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标题: 为什么我的目的条带总是不太亮？？？求助 [打印本页]

作者: 小妖儿 时间: 2011-9-2 17:43 标题: 为什么我的目的条带总是不太亮？？？求助

为什么我的目的条带总是不太亮？？？求助[转自丁香园论坛]

求助各位高手哥哥姐姐
为什么我的目的条带总是看着很模糊，不太亮！
我做的是nf-kb p65 扩增完了是137bp，确实是在marker100-200中间，这不是引物二聚体啊
但总是不太亮?
会不会是胶的原因呢?
我用的是1.5%的胶！！！每次跑35min，marker跑开了！

我都被老板骂了！！！很着急
帮帮我啊

作者: 小妖儿 时间: 2011-9-2 17:44

上样了20ul
loging加了2.5ul
配胶时核酸染料加了5ul
配的是40x的中胶

作者: fangxiang 时间: 2011-9-2 17:45

上样marker 和样品没混匀，或者缓冲液没混匀，或者缓冲液放太久都可能出现这种情况

作者: 绵绵 时间: 2011-9-2 17:45

我愚见你可以采取以下措施：1、有资料或证据推理你做的标本目的基因是高表达的，可能表达本来就低。2、再做一次梯度找到更合适的退火温度。3、增加底物。4、增加循环。5、增加引物。

作者: 阿福 时间: 2011-9-2 17:46

试试用2%的胶,还有验证一下你的目的条带的特异性,如果都没问题,换一下酶试试

作者: 花裙子 时间: 2011-9-2 17:46

主要是调镁离子浓度，和退火温度

作者: 阿拉蕾 时间: 2011-9-2 17:47

我自己构建质粒，酶双切后的小片段是281bp,条带也很弱，但是大片段是7000bp,条带就很亮，我认为：小片段的DNA含量少，所以在胶的条带表现出来就比较弱。

作者: 小荷尖尖 时间: 2011-9-2 17:48

可以试着用2~3%的胶，配胶时核酸染料加入后充分混匀！我的经验是要摇晃20秒。选用细一点梳齿的梳子做胶，待loading染料跑到胶的1/3到1/2的位置时即停止跑胶，照相看看。

作者: 微笑的海豚 时间: 2011-9-2 17:48

1. 如果你的条带是PCR产物的话，想要提高亮度，建议你提高模板量、引物量、dNTP等，至于酶的量，按照说明书用就可以了。PCR的循环超过30基本上不会对产量有特别大的提高，而且突变会增加很多。

2. 另外，根据个人经验，小片段的DNA跑电泳，的确是非常暗的。我当鉴定一个重组质粒，PCR的结果非常好，条带单一，量也很大；但是双酶切之后只能看到载体带，目的带几乎看不见，增加了上样量也没什么效果。后来问了BOSS，他的意见是，这样的情况也是比较正常的。论文答辩时，评审也没说对这个结果产生异议。

作者: HOT兔 时间: 2011-9-2 17:49

我P过更短的目的片段，只有87bp，建议你用2%的中空小胶（如果要回收，就用大孔），跑15到20分钟，因为时间长了，目的片段容易弥散掉。还有就是可以增加你PCR的循环数，增加产物的浓度（我用的是35个循环）。

作者: 丁香@@ 时间: 2011-9-2 17:49

137bp, 1%的胶就够了，估计你的染料不足，可电泳后EB浸泡，另外你的酶也许有问题，效率偏低，可选择Takara,rTaq或者exTaq,最好热启动的

作者: 小妖儿 时间: 2011-9-2 17:49

感谢各位哥哥姐姐对小弟的关怀
我通过查找以及和同学对比发现确实是片段长度决定亮度
100bp就是很淡
所以老板那也通过了！！！！
谢谢大家！！！！
谢谢!

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