA水平实际变化倍数时（sample1相对于sample2），只要N=2^Y就可以了。

建议楼主查看一下这篇文献，主要讲的是delta delta Ct的原理。Livak, K.J. and T.D. Schmittgen, Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods, 2001. 25(4): p. 402-8.

其实我觉得最重要的是内参基因的选择，这是判断RNA水平有无显著变化的关键。我不建议楼主使用GADPH，虽然也能勉强接受。最好是用18S rRNA，这是“金标准”。而且目的基因和内参基因的片段大小最好在300bp以内，这样无论是扩增效率还是准确性都要好很多。我用的是Takara的试剂盒，结果稳定，效果不错，条件允许楼主可以试一试。

最后关于数据的可信度。一般认为用real-time PCR，其数值变化在50%以内都可以认为没有显著差异，但也有意见认为这个浮动应该控制在20%以内。还有就是每个样品的复孔，最终结果相差0.5个Ct值可以接受，否则就要作为坏值而剔除。

以上意见有些是PCR仪的仪器工程师在讲座中提到的，有的是文献中报道的，有些是我做实验的经验，也有些是试剂公司网站提供的。供楼主参考

[ 本帖最后由冷眼相对于 2011-9-2 16:21 编辑 ]

作者: wawa 时间: 2011-9-2 16:22

我准备近期做REAL TIME PCR，看完各位高手的分析后，有两个问题噢：
一是：是不是用2-ΔCT的方法就不用参照物呢，直接用处理前后的样品来比较？
二是：用质粒来制作双标准曲线的时候，如果我的样品处理前后的片断是一样的话，那么就是使用同一个质粒来制作标准曲线，这样子就只用一个标准曲线了，就失去了标准曲线相对定量的意义了啊？

作者: 不懂 时间: 2011-9-2 16:22

2-ΔCT的方法由于没有内参基因校正,误差很大,不建议使用.
双标准曲线是目标基因和内参基因两条标准曲线,narcissuszxb只用一个标准曲线,我不明白了.

作者: 王六六 时间: 2011-9-2 16:23

Pfaffi法中要是对照组和处理组中目的基因的扩增效率E不同的话咋办呀？？
请问楼上各位如何解决这个问题？？

作者: 丸子妹 时间: 2011-9-2 16:23

我要检测某种疾病中A基因的表达与正常人中A基因的表达是否有差异,已经得出该种疾病50例以及正常人5例中A基因的CT值,用 2-ΔΔCT怎么统计患者与正常人中A基因的表达是否有差异.请各位战友指教

作者: 绿茶公子 时间: 2011-9-2 16:24

请教一个问题，比如6个样本，123为对照，456为处理组，得到了以上结果，在进行数据统计时应该用哪一个数值进行统计？dtCT,ddtCT还是2-ddtCT？不同的数值统计出来应该不同吧

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说了这么多，我觉得还是没有人把如何统计最后结果说明白？
比如这个吧，文献中对照组都是用（1+-标准差）表示的，可是123三个对照组的均值根本就很难是1，除非凑巧是1，那好办了。

有人给解答一下么？

作者: 阿福 时间: 2011-9-2 16:27

大家好像没有说出个什么明确的思路。
我最近也在处理PCR的数据，就相对定量方法说说我的一些理解和看法。
1.我们的目的：研究一种或者是多种干预对一种疾病（现象）的影响。那么相对定量就需要得出我们的目的基因在某一种（多种）样品中的表达量相对于对照样品的上调（下调）倍数。这是对研究的终极目的－－－统计学上的总体而言。
2.实际操作：我们研究常常是对一个样本进行的。这里就需要从我们研究的样本数据经过统计分析而实现对终极目的的推断。
3.具体的操作：上面好多的战友都说了几种方法，都是有道理的，但是还是说的很粗略。包括我在学位论文数据库中检索了国内多所所谓的“牛”校他们的数据处理方法都是五花八门。而且你很难得看的明白具体的思路！！
例如：20只大鼠随机等分为两组，干预组以“善宁”治疗，对照组不用任何处理。观察“善宁”对肝脏中目的基因白介素－1（IL-1）的mRNA表达的影响。我们的终极目的就是想得到“善宁”是上调（下调）该基因表达的疗效。而此处20只大鼠仅仅是一个样本。要得到这个终极目标，就要用这20只大鼠的样本统计量去统计推断总体参数，才能实现这个终极目标。我们选用B-actin作为内参基因。

前提：目的基因和内参基因的扩增效率和相关系数要满足不同分析方法的前提。不需多说，上面的战友说的很多了。
那么
首先，干预组和对照组中，IL-1基因在相同的样品（肝脏）中的表达需要用内参基因B-actin归一化（人为的假定为“1”）。主要是消除我们取材时候“量”的差异（不能保证相同的细胞数）。
其次，（“善宁”）干预措施的效果是相对（没有处理）而言的，就是说从基因表达角度看，应该理解为：经过干预后，目的基因的表达是上调（下调）了。反应在数据上就是相对于对照样品，干预样品的目的基因上调（下调）了多少倍（这就是“相对”定量的确切含义）。此处就是以对照样品目的基因的表达量再一次的归一化。而实际上，如果在此用对照样品目的基因IL-1的表达量进行归一化处理（人为的假定为“1”），我们就只能得到这10只“善宁”干预组大鼠相对与没有任何处理的对照组的10只大鼠的目的基因IL-1的表达的倍数关系（对样本而言），还不能就说“善宁”能上调（下调）IL-1基因表达。还需要进一步的统计分析才能这样说！因为这一结论是我们的终极目的（对总体而言）。那么此处是两组样本的比较就可以选择t检验达到统计推断的目的。（当然如果是多组的比较可以选择单因素方差分析）。
而恰恰在进行统计推断时，我们面临一个问题！是什么呢？就是我们能得到“善宁”干预组肝脏中IL-1基因相对与对照组的表达倍数的一组数值（10个数据），可是要完成t检验就还需要对照组的另外10个数据，此处我们已经把对照组的IL-1的表达量假定为“1”了，总不能以均数为“1”，标准差为“0”进行统计分析吧！怎么办呢？比较好的办法就是：在上面进行对照组的归一化处理时，我们是用对照组的目的基因IL-1表达的“均数”来假定为“1”的。因此，可以以这个“均数”再次归一化处理对照组中不同样品的IL-1的表达量。这样就可以得到10个数据（此时“均数”不是10个“1”，标注差也不是10个“0”）。以此就可以完成统计分析了。
其实我们大可不必完成后两种归一化处理。直接把“善宁”干预组和“未处理”对照组中已经经过内参归一化处理的目的基因IL-1的表达量（此处的表达量是各个组织中的目的基因“绝对”表达量）进行t检验，得出我们要的结论------“善宁”是否上调（下调）IL-1的表达。
这里，需要说明的是：因为相对定量是相对而言的，所以在进行实验操作时“一定”要把各个样品一一对应起来，这样得出的CT值才能够进行相关的数据处理。理解也很简单，就是说干预组中1号样品的目的基因就必须和1号样品的内参基因的CT值进行相关数据处理，不能把1号样品的目的基因的CT值和2号样品的内参基因CT值进行数据处理！假如这样做就没有起到“归一化”的作用！但是，在用对照组的的目的基因来归一化处理干预组的目的基因时就需要把所有的对照组的目的基因的表达考虑进去了。否则不能得出干预的效果。这也是把对照组目的基因表达的“均数”用来归一化处理干预组目的基因表达的原因。
说了这么多，不知道对大家有没有帮助。请大家指正！

作者: 圆圆圈圈 时间: 2011-9-2 16:27

求助：
我做的定量实验设计和大家不同，不象大家的实验都有未处理样品，我的实验只是分析某个目的基因在不同材料中的表达情况，这些材料只是品质的不同，在做定量的过程中同一个槽子里扩增只分为两个部分：一是目的基因对不同材料的扩增，另外是相对应的用内参基因对这些材料的扩增。所以我很想问一下象我这样的设计用那种相对定量分析数据的方法好呢？？？

目前我暂用的方法是2-ΔCT法，即：ΔCT（材料1）=CT（材料1目的基因）-CT（材料1内参基因）然后每个材料都这样算出一个2-ΔCT的值，然后比较一下各个材料的2-ΔCT的值。不知这样科学不科学？各位好心人请帮帮忙啊！我就全靠这个结果毕业了！救命啊！

作者: 牙牙 时间: 2011-9-2 16:28

求助：
我是新手。我想请问运用双delta Ct方法进行数据处理后，
最终作图时的标准差值应该怎样计算阿？

具体说：
待测样品中的目的基因和内参，加上对照样品的目的基因和内参
共有4个值会根据PCR重复结果取平均值，那么最后的目的基因相
对表达量值标准差该怎样计算？

作者: +田田+ 时间: 2011-9-2 16:29

请问诸位老师，表中的这个数据应该是目标基因和内参基因在同一个管中吧，要是应用SYBR Green I法，目标基因和内参基因是独立的管，应用2-ΔΔCT法，怎么做最后的统计？谢谢！

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作者: 阿福 时间: 2011-9-2 16:30

根据我们的经验，如果所有样品都在同一板中检测完成，利用2-ΔΔCT 和标准曲线法得到的结果是一致的。如果比较的样品不在同一板中，建议将同一份样品的目的基因和管家基因放在一起扩增，每块板中都用管家基因制作标准曲线，最后根据目的基因和管家基因的quantity比值，进行比较。这样得到的结果可靠行也很高。

作者: 跳跳糖 时间: 2011-9-2 16:31

我也是real-time PCR的初做者，看了各位的发言，感触颇多。现有几个疑问，请大家帮忙解答：
我用的是SYBR染料法，拿到引物后首先要看看引物的扩增效率吧？（对cDNA倍比稀释做标准曲线，R2的意义是加样准确与否吗？斜率可以反映扩增效率）如果目的基因和管家基因扩增效率不同，可以用Pfaffl方法做统计，但是这种方法还需要加做一步---看同一基因在不同处理组是否具有相同的扩增效率。那么这一步每个处理组都要做吗？还是只看一两个处理组就可以了呢？
请大家指教！万分感谢!

作者: 岸上的鱼 时间: 2011-9-2 16:32

请问Pfaffi法具体怎么运算呢？

作者: 微笑的海豚 时间: 2011-9-2 16:40

说了这么多，我觉得还是没有人把如何统计最后结果说明白？
比如这个吧，文献中对照组都是用（1+-标准差）表示的，可是123三个对照组的均值根本就很难是1，除非凑巧是1，那好办了。

有人给解答一下么？

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用2-ddtCT统计。

作者: 红豆冰 时间: 2011-9-2 16:41

请教版主：您说“一般而言，荧光定量PCR在无须得到精确的数值时是可以采用2的-ΔΔCT幂次方计算进行简便计算。但是前提是两者的扩增效率应该一致。所以在引物设计和片段的扩增长度应该大致一样，约50-150bp左右。一般实验室中对于荧光定量PCR做多个片段扩增，为省钱采用sybr green方法，这只是相对粗略计算，完全可用sybr green方法代替探针精确定量。 ”那如果我扩的产物片段长度不一致，那么用sybr green检测时应该怎么处理呢？因为我扩的是两个基因的融合体，这个融合体有好几种亚型，长度都不一样。谢谢您指点！

作者: 旋转木马 时间: 2011-9-2 16:41

我想请问一下,我要做不同组织间同蛋白表达的相对定量.可是我发现我选的内参GAPDH在不同组织间的表达量不同,那还可不可以做为内参啊?

作者: 小蜜蜂 时间: 2011-9-2 16:42

呵呵，好贴应该顶上去，我最近也在统计数据，用双标准曲线法做的相对定量，不过不知道用什么统计方法？大家有没更具体的步骤？

作者: @花开花落@ 时间: 2011-9-2 16:42

我也是用双标准曲线法做的相对定量，之后应该如何统计呢？？？

作者: 大虾米 时间: 2011-9-2 16:43

我想请问一下,我要做不同组织间同蛋白表达的相对定量.可是我发现我选的内参GAPDH在不同组织间的表达量不同,那还可不可以做为内参啊?

很明显不可以。如果你找不到很合适的单参照基因，最后尝试多个参照基因的组合来作为你的参照标准。

作者: 胖小妮子 时间: 2011-9-2 16:44

呵呵，在百度或者GOOGLE上打入：2的*次方，自动出结果，(*^__^*)

作者: 许愿精灵 时间: 2011-9-2 16:44

待测样本基因表达差异分析原始数据

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我最近在做Real-time PCR 相对定量基因表达，我用的是AppliedBiosystem 公司的机器和软件，我有一个问题想请教您一下：
比如我做不同时间点 0h, 3h,6h, 24h 的某个基因表达量的相对变化，也就是说以0h为calibritor, 3h,6h, 24h 相对0h 的变化量。一般每个时间点设三个重复，但是三个重复的样品的值不可能是完全一样的，有时候差异还很大，在分析时是选 0h-1, 0h-2, 0h-3 三个样品中的一个作为calibritor , 也就是设它的值为1，其它两个的值可能大于1 也可能小于1 ，假设0h-2为 0.7 ，0h-3为1.2，那么，如果我选0h-2 为calibritor , 也就是设它的值为1，那么实际上其它所有样品的相对值都升高了，同样，如果选0h-3 为calibritor , 也就是设它的值为1，那么实际上其它所有样品的相对值都降低了。那么我的问题是到底选哪个作为calibritor 呢。多谢了！

作者: 大虾米 时间: 2011-9-2 16:45

3个里面剔掉一个差的最远的，剩下的2个取平均值

作者: 橘子水儿 时间: 2011-9-2 16:46

看了上面的帖子，受益匪浅，我还想再问一句：用2－△△Ct处理数据，最后用什么方法进行统计学分析？若癌和癌旁配对的两组数据，癌旁为1，癌中表达量为癌旁的2－△△Ct倍，可以进行计量资料的t检验吗？

作者: 微笑的海豚 时间: 2011-9-2 16:47

②2－△Ct法应用举例：测定Jun基因在某因子作用前后的表达变化

假设扩增效率（E=10－1/斜率）为2（即每个循环模板量翻倍）
比率（处理后/处理前）＝2 － Ct（处理后）－Ct（处理前）
＝2 － △Ct＝2 －（16－18）＝4
所以Jun基因在处理后表达水平比处理前高4倍
实验数据：

这里的：比率（处理后/处理前）＝2 － Ct（处理后）－Ct（处理前）
似乎应为：比率（处理后/处理前）＝2 － Ct（处理后）+Ct（处理前），否则就不是△Ct了，而是减去Ct（处理后）与Ct（处理前）之和了

作者: 花裙子 时间: 2011-9-2 16:47

那么标准差怎么算啊？我们导师急要，可是我不知道该怎么算？

作者: 大猫 时间: 2011-9-2 16:48

我觉得这个讨论贴严重跑题，重点应该是讨论数据得到后，如何通过分析数据，得到结论性的东西，比如有什么样的差异或意义，这才是我关心的，我项也是多数人关心的，至于detaT，机器软件的算法一般都ok的啦。

作者: 小米虫子 时间: 2011-9-2 16:49

各位老师，我想请教一下，我也是做相对定量，每组数据重复做了三次，但是三次出来的扩增曲线的荧光阈值不相同，在处理是是不是应该先统一阈值，这样的话，CT值也会随着变化，那么，新的CT值之间的相关性会不会变呢，会不会严重影响实验结果。不过，如果不统一阈值而直接用三次的CT值进行计算品均值的话，数据是否成立或者可靠。这样的情况我该怎样处理呢？谢谢

作者: 天蓝蓝 时间: 2011-9-2 16:50

很多人多被这个帖子误导了，仅有一位战友说出了统计方法

作者: 何去何从 时间: 2011-9-2 16:51

请问高人：只做一条曲线行吗？单作内参的曲线，根据内参标准曲线斜率计算目的基因的拷贝数，再与内参相比得出相对表达量？

作者: 蓝蜗牛 时间: 2011-9-2 16:52

本人是菜鸟，想问问做标准曲线是否一定要目的基因的已知拷贝数的标准品，还是直接用PCR产物稀释就可以用来做标准曲线了

作者: 葡萄籽 时间: 2011-9-2 16:53

想问问ΔΔct法的原理是什么？怎样操作？需不需要目的基因已知拷贝数的标准品？谢谢！

作者: 开心蔬菜帮 时间: 2011-9-2 16:54

怎么判断扩增效率是否相同？

作者: 兔纸 时间: 2011-9-2 16:54

如果不做标准曲线，应该如何计算扩增效率？是在做PCR时软件会计算吗？谢谢！

作者: 阿拉蕾 时间: 2011-9-2 16:56

相应版主号召，也贴一下我对定量数据处理的理解
但是发现一篇文章写的比我表述的更好就先拿上来贴上以飨各位看客

现在最常用的两种分析实时定量 PCR 实验数据的方法是绝对定量和相对定量。绝对定量通过标准曲线计算起始模板的拷贝数；相对定量方法则是比较经过处理的样品和未经处理的样品目标转录本之间的表达差异。 2 - △△ CT 方法是实时定量 PCR 实验中分析基因表达相对变化的一种简便方法。本文介绍了该方法的推导，假设及其应用。另外，在本文中我们还介绍了两种 2 - △△ CT 衍生方法的推导和应用，它们在实时定量 PCR 数据分析中可能会被用到。
关键词：反转录 PCR 定量PCR 相对定量实时PCR Taqman
反转录 PCR （ RT-PCR ）是基因表达定量非常有用的一种方法（ 1 － 3 ）。实时 PCR 技术和 RT-PCR 的结合产生了反转录定量 PCR 技术（ 4 ， 5 ）。实时定量 PCR 的数据分析方法有两种：绝对定量和相对定量。绝对定量一般通过定量标准曲线来确定我们所感兴趣的转录本的拷贝数；相对定量方法则是用来确定经过不同处理的样品目标转录本之间的表达差异或是目标转录本在不同时相的表达差异。
绝对定量通常在需要确定转录本绝对拷贝数的条件下使用。通过实时 PCR 进行绝对定量已有多篇报道（ 6 － 9 ），包括已发表的两篇研究论文（ 10 ， 11 ）。在有些情况下，并不需要对转录本进行绝对定量，只需要给出相对基因表达差异即可。显然，我们说 X 基因在经过某种处理后表达量增加 2.5 倍比说该基因的表达从 1000 拷贝 / 细胞增加到 2500 拷贝 / 细胞更加直观。
用实时 PCR 对基因表达进行相对定量分析需要特殊的公式、假设以及对这些假设的验证。 2 - △△ CT 方法可用于定量 PCR 实验来计算基因表达的相对变化： 2 - △△ CT 公式的推导 , 以及实验设计，有效性评估在 Applied Biosystems User Bulletin No.2(P/N4303859) 中有介绍。用 2 - △△ CT 方法分析基因表达数据在文献中也有报道 (5, 6) 。本文介绍了该方法的推导、假设以及应用。另外，本文还介绍了 2 - △△ CT 两种衍生方法的推导和应用，它们在实时定量 PCR 数据分析中都可能被用到。
• 2 - △△ CT 方法
• 2 - △△ CT 方法的推导

作者: 阿拉蕾 时间: 2011-9-2 16:57

PCR 指数扩增的公式是：

Xn 是第 n 个循环后目标分子数。
X 0 是初始目标分子数。
Ex 是目标分子扩增效率。
n 是循环数
C T 代表目标扩增产物达到设定阈值所经历的循环数
因此：
X T 是目标分子达到设定的阈值时的分子数。
C T,X 是目标分子扩增达到阈值时的循环数。
Kx 是一个常数
对于内参反应而言，也有同样的公式：

用 X T 除以 R T 得到：

对于使用 Taqman 探针的实时扩增而言， X T 和 R T 的值由一系列因素决定：包括探针所带的荧光报导基团、探针序列对探针荧光特性的影响、探针的水解效率和纯度以及荧光阈值的设定。因此常数 K 并不一定等于 1 。
假设目标序列与内参序列扩增效率相同：

或：

X N 代表经过均一化处理过的初始目标分子量； △ C T 表示目标基因和内标基因 C T 值的差异（ C T,X -C T,R ）
整理上式得：

最后用任一样本 q 的 X N 除以参照因子（ calibrator ， cb ）的 X N 得到：

作者: 阿拉蕾 时间: 2011-9-2 16:57

在这里
对于一个少于 150bp 的扩增片断而言，如果 Mg 2+ 浓度、引物都进行了适当的优化，扩增效率接近于 1 。因此目标序列的量通过内均一化处理之后相对于参照因子而言就是：　　　　　
1.2 方法的假设和应用
要使△△ C T 计算方法有效，目标序列和内参序列的扩增效率必须相等。看两个反应是否具有相同的扩增效率的方法是看他们模板浓度梯度稀释后扩增产物△ C T 如何变化。
图 1 显示的是 cDNA 样品在 100 倍稀释范围内的实验结果。对于每一个稀释样本，都用 GAPDH 和 c-myc 特异的荧光探针及引物进行扩增。计算出 c-myc 和 GAPDH 的平均 C T 值以及△ C T 值，通过 cDNA 浓度梯度的 log 值对△ C T 值作图，如果所得直线斜率绝对值接近于 0 ，说明目标基因和内标基因的扩增效率相同，就可以通过△△ C T 方法进行相对定量。在图 1 中，直线斜率是 0.047 ，因而假设成立，△△ C T 方法可以用来分析数据。如果两个扩增反应效率不同，则需要通过定量标准曲线和绝对定量的方法来进行相对定量；或者也可以重新设计引物，优化反应条件使得目标序列和内参序列具有相同的扩增效率。

[ 本帖最后由阿拉蕾于 2011-9-2 17:00 编辑 ]

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作者: 阿拉蕾 时间: 2011-9-2 17:03

1.3 内标和参照因子的选择
使用内标基因的目的是为了对加入到反转录反应中的 RNA 进行均一化处理。标准的看家基因一般都可被用作内标基因。适合于实时 PCR 反应内标基因包括 GAPDH ，β -actin, β 2 -microglobulin 以及 rRNA 。当然，其它的看家基因也同样能被用作内标。我们推荐在应用某一基因作为内标之前首先确证该基因的表达不会受实验处理的影响。验证实验处理是否对内标基因表达产生影响的方法在 2.2 部分有描述。
方法中参照因子的选择决定于基因表达定量实验的类型。最简单的设计就是把未经处理的样品作为参照因子（ calibrator ）。经内标基因均一化处理后，通过方法计算，目标基因表达差异通过经过处理的样本相对于未经处理的样本的倍数来表示。对于未经处理的参照样，△△ C T ＝ 0 ，而 2 0 ＝ 1 。所以根据定义，未处理样本的倍数变化为 1 。而对于那些经过处理的样本，相对于参考因子基因表达的倍数为。同样的分析也可用于不同时相的基因表达差异，在这种情况下，一般选 0 时刻的样本作为参照因子。
有些情况下，并不是比较不同处理样本基因表达差异。例如，有的是想看某一器官中特定 mRNA 的表达。在这种情况下，参照因子可能是另一器官中该 mRNA 的表达。表 1 显示了大脑和肾脏总 RNA 中 c-myc 和 GAPDH 转录本的 CT 值。在这一个例子中，大脑被人为的选择为参照因子，通过计算得到肾脏 c-myc 表达量经 GAPDH 校正后相对于大脑的表达量的结果。尽管相对定量方法可用于这种组织之间的比较，但结果的生物学解释是相当复杂的。不同种类细胞中目标和参照转录本单一的相对量变化可能在任何特定的组织中都存在。

作者: 阿拉蕾 时间: 2011-9-2 17:04

1.4 方法的数据分析
实时定量 PCR 所得到 C T 值可以很容易的输出到表格程序如 Microsoft Excel 中去。为了显示数据分析过程，我们在这里给出了一个基因表达定量的实验数据和样本列表。通过 β -actin 均一化处理，我们对目标基因 fos-glo-myc 的表达变化进行了监测。在 8h 的时间范围内，在每一时间点都取 3 个重复样本，每一样本在 cDNA 合成之后都做定量 PCR ，数据分析用到了公式 9 ，即：

Time x 表示任意时间点， Time 0 表示经 β -actin 校正后 1 倍量的目标基因表达。
0 时刻目标基因和内标基因的平均 C T （见图 2 第 8 栏）被用于公式 9 中。通过公式 9 计算出每一个样本目标基因表达通过 β -actin 均一化处理后相对于 0 时刻的倍数（见图 2 第 9 栏）。平均 SD ， CV 由每一个时间点所取的三个重复样求得。用这种分析方法，在 0 时刻的平均倍数变化接近于 1 。我们发现通过检测在 0 时刻平均倍数变化是否为 1 可以很方便的验证三个重复样品之间是否有错误或者误差。如果得到的结果与 1 偏差很大 , 则表明存在计算错误或者是很高的实验误差。

作者: 阿拉蕾 时间: 2011-9-2 17:04

在前面的例子中，在每一时间点上分别取了三个独立的 RNA 样本进行了分析。因此对每一个样本分别处理，通过计算后取结果的平均值就非常重要。如果是同一样本进行 PCR 扩增的重复，这就需要首先求出平均 C T, 然后再进行计算。怎么样计算平均值就要看目标基因和内参基因是在同一个管子中扩增还是在不同的管子中扩增。表 1 给出了目标基因（ c- myc ）和内参基因（ GAPDH ）在不同管中扩增的实验数据。在这里不应该把任一单个的 c-myc 管子和 GAPDH 管子作比较，而应该分别计算出 c-myc 和 GAPDH 的平均 C T 来计算△ C T 。重复实验中 C T 值的估计偏差通过标准的指数计算转化成最后结果中相对量的变化。但其中的一个难点是 C T 值与相应的拷贝数成指数关系（见第 4 部分） , 因此，在最后的计算中，的误差通过△△ C T 加上标准偏差和△△ C T 减去标准偏差来评估，这就使得求得的数值相对于平均值呈不对称分布。不对称分布是因为结果经指数处理后转化成量的线性比较造成的。
通过不同荧光染料标记的探针，我们可以在同一管中同时扩增目标序列和内标序列。表 2 给出了目标基因（ c- myc ）和内标基因（ GAPDH ）在同一管中扩增的实验数据。对于任意一个管子，目标基因（ c- myc ）和内参基因（ GAPDH ）扩增时加入的 cDNA 量都是一样多的，所以可以分别对每个管子计算△ C T 值，这些值取平均后再进行计算。在这里估计误差值也是一个不对称的范围，反映了误差经指数处理转化为线性差异。
在表 1 和表 2 中，估计误差在从△ C T 到△△ C T 的计算中未见有增加，这是因为我们把参照基因和检测基因的误差都显示出来了。我们把△ C T,cb 当作一个人为设定的常数来减去，得到△△ C T 。这样得到的结果就与图 2 所显示的在求平均之前对不同重复样本分别通过各自的 C T 值求所得结果相当。另一种方法是将参照基因当作没有任何误差的１倍的量，在这种情况下，平均△ C T,cb 的误差值被引入到每一样本的△△ C T 中。在表１中，肾脏中△△ C T 变成－ 2.50±0.20 而经过校正的 c-myc 量是 5.6 倍，范围从 4.9 到 5.6 。而在大脑中的结果是没有误差的１倍。

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作者: 阿拉蕾 时间: 2011-9-2 17:05

2.1 2 - △ CT ’ 方法的推导
通过内标 RNA 可以对加入 RNA 的量的差异进行校正。方法的数据分析的一个特点就是能够利用实时 PCR 实验的一部分数据来完成这种校正。在其它的方法不能定量初始 RNA 量的时候：例如，在能得到的 RNA 量非常有限的时候或者需要处理高通量的样品的时候，这一方法的优势就格外明显。当然我们也可以利用 PCR 实验以外的方法来完成这种校正。最常用的一种方法就是用紫外吸收来确定用于 cDNA 合成的 RNA 量，然后将相同的 RNA 反转录产生的 cDNA 用于 PCR 定量反应。这种外标法校正的一个应用例子就是研究某种实验处理是否影响内标基因的表达。在这里，目标基因和内标合二为一。在这个例子中，公式 [2] 不被公式 [3] 除，公式［ 5 ］变成：

整理得：

任一样品Ｘ 0,q 除以参照品 X 0,cb 得：

在这里△ CT’=C T ,q-C T ,cb 。△ C T’ 与前面计算中用的△ C T （用目标基因 C T 值减去参照基因 C T 值）相互区别。
就象在 1.1 部分所描述的，如果条件优化较好，效率接近于 1 ，内标相对于参照因子为：

作者: 阿拉蕾 时间: 2011-9-2 17:05

2.2 2 -△CT ’ 方法的应用
2 - △ CT ，方法的一个应用就是确定实验处理对某一候选内标基因的影响。为了显示这一过程，我们做了血清饥饿 / 诱导实验 (7) 。血清饥饿 / 诱导是研究某些 mRNA 降解的常用方法。然而，血清可能影响一些基因的表达包括标准的看家基因的表达。
在 24-h 血清饥饿培养之后，在 NIH 3T3 细胞中加入 15% 血清诱导基因表达。从细胞中提取 Poly(A) + RNA ，并将之反转录成 cDNA 。利用 SYBR Green 通过实时定量 PCR 检测 GAPDH ，β 2 -microglobulin cDNA 的量。 GAPDH 和β 2 -microglobulin 各自的相对量通过 2 - △ CT ‘ 公式求得。细胞处理对于 GAPDH 的基因表达有明显影响，但对β 2 -microglobulin 没有什么影响。因此β 2 -microglobulin 很适合做血清刺激定量实验的内标，而 GAPDH 并不适合。这一例子向大家展示了在只研究一个基因的时候怎么用 2 - △ CT ‘ 的方法分析基因相对表达数据。

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作者: 阿拉蕾 时间: 2011-9-2 17:06

3. 实时 PCR 数据的统计学分析
实时 PCR 最终分析的是阈值循环或 C 。 C T 值通过 PCR 信号的对数值和循环数来确定。因此 C T 值是一个指数而非线性概念。因此，在任何统计分析中都不要用原始的 C T 值来表示结果。正如我们在前文中所描述的一样， PCR 相对量通常和内标和参照样本一起计算而很少直接用 C T 值来表示，除非我们想检验重复样本之间的差别。为了向大家显示这一点，我们用 SYBR Green 通过 real-time PCR 来检测相同 cDNA 的 96 个重复反应。所有反应组分在同一管中混好后分装到 96 个管中，做实时 PCR 分析，得到了每一个样本的 C T 值。为了比较样品间变化，计算了 96 个样本的平均 ±SD ，如果通过原始 C T 值计算，平均 ±SD 是 20.00±0.193 ， CV 为 0.971% 。但是如果把原始 Ct 值用 2 -CT 转化成线性形式，平均 ±SD 是 9.08 × 10 -7 ±1.33 × 10 -7 ， CV 为 13.5 ％。从这个简单的例子我们可以看出，通过原始 CT 值来反映变化是错误的，应该避免。用 2 -CT 将单个数据转化成线性形式来说明重复样本之间的变化和差异更准确可靠。
结论：

作者: 阿拉蕾 时间: 2011-9-2 17:07

实时定量 PCR 实验设计和数据分析可以采用相对定量和绝对定量两种方法，研究人员在设计实时定量 PCR 实验分析基因表达的时候首先要问的一个问题就是：数据最后会以一个什么样的形式得到。如果需要知道绝对的拷贝数，就必须用绝对定量的方法，否则只需要给出基因表达相对量就足够了。相对定量可能比绝对定量要更容易一些，因为它不需要作标准曲线。
本文所给出的公式对于每个用相对定量的方法分析基因表达差异的研究人员都足够了。下面，我们总结一下实验设计和评估中的一些重要步骤：
• 选择一个内标基因。
• 确定内标的有效性，确保它不会受到实验处理的影响。
• 通过 PCR 扩增目标基因和内标基因 RNA 或 cDNA 的一系列梯度稀释模板确保它们的扩增效率相同。
最后通过 2 - △ CT 计算将统计数据转化成线性形式而不是原始 C T 值。

作者: 清风风铃 时间: 2011-9-2 17:08

真正说出如何统计的人很少其实我觉得用2-△△Ct
法时如果每组没有做三个样本只有一个样本但做了3个以上的重复时,最后的结果是不能统计的只能得出是对对照组的几倍我是这样看的不知对不要想统计就得做多个样本

作者: 牙牙 时间: 2011-9-2 17:11

我也想知道无论用Delta Ct还是其他方法处理之后得到的比值如何进行统计分析。做方差分析还是做多重比较。如果是以2-Delta Ct为原始数据进行统计分析的话，单位是什么。

作者: 幸福无罪 时间: 2011-9-2 17:14

做定量，在普通上扩增得到很好的目的条带，无引物二聚体，但是到定量PCR仪上确得不到扩增曲线，换了另外一台定量PCR仪也是如此。各位大侠帮帮忙，找找原因。谢谢了

作者: fangxiang 时间: 2011-9-2 17:14

不太明白双标准曲线法的公式，所谓的对照样品跟做标准曲线的标准品可以是同样的东西吗？我在做相对定量，但由于目的基因和参考基因扩增效率不一致，所以想采用双标准曲线法，但不知道该如何对数据进行分析。我的样本不是举例中的那种处理前和处理后的样品，而是不同的个体，是收集的病人血样提取的DNA，标准品是构建的含目的基因和参考基因的质粒，标准曲线由质粒10倍稀释获得，请高手指点我该如何统计我的数据获得目的基因相对拷贝数？
非常感谢！ [

作者: 爱哭鬼 时间: 2011-9-2 17:15

我做的定量实验设计和大家不同，不象大家的实验都有未处理样品，我的实验只是分析某个目的基因在不同材料中的表达情况，这些材料只是品质的不同，在做定量的过程中同一个槽子里扩增只分为两个部分：一是目的基因对不同材料的扩增，另外是相对应的用内参基因对这些材料的扩增。所以我很想问一下象我这样的设计用那种相对定量分析数据的方法好呢？？？

目前我暂用的方法是2-ΔCT法，即：ΔCT（材料1）=CT（材料1目的基因）-CT（材料1内参基因）然后每个材料都这样算出一个2-ΔCT的值，然后比较一下各个材料的2-ΔCT的值。不知这样科学不科学？各位好心人请帮帮忙啊！我就全靠这个结果毕业了！救命啊
看了半天也不知道这个怎吗搞

作者: 阿福 时间: 2011-9-2 17:15

误差分析有专门的计算公式，是比较复杂的公式，误差涉及到内参和目的基因的的ct误差。各种不同的方法有不同的公式。请参考所用定量分析的软件。
我一般是设置好之后软件自动生成。这就要对仪器配的软件比较熟悉。我是用biorad的CFX96.用pfaffi法处理数据
如果还要自己分析那简直浪费你的软件！只要把所有东西设置好软件会帮你算的好好的。有那时间到这里问来问去还不如把软件弄熟！

作者: @木木@ 时间: 2011-9-2 17:17

做定量，在普通上扩增得到很好的目的条带，无引物二聚体，但是到定量PCR仪上确得不到扩增曲线，换了另外一台定量PCR仪也是如此。各位大侠帮帮忙，找找原因。谢谢了

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运行程序没有打开荧光收集一项。或其它软件设置不对，。找个熟悉软件的问一下或把文件发给仪器公司的技术指导看看ABI的会帮你分析的

作者: Darcy 时间: 2011-9-2 17:19

实验中的real-time PCR数据通过机器直接得到：CT平均值（mean CT）、CT值的标准差（CT-SD），我通过2 -△△Ct 公式计算出ddCT值（相对表达水平），但是不知道如何求ddCT值的SD和P值？

举个例子或许更容易说清楚：

House-keeping gene: GAPDH

Target gene: CCL6

Ctrl group:
GAPDH
3次CT值 18.21；17.89； 18.15
平均值：18.08
SD值：0.17222

CCL6
3次CT值 31.79； 32.08； 31.68
平均值 31.85
SD值：0.20903

Experiment group:
GAPDH
3次CT值 19.88; 19.63; 19.78
平均值 19.76
SD值0.12777

CCL6
3次CT值 33.35; 33.07; 33.63
平均值 33.35
SD值：0.27807

这样通过公式求出的CCL6的ddCT=1.132883885

但是如何求这个ddCT值的SD，及其P值大小？

谢谢大家了！

作者: HOT兔 时间: 2011-9-2 17:20

实验中的real-time PCR数据通过机器直接得到：CT平均值（mean CT）、CT值的标准差（CT-SD），我通过2 -△△Ct 公式计算出ddCT值（相对表达水平），但是不知道如何求ddCT值的SD和P值？

举个例子或许更容易说清楚：

House-keeping gene: GAPDH

Target gene: CCL6

Ctrl group:
GAPDH
3次CT值 18.21；17.89； 18.15
平均值：18.08
SD值：0.17222

CCL6
3次CT值 31.79； 32.08； 31.68
平均值 31.85
SD值：0.20903

Experiment group:
GAPDH
3次CT值 19.88; 19.63; 19.78
平均值 19.76
SD值0.12777

CCL6
3次CT值 33.35; 33.07; 33.63
平均值 33.35
SD值：0.27807

这样通过公式求出的CCL6的ddCT=1.132883885

但是如何求这个ddCT值的SD，及其P值大小？

谢谢大家了！

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仪器可以算出相对表达量及其标准偏差，但需要设置好仪器。比如基因，样品号，重复等等，随仪器不通而不同但大同小异。然后再根据这个进行统计分析。例如方差分析，t测验等。一般的统计分析应该都学了吧

作者: 麻瓜 时间: 2011-9-2 17:20

仪器可以算出相对表达量及其标准偏差，但需要设置好仪器。比如基因，样品号，重复等等，随仪器不通而不同但大同小异。然后再根据这个进行统计分析。例如方差分析，t测验等。一般的统计分析应该都学了吧

用T检验或方差分析，只要ddCT就可以，不会用到SD值吧？

仪器一般是三个CT求出平均值后计算ddCT，这样用最后的相对表达量（ddCT）来求P值，不就是要脱离了原来CT值间的差异性？

谢谢指导！

作者: 海鸥crazy 时间: 2011-9-2 17:21

我最近上了几次定量，做的标准曲线，发现扩增效率一直上不去，总在百分之80

几，R的平方可达到99.9%。

但是第一次是别人帮***作的，扩增效率都是百分之九十几，我又连做了2次，很认

真，很仔细，操作上也没太大问题，并且样品用的和以前一样，只是样品都又稀释了10

倍，但扩增效率就是上不去。这是怎么回事呀，希望有经验者能帮忙分析下可能造成这

个结果的原因，好进一步纠正~~~~谢谢~~~~

作者: 饭团团 时间: 2011-9-2 17:21

请高人指点：如何求ddCT值的SD，及其P值大小

作者: 竹蜻蜓 时间: 2011-9-2 17:22

请高人指点：如何求ddCT值的SD，及其P值大小

每个样品都有3重复，那么ct值就有标准误SD
ddCT是四个样品（含试验组对照组靶基因内参基因）的CT相比较，4个样品ct的SD相加就是ddCT值的SD。要问为什么？自己看统计学去，另外大学物理实验或者分析化学实验书应该也会提到的。

P值大小用spss算，要不翻统计学书去。

作者: 七彩星星 时间: 2011-9-2 17:22

我认为2-ΔΔCT计算方法讲解得还不错，但是计算软件我还没有用过，有高手可以指点一下吗?

作者: 章鱼小丸子 时间: 2011-9-2 17:23

非常感谢，前面战友的帖子，受益匪浅！
但是，我有几个问题想请教一下：
1.如果我是做一个样品在作用因子刺激下，多个基因的表达前后的变化（差不多30-40个不同基因），这样的话，我每个基因都要做标准曲线（如果每个标准曲线5-6个点，每个点有3个重复),这样，是不可能在一个板上进行的，这样怎么消除误差呢？
2.同时，如何能保证所有基因扩增效率都和内参基因一致（2-ΔΔCT法）呢？即使采用Pfaffi法（要求所有目标基因，扩增效率一致（不知道我理解的对不对）），又如何保证所有目标基因扩增效率一致呢？
困惑，希望高人指点！！！

作者: 我是一片云 时间: 2011-9-2 17:24

请问：我做的实验是析因设计，基因含量检测我做荧光定量PCR，用的染料法，得出的数据（mRNA相对含量的计算用目的mRNA的Ct值减去内参的Ct值得到△Ct，以最大的△Ct作为基准，用其他△Ct减去最大的△Ct并取结果的负值，得到-△△Ct，求得2的-△△Ct次方的结果作为mRNA的相对表达量），用析因设计怎么分析？能举个实例是最好。谢谢了

作者: 小鼹鼠 时间: 2011-9-2 17:24

求助：
我做的定量实验设计和大家不同，不象大家的实验都有未处理样品，我的实验只是分析某个目的基因在不同材料中的表达情况，这些材料只是品质的不同，在做定量的过程中同一个槽子里扩增只分为两个部分：一是目的基因对不同材料的扩增，另外是相对应的用内参基因对这些材料的扩增。所以我很想问一下象我这样的设计用那种相对定量分析数据的方法好呢？？？

目前我暂用的方法是2-ΔCT法，即：ΔCT（材料1）=CT（材料1目的基因）-CT（材料1内参基因）然后每个材料都这样算出一个2-ΔCT的值，然后比较一下各个材料的2-ΔCT的值。不知这样科学不科学？各位好心人请帮帮忙啊！我就全靠这个结果毕业了！救命啊！

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失望极了，把这个帖子看完了，也不知道这个战友提出的问题最后是如何解决的。我也碰到和他类似的问题。

作者: 快乐的大脚 时间: 2011-9-2 17:25

不错，不过涉及最后的统计确实很少！

作者: 阿拉蕾 时间: 2011-9-2 17:25

我说说自己对数据计算的方法吧。
在说计算方法之前，说明一下，荧光定量的数据是指一个处理中至少有三个样本，每个样本四次重复的数据。
实验完成后，仪器会给出48个数据，12个对照样本目的基因的Ct，12个对照样本内参基因的Ct，12个处理样本目的基因的Ct，12个处理样本内参基因的Ct。接下拉算出每一个样本的平均目的基因和内参基因的平均Ct值和SD，这时的SD值来评判复孔的误差；接下来，利用每个样本内参基因和目的基因的平均Ct值（三个样本）分别计算出处理组和对照组的内参和目的基因的平均Ct值和SD，这时的SD值中包括了样本个体间的差异。接下来，利用处理组和对照组的内参和目的基因的平均Ct值相减分别得到处理组和对照组delta Ct，这时的SD值等于计算处理组和对照组平均Ct值时的SD值的平方的和再开方。delta delta Ct值即为处理组delta Ct值减去对照组delta Ct值，标准差与处理组的delta Ct值计算时的标准差相同。最后将上下限的delta delta CT值算出，得到最终的倍数。

作者: 嗡嗡 时间: 2011-9-2 17:26

按照delta,delta方法计算，是不是，control组的值都是1呀？但是我看到很多的文献里面用这种方法的，他们的control往往都不是1？
不知这个如何解？

作者: 飞天小鹿 时间: 2011-9-2 17:26

弱弱的问一句，扩增效率从哪里可以看出来？

作者: 冰激凌小姐 时间: 2011-9-2 17:27

受用了. 但是如何我才能确认目的基因和内参基因的扩增效率是否一样呢? 或者两者的扩增效率各是多少?

作者: 米米 时间: 2011-9-2 17:27

一直用ΔΔCT，是觉得有问题，受教,真是好帖

作者: 森林木 时间: 2011-9-2 17:30

搞了半天，还是不知道最后用什么统计方法去统计结果

作者: loli 时间: 2011-9-2 17:30

我做的定量实验设计和大家不同，不象大家的实验都有未处理样品，我的实验只是分析某个目的基因在不同材料中的表达情况，这些材料只是品质的不同，在做定量的过程中同一个槽子里扩增只分为两个部分：一是目的基因对不同材料的扩增，另外是相对应的用内参基因对这些材料的扩增。所以我很想问一下象我这样的设计用那种相对定量分析数据的方法好呢？？？

目前我暂用的方法是2-ΔCT法，即：ΔCT（材料1）=CT（材料1目的基因）-CT（材料1内参基因）然后每个材料都这样算出一个2-ΔCT的值，然后比较一下各个材料的2-ΔCT的值。不知这样科学不科学？各位好心人请帮帮忙啊！我就全靠这个结果毕业了！救命啊

我也是看了半天，仍然不知道这个问题如何处理！！！谁会呀？就针对这一问题给回答回答呗？

作者: 蒲公英 时间: 2011-9-2 17:31

相对定量简介
分析方法： ①双标曲法 ②2 － △Ct ③2 － △△Ct ④Pfaffi法
①双标准曲线法简介
公式：

优点：分析简单，实验优化简单
缺点：对每一个基因，每一轮实验都必需做标准曲线；必需有固定的标准品做标准曲线；这些标准品并不代表样品扩增的真实状态
应用：基因表达调控研究中最常用与公认的两种相对定量方法之一

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请问这位高手，（1）我可以任意选择一个样品的cdna的模板溶液作为标准品进行梯度稀释吗，必须要回收纯化的质粒才行吗？

（2）我的ABIM7300在相对定量模式下不能自动生成标准曲线，得自己画，只有在绝对定量模式下才能自动生成标准曲线。请问你们的双标准曲线法是在绝对定量模式下做的吗，它跟绝对定量的区别就是不用知道标准品的浓度拷贝数，只需知道它的稀释度即可，而且比绝对定量多了一条内参的标准曲线。你们的仪器在相对定量模式下可以自动生成标准曲线吗，我们的不可以。

（3）请问如果用2-△△ ct法来进行相对定量，那么ABIM7300在相对定量模式下怎么看到扩增效率啊，我怎么也找不到这个选项啊。想通过标准曲线的斜率来计算扩增效率，但是在相对定量模式下不能自动生成标准曲线，正如（2）问中所说的，我得自己画，还得自己算扩增效率。

请这位大侠不吝赐教，小弟感激不尽！！！

作者: 阿拉蕾 时间: 2011-9-2 17:31

一般有四种，后两者较为完善：

2-delta Ct, 2-delta delta Ct, Pfaffl method(2001; Nucleic Acid Research), Vandesompele method (cuturl('http://genomebiology.com/2002/3/7/research/0034.1'))

作者: 米米 时间: 2011-9-2 17:32

是不是每一样品在PCR做3个以上复孔用2--△△CT法得出fold change。每一实验组又要有3个以上重复样品，用这些样品的fold change再去单因素方差分析或者独立样本t检验？

就像我们做western，是把样品重复3次做了，再灰度扫描。因为pcr很精细，人为操作影响大，所以要有3个复孔。

作者: 格格巫 时间: 2011-9-2 17:32

有文章说："实时 PCR 最终分析的是阈值循环或 C 。 C T 值通过 PCR 信号的对数值和循环数来确定。因此 C T 值是一个指数而非线性概念。因此，在任何统计分析中都不要用原始的 C T 值来表示结果"。

但用2 - △△ CT 方法计算出的结果是倍数关系，这些倍数值怎么进行t检验等统计分析呢？

作者: 菠萝菠萝蜜 时间: 2011-9-2 17:33

GSS0517 wrote:
我说说自己对数据计算的方法吧。
在说计算方法之前，说明一下，荧光定量的数据是指一个处理中至少有三个样本，每个样本四次重复的数据。
实验完成后，仪器会给出48个数据，12个对照样本目的基因的Ct，12个对照样本内参基因的Ct，12个处理样本目的基因的Ct，12个处理样本内参基因的Ct。接下拉算出每一个样本的平均目的基因和内参基因的平均Ct值和SD，这时的SD值来评判复孔的误差；接下来，利用每个样本内参基因和目的基因的平均Ct值（三个样本）分别计算出处理组和对照组的内参和目的基因的平均Ct值和SD，这时的SD值中包括了样本个体间的差异。接下来，利用处理组和对照组的内参和目的基因的平均Ct值相减分别得到处理组和对照组delta Ct，这时的SD值等于计算处理组和对照组平均Ct值时的SD值的平方的和再开方。delta delta Ct值即为处理组delta Ct值减去对照组delta Ct值，标准差与处理组的delta Ct值计算时的标准差相同。最后将上下限的delta delta CT值算出，得到最终的倍数。

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分析透彻啊！但不知为什么“delta Ct的SD值等于计算处理组和对照组平均Ct值时的SD值的平方的和再开方”？

作者: 菠萝菠萝蜜 时间: 2011-9-2 17:33

我第一次做定量PCR,
我用的方法是CT法，想检测基因在不同组织，不同时期，不同品种的mRNA表达量变化
1. 样本有400个，（样本有3个重复，既相同的品种组织和年龄，采了三个不同的样本
但是做定量时候没有重复）
2. 使用了2个内参基因

问题：
1.使用方法如果是2-ΔΔCT，我的2个内参应怎么算啊？！
2. 我不太明白公式中的“处理前”和“处理后”
如果是我这个实验，在不同时间的表达量，怎么用“处理前”-“处理后”啊？

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1.不用2个内参吧，都用一个内参就行

2.你的“处理”（即观察因素）是什么？如果是不同时间的表达量的话，最初的时间点就是处理前，其后的时间点就是处理后，处理后的每个时间点再和第一个时间点比较，就得出以后每个时间点相对于最初时间点的量的变化了

作者: 夕阳 时间: 2011-9-2 17:35

我也想知道后面的统计学分析方面的东东，而不是前面的原始数据处理方法，请赐教，谢谢！

作者: 羊咩咩 时间: 2011-9-2 17:35

我最近在做Real-time PCR 相对定量基因表达，我用的是AppliedBiosystem 公司的机器和软件，我有一个问题想请教您一下：
比如我做不同时间点 0h, 3h,6h, 24h 的某个基因表达量的相对变化，也就是说以0h为calibritor, 3h,6h, 24h 相对0h 的变化量。一般每个时间点设三个重复，但是三个重复的样品的值不可能是完全一样的，有时候差异还很大，在分析时是选 0h-1, 0h-2, 0h-3 三个样品中的一个作为calibritor , 也就是设它的值为1，其它两个的值可能大于1 也可能小于1 ，假设0h-2为 0.7 ，0h-3为1.2，那么，如果我选0h-2 为calibritor , 也就是设它的值为1，那么实际上其它所有样品的相对值都升高了，同样，如果选0h-3 为calibritor , 也就是设它的值为1，那么实际上其它所有样品的相对值都降低了。那么我的问题是到底选哪个作为calibritor 呢。多谢了！

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我最近遇到了和karoleaf同样的问题，我做的有癌组织，癌旁组织，正常组织（N1-N10），每组有10例，每例3个重复，那样的话我分析的时候，应该用哪个做calibritor？N1或是N2或是10个的均数？若是用均数怎么在软件上设呢？用的是ABI7500，谢谢各位了！着急中！

作者: 冰激凌小姐 时间: 2011-9-2 17:36

说的都不错啊，不过还是不知道最后统计学方法的选择和应用，应该用什么数据去进行统计学分析

作者: 蝴蝶结子 时间: 2011-9-2 17:36

我筛选了两个内参基因，都做了定量实验，可是现在该如何来处理目的基因的定量数据呢？

作者: 柠檬籽 时间: 2011-9-2 17:37

同样问，双deta方法最后算出来的是倍数关系，如何统计学分析？

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