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标题: 求助：低表达基因如何消除融解曲线双峰？ [打印本页]

作者: panda王 时间: 2011-9-5 15:10 标题: 求助：低表达基因如何消除融解曲线双峰？

求助：低表达基因如何消除融解曲线双峰？

实验分两组：同一目的基因，两组的扩增曲线都很好，高表达组融解曲线呈单峰，但低表达组融解曲线呈双峰，两者行琼脂糖电泳均为单一目的条带，未见杂带。
请教一下，出现这种情况是否是引物二聚体引起？应该怎样解决？
谢谢！

[ 本帖最后由 panda王于 2011-9-5 15:26 编辑 ]

作者: 阿福 时间: 2011-9-5 15:12

贴个图先。
如果电泳表明没有杂带，那么融解曲线应该是单峰的。不知你所说的双峰形状如何，是否为系统的随机波动

作者: 大仙 时间: 2011-9-5 15:15

融解曲线的情况和电泳的结果有时并不一样，我做个一个标本有几个峰的，其中包括有目的片段片段的，还有引物二聚体的，还有其他不知道是什么引起来的峰，跑电泳一看什么都没有，按理论说，有目的片段跑电泳应该有结果的。

作者: 跳跳糖 时间: 2011-9-5 15:17

我也遇到过这种现象，溶解曲线上看有较宽较高的杂峰，怀疑是引物二聚体，跑琼脂糖电泳，引物二聚体其实并不是很明显，只是有模糊稍亮的一片带。
我是通过调整信号收集温度来解决这个问题的：首先，作溶解曲线分析，看一下杂峰与主峰的Tm值，例如75度之前有杂峰，75度之后有主峰，那么，在PCR循环时收集信号时的温度调成75度（或者专门加一个step在此专作收集信号用），这样在75度时只有目的片段的信号是想要的，杂峰都解成单链，没有荧光信号的。

作者: panda王 时间: 2011-9-5 15:30

谢谢！
就是说在延伸后把温度调到主峰Tm值附近的温度收集荧光？

作者: panda王 时间: 2011-9-5 15:31

附上扩增曲线及溶解曲线

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作者: panda王 时间: 2011-9-5 15:32

溶解曲线

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作者: panda王 时间: 2011-9-5 16:28

同一基因，表达量较高组标本的融解曲线如下：

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作者: panda王 时间: 2011-9-5 16:29

这是再次做基因低表达组的融解曲线图

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作者: 微笑的海豚 时间: 2011-9-5 16:30

第一个图Tm值似乎与其他两副不太一样，我个人觉得可以将收集信号的温度设定在83或84度，这样前面的杂峰基本是单链，不影响目的扩增产物的信号收集。

作者: free 时间: 2011-9-5 16:30

我想请问一下收集信号温度怎么设呢？

我也遇到了同样的问题啊

作者: 魔法师A 时间: 2011-9-5 16:31

我们原来也是有这样的打算，可是这样是不能消除在融解曲线的杂峰的，只能在扩增曲线的时候可以这么做。
因为当你做融解曲线时，它是从低温到高温每间隔一温度（如0.5C）采集一次荧光信号的，因为杂峰及二聚Tm值都比产物的低，在升温的过程中，它比产物先采集信号，所以还是不能避免的。
出现这样的情况只有通过优化反应体系来解决！

作者: free 时间: 2011-9-5 16:31

我搞清楚了，就是四步法。

在延伸后面在加一个hold step，温度在PDsTm值和主峰Tm值之间，时间为5s

作者: free 时间: 2011-9-5 16:32

我们原来也是有这样的打算，可是这样是不能消除在融解曲线的杂峰的，只能在扩增曲线的时候可以这么做。
因为当你做融解曲线时，它是从低温到高温每间隔一温度（如0.5C）采集一次荧光信号的，因为杂峰及二聚Tm值都比产物的低，在升温的过程中，它比产物先采集信号，所以还是不能避免的。
出现这样的情况只有通过优化反应体系来解决！

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可以消除PDs对CT值的影响！

作者: panda王 时间: 2011-9-5 16:33

也就是说在延伸后加一步，把温度设定在主峰Tm值水平，进行读版。但是二聚体还是存在，做出来的融解曲线能避免杂峰吗？

作者: panda王 时间: 2011-9-5 16:33

那只能是优化条件或者换引物了？

作者: 阿拉蕾 时间: 2011-9-5 16:34

也就是说在延伸后加一步，把温度设定在主峰Tm值水平，进行读版。但是二聚体还是存在，做出来的融解曲线能避免杂峰吗？

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理论上应该也可以的吧。就是做融解曲线的时候，温度升高时选择高于杂峰的温度开始升温，应该也可以避免。这样的话不仅是在扩增时可以通过选择读版时间避免了非特异性扩增产物或引物二聚体对荧光值的影响，而且融解曲线也可以通过选择起始时间来避免杂峰的影响。

作者: 微笑的海豚 时间: 2011-9-5 16:37

我们原来也是有这样的打算，可是这样是不能消除在融解曲线的杂峰的，只能在扩增曲线的时候可以这么做。
因为当你做融解曲线时，它是从低温到高温每间隔一温度（如0.5C）采集一次荧光信号的，因为杂峰及二聚Tm值都比产物的低，在升温的过程中，它比产物先采集信号，所以还是不能避免的。
出现这样的情况只有通过优化反应体系来解决！

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在延伸后加了升温低于目的片段的Tm但高于PDs的Tm值，持续5 s的步骤,荧光定量PCR仪在每个循环的最后几秒检测荧光信号，故信号在此时被检测,可以有效的消除PDs对荧光信号的影响.扩增曲线上可以消除PDs,溶解曲线上就不知道了,我也没试过,但是能让结果准确就行了.问一下,读版是什么意思?

作者: 阿福 时间: 2011-9-5 16:37

感觉第一幅图中79度左右是有些东西，第三幅图好一些，主要原因是第一和第三幅图的表达丰度太低，同时曲线波动的太厉害（需要软件滤波）造成的。
可以稍微提高退火温度试试看。

作者: 麻瓜 时间: 2011-9-5 16:38

谢谢大家的共享，我觉得做一个浓度梯度还是很有必要的，我以前用的样品浓度过高，在75度左右有引物二聚体的杂峰，但是样品稀释后杂峰就消失啦

作者: 丁香@@ 时间: 2011-9-5 16:39

谢谢大家的共享，我觉得做一个浓度梯度还是很有必要的，我以前用的样品浓度过高，在75度左右有引物二聚体的杂峰，但是样品稀释后杂峰就消失啦

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你好，我的也是在75度左右有一个杂峰。不知道你的样品是按照什么比例稀释的，最后稀释后的浓度是多少？谢谢！

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