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标题: RT-PCR讨论区 [打印本页]
作者: 荷塘青蛙！    时间: 2011-9-6 14:53     标题: RT-PCR讨论区

RT-PCR讨论区 [转载]


大家做RT-PCR的比较多，我认为有必要建立一个专区，这样大家能在这里有目的地交流。现搜集了一些帖子，供大家学习参考，更欢迎同胞们踊跃提问，积极发言~希望大家能多多交流！大家来支持。

[ 本帖最后由 荷塘青蛙！ 于 2011-9-6 14:54 编辑 ]
作者: fangxiang    时间: 2011-9-6 14:57

RT-PCR技术

本人自认为在RT-PCR方面有不少经验.想当年,为了得到可溶性HLA-G分子的CDNA, 没日没夜的批,每次都是另人垂头丧气. 直到有一天.......有了.将近三个月哪! 可现在想起来,有付出总有收获,所以现在对RT-PCR可谓是小菜一碟, 管你基因再复杂! 所以本人愿意与大家讨论.
作者: fangxiang    时间: 2011-9-6 15:04

RNA电泳出现4条带，请问最可能是什么？

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转帖：RT-PCR实验有三步较为关键：抽提RNA，RT，PCR。
我的建议是：1. 做RT前最好测一下RNA浓度，逆转录体系对RNA量还是有一些要求，我的印象是至少大于1ng。
            2. RT按要求做，一般不会出太大问题。但完成后最好也测一下cDNA浓度。
            3. 不知你的PCR产物多长？如需扩长片段，则对前两步要求较高，需要有完整的cDNA存在，不是单改变Mg2+浓度、退火温度能解决的。
作者: 荷塘青蛙！    时间: 2011-9-6 15:04

能不能在这里讲讲RT-PCR的经验？
比如如何避免RNA降解？制胶的方法，注意事项？
我在实验时，有时RNA提不出，方法没区别，但找不到原因。跑出来的胶总是不够直。虽然图像分析能弥补一点，但总觉得不够好，也不知应如何处理。
作者: 荷塘青蛙！    时间: 2011-9-6 15:11

我是这里的新人，也是分子生物学方面的新手。
我的几个问题如下：1）RT和PCR时的引物设计是不是一定要先知道目的基因的序列？2）RT-PCR 的说明书上写，在RT时，引物设计有3种方法即a：Random 9mers；b：Oligo dT-Adaptor Primer；和c：特异的下游引物。如果用a和b方法，那么其他非目的基因不是也会RT和PCR吗？那么电泳后又怎么知道哪个条带是所要的目的片段呢，它的预期大小又是多少呢？3）如果用c方法，那么要去那里查它的序列呢？4）是不是可以完全参考相关实验内容的文献给出的引物进行我的实验呢？
我希望朋友能指点我，虽然这是一些很菜鸟的问题！谢谢！


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PCR 或RT-PCR时扩增的是两引物之间的一段基因序列，做pCR一般来说要知道目的基因的序列或氨基酸序列，但反向PCR可以扩增已知序列以外的序列。
PT-PCR在逆转录阶段，应用不同的引物扩增的片断可能不同，但在PCR阶段它只是扩增你的上下游引物之间的片段，PCR经过25-30次循环后你所要的基因片段得到大大的扩增。电泳时如果没有意外的话应用一条条带，并且在大小相同的mark处。
到参考文献查相应的引物，国外的文献，参考价值大，但自己还是要看一看。
作者: 晶晶亮    时间: 2011-9-6 15:14

我是分子生物学方面的新新新手: 请教 :

本人最近做大鼠实验，有一问题请教各位，取大鼠肝脏做RT-PCR，是否需要对大鼠肝脏进行灌洗处理？如需灌洗则是否是从股动脉或颈动脉放血后，从肝动脉进行冲洗？用生理盐水做冲洗液是否可以？不灌洗，取小块肝脏后，用生理盐水冲洗后放入液氮中是否就可以用来提取RNA？

thank you for help!
作者: 小困    时间: 2011-9-6 15:14

各位专家，你好！我是一名分子方面的新手。有个问题想请教大家，还请不吝赐教！
我正在作一个有关慢性粒细胞白血病BCR-ABL 融合基因的课题。我通过RT-PCR扩增出了产物，想通过测序来证明产物为BCR-ABL融合基因的cDNA.但是通过PUBMED，只能查到BCR-ABL mRNA（编码P210蛋白） 或cDNA的部分序列，无法查到完整的全部序列。不知专家们能否帮忙查查？
多谢！
作者: 阿拉蕾    时间: 2011-9-6 15:15

小鼠肝脏取下来直接做RT-PCR就可以的。
作者: 微笑的海豚    时间: 2011-9-6 15:17

取大鼠肝脏做RT-PCR，是否需要对大鼠肝脏进行灌洗处理？
可以不灌洗，但是一般用DEPC处理过的PBS漂洗，尽量滤干水分，液氮速冻-80保存或直接提取。

是不是可以完全参考相关实验内容的文献给出的引物进行我的实验呢？不可以，因为个人的实验目的不同，且文献可信度？？

1）RT和PCR时的引物设计是不是一定要先知道目的基因的序列？必须

在RT时，引物设计有3种方法即a：Random 9mers；b：Oligo dT-Adaptor Primer；和c：特异的下游引物。如果用a和b方法，是扩增的所有的cDNA（理论上），还要用此产物做PCR 的模板继续扩增。

如果用c方法，那么要去那里查它的序列呢？cuturl('http://www.ncbi.nlm.nih.gov')
作者: 王六六    时间: 2011-9-6 15:17

不知这位台兄用的什么试剂提取RNA。本人用的是Gibco的Trizon试剂。一般所用器材如tip头等都是未开包的，用DEPC处理太麻烦，如果是新的，不用处理，高压时间长一点即可。试剂都应是新的，并且RNA专用，当然也要注意实验环境，特别是离心机等的清洁。一般不会出现降解。本人有一RNA电泳图，还不错，如需要，可赠送。至于胶跑不直，可能是制胶问题，如未使琼脂糖完全融化，导致胶的密度一均匀；也可能是电泳过程导致，注意正负极的金属丝是否是直的。
作者: 花裙子    时间: 2011-9-6 15:18

本人在做RT-PCR遇到一怪现象，即本人对同一动物不同组织扩增同一段基因，结果从一种组织中可以扩出我的目的基因，条带非常的好，而另一组织在同样的条件下却得到许多非特异性的条带，尝试其他条件同样无法得到满意的结果，百思不得其解！（注：已肯定该基因在两种组织中都表达，且内参照在两种组织都可扩增出来）
从这两种组织中提取的RNA的量是不一样的，我测过吸光度，差异还很大，会不会和这有关呢？ 请高手指教！
作者: 章鱼小丸子    时间: 2011-9-6 15:18

做RT-PCR后用分光光度剂测量RNA量的时候，用什么方法处理装提取物的玻璃管？多谢！！
作者: 阿福    时间: 2011-9-6 15:18

做RT-PCR后用分光光度剂测量RNA量的时候，用什么方法处理装提取物的玻璃管？多谢！！

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我们一般测定浓度后把测定用的少量样品丢掉
作者: free    时间: 2011-9-6 15:20

做RT-PCR后用分光光度剂测量RNA量的时候，用什么方法处理装提取物的玻璃管？多谢！！

以去离子水洗3次,每次洗完后甩干.
作者: 蒲公英    时间: 2011-9-6 15:22

“用什么方法处理装提取物的玻璃管”
此处的“玻璃管”应当是石英比色杯吧。处理方法如verygood朋友所言。
如果RNA浓度较高，恐有污染而影响下一批次的样品测定，可以用5％的盐酸浸泡过夜，然后双蒸水洗净备用。

处理石英杯不能象处理其它RNA实验相关器材那样用碱泡，因为二氧化硅是可以与强碱反应成硅酸钠，强碱会腐蚀比色杯。

使用比色杯时，注意不能用手指触摸透光面，防止皮脂或汗液弄脏表面，影响测量精度。如不小心弄脏，可用擦镜纸揩干净。
作者: 阿拉蕾    时间: 2011-9-6 15:23

做RT-PCR后用分光光度剂测量RNA量的时候，用什么方法处理装提取物的玻璃管？多谢！！
如果你还想要RNA，就按照分子克隆上的方法处理。

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用微量比色杯时，去离子水洗10次,每次洗完后甩干最好用真空泵把水吸干。
作者: 荷塘青蛙！    时间: 2011-9-6 15:23

以下是一些RT-PCR的技术操作及相应文献参考：有意者可从中得到一些启示。
. cuturl('http://www.research.umbc.edu/~jwolf/m12.htm')(UMBC)
First strand synthesis and subsequent PCR amplification. Based on LTI protocol

. cuturl('http://www.nwfsc.noaa.gov/protocols/revtrpcr.html')(NWFSC)
Procedure for cDNA synthesis on dynabeads oligo(dT)25

. cuturl('http://gause.usuhs.mil/rt.html')(Cause's Lab)
Detailed protocol for RT and PCR

. cuturl('http://wheat.pw.usda.gov/homepage/lazo/methods/lazo/revtrpcr.html')(Lazo Lab)
First strand cDNA synthesis and PCR amplification

. cuturl('http://www.biol.rug.nl/lacto/protocols/superscript.html')
Procedure either for RT-PCR and primer extension. For primer extension, just add hot dATP

. cuturl('http://www.microbiology.med.umn.edu/immunology/cDNA_RT-PCR.html')(Immunology Resource)
CDNA synthesis from mRNA and subsequent PCR amplification

. cuturl('http://zapruder.pds.med.umich.edu/users/Frank/HepC/HepC.html')(Hans Popper)
This protocol is for the non-isotopic detection of hepatitis C RNA and albumin mRNA (as an internal control) from 4 micron sections of formalin-fixed, paraffin-embedded liver biopsies by RT-PCR. The procedure for RNA extraction from formalin fixed paraffin embedded section and PCR amplification is described.
作者: 荷塘青蛙！    时间: 2011-9-6 15:25

本人在做RT-PCR遇到一怪现象，即本人对同一动物不同组织扩增同一段基因，结果从一种组织中可以扩出我的目的基因，条带非常的好，而另一组织在同样的条件下却得到许多非特异性的条带，尝试其他条件同样无法得到满意的结果，百思不得其解！（注：已肯定该基因在两种组织中都表达，且内参照在两种组织都可扩增出来）
从这两种组织中提取的RNA的量是不一样的，我测过吸光度，差异还很大，会不会和这有关呢？ 请高手指教！

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我也遇到这样的问题，我想是不是两种组织中目的基因的数量差异很大。
同时，我做的是半定量RT-PCR,但是其实很难做到半定量，因为过程中有很多不确定因素，比如测定RNA浓度，然后固定RNA的量进行RT-PCR,至少测RNA浓度时就不能确保完全一致。当然我同时也做了内参。
作者: +田田+    时间: 2011-9-6 15:26

最好用DEPC水冲洗几次。虽说测量时间较短，仍应尽量防止RNA降解。我的做法是，测量时取少量提取产物用DEPC 水稀释，测完后弃之。
作者: 嗡嗡    时间: 2011-9-6 15:29

本人愚见如下：
1.RT-PCR有两种做法：
条件具备的话可用kit进行一步法进行；若条件不太好的话可分两步进行逆转录再PCR。但后来发现两步法的结果更加理想，条带特异性强且无拖尾现象，我推测是体系更加单一比较利于PCR的进行，当然也可能是我买的kit不太好。（promega）。
2.RT-PCR应具备的条件
高质量的RNA（保留后可做5‘，3’RACE）；引物的（最好产物短点）；若涉及粗略定量的话还应考虑RNA的浓度或是cDNA的浓度（如果由内标分子更好，但我发现其实很不容易将RNA的浓度以及内标分子的表达量调整的完全一样）；体系的均一性等。
3.RACE
我做过RACE（3’RACE是宝生物的Kit；5‘RACE是Gibico），但现在再进行另一个同源基因的3‘RACE时却怎么也P不出来，这两个基因是由同一对引物扩增出来的，其中一个已经获得了全序列（RACE的方法），而另一个基因的3’UTR却增么也扩不出来，我推测是不是该基因的3‘UTR太长的缘故，我都快绿了，有无想法，求助！
作者: 小鼹鼠    时间: 2011-9-6 15:30

请问各位大侠：
             RNA提取后需较长时间储存，需加RNA酶抑制剂吗？浓度是多少？
谢谢！
作者: @花开花落@    时间: 2011-9-6 15:30

我提取RNA用的是QIAGEN 公司的RNeasy MINI KIT
效果还好。而且样本间的均一性也可以呀。OD260/280总能在1.6-1.98之间
后来我又用trizol提取，却总是得不到满意结果。比值一直到不了1.4 我用酚氯仿抽提了两次还是不成。而且，每次都会有些RNA损失。真奇怪。大家得OD比值是多少呢？
作者: 牙牙    时间: 2011-9-6 15:31

我的RT-PCR有多条band,不知原因，请各位 帮忙。

在RT时，引物设计Random Primers 和Oligo dT-Adaptor Primer那个更好，我用的是Random Primers ；AMV RT 与MMLV RT 那个更好，我用的是AMV RT。

PCR时，我全选gene, 后用Primer 3.0 选primer 100bp~200bp. 同学说还是先选Gene的前1000bp,用此1000的前两行选一个primer，用此1000的后两行选另一个primer.更专一性一点，又可与primer dimer 区别。想问的是这一方法是否更好，是否更难批出产物，primer dimer 是否难以避免，因我看到有些公司的mannual的pcr图中都有primer dimer bands。我的primer Tm 为60度是否太低。

我的pcr 条件：

94oC, 2min
94oC, 30S
55oC,60S
72OC,45S
30cycles
72oC, 7min

另外pcr 时，这样减少蒸发，用加热的盖?

Fang CY，请给我一张RNA电泳图吧，非常感谢。xiaoyun0031@hotmail.com
不知那位有Primer 5.0.

非常感谢各位化时间看我的贴。
作者: HOT兔    时间: 2011-9-6 15:31

我在香港用过一种试剂，里面含RNase inhibitor, 但记不得叫什么名字了， 提RNA时所用的仪器，耗材如不能用DEPC泡，或来不及处理，用它擦一下就可以了，很方便的。如有条件买瓶试试。
作者: 丸子妹    时间: 2011-9-6 15:32

我在做丙型肝炎荧光定量PCR方面的东东,
各位高手有什么建议啊
作者: 荷塘青蛙！    时间: 2011-9-6 16:06

RT-PCR的常用内标b－actin 和GAPDH的使用有选择性吗？比如不同的细胞，不同的刺激。
作者: 阿福    时间: 2011-9-6 16:06

我在香港用过一种试剂，里面含RNase inhibitor, 但记不得叫什么名字了， 提RNA时所用的仪器，耗材如不能用DEPC泡，或来不及处理，用它擦一下就可以了，很方便的。如有条件买瓶试试。

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Protector RNase Inhibitor？ Roch的好像是。
作者: 丁香@@    时间: 2011-9-6 16:07

我做了两个多月的半定量RT-PCR，用两步法做的。结果在用housekeeping gene调PCR模板量时，怎么也得不到一致的量，是不是RT之后，用RNase-H 将cDNA单链和RNA的杂交体进行处理，驱除RNA，然后再测cDNA的浓度，再以相同的模板量进行PCR，就可以了？假如采用一步法，要定量的话，测完各个样品的RNA浓度后，以相同的RNA量进行RT-PCR就可以了？
热切盼望哪位高手帮助！
作者: 不懂    时间: 2011-9-6 16:15

我做了两个多月的半定量RT-PCR，用两步法做的。结果在用housekeeping gene调PCR模板量时，怎么也得不到一致的量，是不是RT之后，用RNase-H 将cDNA单链和RNA的杂交体进行处理，驱除RNA，然后再测cDNA的浓度，再以相同的模板量进行PCR，就可以了？假如采用一步法，要定量的话，测完各个样品的RNA浓度后，以相同的RNA量进行RT-PCR就可以了？
热切盼望哪位高手帮助！

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sorry i can not type chinese now.
it does not need RNase-H digestion,beside the single strand of cDNA is different. the Pcr procedure is changeable and not standerd in dfferent time. so u should do inner control every time and caculate the ratio of target gene and housekepping gene.
作者: 果冻也酸    时间: 2011-9-6 16:15

大家好，我想请教各位，我的RNA抽提260/280在2.0左右，RT按MBI CDNA第一链合成试剂盒做，然后取十分之一PCR,可最常见的结果是跑出一条在溴酚兰前一点点的条带（2.0％琼脂糖），是否为引物二聚体？可能是什么原因？CDNA合成失败？PCR条件不妥？我怎么检验CDNA的合成，紫外分光法，值是？希望大家赐教。
作者: 微笑的海豚    时间: 2011-9-6 16:16



QUOTE:
原帖由 果冻也酸 于 2011-9-6 16:15 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
大家好，我想请教各位，我的RNA抽提260/280在2.0左右，RT按MBI CDNA第一链合成试剂盒做，然后取十分之一PCR,可最常见的结果是跑出一条在溴酚兰前一点点的条带（2.0％琼脂糖），是否为引物二聚体？可能是什么原因？CDNA合成失败？PCR条件不 ...

应该是引物二聚体。我在做实验的时候，也碰到这些情况。但我同时还得到我的目的带。检验cDNA第一链的合成，可以跑一下电泳，有一条从点样孔到溴酚兰之前的发散的光带。直接用紫外分光法测好象不准，因为同时还有RNA。RT的产物是单链CDNA和RNA的杂交体。
作者: 椰子叶子    时间: 2011-9-6 16:16

我已经用了inner control.我就是用housekeeping-gene来做inner control的，因为我有很多个样品，不同发育阶段的，所以我想先用housekeeping gene做PCR来调每个样品的起始模板量，等到每个样品用housekeeping gene primer扩出的产物经电泳后，每一条带的亮度一致以后，我再用同样的模板量以特异引物PCR。这样得到的结果我就当作是半定量的结果。可我调了2个多月了，还是调不一致，CDAN模板也降解了。所以现在我又要从头做起。头疼！
能否具体地告诉我该怎么做？万分感激！
作者: fangxiang    时间: 2011-9-6 16:17

不要去费力调整什么一样的上样量，当然，如果量一样，发的图好看一些，但和花的功夫比，实在没什么一丝。
每次做PCR的同时都做内参照，内参照可以在一个管子里做（那样也是图好看一些），最好分开两管，把除了引物之外的mixture统一配，拍照后，算目的基因和内参的比值，这就是基因表达的相对浓度（是相对，很多国内文章把这都搞错了）。
我们以前都是在同一贯中，但是这样两对引物之间会有干扰，你可以作作看看有多可怕。
作者: 椰子叶子    时间: 2011-9-6 16:20

你说的关于通过电泳的方法看cDNA的方法恐怕太奢侈了吧。多么宝贵的cDNA啊！
其实还是万能的内参照，做一下任何常见基因就可以来，尤其是以前作过的。
作者: 羊咩咩    时间: 2011-9-6 16:21

我已经用了inner control.我就是用housekeeping-gene来做inner control的，因为我有很多个样品，不同发育阶段的，所以我想先用housekeeping gene做PCR来调每个样品的起始模板量，等到每个样品用housekeeping gene primer扩出的产物经电泳后，每一条带的亮度一致以后，我再用同样的模板量以特异引物PCR。这样得到的结果我就当作是半定量的结果。可我调了2个多月了，还是调不一致，CDAN模板也降解了。所以现在我又要从头做起。头疼！

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我想，重要的是在RT过程定量，各样品RNA要尽量准确测定浓度，反应体系除了RNA外作成N+1份mixture，准确分装，准确加入等量RNA，问题应该不大。
作者: fangxiang    时间: 2011-9-6 16:21

多谢两位高手的答复。我现在终于茅塞顿开了。我知道怎么做了。万分感激！
对，用电泳检测cDNA的合成确实很浪费，我们一般也没有这样做。不过我的同学有这样做的。有时候为了检测cDNA是否已降解，偶尔跑一下电泳。
作者: fangxiang    时间: 2011-9-6 16:22

关于半定量

RT-PCR内参照可以在一个管子里做（那样也是图好看一些），最好分开两管，把除了引物之外的mixture统一配，拍照后，算目的基因和内参的比值，这就是基因表达的相对浓度

我曾经作过同一管的PCR，内有actin 和目的基因引物。虽然可见到两条均一条带但图片质量不理想（而且酶量、Mg2+加倍）。请教mxbdna2003 ，你是如何处理同一管的PCR的各成分的浓度？  
作者: 椰子叶子    时间: 2011-9-6 16:22

sorry cannot type chinese now. i maybe write in chinese later.
for <Biowind>
of couse it should determined the amount of RNA. but it not for the quantitity of the PCR. it just was convienent to guess the amount ot the template<(for RT and PCR) and bettrer for publication and editor if he don not know the preocedure much. but the amount just using "accurate piptte" is wrong. it shoud be remembered to do the inner control of housekeeping gene everytime.
作者: 椰子叶子    时间: 2011-9-6 16:22

在同一管中做RT，其实没有什么问题，不需要taq魅加量，taq酶本来就是过量的^-^，（平时做pcr的时候，完全可以再省一些taq酶的，半斤八两就可以了，我想这肯定再很多贴子里应该都谈到了。Mg就跟不能变了，一变整个体系就变了。能看到均一条带就很好了。
关键是摸，十八摸（太少，只争朝夕，开个玩笑）虽然用不着，但是摸上3、5摸总是必要的，首先遥分开摸，然后再一起摸，直到摸的好了，还要考虑比较的不同的模板中的量，所以我们不建议再同一管中进行，因为还有互相竞争抑制的问题，即使不同基因之间。

To biowind
愚见采用从RNA定量的方法似不妥，不要说PCR的本身的敏感度，即便是再反转录就有差异，到了cDNA的分装和用于模板的取样，这些都不能保证准确，当然再反转录阶段我们也野葛控制在1或4ug，但这是为了再将来加样的时候保证大致差不多，而且尽可能的利用反转录魅，而且RNA定量本身及时用电泳也不是那么准，所以比较不同标本之间就更不准了。胡言乱语，仅供参考。
作者: loli    时间: 2011-9-6 16:23

我前后两次用一步法做rt-pcr，温度和试剂浓度等条件都相同，用的是同一种引物，电泳结果第一次有且仅有一条600多bp的带，而第二次却有且仅有一条500bp的带。如果引物的特异性强为什么相同方法作两遍会出现两条bp值不同的带，如果引物特异性不高又为何每次只有一条带。我百思不得其解：（！（另：引物设计时是233bp）
各位高手指点一下吧！
作者: 麻瓜    时间: 2011-9-6 16:28

有没有人用过SEEGENE公司的DNAFISHING KIT 呀?
怎么购买呢?
作者: 飞天小鹿    时间: 2011-9-6 16:28



QUOTE:
原帖由 麻瓜 于 2011-9-6 16:28 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
有没有人用过SEEGENE公司的DNAFISHING KIT 呀?
怎么购买呢?  

国内没有代理商。不好意思，当初推荐的时候没考虑这点。
香港的代理商信息如下：
Line Analytics, Ltd.

1407B Sea View Estate 2-8 Watson Rd. North Point,
Hong Kong
Tel: (852) 2578-5839
Fax: (852) 2807-2674
E-mail: line@lineanalytics.com
URL: cuturl('www.lineanalytics.com')
作者: 丁香@@    时间: 2011-9-6 16:29

愚见采用从RNA定量的方法似不妥，不要说PCR的本身的敏感度，即便是再反转录就有差异，到了cDNA的分装和用于模板的取样，这些都不能保证准确，当然再反转录阶段我们也野葛控制在1或4ug，但这是为了再将来加样的时候保证大致差不多，而且尽可能的利用反转录魅，而且RNA定量本身及时用电泳也不是那么准，所以比较不同标本之间就更不准了。胡言乱语，仅供参考。

mxbdna2003,假如我用一步法做，RNA先测浓度，然后以相同的量进行RT-PCR，同时做内参，这样行不行呢？还有我有
作者: 阿拉蕾    时间: 2011-9-6 16:30

RT-PCR的常用内标b－actin 和GAPDH的使用有选择性吗？比如不同的细胞，不同的刺激。  
作者: 阿拉蕾    时间: 2011-9-6 16:30

我在香港用过一种试剂，里面含RNase inhibitor, 但记不得叫什么名字了， 提RNA时所用的仪器，耗材如不能用DEPC泡，或来不及处理，用它擦一下就可以了，很方便的。如有条件买瓶试试。

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Protector RNase Inhibitor？ Roch的好像是。
作者: 小荷尖尖    时间: 2011-9-6 16:31

我做了两个多月的半定量RT-PCR，用两步法做的。结果在用housekeeping gene调PCR模板量时，怎么也得不到一致的量，是不是RT之后，用RNase-H 将cDNA单链和RNA的杂交体进行处理，驱除RNA，然后再测cDNA的浓度，再以相同的模板量进行PCR，就可以了？假如采用一步法，要定量的话，测完各个样品的RNA浓度后，以相同的RNA量进行RT-PCR就可以了？
热切盼望哪位高手帮助！
作者: 阿拉蕾    时间: 2011-9-6 16:31

你的变性温度太高了，一般85～90就可以了，这样子很容易把DNA也同时扩增出现多条带！
作者: 阿拉蕾    时间: 2011-9-6 16:32

我做了两个多月的半定量RT-PCR，用两步法做的。结果在用housekeeping gene调PCR模板量时，怎么也得不到一致的量，是不是RT之后，用RNase-H 将cDNA单链和RNA的杂交体进行处理，驱除RNA，然后再测cDNA的浓度，再以相同的模板量进行PCR，就可以了？假如采用一步法，要定量的话，测完各个样品的RNA浓度后，以相同的RNA量进行RT-PCR就可以了？
热切盼望哪位高手帮助！

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sorry i can not type chinese now.
it does not need RNase-H digestion,beside the single strand of cDNA is different. the Pcr procedure is changeable and not standerd in dfferent time. so u should do inner control every time and caculate the ratio of target gene and housekepping gene.
作者: =菓子=    时间: 2011-9-6 16:32

大家好，我想请教各位，我的RNA抽提260/280在2.0左右，RT按MBI CDNA第一链合成试剂盒做，然后取十分之一PCR,可最常见的结果是跑出一条在溴酚兰前一点点的条带（2.0％琼脂糖），是否为引物二聚体？可能是什么原因？CDNA合成失败？PCR条件不妥？我怎么检验CDNA的合成，紫外分光法，值是？希望大家赐教。xiexie。
作者: 阿拉蕾    时间: 2011-9-6 16:33

大家好，我想请教各位，我的RNA抽提260/280在2.0左右，RT按MBI CDNA第一链合成试剂盒做，然后取十分之一PCR,可最常见的结果是跑出一条在溴酚兰前一点点的条带（2.0％琼脂糖），是否为引物二聚体？可能是什么原因？CDNA合成失败？PCR条件不妥？我怎么检验CDNA的合成，紫外分光法，值是？希望大家赐教。xiexie。  

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应该是引物二聚体。我在做实验的时候，也碰到这些情况。但我同时还得到我的目的带。检验cDNA第一链的合成，可以跑一下电泳，有一条从点样孔到溴酚兰之前的发散的光带。直接用紫外分光法测好象不准，因为同时还有RNA。RT的产物是单链CDNA和RNA的杂交体。
作者: fangxiang    时间: 2011-9-6 17:04

我已经用了inner control.我就是用housekeeping-gene来做inner control的，因为我有很多个样品，不同发育阶段的，所以我想先用housekeeping gene做PCR来调每个样品的起始模板量，等到每个样品用housekeeping gene primer扩出的产物经电泳后，每一条带的亮度一致以后，我再用同样的模板量以特异引物PCR。这样得到的结果我就当作是半定量的结果。可我调了2个多月了，还是调不一致，CDAN模板也降解了。所以现在我又要从头做起。头疼！
能否具体地告诉我该怎么做？万分感激！
作者: 椰子叶子    时间: 2011-9-6 17:05

不要去费力调整什么一样的上样量，当然，如果量一样，发的图好看一些，但和花的功夫比，实在没什么一丝。
每次做PCR的同时都做内参照，内参照可以在一个管子里做（那样也是图好看一些），最好分开两管，把除了引物之外的mixture统一配，拍照后，算目的基因和内参的比值，这就是基因表达的相对浓度（是相对，很多国内文章把这都搞错了）。
我们以前都是在同一贯中，但是这样两对引物之间会有干扰，你可以作作看看有多可怕。
作者: 椰子叶子    时间: 2011-9-6 17:06

你说的关于通过电泳的方法看cDNA的方法恐怕太奢侈了吧。多么宝贵的cDNA啊！
其实还是万能的内参照，做一下任何常见基因就可以来，尤其是以前作过的。
作者: 阿拉蕾    时间: 2011-9-6 17:06

我已经用了inner control.我就是用housekeeping-gene来做inner control的，因为我有很多个样品，不同发育阶段的，所以我想先用housekeeping gene做PCR来调每个样品的起始模板量，等到每个样品用housekeeping gene primer扩出的产物经电泳后，每一条带的亮度一致以后，我再用同样的模板量以特异引物PCR。这样得到的结果我就当作是半定量的结果。可我调了2个多月了，还是调不一致，CDAN模板也降解了。所以现在我又要从头做起。头疼！

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我想，重要的是在RT过程定量，各样品RNA要尽量准确测定浓度，反应体系除了RNA外作成N+1份mixture，准确分装，准确加入等量RNA，问题应该不大。
作者: fangxiang    时间: 2011-9-6 17:07

多谢两位高手的答复。我现在终于茅塞顿开了。我知道怎么做了。万分感激！
对，用电泳检测cDNA的合成确实很浪费，我们一般也没有这样做。不过我的同学有这样做的。有时候为了检测cDNA是否已降解，偶尔跑一下电泳。
作者: 冰激凌小姐    时间: 2011-9-6 17:07

关于半定量

RT-PCR内参照可以在一个管子里做（那样也是图好看一些），最好分开两管，把除了引物之外的mixture统一配，拍照后，算目的基因和内参的比值，这就是基因表达的相对浓度

我曾经作过同一管的PCR，内有actin 和目的基因引物。虽然可见到两条均一条带但图片质量不理想（而且酶量、Mg2+加倍）。请教mxbdna2003 ，你是如何处理同一管的PCR的各成分的浓度？
作者: 椰子叶子    时间: 2011-9-6 17:08

sorry cannot type chinese now. i maybe write in chinese later.
for <Biowind>
of couse it should determined the amount of RNA. but it not for the quantitity of the PCR. it just was convienent to guess the amount ot the template<(for RT and PCR) and bettrer for publication and editor if he don not know the preocedure much. but the amount just using "accurate piptte" is wrong. it shoud be remembered to do the inner control of housekeeping gene everytime.
作者: fangxiang    时间: 2011-9-6 17:09

愚见采用从RNA定量的方法似不妥，不要说PCR的本身的敏感度，即便是再反转录就有差异，到了cDNA的分装和用于模板的取样，这些都不能保证准确，当然再反转录阶段我们也野葛控制在1或4ug，但这是为了再将来加样的时候保证大致差不多，而且尽可能的利用反转录魅，而且RNA定量本身及时用电泳也不是那么准，所以比较不同标本之间就更不准了。胡言乱语，仅供参考。

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假如我用一步法做，RNA先测浓度，然后以相同的量进行RT-PCR，同时做内参，这样行不行呢？还有我有假如20多个不同处理的样品要同时进行比较，是不是我每一个样品都要加入β-actin的引物做内参？那这样的话，岂不是共有40多个样品要一起跑电泳（一半是加有特异引物的，一半是加有β-actin引物的），那怎么跑电泳啊，一次根本跑不完？
关于平台期，是不是只要在平台期以前取样都可以？举例说，假如第30个循环已经到平台期了，那么我在第30个循环以前的任何一个循环取样做为最终定量行不行？
多谢！
作者: 阿福    时间: 2011-9-6 17:09

说的很对,但是dNTP 的量似乎应进行调整总之，建议不要同管作RT-PCR.

因为还有各引物的退火温度可能不一致的问题。

另外用primer premier 5.o设计引物扩增全长mRNA序列给出的引物存在hair pin,dimer and false priming.如何进行手动修改。
作者: 椰子叶子    时间: 2011-9-6 17:10

一定要做内参的，每一次，我想。不作内参的结果是不可信的，实际上，半定量rt－pcr本身就是不可信的，大部分，我想，不过我做的是可信的，玩笑，^_^。因为我反复摸，每次作，重复做，跟自己对照，用不同的酶，不同的体系，作出同样的结果，指的是基因表达结果，不是条带什么的。
不管多少样品，内参不作，等于说比较珠穆朗玛峰和泰山的高度一样，没有海拔，泰山从地面的高度和珠穆朗玛峰从青藏高原的高度没什么差别。
电泳可以不一起跑，没有关系，计算的是相对表达程度，着我在好几封帖子里都谈了，再说一边我得观点，1、半定量和定量RT-PCR做的都是基因相对表达量，不是绝对表达量，除非你能准确知道来自多少细胞，但是细胞还有死的呢。2、以电泳为基础的半定量RT-PCR本身是不可信的，作为实验的粗筛是可以的，但不能作为最终结果的，（我的可以，玩笑），3、半定量RT-PCR应该再两管中进行，除非内参基因和目的基因表达相同，长度差不多，GC含量相似，或者实在穷的要省PCR管和taq。
关于平台期和线性期的问题，实际上线性期是指数期，只不过碰巧2的冥和2的倍数是相同的。看上去任何一个时期都可以，实际上是不对的，因为牵涉到酶促动力学的问题，这个我也不懂，有一些专门的文章，好像，涉及到很多化学的东西。我们学医的，也没必要知道那些，但是其中主要是因为模板引物酶原料和buffer之间的关系，这种反应单靠改变其中一种成分没有用的，酶一直是过量，再加酶也没用，引物ntp都是这样。烟鬼正传，最好选线性期的开始阶段，但是要在你的凝胶成像分辨范围内，所以选一个这两种的契合点。给你一张图你就明白了，再开始的时候酸的是切线，这图我在 *** 帖过。
关于引物设计，再可能的情况下，除了常规要求之外，最好兼顾跨内含子（不过，根据要求，还可以专门设计隔内含子的，这样还可以用于基因组PCR）、长度小于500bp－600bp等等。

另：
引物当然要设计成一样的退火温度，即使不再一管中，也要一样的，要在一台机器里啊。我的引物占了冰箱一格，大部分是一个温度，这样任何几个都可以拿来披，也不用查。
我反复说过了，别用软件，就用眼睛看，软件涉及的在好，有些基因在它出软件的时候，还没发现呢，跟不要说在基因组的位置和序列了，怎么考虑内含子的问题呢？
作者: fangxiang    时间: 2011-9-6 17:10



QUOTE:
原帖由 椰子叶子 于 2011-9-6 17:10 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
一定要做内参的，每一次，我想。不作内参的结果是不可信的，实际上，半定量rt－pcr本身就是不可信的，大部分，我想，不过我做的是可信的，玩笑，^_^。因为我反复摸，每次作，重复做，跟自己对照，用不同的酶，不同的体系，作出同样的结果，指的是基因表 ...

你的比喻很形象。我明白了。做内参的管当然是和加有特定引物的管是分开的。我是指RT和PCR在同一管里做，直接加入RNA，然后用Clontech的One-step Titanium RT-PCR kit做。我去年做过的，用一步法做出的结果比用两步法做出的不论是带的亮度还是带的形状以及带的特异性都要好。不过我可能会采用两步法，用Gibco的Superscript 逆转录酶。
作者: 椰子叶子    时间: 2011-9-6 17:11

我一直不建议采用一步法，因为逆转录酶很贵，就坐一次PCR，多可惜啊！还有RNA。而且反转录了之后可以做10－20次，还可以摸条件找原因。建议大家查一查eeflying帖子，他的论述很正确精辟，是高手。我只是和他关于扩增片断长度上有不同意见。
作者: fangxiang    时间: 2011-9-6 17:12

谢谢，还想请教一下，用18S RNA做内参，其引物是什么？另外，在做Northern blot和RNA组织原位杂交时，我用cDNA的片段（3个基因的cDNA片段长度分别为：200bp, 433bp, 888bp）做探针，用Roche的DIG标记试剂盒进行标记，可否？盼回复。谢谢！
作者: 椰子叶子    时间: 2011-9-6 17:12

18s的引物也和著名的βactin一样是设计的，只要拿到序列就可以了，但是限制是只能用总RNA为模板，但是比actin和bubulin等可准多了，更不要说GAPDH这个破烂了。18s除了在细胞中更相同（量）外，主要是它占的比例远远高于看家基因，所以定量更加准确，我想，不知对不对，请几位主任和eeflying指教。我认为，就像你用某一种东西的数量去概括，因该选那种多的东西，说一座房子是由2000块砖造成的，比说又29根梁更准确吧。更不要说没有看家基因不看家的缺点，因为他是服务于整个基因组表达谱什么的。
PE有专门的用于实时PCR的内参试剂盒，就是用18s，不过我们看懂使用的那条序列，不知有没有人用过，告知其序列和genbank号。
正好问一下，我查了一些序列，一直没有去合成，主要是因为手上的actin的荧光探针还没有完，当初和成了一堆。
有那位高手用过18s的内参，请问您的序列（我指的是模板的序列）？
原位杂交最好用RNA做探针，效果好一些，反正你有钱卖roche的盒子，而且量也能保证，因为转录过程嘛，沿着一条线突突地跑就是了。正义反义也容易理清。
作者: fangxiang    时间: 2011-9-6 17:25

18s的引物也和著名的βactin一样是设计的，只要拿到序列就可以了，但是限制是只能用总RNA为模板。

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请问椰子叶子，你说的18S 只能用总RNA为模板，是指的RT时的模板吧。这应该没有什么影响啊，因为我的目的基因也是用总RNA做模板进行RT的。
体外转录的RNA，标记时怎么知道哪条是正义RNA，哪条是反义RNA？难道RNA的两条链转录后不是混在一起吗？低级问题，可我确实不知道，盼指点。
作者: 微笑的海豚    时间: 2011-9-6 17:25

我觉得做RT-PCR的方法和条件及应注意的事项就是那么几条,许多专业书都有详细的描述,但是许多人还是历经多次磨难，有时就是得不出结果。因此，我认为因为每个人所要克隆的片断不同，引物不同等，因此对不同的人来说还是有他自己的特殊性,我的以下经历说明：做实验时各人的情况不同,做不出时还是要好好动一下脑子。
    记得我开始我的ＲＴ－PCR时，按常规方法，提取总ＲＮＡ后，首先用自己设计的下游引物进行逆转录，不断改变反应条件，进行了Ｎ次均没有结果。后来考虑到本人的克隆的PCR的片断位于我们实验另一位同学克隆的片断当中，而该同学已经用RT-PCR克隆出她的片断（尽管她用这些ＲＴ－ＰＣＲ产物做模版再进行ＰＣＲ时也没办法重复出她的产物），因此，我先用她的引物和条件扩增出她的片断，然后用她的ＲＴ－ＰＣＲ产物作模板（有点改进，逆转录反应换用了９mers随机引物），用我的引进物进行一般PCR，终于得到我的产物，测序结果完全正确。尽管我的这个经历别人很人遇到，但足可以说明实验可以有自己的模式，书本的知识和别人的经验很重要，但有时也不定要受到书本框框和别人经验的限制。
作者: 绿茶公子    时间: 2011-9-6 17:26

本人在作巢式RT-PCR时，常遇到空白对照（无模板）中也扩出阳性产物，请问这种污染可能来自何处，当如何处理？多谢！
作者: mogu    时间: 2011-9-6 17:27

我做的反转录***因长度有8.5KB左右，
我现在要做的其中一部分大约有6KB左右
抽提RNA用实验室其他人的引物经反转录扩增有条带
但是我自己的老是反转录不成功，
没有清晰条带，老是很模糊一带。
提高退火温度到60还是很模糊。不知道这里的高手有何建议
另外，反转录如此长的***因要注意什么，谢谢　
作者: 米米    时间: 2011-9-6 17:28

我从国外文献查的引物，但没做出目的条带，如何确定引物的准确性？
作者: 米米    时间: 2011-9-6 17:28

请问：
1 引物的特异退火温度怎样设定？可以根据gc 和at含量算出吗？可以用引物报告单上的Tm值吗？
2 PCR时20微升体系中cDNA应加多少比较合适？MgCl2应加多少？各个成分的量有无确定标准？
3 PCR结果跑电泳，actin有，但跑不出目的条带，有几种原因？与cDNA的量少有关吗？Mg离子太多是否会抑制Taqase的活性？
作者: 嘉年华    时间: 2011-9-6 17:29

请教一个关于RT-PCR的问题
我准备从外周血中提取mRNA,然后做RT-PCR，希望扩增出特定的片段，
采用Gentra试剂盒提取RNA,提取完成跑电泳，正常人样品可见清楚两条带，而病人组要么只有一条带，要么什么也没有，不知是什么原因。
是RNA降解了吗？还是其它问题？（血样保存在-70度）
作者: 微笑的海豚    时间: 2011-9-6 17:30

我做的反转录***因长度有8.5KB左右，
我现在要做的其中一部分大约有6KB左右
抽提RNA用实验室其他人的引物经反转录扩增有条带
但是我自己的老是反转录不成功，
没有清晰条带，老是很模糊一带。
提高退火温度到60还是很模糊。不知道这里的高手有何建议
另外，反转录如此长的***因要注意什么，谢谢　

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个人认为,一般来说要扩增从反转录到PCR全过程的长达2kb以上的片断是相当困难的事,很多长基因是通过随机引物库得到的而不是通过oligo Td得到的,不要说反转录,即使是PCR也是很困难的,不信可以从质粒里试试,至于反转录,就更是天方也谈了,除了美的效率等,还有RNA的二级结构等因素,不知你的实验目的,可否从实验设计上修改.当然,霸王硬上弓未尝不可,这就要一些大公司的特殊的名贵的效果也未必好的酶了,roche和gibco(invitrogen)都有的.听天由命吧.另外,8.5真不多见,印象中知道的只有一个PTP是这样,不过还有那个著名的20kb的东东.
作者: 椰子叶子    时间: 2011-9-6 17:30

请问：
1 引物的特异退火温度怎样设定？可以根据gc 和at含量算出吗？可以用引物报告单上的Tm值吗？
2 PCR时20微升体系中cDNA应加多少比较合适？MgCl2应加多少？各个成分的量有无确定标准？
3 PCR结果跑电泳，actin有，但跑不出目的条带，有几种原因？与cDNA的量少有关吗？Mg离子太多是否会抑制Taqase的活性？

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一般来说引物报告单伤得是对的,也可以自己算,实际上重要的各条引物一致,剩下的可以摸的.
20中是指体积还是量?只要不明显改变体系的离子强度,加1,2ul都可以的.mg要调的,但我总觉得没有书里讲的那么玄乎,我都是常年不变的.
如果内参照有,目的没有,至少证明不是"美丽惹"的祸.原因书里应该都说了.
作者: 椰子叶子    时间: 2011-9-6 17:30

我准备从外周血中提取mRNA,然后做RT-PCR，希望扩增出特定的片段，
采用Gentra试剂盒提取RNA,提取完成跑电泳，正常人样品可见清楚两条带，而病人组要么只有一条带，要么什么也没有，不知是什么原因。
是RNA降解了吗？还是其它问题？（血样保存在-70度）

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要么事实如此,要么病人的标本问题,正明这一点在病人里做一个看家基因就行了.G是个什么试剂盒?
作者: 椰子叶子    时间: 2011-9-6 17:31

本人在作巢式RT-PCR时，常遇到空白对照（无模板）中也扩出阳性产物，请问这种污染可能来自何处，当如何处理？多谢！

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痕量的污染或者自无须有,巢式,嘿嘿,就是这样.亮不亮?多少个循环?是什么东西(阔的)?
作者: 椰子叶子    时间: 2011-9-6 17:31

我从国外文献查的引物，但没做出目的条带，如何确定引物的准确性？

==============================================================================================================在作之前连序列都没对过,就找着老外或者在外的老中去合成引物了?有种!一定要对一下,并且即使对了(指的是序列正确)也要看看它设计的好不好,不行自己来,呃都是推倒重来.
现在么,下载一个序列,在里面查一下不就行了.
作者: 椰子叶子    时间: 2011-9-6 17:32

本人在做RT-PCR遇到一怪现象，即本人对同一动物不同组织扩增同一段基因，结果从一种组织中可以扩出我的目的基因，条带非常的好，而另一组织在同样的条件下却得到许多非特异性的条带，尝试其他条件同样无法得到满意的结果，百思不得其解！（注：已肯定该基因在两种组织中都表达，且内参照在两种组织都可扩增出来）
从这两种组织中提取的RNA的量是不一样的，我测过吸光度，差异还很大，会不会和这有关呢？ 请高手指教！

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我想你可以考虑你另一组织的RNA是否有DNA污染。
建议将浓度较高的RNA稀释后再做反转录。
作者: 冰激凌小姐    时间: 2011-9-6 17:32

由于非典形势严峻，我现在在家做有关RT—PCR的论文，但有很多问题弄不明白，比如说定量RT—PCR和非定量RT—PCR的具体区别，RT—PCR的分类、此法的影响因素，创始时间等等，还望有高人指点，若能给发几篇具体文献，本人将感激不尽！！
作者: 阿拉蕾    时间: 2011-9-6 17:33

关于primer 5.0，你只要随便在网上下一个demo版，（在google上搜索一下，到处都有）。关键是在打开计算机中的win.ini文件（打开方式：在开始/运行中键入win.ini），找到[win32]，在下一行中加上 vspace=PU，如果原来就存在这一行，就把原来的vspace=DU改成vspace=PU。这样就可以用了。
作者: @木木@    时间: 2011-9-6 17:34

阳性对照一定要做好，如果在可能的情况下，actin或GAPDH在一个体系内进行，然后进行光密度扫描。
RNA电泳时在低温下进行，如果电泳槽比较干净，甚至可以不用预先处理。
作者: 椰子叶子    时间: 2011-9-6 17:34

最好在2管中；最好不用GAPDH；一般不用低温；最好是处理一下电泳槽。仅供参考，互相交流。
作者: Darcy    时间: 2011-9-6 17:34

请教各位高人，我做一个细胞因子的RT-PCR,不同细胞系中均出现目的条带，但同时又有几根杂带，有的比目的带还亮，而同时做的对应已知阳性株却扩得很好，亮亮的一条带，很漂亮，尝试提高退火温度至65度，仍然没有改变，后将延伸时间从1分30秒降为一分钟，有的目的带又扩不出来。最后按标准程序做touch-down PCR,有的作的好，有的不好。奇怪，为什么不同摸版在同样条件下，扩同一个基因，会有这么大的差别？有什么办法可以提高反应的特异性吗？以下是我的一个RT-PCR的电泳图，请各位高人指教，谢谢。

图片附件: 48368521_snap.jpg (2011-9-6 17:35, 14.7 KB) / 该附件被下载次数 15
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=8543

作者: 许愿精灵    时间: 2011-9-6 17:35

做wistar大鼠骨髓组织中TNF-α、IL-1β的western blot留取标本时是否需要把红细胞破坏掉?直接留取后放入液氮冷冻,深低温冰箱保存可以吗?
做骨髓组织中TNF-α、IL-1β RT-PCR是否需要提取除单个核细胞?直接破坏红细胞提总的RNA行吗?还有其他注意事项吗?

万分着急! 谢!  
作者: 阿拉蕾    时间: 2011-9-6 17:42

请把各个条带标记一下，另外阳性主是指表达很高的意思么？
第三泳道似乎很不错。
我觉得可能是引物的问题，在其它基因或者本基因上有相似序列，把基因的名字和序列传上来看看吧。
作者: 椰子叶子    时间: 2011-9-6 17:44

红细胞裂解不是很麻烦的事，分子克隆上似乎是有的，根据谁言要求，一般 的实验是需要去掉红细胞的。
作者: 椰子叶子    时间: 2011-9-6 17:44

做RT--PCR可以用dUTP代替dTTP
作者: 喵咪    时间: 2011-9-6 17:45

请问
做RT--PCR可以用dUTP代替dTTP吗?
作者: 椰子叶子    时间: 2011-9-6 17:46

当然可以
作者: 喵咪    时间: 2011-9-6 17:46

谢谢
请问用TRIZOL从血清中提取丙肝RNA没有看到沉淀,结果也没有做出来是不是提取的问题啊,还有去除上清仍有少量可不可以烤一烤,温度是多少啊
作者: dreaming    时间: 2011-9-6 17:47

我是一个新新手，现请教几个有关RT-PCR的问题：
1.组织半定量RT-PCR，RT时组织有无必要称重？
2.若测同一组织多种目的基因的相对表达，是否每种目的基因PCR时都要用内参对照？还是只作一次内参对照就行？内参对照是否必需要和目的片断的扩增同一条件？
3.20ul的PCR体系中需加入多少cDNA,我加的是5ul，可以更少吗？若减少加入量，PCR体系的其他成分的浓度需变否？
4.PCR反应产物是否要一定在48小时内电泳分析？以后再电泳图形是否就会不规则？长期保存在－20度是否仍会降解？
不知我表达清楚否？这虽是些很菜鸟的问题，可对我来讲也是很现实的问题，我也曾查过书，可仍是一知半解。望各位高手不吝赐教 !
作者: 海鸥crazy    时间: 2011-9-6 17:48

我一直再做RT-PCR，可以一直都有问题！我提取的RNA纯度挺高的，RT-PCR用的是保生物公司的试剂盒，两步法来完成的，可以不知道为什么就是没有结果，希望高手指导！
谢谢
作者: 柠檬籽    时间: 2011-9-6 17:48

我也是一个新新手，最近做RT-PCR怎么咽做不出来结果。请问一下各位大虾，我做的是心肌细胞c-fos mRNA的表达量变化。请各位大虾看一下我的引物和体系，看一下是什么问题？
c-fos：上游引物 5'-CAC GAC CAT GAT GTT CTC GG-3'
下游引物 3'-TGG CTC TAA CGG TTA GAT GA-5'
转录用的oligo dT15(promega)、MMLV逆转录酶
PCR体系：
5ul cDNA
1ul dNTP(10mmol/l)
5ul 10xbuffer
1ul TaqE(2u/ul)
2ul c-fos 上
2ul c-fos 下
3ul MgCL2(25mmol/l)
加ddH2O到50ul
退火温度从55度到59.5度做过梯度，都没有目的条带(文献上说是348bp)。用Primer 5.0它推荐退火为43.5度，我今天做了还是什么也没有！
不知是何原因呢？是引物设计的问题吗？
c-fos mRNA在GenBANK的序列号为X06769
用上述条件和温度内参跑得很好很干净
作者: 兔纸    时间: 2011-9-6 17:49

Hi，我是新手上路，现在课题很急，需要有关real-time RT-PCR 的资料和各位的经验，请多指教。
作者: 阿福    时间: 2011-9-6 17:50

谢谢
请问用TRIZOL从血清中提取丙肝RNA没有看到沉淀,结果也没有做出来是不是提取的问题啊,还有去除上清仍有少量可不可以烤一烤,温度是多少啊

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看不见沉淀是不是你用的组织太少了，增加组织量，试一试。不懂你的“去除上清仍有少量可不可以烤一烤”是什么意思。我用自己配的试剂提RNA，可能和试剂盒的方法有区别。
作者: 阿福    时间: 2011-9-6 17:50

本人在做RT-PCR遇到一怪现象，即本人对同一动物不同组织扩增同一段基因，结果从一种组织中可以扩出我的目的基因，条带非常的好，而另一组织在同样的条件下却得到许多非特异性的条带，尝试其他条件同样无法得到满意的结果，百思不得其解！（注：已肯定该基因在两种组织中都表达，且内参照在两种组织都可扩增出来）
从这两种组织中提取的RNA的量是不一样的，我测过吸光度，差异还很大，会不会和这有关呢？ 请高手指教！

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得到许多非特异性的条带的组织是否存在不同剪接
作者: 喵咪    时间: 2011-9-6 17:51

我做的是从血清中提取丙型肝炎病毒的RNA 没有组织,做了十几次RTPCR都没有做出来,不过原因找到了,是我的胶有问题,又从垃圾堆里把以前的找出来从新跑了一下,都出来了,真是一招不慎全盘皆输啊
作者: 还是孩子    时间: 2011-9-6 17:51

我是新手，最近在作rt-pcr时，我的目的基因条带出来了，但出现了一条亮度非常高的非特异性带，每次每个标本都出现。我已把镁离子浓度和退火温度做了调整，但效果不佳。引物以前用过，没有问题，pcr条件差不多也有此非特异性带，但没这么明显，这次却怎么也弱不了它。期待各位的帮助，谢谢！！！
作者: 阿拉蕾    时间: 2011-9-6 17:52

我是新手，最近在作rt-pcr时，我的目的基因条带出来了，但出现了一条亮度非常高的非特异性带，每次每个标本都出现。我已把镁离子浓度和退火温度做了调整，但效果不佳。引物以前用过，没有问题，pcr条件差不多也有此非特异性带，但没这么明显，这次却怎么也弱不了它。期待各位的帮助，谢谢

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模板一样么？
大小？
实在不行抠下来测序。
作者: queen    时间: 2011-9-6 17:53

大家好，我现在要从人肝中提取apoA-1的MRNA全长,然后RTPCR得到它的全长DNA.工900个BP 问还有什么困难和问题吗
哪位老兄给我 这方面RTPCR的资料啊
作者: queen    时间: 2011-9-6 17:53

高手好，小弟这厢有礼了。《1》问：我现在有人肝组织的总RNA，RT是用a：Random 9mers；b：Oligo dT-Adaptor Primer 设计的引物 能把所有的蛋白的CDNA都反转录出来吗，其他的我不管。我的目的基因是APOA-1。全厂900不到。
《2》问我用A 法B法 能得到我的AOPOA-1的CDNA吗。我的APOA-1全长900左右，它对RNA的提取和RT的要求是不是很高。
《3》问我的RNA是我师姐给的。在-80度冰箱里防了差不多有一年了，问还能用吗
作者: queen    时间: 2011-9-6 17:53

高手好，小弟这厢有礼了。《1》问：我现在有人肝组织的总RNA，RT是用a：Random 9mers；b：Oligo dT-Adaptor Primer 设计的引物 能把所有的蛋白的CDNA都反转录出来吗，其他的我不管。我的目的基因是APOA-1。全厂900不到。
《2》问我用A 法B法 能得到我的AOPOA-1的CDNA吗。我的APOA-1全长900左右，它对RNA的提取和RT的要求是不是很高。
《3》问我的RNA是我师姐给的。在-80度冰箱里防了差不多有一年了，问还能用吗
作者: 喵咪    时间: 2011-9-6 17:54

RNA放-80℃一年是没有问题的
作者: 森林木    时间: 2011-9-6 17:54

我想问2个问题，1，我看了本讨论区以前的贴子，有站友说过RT-PCR做半定量为了准确，要多重复几次，那这种重复是从那一步开始呢？从提RNA，还是RT，还是用同一支cDNA每次加固定的量多做几次扩增？
2，由于条件所限，我没有扫胶的设备，只能把电泳的结果拍成照片载扫到电脑里用图象分析软件分析，请问可以吗？如果可以，我该用什么软件呢？
请各位不吝赐教，谢谢！
作者: panda王    时间: 2011-9-7 08:55

谁有系统介绍RT-PCR的资料告诉我好吗，或者说哪里有的下啊
我昨天下了CLONETCH的使用说明书。但是总觉的差的远。
有的话法给我好吗
作者: panda王    时间: 2011-9-7 08:55

我急着赶实验，麻烦谁有RT-PCR的详细资料，操作步骤，发给我好吗。 我是要从人 肝组织的总RNA 里RT-PCR出 人APOA-1的全长DNA
作者: fangxiang    时间: 2011-9-7 09:07

请教我现在进行RT-PCR,跑电泳什么也没有，不知道怎么回事！我的cDNA模板上周还在作其他引物的试验，没有任何问题，即使没有这个基因，也应该出来引物二聚体，现在是什么也没有？各位大侠，请赐教！
作者: 阿拉蕾    时间: 2011-9-7 09:09

我是新手，最近在作rt-pcr时，我的目的基因条带出来了，但出现了一条亮度非常高的非特异性带，每次每个标本都出现。我已把镁离子浓度和退火温度做了调整，但效果不佳。引物以前用过，没有问题，pcr条件差不多也有此非特异性带，但没这么明显，这次却怎么也弱不了它。期待各位的帮助，谢谢！！！e-mail:luo-my@163.com

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提高退火温度试一下。
作者: 阿拉蕾    时间: 2011-9-7 09:09

高手好，小弟这厢有礼了。《1》问：我现在有人肝组织的总RNA，RT是用a：Random 9mers；b：Oligo dT-Adaptor Primer 设计的引物 能把所有的蛋白的CDNA都反转录出来吗，其他的我不管。我的目的基因是APOA-1。全厂900不到。
《2》问我用A 法B法 能得到我的AOPOA-1的CDNA吗。我的APOA-1全长900左右，它对RNA的提取和RT的要求是不是很高。
《3》问我的RNA是我师姐给的。在-80度冰箱里防了差不多有一年了，问还能用吗

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1. 你用随机引物和Oliga dT做RT，得到的产物理论上包括所有表达的基因的cDNA。你如果要得到特异的cDNA，可以用针对某一基因的特异引物做RT。不管那种方法做的RT，你都可以用来做PCR，扩增你的目的基因。

2. A 法和B法都能得到你的apo A-1的CDNA。900bp的目的片段不算长，应该容易扩出来。

3. 你可以先把模板RNA跑个电泳，看看有没有降解。RT对于RNA的质量要求并不是很高，只要降解不是太厉害，应该可以用。
作者: 阿拉蕾    时间: 2011-9-7 09:10

我是一个新新手，现请教几个有关RT-PCR的问题：
1.组织半定量RT-PCR，RT时组织有无必要称重？
2.若测同一组织多种目的基因的相对表达，是否每种目的基因PCR时都要用内参对照？还是只作一次内参对照就行？内参对照是否必需要和目的片断的扩增同一条件？
3.20ul的PCR体系中需加入多少cDNA,我加的是5ul，可以更少吗？若减少加入量，PCR体系的其他成分的浓度需变否？
4.PCR反应产物是否要一定在48小时内电泳分析？以后再电泳图形是否就会不规则？长期保存在－20度是否仍会降解？
不知我表达清楚否？这虽是些很菜鸟的问题，可对我来讲也是很现实的问题，我也曾查过书，可仍是一知半解。望各位高手不吝赐教！

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1.没必要，黄豆大就行了，要抓紧时间冷冻。
2。每次都做。不一定，但最好接近。一般内参对照的条件简单，容易扩增。为
3。一般是5ul，为什么要减少加入量？
4。尽量早电泳，我的可以保持一个多月。
作者: guagua    时间: 2011-9-7 09:10

做PCR时，发现引物有问题，我是从文献上获得引物序列，不知道同源性如何？请教各位PCR高手，帮我确定。
人源的P物质受体NK-1引物序列：
sense：5’－AGGACAGTGACGAACTATTTTCTGG-3’
antisense：5’－CTGCTGGATAAAACTTCTTCAGGTAG-3’

万分感谢！！！
作者: fangxiang    时间: 2011-9-7 09:19

我想问2个问题，
1、有站友说过RT-PCR做半定量为了准确，要多重复几次，那这种重复是从那一步开始呢？从提RNA，还是RT，还是用同一支cDNA每次加固定的量多做几次扩增？
2、由于条件所限，我没有扫胶的设备，只能把电泳的结果拍成照片载扫到电脑里用图象分析软件分析，请问可以吗？如果可以，我该用什么软件呢？

请各位不吝赐教，谢谢！ 哥哥姐姐们谁有系统介绍RT-PCR的资料告诉我好吗，或者说哪里有的下啊
我昨天下了CLONETCH的使用说明书。但是总觉的差的远。
作者: wawa    时间: 2011-9-7 09:20

我也一直在做RT－PCR，刚开始时批出一个条带，但亮度太低，分析是得到的cDNA量太低，后来我试图从Mg离子浓度、RNA模板量、退火温度、延伸时间等方面进行搜索，结果什么都没有了。我想问：RNA模板是否也有个量的规定？RT－PCR后的溶液是否取来做为模板进行直接的PCR？为何同等条件下，新的PCR仪却扩增不出来？当退火温度升高或降低都不再批出条带来，是否说明退火温度就是该温度，而为何批出的条带亮度太低？还有一个，关于试剂盒(Promega)中的各试剂以及RNA冻融几次，RT－PCR就无法作出来了？谢谢！
作者: 喵咪    时间: 2011-9-7 09:22

我也一直在做RT－PCR，刚开始时批出一个条带，但亮度太低，分析是得到的cDNA量太低，后来我试图从Mg离子浓度、RNA模板量、退火温度、延伸时间等方面进行搜索，结果什么都没有了。我想问：RNA模板是否也有个量的规定？RT－PCR后的溶液是否取来做为模板进行直接的PCR？为何同等条件下，新的PCR仪却扩增不出来？当退火温度升高或降低都不再批出条带来，是否说明退火温度就是该温度，而为何批出的条带亮度太低？还有一个，关于试剂盒(Promega)中的各试剂以及RNA冻融几次，RT－PCR就无法作出来了？谢谢！

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我做丙型肝炎的RT－PCR,血清中的病毒含量是非常低的，但做套式PCR做出的条带是很亮的.RNA-70℃反复冻融3次与对照是没有什么显著差异的。至于反复冻融几次就做不出来就不知道了
作者: 8黑眼圈8    时间: 2011-9-7 10:21

谁用过promage公司的逆转录试剂盒，按说明书1ugRNA用15u的AMV-RT，是不是说15U的AMV-RT只能转录1ugRNA，如果RNA的量大于1ug会不会影响反应结果？
RT-PCR的反应条件已摸好，为什么重新抽提RNA并逆转录CDNA后，按原先的条件进行PCR 却不见任何反应条带？如何判断CDNA的质量？同种细胞的CDNA电泳的条带一样吗？是什么样的？反应体积为25ul，CDNA的量一般用多少？
请各位高手帮帮忙，我花了好几个月时间做RT-PCR，原想条件已摸好，没想到进行重复实验却又没结果，我真的对RT-PCR方法失去信心！
作者: 微笑的海豚    时间: 2011-9-7 10:40



QUOTE:
原帖由 8黑眼圈8 于 2011-9-7 10:21 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
谁用过promage公司的逆转录试剂盒，按说明书1ugRNA用15u的AMV-RT，是不是说15U的AMV-RT只能转录1ugRNA，如果RNA的量大于1ug会不会影响反应结果？
RT-PCR的反应条件已摸好，为什么重新抽提RNA并逆转录CDNA后，按原先的条件进行PCR ...

我做RT后，鉴定cDNA质量可以用beta-actin或GAPDH引物进行PCR，27圈就可。应该比较亮才对。多家试剂公司的阳性对照就是这两个基因，他们的引物是公开的，效果不错。
一次反转录用1 ugRNA太多了，可以做好多个PCR。
我做RT，一般用SuperScriptII，50 u 就可以了（厂家说200 u)，给厂家知道要气死了。基本没有失手。20 ul反转录体系，取1－2 ul做PCR模板。
作者: 圆圆圈圈    时间: 2011-9-7 10:52

想做DDRT-PCR 260/280比值多少是最好的，哪个范围内的就可以使用？？请赐教。
作者: 红豆冰    时间: 2011-9-7 10:54

求教！
大家好，我是一个新手，最近也在做pcr。但是在引物设计上还不知道如何入手，所查到的primer5.0和Oligo也都是demon版的。请问在哪里有***版下载？谢谢！
作者: 旋转木马    时间: 2011-9-7 10:55

我也在做RT-PCR ，现在在自己设计l了一条引物，从ncbi.nlm.nih.gov上查到相应序列，我通过protein 来查找到相应的mRNA但是上面提示有 很多的varient，我想知道，是不是所有的细胞都有几乎相同的MRNA ,如果由于个别碱基地变异，在设计引物的时候应该怎么办，我现在就按照我自己设计的引物（用Primer premier 5.0)来批却批不出来。pcr方法应该没问题，因为我的内参每次都批的很好。引物设计软件分析我的设计，总评分在90分，我看了觉得如果有问题就是其中一条引物的gc比值只有36％，余下没有什么问题。还有不知国外的引物合成是不是与国内的相差很大。我另外一条目的基因开始用同学从国外带来的引物批就批的很好，但是我按照上面的序列找生工合成的就批不出来，很郁闷。哪位高人能解答，谢
作者: 阿拉蕾    时间: 2011-9-7 10:57

in my opinin it is not so excellent to design the primers sith software. and according the main principle of designation and using your naked esys. and also do not beleieve the reference always.
as for as varient,i do not know what u mean. the SNP or variant transcripition? please refer my
cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=67&id=166687&sty=1&tpg=1&age=-1')
the primer,especialy the last nucleotide, i think, should better at the position of firdt nucleotide of 3 codon,if u select the ORF as the target sequence.
作者: 明天的明天    时间: 2011-9-7 10:58

本人在做RT-PCR，目的片段大约长2.6KB，经过一个多月的艰辛，终于括出所需条带。但很不稳定，做出来4次之后就再也括不出来了。不知道问题出在什么地方？希望大家能够 指点迷津。谢谢！
作者: 清风风铃    时间: 2011-9-7 10:59

我欲用rt-pcr测药物作用前后survivin基因的变化。但在设计引物时出现了问题。请问：1。人体不同组织中mrna的序列一样吗？我做的是卵巢癌，但文献上报道的是肺癌或肝癌，我可以用文献上报道的吗？
2。在引物设计上，硷基是否要与目的基因完全一致。我查了一些文献，他们所提供的引物序列上游引物与目的基因一致，但下游引物却不一致，请指教。万分感谢。
作者: 阿拉蕾    时间: 2011-9-7 10:59



QUOTE:
原帖由 清风风铃 于 2011-9-7 10:59 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
我欲用rt-pcr测药物作用前后survivin基因的变化。但在设计引物时出现了问题。请问：1。人体不同组织中mrna的序列一样吗？我做的是卵巢癌，但文献上报道的是肺癌或肝癌，我可以用文献上报道的吗？
2。在引物设计上，硷基是否要与 ...

question 1: of course.
question 2: of course. if some guys' primers is different i think it must onlyy one or two nucleotides difference. and he must use the varient as the template. there are some different mRNA sequences in the GenBank, the causes are many, for example, the wrong sequencing and the varient gene itself.
作者: fangxiang    时间: 2011-9-7 11:00

我的意思是既指单链构象多态性又指基因的不同变异体。在前者存在的情况下，是不是要尽量避免把引物设计在snp的差异位点上;对于后者是不是要尽量扩增基因的保守区域？在Genebank中一段gene的cds总是小于full length，那么是不是大多数cds都是保守的，可否只扩增cds中间的序列来消除transcription variant 的影响？
另外是不是pcr引物设计时要很注意待扩增区域的gc含量是否均匀，如何判别均匀与否，如果不是很均匀，是不是不好控制退火温度？如果实在是不均匀，在反应时如何改进实验条件？
难道genebank中的不正确的序列还没有被删除吗？
作者: 阿拉蕾    时间: 2011-9-7 11:01

if u refer '单链构象多态性' as SNP,it is wrong. the former is SSCP and the latter is single nucleotide polymorhism.
在前者存在的情况下，是不是要尽量避免把引物设计在snp的差异位点上. of course the primers are on the upstrem and doownstream respectiverly.

在Genebank中一段gene的cds总是小于full length，那么是不是大多数cds都是保守的，可否只扩增cds中间的序列来消除transcription variant 的影响？according to the 5' and 3' UTR the ORF comparely conserve esüecially in one gene family or superfamily. but for on cetain gene only the domain is conserve,for exaample, in different specie. but the conservation of domain is refer to protein rather than gene, for example, the third nucleotide of the coden may be vatient.

另外是不是pcr引物设计时要很注意待扩增区域的gc含量是否均匀，如何判别均匀与否，如果不是很均匀，是不是不好控制退火温度？如果实在是不均匀，在反应时如何改进实验条件？refer to the textbook.

难道genebank中的不正确的序列还没有被删除吗？of course. u can create a sequence to input also
作者: 岸上的鱼    时间: 2011-9-7 11:02

请教:
我做RT-PCR已经3个月了，现在遇到一个奇怪的问题。我提RNA用的是TRIZOL，逆转录用的是MBI的试剂盒，得到的CDNA用来做PCR，目的片段大小为2。6KB，以前设计的一对引物括了一个多月才出来条带。但遗憾的是其中一条的酶切位点为ECORV，酶切后为平端，考虑到连接起来难度较大，就换了一个酶切位点。新引物拿到后曾经做出来过3次，但效果不太好。后来就再也做不出来了。我的CDNA用来做别人600BP的片段做的也挺好的，不知道为什么我的做不出来。现在真是心急如
作者: 清风风铃    时间: 2011-9-7 11:02

你的意思是不是我找一篇图比较好的文献，用他的引物序列就可以呢，即使它们是不同组织？
作者: 阿拉蕾    时间: 2011-9-7 11:22



QUOTE:
原帖由 清风风铃 于 2011-9-7 11:02 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
你的意思是不是我找一篇图比较好的文献，用他的引物序列就可以呢，即使它们是不同组织？  

u can. but check it before using.
and if i was u, i would design myself.
作者: 喵咪    时间: 2011-9-7 14:40

多谢。但我不知道要如何check呢。你所言及是，但我是学临床的，对基础的知识真的是很欠缺，真是书到用时方恨少。而我老师只是专心于做手术又不能指导我，我真的不会自己设计。现在觉得自己是一只无头苍蝇，很烦。
作者: 喵咪    时间: 2011-9-7 14:40

阿拉蕾：
能否冒昧地问一下，你能帮我参考一下吗。我要做的 是survivin 基因，我在medline上查得LOCUS BIRC5 1619 bp mRNA linear PRI 31-OCT-2000
DEFINITION Homo sapiens baculoviral IAP repeat-containing 5 (survivin)
(BIRC5), mRNA.
ACCESSION NM_001168
VERSION NM_001168.1 GI:4502144
KEYWORDS .
SOURCE Homo sapiens (human)
ORGANISM Homo sapiens
Eukaryota; Metazoa; Chordata; Craniata; Vertebrata; Euteleostomi;
Mammalia; Eutheria; Primates; Catarrhini; Hominidae; Homo.
REFERENCE 1 (bases 1 to 1619)
AUTHORS Altieri,D.C.
TITLE Molecular cloning of effector cell protease receptor-1, a novel
cell surface receptor for the protease factor Xa
JOURNAL J. Biol. Chem. 269 (5), 3139-3142 (1994)
MEDLINE 94148797
PUBMED 8106347
REFERENCE 2 (bases 1 to 1619)
AUTHORS Altieri,D.C.
TITLE Splicing of effector cell protease receptor-1 mRNA is modulated by
an unusual retained intron
JOURNAL Biochemistry 33 (46), 13848-13855 (1994)
MEDLINE 95034823
PUBMED 7947793
REFERENCE 3 (bases 1 to 1619)
AUTHORS Ambrosini,G., Adida,C. and Altieri,D.C.
TITLE A novel anti-apoptosis gene, survivin, expressed in cancer and
lymphoma
JOURNAL Nat. Med. 3 , 917-921 (1997)
作者: 喵咪    时间: 2011-9-7 14:42

MEDLINE 97398388
PUBMED 9256286
REFERENCE 4 (bases 1 to 1619)
AUTHORS Ambrosini,G., Adida,C., Sirugo,G. and Altieri,D.C.
TITLE Induction of apoptosis and inhibition of cell proliferation by
survivin gene targeting
JOURNAL J. Biol. Chem. 273 (18), 11177-11182 (1998)
MEDLINE 98225200
PUBMED 9556606
REFERENCE 5 (bases 1 to 1619)
AUTHORS Li,F., Ambrosini,G., Chu,E.Y., Plescia,J., Tognin,S.,
Marchisio,P.C. and Altieri,D.C.
TITLE Control of apoptosis and mitotic spindle checkpoint by survivin
JOURNAL Nature 396 (6711), 580-584 (1998)
MEDLINE 99075336
PUBMED 9859993
COMMENT REVIEWED REFSEQ: This record has been curated by NCBI staff. The
reference sequence was derived from U75285.1.
Summary: The protein encoded by this gene is an apoptosis inhibitor
that is expressed during the G2/M phase of the cell cycle. BIRC5
associates with the microtubules of the mitotic spindle and any
disruption results in the loss of apoptosis activity.
COMPLETENESS: complete on the 3' end.
FEATURES Location/Qualifiers
source 1..1619
/organism="Homo sapiens"
/db_xref="taxon:9606"
/chromosome="17"
/map="17q25"
gene 1..1619
/gene="BIRC5"
/note="synonym: API4"
/db_xref="LocusID:332"
/db_xref="MIM:603352"
CDS 50..478
/gene="BIRC5"
/note="apoptosis inhibitor 4; survivin"
/codon_start=1
/product="baculoviral IAP repeat-containing protein 5"
/protein_id="NP_001159.1"
/db_xref="GI:4502145"
/db_xref="LocusID:332"
/db_xref="MIM:603352"
/translation="MGAPT LPPAW QPFLK DHRIS TFKNW PFLEG CACTP ERMAE AGFI
H CPTEN EPDLA QCFFC FKELE GWEPD DDPIE EHKKH SSGCA FLSVK KQFEE LTLGE FL
KLD RERAK NKIAK ETNNK KKEFE ETAKK VRRAI EQLAA MD"
misc_feature 89..310
/gene="BIRC5"
/note="BIR; Region: Baculoviral inhibition of apoptosis
protein repeat"
/db_xref="CDD:BIR"
misc_feature 101..310
/gene="BIRC5"
/note="BIR; Region: Inhibitor of Apoptosis domain"
作者: 喵咪    时间: 2011-9-7 14:42

/db_xref="CDD:pfam00653"
misc_feature 101..310
/gene="BIRC5"
/note="BIR; Region: Zn binding domain involved in protein
protein interactions in caspase inhibition and spindle
assembly"
/db_xref="CDD:LOAD:bir"
variation 626
/gene="BIRC5"
/allele="T"
/allele="C"
/db_xref="dbSNP:2239680"
variation 1048
/gene="BIRC5"
/allele="T"
/allele="C"
/db_xref="dbSNP:1042489"
variation 1479
/gene="BIRC5"
/allele="G"
/allele="C"
/db_xref="dbSNP:2856269"
polyA_signal 1600..1605
/gene="BIRC5"
polyA_site 1619
/gene="BIRC5"
BASE COUNT 349 a 392 c 449 g 429 t
ORIGIN
1 ccgccagatt tgaatcgcgg gacccgttgg cagaggtggc ggcggcggca tgggtgcccc
61 gacgttgccc cctgcctggc agccctttct caaggaccac cgcatctcta cattcaagaa
121 ctggcccttc ttggagggct gcgcctgcac cccggagcgg atggccgagg ctggcttcat
181 ccactgcccc actgagaacg agccagactt ggcccagtgt ttcttctgct tcaaggagct
241 ggaaggctgg gagccagatg acgaccccat agaggaacat aaaaagcatt cgtccggttg
301 cgctttcctt tctgtcaaga agcagtttga agaattaacc cttggtgaat ttttgaaact
361 ggacagagaa agagccaaga acaaaattgc aaaggaaacc aacaataaga agaaagaatt
421 tgaggaaact gcgaagaaag tgcgccgtgc catcgagcag ctggctgcca tggattgagg
481 cctctggccg gagctgcctg gtcccagagt ggctgcacca cttccagggt ttattccctg
541 gtgccaccag ccttcctgtg ggccccttag caatgtctta ggaaaggaga tcaacatttt
601 caaattagat gtttcaactg tgctcctgtt ttgtcttgaa agtggcacca gaggtgcttc
661 tgcctgtgca gcgggtgctg ctggtaacag tggctgcttc tctctctctc tctctttttt
721 gggggctcat ttttgctgtt ttgattcccg ggcttaccag gtgagaagtg agggaggaag
781 aaggcagtgt cccttttgct agagctgaca gctttgttcg cgtgggcaga gccttccaca
841 gtgaatgtgt ctggacctca tgttgttgag gctgtcacag tcctgagtgt ggacttggca
901 ggtgcctgtt gaatctgagc tgcaggttcc ttatctgtca cacctgtgcc tcctcagagg
961 acagtttttt tgttgttgtg tttttttgtt tttttttttt ggtagatgca tgacttgtgt
1021 gtgatgagag aatggagaca gagtccctgg ctcctctact gtttaacaac atggctttct
1081 tattttgttt gaattgttaa ttcacagaat agcacaaact acaattaaaa ctaagcacaa
1141 agccattcta agtcattggg gaaacggggt gaacttcagg tggatgagga gacagaatag
1201 agtgatagga agcgtctggc agatactcct tttgccactg ctgtgtgatt agacaggccc
1261 agtgagccgc ggggcacatg ctggccgctc ctccctcaga aaaaggcagt ggcctaaatc
1321 ctttttaaat gacttggctc gatgctgtgg gggactggct gggctgctgc aggccgtgtg
1381 tctgtcagcc caaccttcac atctgtcacg ttctccacac gggggagaga cgcagtccgc
1441 ccaggtcccc gctttctttg gaggcagcag ctcccgcagg gctgaagtct ggcgtaagat
1501 gatggatttg attcgccctc ctccctgtca tagagctgca gggtggattg ttacagcttc
1561 gctggaaacc tctggaggtc atctcggctg ttcctgagaa ataaaaagcc tgtcatttc

你能在百忙之中帮帮我吗？真的是万分感谢。谢谢，谢谢。
作者: 菠萝菠萝蜜    时间: 2011-9-7 14:43

有问题请教！
要扩400多碱基的片断，结果扩出来的一条用MARKER对照，显示是2000个碱基数。这种现象怎么解释阿？！
我的引物是从文献上查来的，对过原序列，还用软件分析过
虽然不是特别好，可是一般的条件都能满足。
为什么会出现这种结果，我实在想不出来
我的那条目的基因全长都没有2000，只有799。
会不会是MARKER有问题？
因为这次没有做内参，所以……
不过这个CDNA拿来做内参，跑出来的是很清楚的一条带。
作者: 绿茶公子    时间: 2011-9-7 14:44

大家好！在RT-PCR的的九十天，终于有了结果，我可为之瘦了整整一大圈！
我的感受是：第一，用好的Trizol或好的试剂盒提RNA，否则mRNA的完整性无法保证；第二，cDNA全长超过1000bp以上建议用好的逆转录试剂盒；第三，要考虑模板的复杂性，如模板GC含量总体平均不太高，但局部有好几处含量偏高，超过75％等，建议使用GC enhance system如Takara，普通的taq难以逾越。
作者: 阿拉蕾    时间: 2011-9-7 14:44

有问题请教！
要扩400多碱基的片断，结果扩出来的一条用MARKER对照，显示是2000个碱基数。这种现象怎么解释阿？！
我的引物是从文献上查来的，对过原序列，还用软件分析过
虽然不是特别好，可是一般的条件都能满足。
为什么会出现这种结果，我实在想不出来
我的那条目的基因全长都没有2000，只有799。
会不会是MARKER有问题？
因为这次没有做内参，所以……
不过这个CDNA拿来做内参，跑出来的是很清楚的一条带。

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genomics maybe.
作者: 天蓝蓝    时间: 2011-9-7 14:45

请教一个问题，模板的复杂性，包括GC含量如何分析？我现在也在做RT-PCR，目的片段2600BP，用的是TAKARA EX酶，但还是做不出来，不 知道是不是模板的问题，希望能指教。谢谢！
作者: 阿拉蕾    时间: 2011-9-7 14:46

模板可以用Oligo6等分析，看看局部GC的分布，我的模板1500bp，有4、5处GC含量达85％甚至90％，普通Taq是批不出来的。当然RNA抽提，逆转录同样非常重要！
作者: 阿拉蕾    时间: 2011-9-7 14:46

补充一点：你的cDNA挺长的，建议用好的的试剂，如Invitrogen的Trizol和逆转录系统。
作者: 天蓝蓝    时间: 2011-9-7 14:52

楼上的大哥 基因组？
我不是很明白你的意思？
难道这个引物与其他地方有错配的？ 可是这样的东西也太悬了阿
我不可能把它与全基因组核对阿

那我该怎么办呢？只能换引物吗？
除了这个原因没有别的可能了吗？
作者: 阿拉蕾    时间: 2011-9-7 14:52

genomic sequence of your gene.
just possiblity. another possiblity is the gene of superfamily.
but i think former is possibe
CHECK THE PRIMERS ON THE GENOIMC OF YOUR GENE NOT ALL GENOMICS
作者: 天蓝蓝    时间: 2011-9-7 14:53

第二种可能已经排除
我现在可以确认不是第一个问题
因为我查过国内国外的文献 几乎有一大半用的就是我这对引物
作者: 阿拉蕾    时间: 2011-9-7 14:53

第二种可能已经排除
我现在可以确认不是第一个问题
因为我查过国内国外的文献 几乎有一大半用的就是我这对引物

===============================================================================================

check the primers if it is on the exons and check if the length between the primers is equal to the length u have amplified.
or using DNaseI treatment before RT to test.
作者: 天蓝蓝    时间: 2011-9-7 14:54

引物与该基因的mRNA核对过 第一个是位于编码序列的第1到20。第二个是在
编码序列最后几个连同后面几个碱基。
很奇怪 为什么别人都用这个得出400多
我们却得到2000BP片断
是否有可能是引物合成有问题？
作者: 阿拉蕾    时间: 2011-9-7 14:54

check the genomics, not only mRNA. how many exons does this gene have? how long between the 2 primers in genomics? if it is 2kb, ithat is the problem. u might mix the genomics in the RNA. of course it just a guess. so that is why i suggest u check it first.
作者: 天蓝蓝    时间: 2011-9-7 14:54

但是RT-PCR的模板不应该是mRNA逆转录过来的cDNA吗？
难道是所有的RNA?
作者: 天蓝蓝    时间: 2011-9-7 14:55

不明白阿
不过我还是会去对一对的  
作者: 阿拉蕾    时间: 2011-9-7 14:58

但是RT-PCR的模板不应该是mRNA逆转录过来的cDNA吗？
难道是所有的RNA?

===============================================================================================================

actually, there are indeed other RNA during the PCR if u use total RNA<i think so, because nowaday seldom using mRNA) as the template during the RT. the tRNA and rRNA are still mixed in the cDNA.
but what i mean is not rRNA and tRNA. I just told u that the genomic DNA maybe mix in the RNA. and so i ask how many exons this gene has.
作者: 天蓝蓝    时间: 2011-9-7 14:59

在该基因的整个基因里
这两对引物之间的片段长是1446BP

可是
很有疑问 就是即便被污染 可是那个mRNA不也应该在提取物里面吗？
那么cDNA 也应在反映体系里面阿 而短的片段相对来说更容易扩出来的
为什么只扩出来2000的 而我需要的400多的一点都没有呢？而且 换了很多种反映条件 始终扩不出400的
作者: 阿拉蕾    时间: 2011-9-7 14:59

synthsize the primers again, i am afraid.
using the different sequence maybe.
作者: 小葵    时间: 2011-9-7 15:00

各位高手，不好意思，我是PCR新手，请教几个愚蠢的问题：
内参照有种属差异吗？如大鼠、小鼠。
用Trizol处理的标本－70度可保存多久？
内参与目的片断可以同时PCR吗？有何要点？
作者: 阿拉蕾    时间: 2011-9-7 15:04

各位高手，不好意思，我是PCR新手，请教几个愚蠢的问题：
内参照有种属差异吗？如大鼠、小鼠。
yes.
用Trizol处理的标本－70度可保存多久？
samles or RNA? ABOUT 1 YEAR. better not too longer.
内参与目的片断可以同时PCR吗？有何要点？
better not.

===================================================

please check the in the DXY.here are many many title.
作者: 格格巫    时间: 2011-9-7 15:05

各位高手,请教一个问题.我从资料上查到两组引物,如下:
SEQUENCE(5-3) RT-PCR efficiency

HS EGR-1,NM 001964 f:CAGC ACCT TCAA CCCT CAG 1.812
r:CACA AGGT GTTG CCAC TGTT

MM EGR-1,NM 007913 f:CAGG AGTT GGAG TGTT GTGG 1.931
r:TATC CCAT GGGC AATA GAGC
我不太明白HS和MM有什么区别.
刚开始做这方面的实验,是个新手,还望大家不吝指教,谢谢了!!
作者: free    时间: 2011-9-7 15:05

我是生手求教：RT-PCR与ELISA方法比测细胞因子哪一个价格更低？
作者: 开心蔬菜帮    时间: 2011-9-7 15:06

请教：我要扩增一全长为3.4kb的基因，PCR条件：94度2分钟，94度30秒，60度30秒，68度3分钟，72度7分钟。结果：阳性对照在500bp,样本无条带。可能是什么原因？
作者: 喵咪    时间: 2011-9-7 15:06

我是生手求教：RT-PCR与ELISA方法比测细胞因子哪一个价格更低？

====================================================

RT-PCR价格更低
作者: 喵咪    时间: 2011-9-7 15:07

请教：我要扩增一全长为3.4kb的基因，PCR条件：94度2分钟，94度30秒，60度30秒，68度3分钟，72度7分钟。结果：阳性对照在500bp,样本无条带。可能是什么原因？

================================

你的热循环参数好象有问题吧
作者: 飞天小鹿    时间: 2011-9-7 15:07

我做的电泳结果，从加样孔就开始出现淡的一片，但是没有一条亮带出现
这样子，我知道是没有扩出来，但我想知道那些淡的是什么
谢谢  
作者: 飞天小鹿    时间: 2011-9-7 15:08

还有一个问题，是不是一般来说，如果要半定量的话
循环数都不要超过30，否则就达到了平台期
作者: 花裙子    时间: 2011-9-7 15:08

我做的电泳结果，从加样孔就开始出现淡的一片，但是没有一条亮带出现
这样子，我知道是没有扩出来，但我想知道那些淡的是什么
谢谢

===========================================================

是不是你在提RNA的时候把DNA也提出来了?
作者: 阿福    时间: 2011-9-7 15:09

在该基因的整个基因里
这两对引物之间的片段长是1446BP

可是
很有疑问 就是即便被污染 可是那个mRNA不也应该在提取物里面吗？
那么cDNA 也应在反映体系里面阿 而短的片段相对来说更容易扩出来的
为什么只扩出来2000的 而我需要的400多的一点都没有呢？而且 换了很多种反映条件 始终扩不出400的

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这个片断也太长了点吧。用primer premier5再分析一下吧。
作者: 阿福    时间: 2011-9-7 15:09

各位高手,请教一个问题.我从资料上查到两组引物,如下:
SEQUENCE(5-3) RT-PCR efficiency

HS EGR-1,NM 001964 f:CAGC ACCT TCAA CCCT CAG 1.812
r:CACA AGGT GTTG CCAC TGTT

MM EGR-1,NM 007913 f:CAGG AGTT GGAG TGTT GTGG 1.931
r:TATC CCAT GGGC AATA GAGC
我不太明白HS和MM有什么区别.
刚开始做这方面的实验,是个新手,还望大家不吝指教,谢谢了!!

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HS EGR-1,NM 001964是

LOCUS NM_001964 3136 bp mRNA linear PRI 01-JUN-2003
DEFINITION Homo sapiens early growth response 1 (EGR1), mRNA.
ACCESSION NM_001964
VERSION NM_001964.2 GI:31317226
KEYWORDS .
SOURCE Homo sapiens (human)

MM EGR-1,NM 007913是

LOCUS NM_007913 4494 bp mRNA linear ROD 07-APR-2003
DEFINITION Mus musculus early growth response 1 (Egr1), mRNA.
ACCESSION NM_007913
VERSION NM_007913.2 GI:24475900
KEYWORDS .
SOURCE Mus musculus (house mouse)

所以HS是Homo sapiens，MM是Mus musculus ，一个是人一个是mouse。

关于序列可以在NCBI的Nucleotide里找。
作者: 嗡嗡    时间: 2011-9-7 15:10

请问一个问题,mouse的内参用什么?具体有什么要求?谢谢了!!!
作者: 喵咪    时间: 2011-9-7 15:11

我做的电泳结果，从加样孔就开始出现淡的一片，但是没有一条亮带出现
这样子，我知道是没有扩出来，但我想知道那些淡的是什么
谢谢

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应该是 dna吧
作者: 喵咪    时间: 2011-9-7 15:11

请问一个问题,mouse的内参用什么?具体有什么要求?谢谢了!!!

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各个物种（哺乳动物）之间beta-actin的序列相对很保守，
人的beta-actin也可以使用。
作者: 喵咪    时间: 2011-9-7 15:11

各个物种（哺乳动物）之间beta-actin的序列相对很保守，
人的beta-actin也可以使用。

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我用过人的beta-actin,结果是没有.相反的是人的egr-1引物反倒可以,就是条带不太清晰.
作者: 橘子水儿    时间: 2011-9-7 15:12

有用过QIAGEN OneStep试剂盒的吗？请问如何购买？价格如何？
作者: 天蓝蓝    时间: 2011-9-7 15:12

我用primer 5 oligo 6都分析过了
引物没什么问题
我已经重新合成一对
看看效果怎么样
作者: 大仙    时间: 2011-9-7 15:13

各位高手好！小弟想请问何处可下载分析RT-PCR条带的图象分析软件
非常感谢
作者: 过路甲    时间: 2011-9-7 15:14

我是一位新手，请教各位老师：我在做鸡MHC-II beta链的 RT-PCR，电泳可是什么也没有跑出来。所使用的引物是参考NCBI上的文献，上游：GCC ATG GGG AGC GGG CGC GTC前面加上保护碱基和酶切位点CG GAATTC；下游：CTA ATT CAG CAT CCC TGG AGC G前面加上保护碱基和酶切位点GC GTCGAC，上海生工设计。欲扩增的产物为956bp，循环参数是94度，1min；退火温度（第一次为70度，后来改变几次）1min；72度，3min，共30个循环。理论上接近MARKER上1000BP，退火温度前后改变几次，还是没有结果。我不知道哪里出了差错
作者: 微笑的海豚    时间: 2011-9-7 15:15

我是一位新手，请教各位老师：我在做鸡MHC-II beta链的 RT-PCR，电泳可是什么也没有跑出来。所使用的引物是参考NCBI上的文献，上游：GCC ATG GGG AGC GGG CGC GTC前面加上保护碱基和酶切位点CG GAATTC；下游：CTA ATT CAG CAT CCC TGG AGC G前面加上保护碱基和酶切位点GC GTCGAC，上海生工设计。欲扩增的产物为956bp，循环参数是94度，1min；退火温度（第一次为70度，后来改变几次）1min；72度，3min，共30个循环。理论上接近MARKER上1000BP，退火温度前后改变几次，还是没有结果。我不知道哪里出了差错，恳请各位老师给分析分析，感谢了。

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这个循环的温度是从哪里得来得？？？？
好像有点奇怪啊！
作者: 哇啦    时间: 2011-9-7 15:15

定量RT-PCR用的对照为内源性与外源参考标准,内源性标准通常为管家基因.
作者: dior    时间: 2011-9-7 15:16

大家好，我想问一下RT-PCR用来分析生物多样性功能可行吗
作者: 王六六    时间: 2011-9-7 15:16

请教各位大虾：
贴壁的细胞如何用TRIzol进行处理？
需要消化、离心收集？
还是直接用橡皮刮刮取细胞离心收集？
残余的血清、胰酶会对RNA的提取有影响吗？
作者: 章鱼小丸子    时间: 2011-9-7 15:17

大家能解释一下跑总RNA电泳图时，几种RNA在图上的位置和基本应有的特征吗？以及跑出什么样的图表示提RNA可能出现的不同结果吗？我以前听说过此方面的部分信息，现想具体了解，恳请大家作个介绍！！不胜感激！
作者: 微笑的海豚    时间: 2011-9-7 15:18

再请问一个问题,mouse的内参用什么?具体有什么要求?谢谢了!!!

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我知道你指的内参是什么了。我用的是G3PDH，好象每个实验室选用的不一样。
作者: 微笑的海豚    时间: 2011-9-7 15:18

请教各位大虾：
贴壁的细胞如何用TRIzol进行处理？
需要消化、离心收集？
还是直接用橡皮刮刮取细胞离心收集？
残余的血清、胰酶会对RNA的提取有影响吗？

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我用的是100x15mm的culture dish，先吸掉medium，再用用PBS 10ml洗x3次，再是TRIzol 1ml 37度4min溶解，2ml medium中和TRIzol，再离心收集。接下来就是用kits了。我感觉用kits提取RNA很稳定。
作者: 喵咪    时间: 2011-9-7 15:19

甲醇/盐酸（1：1）浸泡1小时，处理石英比色杯，DEPC水洗干净即可
作者: 去看海    时间: 2011-9-7 15:19

我要检测一个基因在组织的表达情况，可是我在pubmed上只找到了人和小鼠的基因序列但是没有大鼠的，而我用的动物是大鼠，那该怎么办？请问有没有什么好的办法。
作者: 微笑的海豚    时间: 2011-9-7 15:20     标题: 回复 #181 去看海 的帖子

有可能大鼠序列你没有找到。
如果的确没有，那麽检测该基因在大鼠中的表达情况有点早，
应该先确定该基因在大鼠中的同源基因是否存在，及序列如何，

不同物种间的基因不是完全对等的，
人和小鼠的同功能基因存在并不意味着大鼠就有该基因。
作者: 微笑的海豚    时间: 2011-9-7 15:20

我用的是100x15mm的culture dish，先吸掉medium，再用用PBS 10ml洗x3次，再是TRIzol 1ml 37度4min溶解，2ml medium中和TRIzol，再离心收集。接下来就是用kits了。我感觉用kits提取RNA很稳定。

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Trizol的说明书上强调的很明白，RNA提取不能用非培养液洗涤，倒掉培养液直接放Trizol.
作者: 小蜜蜂    时间: 2011-9-7 15:21

我做RT-PCR没扩出来,PCR反应条件应该没问题,以前扩出来的,现在只是模板不同.现在高度怀疑是RNA 或逆转录的问题.不知该怎样检测逆转录是否成功?
作者: 小蜜蜂    时间: 2011-9-7 15:21

我做RT-PCR没扩出来,PCR反应条件应该没问题,以前扩出来的,现在只是模板不同.现在高度怀疑是RNA 或逆转录的问题.不知该怎样检测逆转录是否成功?
作者: 冰激凌小姐    时间: 2011-9-7 15:21

调调镁离子浓度试试吧!
作者: 阿拉蕾    时间: 2011-9-7 15:22

可以选用GAPDH，我用的效果还可以。
Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase(GADPH),
sense primer 5’-ATC ACC ATC TTC CAG GAG CG -3’;
antisense primer 5’-CCT GCT TCA CCA CCT TCT TG -3’;
the PCR product size was 584bp.
作者: 阿拉蕾    时间: 2011-9-7 15:22

请教各位大虾：
贴壁的细胞如何用TRIzol进行处理？
需要消化、离心收集？
还是直接用橡皮刮刮取细胞离心收集？
残余的血清、胰酶会对RNA的提取有影响吗？

=======================================================================================================

按照常规方法洗细胞，PBS或者D-HANKs洗两次，每次静置10-5分钟，然后加胰酶1%消化收集细胞，以后的方法与悬浮细胞一样。
作者: 阿拉蕾    时间: 2011-9-7 15:23

请教各位大虾：
贴壁的细胞如何用TRIzol进行处理？
需要消化、离心收集？
还是直接用橡皮刮刮取细胞离心收集？
残余的血清、胰酶会对RNA的提取有影响吗？

====================================================================================================

按照常规方法洗细胞，PBS或者D-HANKs洗两次，每次静置10-5分钟，然后加胰酶1%消化收集细胞，以后的方法与悬浮细胞一样。

==========================================================

再次强调，提取RNA之前绝对不能洗涤，
RNA在这一会降解已经很厉害了，
倒不是因为污染，是细胞自身的RNA清除机制在起作用。
作者: 糊涂虫    时间: 2011-9-7 15:23

我作了2个月的RT－PCR，前面还好好的，突然之间就出现了一条大约600bp的片断，亮度比我想要的400bp的还高。我降低了循环次数、减少了延伸时间和模板量还是不行，这到底是怎么回事呢？
哪位高手指点一下，不胜感激！！！
作者: 阿福    时间: 2011-9-7 15:25

我做RT-PCR没扩出来,PCR反应条件应该没问题,以前扩出来的,现在只是模板不同.现在高度怀疑是RNA 或逆转录的问题.不知该怎样检测逆转录是否成功?

=========================================================

可以选用内参来扩增，如GAPDH等，因为其丰度高，容易扩增，
据此我想可以初步判断反转录质量。
作者: 阿福    时间: 2011-9-7 15:25

我作了2个月的RT－PCR，前面还好好的，突然之间就出现了一条大约600bp的片断，亮度比我想要的400bp的还高。我降低了循环次数、减少了延伸时间和模板量还是不行，这到底是怎么回事呢？
哪位高手指点一下，不胜感激！！！

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从你的描述中感觉真的很奇怪，好像变魔术一样。
但魔术毕竟都是假的，只不过你没有看出它的破绽在那里而已
作者: 丸子妹    时间: 2011-9-7 15:26

大家好！

请问RT-PCR时，在无反转录酶的情况下，对照RNA也获得目的条带了。（小片断，200BP）这是怎么回事？

而引物事先已经对过，除了满足“在不同外元上“这一条件之外，其中一个引物本身还跨一个内元。即，上游引物在外元一末尾以及外元二开始部分，下游引物在外元三上面。

按理说，Genomic DNA扩增出来的条带不应该也是200bp啊！我该怎么办呢？

谢谢！  
作者: 8黑眼圈8    时间: 2011-9-7 15:27

大家好，怀着太多的疑问，我终于找到了分析测试百科测试网。请各位高手帮我一把。
1、用Random primers和Oligo dT作反转录效果一样吗？需要注意些什么？
2、PCR后跑电泳结果还可以，但有时候将PCR产物在4摄氏度放置一天后，再跑电泳时发现条带没有了，如何解释
作者: 微笑的海豚    时间: 2011-9-7 15:28

大家好！

请问RT-PCR时，在无反转录酶的情况下，对照RNA也获得目的条带了。（小片断，200BP）这是怎么回事？

而引物事先已经对过，除了满足“在不同外元上“这一条件之外，其中一个引物本身还跨一个内元。即，上游引物在外元一末尾以及外元二开始部分，下游引物在外元三上面。

按理说，Genomic DNA扩增出来的条带不应该也是200bp啊！我该怎么办呢？

谢谢！

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refer to
cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=67&id=166687&sty=1&tpg=1&age=-1')
作者: 微笑的海豚    时间: 2011-9-7 15:29

大家好，怀着太多的疑问，我终于找到了分析测试百科网。请各位高手帮我一把。
1、用Random primers和Oligo dT作反转录效果一样吗？需要注意些什么？
2、PCR后跑电泳结果还可以，但有时候将PCR产物在4摄氏度放置一天后，再跑电泳时发现条带没有了，如何解释？

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1.我们实验室最近用随机引物做得好，如果样品足够，可以都试试，都是经典方法，做出来就达到目的了
2.应该不会，除非你的管子不干净，但最好冻存
作者: 嗨皮    时间: 2011-9-7 15:29

各位大侠:小弟敬礼了.
今天我第一次接触RT-PCR,遇到很多问题,现求救.
1.由于经费有限,我买的试剂盒PCR反应液体积是80ul.加上RT的20ul.总共PCR反应体系是100ul.请问我按等比例缩小体积为20ul,会不会影响退火温度,即改变退火温度值?
2.我的目的片段很小,为81个和100个碱基,内参照β-actin是249个硷基,请问溴酚兰的浓度是多少为宜,3%可以分开吗？３％时溴酚兰的片段是多少？此时我的Marker选多少合适？
３.另外DNA的浓度如何计算，比如１ODRNA是４０ug/ml.DNA的浓度是多少，是用OD260还是OD280?
4.降落PCR是梯度PCR吗？PCR最后一步４℃需要设置吗？
５.只有β-actin和Maker,没有目的片段是啥回事？
　　　　　　　　　　　　　　
谢谢！
作者: 喵咪    时间: 2011-9-7 15:30

再次强调，提取RNA之前绝对不能洗涤，
RNA在这一会降解已经很厉害了，
倒不是因为污染，是细胞自身的RNA清除机制在起作用。

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不太懂，是不是提RNA前不能用PBS洗？我觉得应该要洗吧。
作者: 阿拉蕾    时间: 2011-9-7 15:31

eeflying is right.
no necessary to wash.
nothing in the trace medium will interfere the RNA.
think about it, need we wash the specomen of the surgery operation?  
作者: panda王    时间: 2011-9-7 15:31

我也做RT-PCR,内参500碱基已见到,可是300bp的目的产物却无影无踪.我是用premega 一步法,电泳证实样品未降解,请问高手我该如何做?另外,我也用过二步法,分别以寡聚T和特异性下游引物进行逆转录,可是1.5%的普通琼脂糖电泳未见目的基因cDNA带.不知是因为量少还是其他原因,请做过cDNA验证的高手指点一二,不胜感谢!
作者: @花开花落@    时间: 2011-9-7 15:32

我想从组织中提出总RNA后经RT-PCR来获得目的基因片段，用于后继的酶切连接实验。但是我在PUBMED上调出目的基因的序列后，发现在此基因启始密码子ATG 左右全部都是高GC 含量的碱基，如下：………gccgcgagcagcgcccggaccccccagcggcggcccccgcccgcccagccccccggcccgccATGggcgccgcggcccgcaccctgcggctggcgctcggcctcctgctg………,请问各位我该如何设计这个引物呢？谢谢各位！
作者: 幸福无罪    时间: 2011-9-7 15:33

最近开始做RT
可是我得到的条带是一个区段（不同引物在同一位置出现一个宽区带），没有在特定的bp形成条带，不知是不是非特异性的太多，还是RNA已经降解。
作者: loli    时间: 2011-9-7 15:33

请教各位高手：我在做一种细胞因子的RT-PCR，根据从ncbi中查到的序列设计了引物（与参考文献中的引物序列基本相同），用Trizol抽提总RNA，然后分别用特异性引物和oligo(dT)进行反转录，再PCR。PCR参数是940C 1min, 550C 1min, 720C 2min, 720C 7min.可是做了很长一段时间了还是得不到目的条带（约500bp)，总是在300~400之间出现带，曾降低过退火温度，没有成功。这到底为什么呢？恳求各位高手的解答！！
作者: loli    时间: 2011-9-7 15:33

请教各位高手：我在做一种细胞因子的RT-PCR，根据从ncbi中查到的序列设计了引物（与参考文献中的引物序列基本相同），用Trizol抽提总RNA，然后分别用特异性引物和oligo(dT)进行反转录，再PCR。PCR参数是940C 1min, 550C 1min, 720C 2min, 720C 7min.可是做了很长一段时间了还是得不到目的条带（约500bp)，总是在300~400之间出现带，曾降低过退火温度，没有成功。这到底为什么呢？恳求各位高手的解答！！
作者: 绵绵    时间: 2011-9-7 15:45

求助各位高手：我是一名新手，课题需要扩增2000bp左右的全长cdna，从ncbi中查到cdna序列设计了引物，用Trizol抽提总RNA，使用takara的逆转录pcr试剂盒用特异性下游引物和oligo(dT)进行反转录，条件是42度1h，92度5min，而后PCR，条件是92度 1min, 60度 1min, 72度 2min,35个循环， 72度10min。经过两个多月的努力还是得不到目的条带，但bata-actin（约300bp）可以扩增出，退火温度也调过，本人实在找不到原因，请教各位高手指点一下，谢谢！！
作者: 海鸥crazy    时间: 2011-9-7 15:46

求解：用特异性下游引物和oligo(dT)进行反转录，其条件有区别吗？我昨天用特异性下游引物进行反转录，再PCR已经得到了目的条带，可是我不理解为什么用oligo(dT)不能成功呢？请教各位高手，谢谢！
作者: dior    时间: 2011-9-7 15:47

Hi all,

I am from Singapore, computer can see Chinese but cannot input Chinese characteres, so I write in English. Sorry for inconvenience.

I need to clone a long gene ~3.5kb. I extract total RNA then reverse transcibe to cDNA, then PCR with various conditions, with betaine, dmso, different mgcl2, different annealing temperature with no success, using long dna polymerase. However I can PCR Gapdh.

I doubt it is a reverse transcription problem. Can anyone suggest what to do to RT the long RNA ~3.5kb?

Did anyone have any ever add DMSO or other additive into reverst transcription?

Thanks,
作者: mogu    时间: 2011-9-7 15:48

按您说，RNA可以直接作为模板扩出目的条带。那么我以cDNA为模板扩出的条带，如何说明有无RNA为模板的影响呢？

另外，做完RT以后，RNA在溶液中还有吗？冻融cDNA几次以后，RNA为模板的可能性还存在吗？

我就是想知道，在RNA也可以扩出条带的情况下，我对cDNA需要做什么处理吗？这会影响对基因表达水平的估计吗？

谢谢！在线盼您为我解惑！
作者: 阿拉蕾    时间: 2011-9-7 15:49

it is not from genomics. think about it, if from the genomic, it should be longer than that from cDNA. it is from the RNA itself. please check my BBS in DXY. i have said that several times. the Taq has the ability to amplify directly from the RNA!
best wishes,
作者: mogu    时间: 2011-9-7 15:49

请问RT-PCR时，在无反转录酶的情况下，对照RNA也获得目的条带了。（小片断，200BP）这是怎么回事？

而引物事先已经对过，除了满足“在不同外元上“这一条件之外，其中一个引物本身还跨一个内元。即，上游引物在外元一末尾以及外元二开始部分，下游引物在外元三上面。

按理说，Genomic DNA扩增出来的条带不应该也是200bp啊！我该怎么办呢？

谢谢！

refer to
cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=67&id=166687&sty=1&tpg=1&age=-1')
作者: mogu    时间: 2011-9-7 15:50

看了你下面给我的回答，我不明白你的第二句话。
“ because for RT, u will not ampilifiy it until platue phase.”

你是指PCR的平台期才可能以RNA为模板，taq酶合成目的条带吗？为什么呢？有什么理论依据吗？

非常感谢！
作者: mogu    时间: 2011-9-7 15:50

看了你下面给我的回答，我不明白你的第二句话。
“ because for RT, u will not ampilifiy it until platue phase.”

你是指PCR的平台期才可能以RNA为模板，taq酶合成目的条带吗？为什么呢？有什么理论依据吗？

非常感谢！
作者: 阿拉蕾    时间: 2011-9-7 15:50

trace RNA, no necissary to care about it in the caculation and experiment. because for RT, u will not ampilifiy it until platue phase.
作者: 阿拉蕾    时间: 2011-9-7 15:51

Hi all,

I am from Singapore, computer can see Chinese but cannot input Chinese characteres, so I write in English. Sorry for inconvenience.

I need to clone a long gene ~3.5kb. I extract total RNA then reverse transcibe to cDNA, then PCR with various conditions, with betaine, dmso, different mgcl2, different annealing temperature with no success, using long dna polymerase. However I can PCR Gapdh.

I doubt it is a reverse transcription problem. Can anyone suggest what to do to RT the long RNA ~3.5kb?

Did anyone have any ever add DMSO or other additive into reverst transcription?

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maybe you should purchase a better rt-kit
作者: 喵咪    时间: 2011-9-7 15:51

taq酶有逆转录的功能
但是没有见过以RNA为模板进行PCR的
作者: 喵咪    时间: 2011-9-7 15:53

我是新手，最近在作rt-pcr时，我的目的基因条带出来了，但出现了一条亮度非常高的非特异性带，每次每个标本都出现。我已把镁离子浓度和退火温度做了调整，但效果不佳。引物以前用过，没有问题，pcr条件差不多也有此非特异性带，但没这么明显，这次却怎么也弱不了它。期待各位的帮助，谢谢
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回答：模板量可以适当稀释一下。
作者: 喵咪    时间: 2011-9-7 15:53

求解：用特异性下游引物和oligo(dT)进行反转录，其条件有区别吗？我昨天用特异性下游引物进行反转录，再PCR已经得到了目的条带，可是我不理解为什么用oligo(dT)不能成功呢？请教各位高手，谢谢！

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回答：不知道你用olig（dT）不能成功其结果是什么？如果是得到的非特异条带
较多，是因为应用特异性引物RT仅产生所需要的cDNA，是更为特异的pcr扩增，而
用olig（dt）则RT所有MRNA，相对会产生较多的非特异性产物。
作者: 喵咪    时间: 2011-9-7 15:54

我做RT-PCR没扩出来,PCR反应条件应该没问题,以前扩出来的,现在只是模板不同.现在高度怀疑是RNA 或逆转录的问题.不知该怎样检测逆转录是否成功?

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回答：1、通过OD260/OD280值检测你的RNA质量，或电泳RNA
2、同法可检测你的CDNA质量
作者: 小荷尖尖    时间: 2011-9-7 15:55

我想请问各位英雄：如果用同一对引物扩增不同的肿瘤细胞中同一种成分，RT-PCR结果在理论上会不会是一样的
作者: 8黑眼圈8    时间: 2011-9-7 15:55

求解：用特异性下游引物和oligo(dT)进行反转录，其条件有区别吗？我昨天用特异性下游引物进行反转录，再PCR已经得到了目的条带，可是我不理解为什么用oligo(dT)不能成功呢？请教各位高手，谢谢！

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回答：不知道你用olig（dT）不能成功其结果是什么？如果是得到的非特异条带
较多，是因为应用特异性引物RT仅产生所需要的cDNA，是更为特异的pcr扩增，而
用olig（dt）则RT所有MRNA，相对会产生较多的非特异性产物。

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可是我用oligo(dT)得到的结果仅仅是非特异性产物，并没有目的条带，所以我很迷惑，故有此疑问。
作者: 8黑眼圈8    时间: 2011-9-7 15:55

求解：用特异性下游引物和oligo(dT)进行反转录，其条件有区别吗？我昨天用特异性下游引物进行反转录，再PCR已经得到了目的条带，可是我不理解为什么用oligo(dT)不能成功呢？请教各位高手，谢谢！

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回答：不知道你用olig（dT）不能成功其结果是什么？如果是得到的非特异条带
较多，是因为应用特异性引物RT仅产生所需要的cDNA，是更为特异的pcr扩增，而
用olig（dt）则RT所有MRNA，相对会产生较多的非特异性产物。

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可是我用oligo(dT)得到的结果仅仅是非特异性产物，并没有目的条带，所以我很迷惑，故有此疑问。
作者: @木木@    时间: 2011-9-7 15:56

各位大虾好：
我提取的是小鼠肝脏的RNA，跑内参时总是跑出两条很亮的带，而且没有杂带，但其中一条不是我要的。曾怀疑是污染造成的，重做RT和PCR后仍是怎样？
谢谢各位不惜赐教！
作者: Darcy    时间: 2011-9-7 15:57

大家好，我是分子生物学方面的新手，在进行RT-PCR时，可不可以不用试剂盒提取模板，直接取血液或者尿囊液做模板！  
作者: 冷太阳    时间: 2011-9-7 15:57

我最近购产于上海生工的一瓶用于提RNA的酚氯仿异丙醇（125：24：1），pH4.5，但加入后用后只见沉淀和液相。不象用以前的别的试剂，有三层，上层水相，中间一层蛋白质，下面才是有机液体。原来我一直用promaga的，第一次用上海生工的，没有说明书，不知该如何使用，大家用起来是否这样。 有人用过吗？
作者: 小妖儿    时间: 2011-9-7 15:58

我想请教各位高手的是，在切下组织，研磨碎后，加入裂解液（变性液）后是否可以冻存，几个小时后再提RNA。我主样做主要是受时间所迫，这期间还得去做别的事。当然，按书上的做法，可以取下组织后直接放液氮冻存，但我想把组织先研磨好，因为我的组织有好几份，磨起来也要花很长时间。我的时间可以做到这一步。余下的又得另一段时间去做。那我是否可以这样做，是加了裂解液再冻，还是不加就冻起来。前提是我的组织已研磨碎了。
作者: 米米    时间: 2011-9-7 15:59

本人做一个糖皮质激素受体基因的RT-PCR已做了几个月，均无结果。很苦恼呀！

每次内参都挺好。我是做小鼠的脑组织中的，参考的是国外文献中肝细胞中的引物和反应体系，没出来！然后，改变条件，温度从40-53度，Mg2+从0.5-2.0都试过了，同样的引物已合成了几次，结果最好也不过是有点引物二聚体，大多一片空白，真不知在那些要紧环节出了问题，望各位指点！多谢！！
作者: 喵咪    时间: 2011-9-7 16:00

大家好，我是分子生物学方面的新手，在进行RT-PCR时，可不可以不用试剂盒提取模板，直接取血液或者尿囊液做模板！

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当然不行
RNA要么在细胞内要么包在病毒内
必须把它提取出来啊
作者: 胖小妮子    时间: 2011-9-7 16:00

我取卵巢癌组织做RT-PCR，但需攒到一定病例数才能做，标本如何保存才不至于影响pcr的结果呢？？
作者: 阿拉蕾    时间: 2011-9-7 16:01

我取卵巢癌组织做RT-PCR，但需攒到一定病例数才能做，标本如何保存才不至于影响pcr的结果呢？？

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卵巢癌组织切下来液氮速冻后放在-80度冰箱。问题不大。
作者: 阿拉蕾    时间: 2011-9-7 16:01

本人做一个糖皮质激素受体基因的RT-PCR已做了几个月，均无结果。很苦恼呀！

每次内参都挺好。我是做小鼠的脑组织中的，参考的是国外文献中肝细胞中的引物和反应体系，没出来！然后，改变条件，温度从40-53度，Mg2+从0.5-2.0都试过了，同样的引物已合成了几次，结果最好也不过是有点引物二聚体，大多一片空白，真不知在那些要紧环节出了问题，望各位指点！多谢！！

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可能不同组织来源的基因丰度不同，可以先去NCBI看看该基因的组织分布。我想主要是引物不对头吧，一般靠3‘端，300BP易成功，要不试试？
作者: 白鸟之翼    时间: 2011-9-7 16:02

本人做RT-PCR的时候出现了一奇怪的现象，在反转录的第一链做PCR的时候，第一次能扩出来，到第二次以后就做不出来，所有的条件都不改变，唯一的就是第一链在冰箱过了一晚上，重复了很多次都是这样，请高手指点
作者: fangxiang    时间: 2011-9-7 16:03

beacon designer , who wants its serial number
作者: 花裙子    时间: 2011-9-7 16:03

本人做RT-PCR的时候出现了一奇怪的现象，在反转录的第一链做PCR的时候，第一次能扩出来，到第二次以后就做不出来，所有的条件都不改变，唯一的就是第一链在冰箱过了一晚上，重复了很多次都是这样，请高手指点

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我也是，不知道是不是天气热的缘故，望高手指点！
作者: 麻瓜    时间: 2011-9-7 16:03

请问：我取总RNA，测得A260:A280是2.0,2.1.甚至2.3,有人说>2.3是完全降解，但我跑胶后的条带是挺好的，也RT-PCR出来了所需片段。请问比值大于2是什么原因造成的？
作者: 微笑的海豚    时间: 2011-9-7 16:04

本人做RT-PCR的时候出现了一奇怪的现象，在反转录的第一链做PCR的时候，第一次能扩出来，到第二次以后就做不出来，所有的条件都不改变，唯一的就是第一链在冰箱过了一晚上，重复了很多次都是这样，请高手指点

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我也是，不知道是不是天气热的缘故，望高手指点！

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你的模板降解了。将第一链冻在—20度冰箱试一试。应该问题不大。
作者: 花裙子    时间: 2011-9-7 16:05

可是测了OD值，并没有降解啊？
作者: 嘉年华    时间: 2011-9-7 16:06

哪位高手帮忙：
我做VEGF的RT-PCR，利用BBI公司的逆转录KIT和生工的PCR试剂盒。我逆转录用的是Oligo（dT18）做的引物，扩增的条件是：94度预变性2分钟，95度1分钟、55度1分钟、72度2分钟30个cycles，72度10分钟。扩增的应该是片断长度为400～700bp共四个产物（均是VEGF的isoforms）。电泳时发现actin能扩增出来，而目的基因没有扩增出来。反应体系按照试剂盒上的要求进行。
没有扩增出后，改变了反应条件，94度预变性2分钟，94度30秒、55度30秒、72度1分钟30个cycles，72度10分钟，结果还是没有扩出来。
不知道问题出在哪里，哪位高手请帮忙分析一下。
作者: +田田+    时间: 2011-9-7 16:06

可以调节镁离子浓度，分成1.0，1.5，2.0
调节退火温度，我认为你应该将退火温度下调
作者: 胖小妮子    时间: 2011-9-7 16:07

我的目的基因扩增出来后，为什么有一个标本跑出两条分子量大小不一的清晰地条带。由谁能够帮我解释这个奇怪的现象？！
作者: HOT兔    时间: 2011-9-7 16:07

我从卵巢癌细胞HO-8910中提rna做rt-pcr，但做了两个月了，什么也没跑出来，连条杂带都没有，请各位老师帮我分析分析。
我的引物Survivin上游引物为5’gcatgggtgccccgacgttg3’,下游引物为5’gctccggccagaggcctcaa3’。买的宝生物BcaBest的试剂盒。逆转录的条件根据试剂盒提供的，pcr时为94 30s,50 30s,72 30s,30个循环，跑电泳后，阳性对照有，但连内参都没有，是什么原因呀？
很着急，很上火
作者: HOT兔    时间: 2011-9-7 16:08

这是我的基因序列，各位帮我看看引物设计的有问题吗？
: BC034148. Homo sapiens, bac...[gi:21707886] Links

LOCUS BC034148 1643 bp mRNA linear PRI 08-JUL-2002
DEFINITION Homo sapiens, baculoviral IAP repeat-containing 5 (survivin), clone
MGC:32768 IMAGE:4656567, mRNA, complete cds.
ACCESSION BC034148
VERSION BC034148.1 GI:21707886
KEYWORDS MGC.
SOURCE Homo sapiens (human)
ORGANISM Homo sapiens
Eukaryota; Metazoa; Chordata; Craniata; Vertebrata; Euteleostomi;
Mammalia; Eutheria; Primates; Catarrhini; Hominidae; Homo.
REFERENCE 1 (bases 1 to 1643)
AUTHORS Strausberg,R.
TITLE Direct Submission
JOURNAL Submitted (02-JUL-2002) National Institutes of Health, Mammalian
Gene Collection (MGC), Cancer Genomics Office, National Cancer
Institute, 31 Center Drive, Room 11A03, Bethesda, MD 20892-2590,
USA
REMARK NIH-MGC Project URL: cuturl('http://mgc.nci.nih.gov')
COMMENT Contact: MGC help desk
Email: cgapbs-r@mail.nih.gov
Tissue Procurement: ATCC
cDNA Library Preparation: CLONTECH Laboratories, Inc.
cDNA Library Arrayed by: The I.M.A.G.E. Consortium (LLNL)
DNA Sequencing by: Sequencing Group at the Stanford Human Genome
Center, Stanford University School of Medicine, Stanford, CA 94305
Web site: cuturl('http://www-shgc.stanford.edu')
Contact: (Dickson, Mark) mcd@paxil.stanford.edu
Dickson, M., Schmutz, J., Grimwood, J., Rodriquez, A., and Myers,
R. M.
作者: HOT兔    时间: 2011-9-7 16:08

Clone distribution: MGC clone distribution information can be found
through the I.M.A.G.E. Consortium/LLNL at: cuturl('http://image.llnl.gov')
Series: IRAL Plate: 41 Row: h Column: 21.
FEATURES Location/Qualifiers
source 1..1643
/organism="Homo sapiens"
/mol_type="mRNA"
/db_xref="taxon:9606"
/clone="MGC:32768 IMAGE:4656567"
/tissue_type="Lung, mucoepidermoid carcinoma"
/clone_lib="NIH_MGC_59"
/lab_host="DH10B"
/note="Vector: pDNR-LIB"
CDS 45..473
/codon_start=1
/product="baculoviral IAP repeat-containing 5 (survivin)"
/protein_id="AAH34148.1"
/db_xref="GI:21707887"
/db_xref="LocusID:332"
/translation="MGAPTLPPAWQPFLKDHRISTFKNWPFLEGCACTPERMAEAGFI
HCPTENEPDLAQCFFCFKELEGWEPDDDPIEEHKKHSSGCAFLSVKKQFEELTLGEFL
KLDRERAKNKIAKETNNKKKEFEETAKKVRRAIEQLAAMD"
BASE COUNT 382 a 388 c 446 g 427 t
ORIGIN
1 agatttgaat cgcgggaccc gttggcagag gtggcggcgg cggcatgggt gccccgacgt
61 tgccccctgc ctggcagccc tttctcaagg accaccgcat ctctacattc aagaactggc
121 ccttcttgga gggctgcgcc tgcaccccgg agcggatggc cgaggctggc ttcatccact
181 gccccactga gaacgagcca gacttggccc agtgtttctt ctgcttcaag gagctggaag
241 gctgggagcc agatgacgac cccatagagg aacataaaaa gcattcgtcc ggttgcgctt
301 tcctttctgt caagaagcag tttgaagaat taacccttgg tgaatttttg aaactggaca
361 gagaaagagc caagaacaaa attgcaaagg aaaccaacaa taagaagaaa gaatttgagg
421 aaactgcgaa gaaagtgcgc cgtgccatcg agcagctggc tgccatggat tgaggcctct
481 ggccggagct gcctggtccc agagtggctg caccacttcc agggtttatt ccctggtgcc
541 accagccttc ctgtgggccc cttagcaatg tcttaggaaa ggagatcaac attttcaaat
601 tagatgtttc aactgtgctc ttgttttgtc ttgaaagtgg caccagaggt gcttctgcct
661 gtgcagcggg tgctgctggt aacagtggct gcttctctct ctctctctct tttttggggg
721 ctcatttttg ctgttttgat tcccgggctt accaggtgag aagtgaggga ggaagaaggc
781 agtgtccctt ttgctagagc tgacagcttt gttcgcgtgg gcagagcctt ccacagtgaa
841 tgtgtctgga cctcatgttg ttgaggctgt cacagtcctg agtgtggact tggcaggtgc
901 ctgttgaatc tgagctgcag gttccttatc tgtcacacct gtgcctcctc agaggacagt
961 ttttttgttg tgtttttttt tttttttttt ggtagatgca tgacttgtgt gtgatgagag
1021 aatggagaca gagtccccgg ctcctctact gtttaacaac atggctttct tattttgttt
作者: HOT兔    时间: 2011-9-7 16:09

1081 gaattgttaa ttcacagaat agcacaaact acaattaaaa ctaagcacaa agccattcta
1141 agtcattggg gaaacggggt gaacttcagg tggatgagga gacagaatag agtgatagga
1201 agcgtctggc agatactcct tttgccactg ctgtgtgatt agacaggccc agtgagccgc
1261 ggggcacatg ctggccgctc ctccctcaga aaaaggcagt ggcctaaatc ctttttaaat
1321 gacttggctc gatgctgtgg gggactggct gggctgctgc aggccgtgtg tctgtcagcc
1381 caaccttcac atctgtcacg ttctccacac gggggagaga cgcagtccgc ccaggtcccc
1441 gctttctttg gaggcagcag ctcccgcagg gctgaagtct ggcgtaagat gatggatttg
1501 attcgccctc ctccctgtca tagagctgca gggtggattg ttacagcttc gctggaaacc
1561 tctggaggtc atctcggctg ttcctgagaa ataaaaagcc tgtcatttca aataaaaaaa
1621 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaa
//
作者: 胖小妮子    时间: 2011-9-7 16:10

你的引物gc含量太高
另一个问题是你加反应体系的成份时是否注意到各个成份的混匀
你的tRNA是否及时进行了逆转录，或者在你做逆转录前测一测你的TRNA的浓度
作者: HOT兔    时间: 2011-9-7 16:10

我的各个成分应该是充分混匀了，提完rna立即做的,光密度比值是1.8，rna跑电泳也挺好的，可今天我把引物 跑电泳却没跑出来，是不是引物的问题
作者: 阿拉蕾    时间: 2011-9-7 16:11

要用RT－PCR在大鼠克隆一基因，人和小鼠已经有了，设计引物是否应根据人和小鼠的两端上下游和非编码区进行。应注意什么问题？
开题需要，请多指教。
作者: 桔囿    时间: 2011-9-7 16:11

各位高手，请教一个问题：目的基因单独扩，很亮；可加入内参GAPDH后，每次扩内参很亮，目的条带很弱，调整引物的量，50ul体系中GAPDH调到10pm，primer 25pm，结果差不多。我该怎么调整体系。
作者: 胖小妮子    时间: 2011-9-7 16:12

请教各位大虾：
RT-PCR后怎样半定量分析产物与内参照的比值，用什么软件？
多谢！
作者: 蝴蝶结子    时间: 2011-9-7 16:12

请问p目的基因一定要同时加入内参吗？保家基因可以分开做吗？如果两种基因的PCR条件相差很大，怎么办呢？
作者: =菓子=    时间: 2011-9-7 16:13

请问做原位杂交对石蜡切片有什么特殊要求吗？
作者: 不懂    时间: 2011-9-7 16:14

请问各位大虾肝素对PCR的结果影响大吗？最好用什么抗凝剂提取外周血单个核细胞（PBMC）进行PCR比较好？
多谢！
作者: 许愿精灵    时间: 2011-9-7 16:14

我要用RT－PCR钓一个基因，mRNA长约3kb，其间还有一个茎环结构，该如何应付？  
作者: queen    时间: 2011-9-7 16:15

我想用急性分离的细胞（数目只有几十个）做同一类型细胞的single cell RT-PCR，可以吗？
在国内有哪些机构可以做？
谢谢
作者: 大虾米    时间: 2011-9-7 16:16

目的片段最好是和管家基因分开p,虽然说服力不一定强,但是应该好跑.
作者: 阿福    时间: 2011-9-7 16:16

可以用凝胶分析系统,这是很成熟的方法.
作者: 冰激凌小姐    时间: 2011-9-7 16:18

可以用凝胶分析系统,这是很成熟的方法.

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请问是Image MASTER 吗？分析时使用DATA 中的amout 还是IOD,或是maxOD
统计时又该如何处理？烦劳大虾说详细些。多谢！
作者: 冰激凌小姐    时间: 2011-9-7 16:19

请问各位大虾肝素对PCR的结果影响大吗？最好用什么抗凝剂提取外周血单个核细胞（PBMC）进行PCR比较好？
多谢！
作者: finger    时间: 2011-9-7 16:19

请教各位高手，我需要做全血细胞的RT-PCR，可是在提RNA时就遇到了困难，我用的是TRIZOL法，结果提取完之后，肉眼可见沉淀，但是跑电泳时，只跑出来象棉花团似的并且不太亮的光团，这是怎么回事啊？是我没提出来，还是电泳有什么问题啊？
另外我想问一下，DEPC水，是如何储存？并且可以存多少天啊？
作者: 阿拉蕾    时间: 2011-9-7 16:19

是容积或密度及峰浓度都可以
作者: 米米    时间: 2011-9-7 16:20

斑竹您好:
我做PCR已经好几个月了,一直没有结果.我要阔的目的基因是大约2000bp,可是近在1500bp左右出现过较弱的条带,目的基因始终没有出现过.我该做那些改进呢?
我的循环参数是:94度30秒,50度30秒,72度2分半,35个循环.
多谢
作者: 微笑的海豚    时间: 2011-9-7 16:22

我想请教各位高手的是，在切下组织，研磨碎后，加入裂解液（变性液）后是否可以冻存，几个小时后再提RNA。我主样做主要是受时间所迫，这期间还得去做别的事。当然，按书上的做法，可以取下组织后直接放液氮冻存，但我想把组织先研磨好，因为我的组织有好几份，磨起来也要花很长时间。我的时间可以做到这一步。余下的又得另一段时间去做。那我是否可以这样做，是加了裂解液再冻，还是不加就冻起来。前提是我的组织已研磨碎了。

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我觉得你最好是将组织碾碎后立刻加入裂解液
我试过，这样放-80度冰箱可以放一个月没问题
当然前提是你要将新鲜的组织立即碾碎，然后加入裂解液立即冻存，保证细胞破裂后，RNA尽量不降解。
其实，你可以将新鲜组织放液氮中，题RNA的时候再碾碎不是很好吗？
作者: 明天的明天    时间: 2011-9-7 16:22

我在做RT-PCR时遇到一个问题
我的目的基因表达量比较低，所以模板量和循环数都要比较大
但是，在该条件下，内参就会非常的亮且宽，而且常常跑不出目的基因来
所以我想分开来跑，但是我有担心PCR条件不一样影响定量
请问各位高手有何高见？
谢谢！  
作者: 韩梅梅    时间: 2011-9-7 16:23

我是新手，正在准备作RT-PCR,看了大家的发言学到了很多东西.
作者: 韩梅梅    时间: 2011-9-7 16:24

我 是新手,正在准备做RTPCR,问各位高人几个低级问题:3月前提的RNA,放崽-80C冰箱里,用乙醇保存,现在我可不可以把乙醇蒸发,加3蒸水溶解RNA?(从1X107成纤维细胞提取)需不需要测浓度?不测可以吗?加多少水溶阿?谢谢!  
作者: 麻瓜    时间: 2011-9-7 16:24

我做的是从血清中提取丙型肝炎病毒的RNA 没有组织,做了十几次RTPCR都没有做出来,不过原因找到了,是我的胶有问题,又从垃圾堆里把以前的找出来从新跑了一下,都出来了,真是一招不慎全盘皆输啊

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能不能告诉我你是怎样从血清中提取病毒RNA的，是按照TRIZOL说明书操作的吗？谢谢！
作者: 小鼹鼠    时间: 2011-9-7 16:25

有没有那位同仁作过风疹病毒，能否介绍一下，我正准备做。万分感谢！
作者: 羊咩咩    时间: 2011-9-7 16:25

我是新手，准备用RT-PCR测肾脏内NOS（iNOS,nNOS，eNOS)的表达。请问：
1.三种NOS的序列要到哪儿去查？
2.引物可以照搬老外的吗？
3.肾脏切取保存前需要灌注吗？
4.－80度可以保存多久
谢谢
作者: 阿福    时间: 2011-9-7 16:26

请教各位高手，我需要做全血细胞的RT-PCR，可是在提RNA时就遇到了困难，我用的是TRIZOL法，结果提取完之后，肉眼可见沉淀，但是跑电泳时，只跑出来象棉花团似的并且不太亮的光团，这是怎么回事啊？是我没提出来，还是电泳有什么问题啊？
另外我想问一下，DEPC水，是如何储存？并且可以存多少天啊？

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我想可能是你的模板量多了,降低模板量试试看.
我的DEPC水就在常温下放置.只要做实验时注意别污染了就行了.
作者: 邓布利多    时间: 2011-9-7 16:26

有一个问题请教：我下载的PP,就是需要在 win.ini中加入[win32]
vspace=PU 的那个版，我在装了98和XP双系统的机子上的XP中能够***并正常使用，可是在只装了XP的机子上却无法使用，打开软件时显示“Primer Premier 5.exe 遇到问题需要关闭。我们对此引起的不便表示抱歉”，不知道是什么原因，又该怎么解决啊！
作者: 椰子叶子    时间: 2011-9-7 16:27

把正确条带切下来用胶回收后再扩增一次看有没有非特异出现，引物或其他成分中有没有混入其他东西  
作者: 喵咪    时间: 2011-9-7 16:28

能不能告诉我你是怎样从血清中提取病毒RNA的，是按照TRIZOL说明书操作的吗？谢谢！


不是的

图片附件: 53545640_snap.jpg (2011-9-7 16:28, 62.05 KB) / 该附件被下载次数 14
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=8552

作者: 喵咪    时间: 2011-9-7 16:29

有一个问题请教：我下载的PP,就是需要在 win.ini中加入[win32]
vspace=PU 的那个版，我在装了98和XP双系统的机子上的XP中能够***并正常使用，可是在只装了XP的机子上却无法使用，打开软件时显示“Primer Premier 5.exe 遇到问题需要关闭。我们对此引起的不便表示抱歉”，不知道是什么原因，又该怎么解决啊！

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你不要改这个win.ini,有时候不稳定,用算号器激活就和正版一样了啊
作者: 邓布利多    时间: 2011-9-7 16:29

可是，我现在的问题是，下载的DEMO在XP中根本就不能运行啊，又怎么激活呢？再装98吧，又得先将XP卸掉，那样许多辛辛苦苦得来的东西就丢失了。还请高手给我支支招。谢了
作者: 喵咪    时间: 2011-9-7 16:30

可是，我现在的问题是，下载的DEMO在XP中根本就不能运行啊，又怎么激活呢？再装98吧，又得先将XP卸掉，那样许多辛辛苦苦得来的东西就丢失了。还请高手给我支支招。谢了

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把它卸了我发个给你
作者: 椰子叶子    时间: 2011-9-7 16:30

重装软件，然后不要打开，直接运行win.ini进行修改
作者: 邓布利多    时间: 2011-9-7 16:31

多谢 simba 我这样试过的，没用，运行后还是显示：
错误签名：
AppName: primer premier 5.exe   AppVer: 0.0.0.0   ModName: xnmba458.dll
ModVer: 4.58.0.0   Offset: 000154fb

我又不敢将系统文件里的xnmba458.dll给删了  
作者: 细水长流    时间: 2011-9-7 16:33

大家好，我想请教一下：有哪位抽提过痰中的mRNA的？能否提供些这方面的材料？请赐教！本人万分感激！
作者: 邓布利多    时间: 2011-9-7 16:34

用TaKaRa的RNA提取试剂盒就可以了，又便宜又好用，省事.
作者: 不懂    时间: 2011-9-7 16:35

你那个survivin上下游引物的序列是哪里查来的？可以告知一下来源吗？
谢谢
作者: 跳跳糖    时间: 2011-9-7 16:35

各位好
请教一个问题,我做RT-PCR,在提取到总RNA后,逆转录之前,
我想跑一个琼脂糖电泳,检验一下RNA有没有提出.
今天刚跑完一个,第一次,只看到了泳道,没有带
请各位大侠帮忙解释一下,是何原因?
因为我在制胶和配缓冲液时所用的液体都没有进行灭RNA酶处理,
这会不会影响结果,比如把RNA 分解了?
谢谢
另外,在水溶RNA时,因为没有去离子的DEPC水,我自己用双蒸水和DEPC配置的,这会不会对RNA或电泳产生影响?
谢谢
作者: 细水长流    时间: 2011-9-7 16:36

我还想请教一下：哪儿有TaKaRa的RNA提取试剂盒购买?
作者: 冰激凌小姐    时间: 2011-9-7 16:36

用TaKaRa的RNA提取试剂盒就可以了，又便宜又好用

你是指catrimox_14吗？

具体操作步骤 能相告吗？比说明书要详细 谢谢了！
作者: 邓布利多    时间: 2011-9-7 16:37

你上 TaKaRa的网站上看一下就知道了，可以先下载说明书，详细看一下自己还需要准备什么东西，TaKaRa网站还有一个讨论区，有关TaKaRa产品的问题一般都可以很快得到回答，其他问题也可以拿到上面讨论，毕竟科研协作讨论才能出东西。
直接给TaKaRa打电话，以后你不找他们，他们也会找你了 ：）
作者: +田田+    时间: 2011-9-7 16:38

我有他们的说明书，但是太过于笼统，比如catrimox的加量问题，毫升数？
我就在大连，虽然很方便，但是得不到他们的详细步骤
作者: 飞天小鹿    时间: 2011-9-7 16:38

向各位高手请教：

如果要用RT-PCR的方法检测mRNA表达水平，那么如何彻底消除基因组DNA的污染？我提取的是细胞质RNA（kit），并用DNase处理，但还是在对照组（没有RT的PCR）扩增出了明显的条带。我想用跨内含子的引物来做PCR，这样就不用考虑基因组DNA的污染问题了。可是，我的mRNA只有一个cds, 该如何是好呢？

另外， PCR反应的循环数一般为多少才合适而不至于达到平台期呢？

谢谢
作者: 邓布利多    时间: 2011-9-7 16:40

对不起 angelmachina，我没有用过 TaKaRa 的RNA 提取试剂盒，我本来是准备买他们的来着，就上他们的网页看了看，在home page 上有广告，说是可以从许多不同来源的标本中提取RNA，我想他们一定有详细的说明书，可以打电话或EMAIL让给发一份给你。我现在用的是QIAGEN Viral Mini Kit, 该试剂盒的专利是一种硅胶柱子，可以吸附大于200bp的RNA，经过一系列洗涤步骤后用洗脱液将RNA从柱子上洗脱下来，用该试剂盒用不了一个小时搞定，唯一的缺点是比较贵，不过我们老板有钱也就无所谓了，然后用试剂盒比用 Trizol的好处是省事，不用摸条件。TaKaRa的便宜不少，可以问问看。
作者: 夕阳    时间: 2011-9-7 16:41

TaKaRa 的RNA 提取试剂盒，从动物，血细胞不同来源的标本中提取RNA，我想从霉菌或真菌中提取总RNA，结果不敢确定，如果老兄你的Kit有或者你知道其它kit此优点的话麻烦相告一下，先不考虑价格。thanks
作者: 果冻也酸    时间: 2011-9-7 16:44

请教版主和各位大侠，有没有人用过生工的UNIQ-10柱式总RNA抽提试剂盒？
我们用来提取心肌组织的总RNA，每次都会遇到这样的问题：
1. 加入450μL的RLT Solution 到匀浆的组织中，会臭得不得了！是RLT Solution 本身就这样臭还是RLT Solution 不能加入匀浆管中挤压？

2. 按盒子上的要求 “匀浆后，将700μl的样品及其可能出现的沉淀一起加到套放于2ml收集管的UNIQ-10柱中，8,000rpm室温离心1分钟，再倒去收集管中的废液，加入500μl的RW Solution到UNIQ-10柱，再离心..."。 但是“8,000rpm室温离心1分钟“根本不能将柱中的液体大部分离心到收集管中，以至于后面的500μl的RW Solution根本加不进去，我们检查过并没有组织将柱子的膜堵住，但液体就是离不出去。提取最后跑胶见不到RNA。

现在找不到原因，很着急，急急急！！！
望哪位用过这个试剂盒的大侠，可否给我们点意见？？
谢谢了！
作者: 邓布利多    时间: 2011-9-7 16:45

TaKaRa 的RNA 提取试剂盒，从动物，血细胞不同来源的标本中提取RNA，我想从霉菌或真菌中提取总RNA，结果不敢确定，如果老兄你的Kit有或者你知道其它kit此优点的话麻烦相告一下，先不考虑价格。thanks

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你可以用QIAGEN的RNAeasy Mini Kit, 到广州基因公司订购，电话我一时找不到，你可以上基因公司的网站，给他们发一EMAIL，让他们先将 protocol发给你，仔细看一下自己需要准备什么，以免kit到
作者: 邓布利多    时间: 2011-9-7 16:48

TaKaRa 的RNA 提取试剂盒，从动物，血细胞不同来源的标本中提取RNA，我想从霉菌或真菌中提取总RNA，结果不敢确定，如果老兄你的Kit有或者你知道其它kit此优点的话麻烦相告一下，先不考虑价格。thanks

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你可以用QIAGEN的RNAeasy Mini Kit, 到广州基因公司订购，电话我一时找不到，你可以上基因公司的网站，给他们发一EMAIL，让他们先将 protocol发给你，仔细看一下自己需要准备什么，以免kit到了后又缺这个缺那个，又得等时间，好像用这个 kit 需要自己准备 β－巯基乙醇，其他都是常规的东西。
作者: 邓布利多    时间: 2011-9-7 16:48

TaKaRa 的RNA 提取试剂盒，从动物，血细胞不同来源的标本中提取RNA，我想从霉菌或真菌中提取总RNA，结果不敢确定，如果老兄你的Kit有或者你知道其它kit此优点的话麻烦相告一下，先不考虑价格。thanks

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你可以用QIAGEN的RNAeasy Mini Kit, 到广州基因公司订购，电话我一时找不到，你可以上基因公司的网站，给他们发一EMAIL，让他们先将 protocol发给你，仔细看一下自己需要准备什么，以免kit到了后又缺这个缺那个，又得等时间，好像用这个 kit 需要自己准备 β－巯基乙醇，其他都是常规的东西。
作者: 椰子叶子    时间: 2011-9-7 16:49

向各位高手请教：
我提取的是细胞质RNA（kit），并用DNase处理，但还是在对照组（没有RT的PCR）扩增出了明显的条带

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1 可能性包括：DNase处理的不够，可加长作用时间试试，一般在RNA电泳时就可以看出DNA污染的程度了;PCR体系是否污染（阴性对照是阴性吗）
2 PCR的圈数一般在25－30个cycle，但不固定，你要做个不同cycle的PCR，确定指数增长期的圈数。
作者: 邓布利多    时间: 2011-9-7 16:50

谢谢您发给我的PP，很遗憾，我安装运行后还是显示：
错误签名：
AppName: primer premier 5.exe AppVer: 0.0.0.0 ModName: xnmba458.dll
ModVer: 4.58.0.0 Offset: 000154fb
我是一点招都没有了。
作者: 喵咪    时间: 2011-9-7 16:51

你是不是改过那个.ini的文件啊
作者: 邓布利多    时间: 2011-9-7 16:51

你是不是改过那个.ini的文件啊

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是的，以前是改过，但是我卸载时卸得很干净，又重新启动了。可是我将加入的[win32] vspace=PU删除后还是不行啊。
作者: 喵咪    时间: 2011-9-7 17:00

你把PP卸载然后再搜索这个文件
看看还在不在
在就把他删了
再重新安装
作者: 假小子    时间: 2011-9-7 17:01

请教各位，逆转录后的单链cDNA好象不太稳定，冻融几次就降解了，各位有没有什么好的办法保存，本人需要逆转录后做很多引物对的检测！谢谢！
作者: 邓布利多    时间: 2011-9-7 17:01

一般来说成了cDNA 就不用太担心啦，你可以将cDNA分成几个小管保存啊，不必每次拿出来全部冻融。
作者: 阿拉蕾    时间: 2011-9-7 17:01

请问：
1 引物的特异退火温度怎样设定？可以根据gc 和at含量算出吗？可以用引物报告单上的Tm值吗？
2 PCR时20微升体系中cDNA应加多少比较合适？MgCl2应加多少？各个成分的量有无确定标准？
3 PCR结果跑电泳，actin有，但跑不出目的条带，有几种原因？与cDNA的量少有关吗？Mg离子太多是否会抑制Taqase的活性？

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1、引物的特异退火温度可以算出：即引物报告单上的Tm值减区2-5度。而Tm值的计算公式为：（G+C）*4+（A+T）*2，其实报告单上的Tm值就是这样算出的。
2、PCR时20微升体系中cDNA一般加3微升。20微摩尔的MgCl2加1,5微升。
作者: 麻瓜    时间: 2011-9-7 17:02

实验目的：克隆一种双链双节段病毒（RNA病毒）的其中一个节段基因组，大小约2.8kb。
实验方案：先用蛋白酶K法抽提病毒的基因组（细胞毒超离纯化得到病毒），然后使用RT-PCR方法获得目的片段，再把目的片段与T-easy vector相连，转化TOP10感受态细胞，用蓝/白斑筛选阳性克隆，然后用电泳、PCR、酶切等方法鉴定重组。
实验结果：
1.抽提病毒病毒后，普通gel电泳可见两条靠的很近的带子（两个片段分别是3kb，2.8kb）。
2.RT-PCR后电泳结果可见在Marker3.0kb水平的地方有比较弱的条带，割胶回收后与Teasy连接后转化长了十几个白斑。挑斑鉴定重组时，质粒电泳初步筛选可见有高出蓝斑的克隆，将这些克隆进行PCR和酶切却没有目的带子。
问题是：明明PCR有条带，为什么连接后连白斑也是空载体的大小？即使我的PCR产物量不大，我想多少都应该连上一些，为什么难得的几个稍高一点的质粒却连上了别的东西？
我已经做了很多次的RT-PCR及这种连接转化鉴定过程了，结果很相似，都是有白斑鉴定结果却不对，我已经花了将近四个月在这里了，好郁闷哦，钱花了不少，一点结果都没有，时间浪费了更是让我难过（一个国家重点项目，年终要小结的，可是一点东西都没出来，很急啊），恳请各位高手给我指点迷津，让我早点走出迷宫，在此先谢过大家！！！
作者: 小米虫子    时间: 2011-9-7 17:03

老板让我作半定量PCR，可是连他也不知道该怎么做，我应该是全实验室第一个开始做这个的把！所以，第一个遇到的问题就不知道该怎么办了，半定量的时候模板的量是怎么定的呢？是不是一定要从cDNA的量来定？那应该怎么做呢？不怕在检测cDNA量的时候害的它们都降解么？（虽然不是RNA，是不是也会降解亚？）
请教大家，多谢了
作者: 如影随形    时间: 2011-9-7 17:03

我在做HCV的逆转录，引物设计的目的片断是三百多bp，但是pcr扩增出来的片断都是一百左右的，我的引物有16对，每对扩增出来都是这么大，我反复做都没有发现原因，请各位高手帮帮我，我实在是没有办法了，谢谢大家了。
作者: 阿拉蕾    时间: 2011-9-7 17:04

不知道你扩增出来的约100bp的PCR片段是小于100还是大于100，要是小于100bp的，而且是像RNA那样一大团的话，可能是形成了引物二聚体的缘故。要是大于100bp的话，我想你应该再摸索PCR条件，比如退火温度，各种试剂的浓度等，实在不行，你要从RT中寻找原因了（是不是RNA抽提时基因组断裂？）。另请问为什么要设计16对引物？你反复做是什么概念？是用不同引物还是单纯的重复，还是PCR条件的摸索？你是不是看看已有的参考文献，或在NCBI中把已报导的序列调出来，分析一下二级结构，看是不是有特殊的二级结构存在？另问你的RT kit用了哪种的？要是有复杂结构的话，你最好用活性温度高点的反转录酶。
作者: 喵咪    时间: 2011-9-7 17:06

我也做HCV RTPCR
把你的步骤详细说说
作者: 喵咪    时间: 2011-9-7 17:06

请教版主和各位大侠，有没有人用过生工的UNIQ-10柱式总RNA抽提试剂盒？
2. 按盒子上的要求 “匀浆后，将700μl的样品及其可能出现的沉淀一起加到套放于2ml收集管的UNIQ-10柱中，8,000rpm室温离心1分钟，再倒去收集管中的废液，加入500μl的RW Solution到UNIQ-10柱，再离心..."。 但是“8,000rpm室温离心1分钟“根本不能将柱中的液体大部分离心到收集管中，以至于后面的500μl的RW Solution根本加不进去，我们检查过并没有组织将柱子的膜堵住，但液体就是离不出去。提取最后跑胶见不到RNA。

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我用过生工的UNIQ-10柱式总RNA抽提试剂盒，你用的那是RNA 抽提纯化试剂盒，有点区别。你可以将离心速度加快或者是时间延长一点，说明书上写的并不是完全绝对的。
作者: 速冻虾米    时间: 2011-9-7 17:07

我用的是V-gene的试剂盒提的RNA，我扩出来的片断大于100bp，我用16对不同的引物扩增，在扩增时我用的退火温度时54度，引物设计时退火温度是59度，我提的RNA有四份，都做了RT-PCR，扩增出来的片断大小都在100－200之间。
作者: 喵咪    时间: 2011-9-7 17:08

提取HCV的RNA可以用TRIZOL,不麻烦也很便宜,如果你要具体步骤说一声
你的引物是你设计的吗
HCV容易变易
不知道你的引物在哪个区
是不是你的引物的特异度不够
你可以提高退火温度试试
作者: 蓝蜗牛    时间: 2011-9-7 17:08

请教各位大虾,我从血清中提HCV的RNA,比色A260/A280比值接近2,但跑胶却没有条带,这是怎么回事啊?
作者: 速冻虾米    时间: 2011-9-7 17:09

我用的引物不是我设计的，所以在哪个区我也不知道。TRIZE是试剂盒吗，效果如何，有具体步骤的话给我一份，大概要多长时间才能完成RNA的抽提？
作者: 喵咪    时间: 2011-9-7 17:09

我用的引物不是我设计的，所以在哪个区我也不知道。TRIZE是试剂盒吗，效果如何，有具体步骤的话给我一份，大概要多长时间才能完成RNA的抽提？

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图片附件: 56874559_snap.jpg (2011-9-7 17:10, 62.05 KB) / 该附件被下载次数 12
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=8553

作者: 喵咪    时间: 2011-9-7 17:10

是TRIZOL 写错了
这个步骤是有来历的
左上是NaAC的配置方法
作者: 椰子叶子    时间: 2011-9-7 17:10

逆转录-聚合酶链反应 (Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction，RT-PCR)的原理是：提取组织或细胞中的总RNA，以其中的mRNA作为模板，采用Oligo（dT）或随机引物利用逆转录酶反转录成cDNA。再以cDNA为模板进行PCR扩增，而获得目的基因或检测基因表达。RT-PCR使RNA检测的灵敏性提高了几个数量级，使一些极为微量RNA样品分析成为可能。该技术主要用于：分析基因的转录产物、获取目的基因、合成cDNA探针、构建RNA高效转录系统。
一、反转录酶的选择
1． Money 鼠白血病病毒（MMLV）反转录酶：有强的聚合酶活性，RNA酶H活性相对较弱。最适作用温度为37℃。
2． 禽成髓细胞瘤病毒（AMV）反转录酶：有强的聚合酶活性和RNA酶H活性。最适作用温度为42℃。
3．Thermus thermophilus、Thermus flavus等嗜热微生物的热稳定性反转录酶：在Mn2+存在下，允许高温反转录RNA，以消除RNA模板的二级结构。
4．MMLV反转录酶的RNase H-突变体：商品名为SuperScript 和SuperScriptⅡ。此种酶较其它酶能多将更大部分的RNA转换成cDNA，这一特性允许从含二级结构的、低温反转录很困难的mRNA模板合成较长cDNA。
二、合成cDNA引物的选择
1． 随机六聚体引物：当特定mRNA由于含有使反转录酶终止的序列而难于拷贝其全长序列时，可采用随机六聚体引物这一不特异的引物来拷贝全长mRNA。用此种方法时，体系中所有RNA分子全部充当了cDNA第一链模板，PCR引物在扩增过程中赋予所需要的特异性。通常用此引物合成的cDNA中96%来源于rRNA。
2． Oligo(dT)：是一种对mRNA特异的方法。因绝大多数真核细胞mRNA具有3’端Poly(A+)尾，此引物与其配对，仅mRNA可被转录。由于Poly(A+)RNA仅占总RNA的1-4%，故此种引物合成的cDNA比随机六聚体作为引物和得到的cDNA在数量和复杂性方面均要小。
作者: 椰子叶子    时间: 2011-9-7 17:11

3． 特异性引物：最特异的引发方法是用含目标RNA的互补序列的寡核苷酸作为引物，若PCR反应用二种特异性引物，第一条链的合成可由与mRNA 3’端最靠近的配对引物起始。用此类引物仅产生所需要的cDNA，导致更为特异的PCR扩增。
二、 试剂准备
1．RMA提取试剂
2．第一链cDNA合成试剂盒
3．dNTPmix：含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2mM
4．Taq DNA聚合酶
三、操作步骤
1. 总RNA的提取：见相关内容。
2. cDNA第一链的合成：目前试剂公司有多种cDNA第一链试剂盒出售，其原理基本相同，但操作步骤不一。现以GIBICOL公司提供的SuperScriptTM Preamplification System for First Strand cDNA Synthesis 试剂盒为例。
（1）在0.5ml微量离心管中，加入总RNA 1-5μg，补充适量的DEPC H2O使总体积达11μl。在管中加10μM Oligo（dT）12-18 1μl，轻轻混匀、离心。
（2）70℃加热10min，立即将微量离心管插入冰浴中至少1min。
然后加入下列试剂的混合物：
10×PCR buffer 2μl
25mM MgCl2 2μl
10mM dNTPmix 1μl
0.1M DTT 2μl
轻轻混匀，离心。42℃孵育2-5min。
（3）加入SuperscriptⅡ1μl ，在42℃水浴中孵育50min。
（4）于70℃加热15min以终止反应。
（5）将管插入冰中，加入RNase H 1μl ，37℃孵育20min，降解残留的RNA。-20℃保存备用。
作者: 椰子叶子    时间: 2011-9-7 17:12

3．PCR：
（1）取0.5ml PCR管，依次加入下列试剂：
第一链cDNA 2μl
上游引物（10pM） 2μl
下游引物（10pM） 2μl
dNTP(2mM) 4μl
10×PCR buffer 5μl
Taq 酶（2u/μl） 1μl
（２） 加入适量的ddH2O，使总体积达50μl。轻轻混匀，离心。
（３） 设定PCR程序。在适当的温度参数下扩增28-32个循环。为了保证实验结果的可靠与准确，可在PCR扩增目的基因时，加入一对内参（如G3PD）的特异性引物，同时扩增内参DNA，作为对照。
（４） 电泳鉴定：行琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下观察结果。
（５） 密度扫描、结果分析：采用凝胶图像分析系统，对电泳条带进行密度扫描。
四、注意事项
1． 在实验过程中要防止RNA的降解，保持RNA的完整性。在总RNA的提取过程中，注意避免mRNA的断裂。
2． 为了防止非特异性扩增，必须设阴性对照。
3． 内参的设定：主要为了用于靶RNA的定量。常用的内参有G3PD（甘油醛-3-磷酸脱氢酶）、β-Actin（β-肌动蛋白）等。其目的在于避免RNA定量误差、加样误差以及各PCR反应体系中扩增效率不均一各孔间的温度差等所造成的误差。
4． PCR不能进入平台期，出现平台效应与所扩增的目的基因的长度、序列、二级结构以及目标DNA起始的数量有关。故对于每一个目标序列出现平台效应的循环数，均应通过单独实验来确定。
5． 防止DNA的污染：
（１） 采用DNA酶处理RNA样品。
（２） 在可能的情况下，将PCR引物置于基因的不同外显子，以消除基因和mRNA的共线性。
作者: 蒲公英    时间: 2011-9-7 17:13

请教各位前辈，我做RT-PCR做到悲痛欲绝，肠断无泪。请各位大侠帮我分析。我从培养细胞中提RNA，RNA电泳3条带清晰，比例均可。测RNA浓度，在0.5到3之间，用AMV及随机引物，37度1小时做RT， 以GAPDH（鼎国，400多BP）为内参做PCR，目的基因片段为584BP，反复做，目的基因及内参均未扩出，但可见引物二聚体，请问，那一步出问题？RT还是PCR？是否要换用MMLV（但MMLV扩长片段，我的基因是一短片段），随机引物与OLIGDT15或18所需RT温度是否不同？用随机引物需37度1小时，用OLIGDT15或18需42度1小时？
作者: 椰子叶子    时间: 2011-9-7 17:13

RNA操作中的一般要求

在所有RNA实验中，最关键的因素是分离得到全长的RNA。而实验失败的主要原因是核糖核酸酶（RNA酶）的污染。由于RNA酶广泛存在而稳定，一般反应不需要辅助因子。因而RNA制剂中只要存在少量的RNA酶就会引起RNA在制备与分析过程中的降解，而所制备的RNA的纯度和完整性又可直接影响RNA分析的结果，所以RNA的制备与分析操作难度极大。
在实验中，一方面要严格控制外源性RNA酶的污染；另一方面要最大限度地抑制内源性的RNA酶。RNA酶可耐受多种处理而不被灭活，如煮沸、高压灭菌等。
外源性的RNA酶存在于操作人员的手汗、唾液等，也可存在于灰尘中。在其它分子生物学实验中使用的RNA酶也会造成污染。这些外源性的RNA酶可污染器械、玻璃制品、塑料制品、电泳槽、研究人员的手及各种试剂。而各种组织和细胞中则含有大量内源性的RNA酶。
一、 防止RNA酶污染的措施
1. 所有的玻璃器皿均应在使用前于180℃的高温下干烤6hr或更长时间。
2. 塑料器皿可用0.1% DEPC水浸泡或用氯仿冲洗（注意：有机玻璃器具因可被氯仿腐蚀，故不能使用）。
3. 有机玻璃的电泳槽等，可先用去污剂洗涤，双蒸水冲洗，乙醇干燥，再浸泡在3% H2O2 室温10min，然后用0.1% DEPC水冲洗，晾干。
4. 配制的溶液应尽可能的用0.1% DEPC，在37℃处理12hr以上。然后用高压灭菌除去残留的DEPC。不能高压灭菌的试剂，应当用DEPC处理过的无菌双蒸水配制，然后经0.22μm滤膜过滤除菌。
5. 操作人员戴一次性口罩、帽子、手套，实验过程中手套要勤换。
6. 设置RNA操作专用实验室，所有器械等应为专用。
二、常用的RNA酶抑制剂
1. 焦磷酸二乙酯（DEPC）：是一种强烈但不彻底的RNA酶抑制剂。它通过和RNA酶的活性基团组氨酸的咪唑环结合使蛋白质变性，从而抑制酶的活性。
2. 异硫氰酸胍：目前被认为是最有效的RNA酶抑制剂，它在裂解组织的同时也使RNA酶失活。它既可破坏细胞结构使核酸从核蛋白中解离出来，又对RNA酶有强烈的变性作用。
3. 氧钒核糖核苷复合物：由氧化钒离子和核苷形成的复合物，它和RNA酶结合形成过渡态类物质，几乎能完全抑制RNA酶的活性。
4. RNA酶的蛋白抑制剂（RNasin）：从大鼠肝或人胎盘中提取得来的酸性糖蛋白。RNasin是RNA酶的一种非竞争性抑制剂，可以和多种RNA酶结合，使其失活。
5. 其它：SDS、尿素、硅藻土等对RNA酶也有一定抑制作用。
作者: 椰子叶子    时间: 2011-9-7 17:14

mRNA的分离与纯化
真核细胞的mRNA分子最显著的结构特征是具有5’端帽子结构（m7G）和3’端的Poly(A)尾巴。绝大多数哺乳类动物细胞mRNA的3’端存在20-30个腺苷酸组成的Poly（A）尾，通常用Poly（A+）表示。这种结构为真核mRNA的提取，提供了极为方便的选择性标志，寡聚（dT）纤维素或寡聚（U）琼脂糖亲合层析分离纯化mRNA的理论基础就在于此。
mRNA的分离方法较多，其中以寡聚（dT）-纤维素柱层析法最为有效，已成为常规方法。此法利用mRNA 3’末端含有Poly（A+）的特点，在RNA流经寡聚（dT）纤维素柱时，在高盐缓冲液的作用下，mRNA被特异地结合在柱上，当逐渐降低盐的浓度时或在低盐溶液和蒸馏水的情况下，mRNA被洗脱，经过两次寡聚（dT）纤维柱后，即可得到较高纯度的mRNA。
寡聚(dT)纤维素柱纯化mRNA
一、试剂准备
1．3M醋酸钠（pH 5.2）
2．0.1M NaOH
3．1×上样缓冲液：20mM Tris-HCl(pH 7.6)；0.5M NaCl；1M EDTA（pH 8.0）；0.1%SLS(十二烷基氨酸钠。配制时可先配制Tris-HCl(pH 7.6)、NaCl、EDTA（pH 8.0）的母液，经高压消毒后按各成分确切含量，经混合后再高压消毒，冷却至65℃时，加入经65℃温育（30min）的10%SLS至终浓度为0.1%。
4．洗脱缓冲液：10mM Tris-HCl(pH 7.6)；1mM EDTA(pH 8.0)；0.05% SDS
5．无水乙醇、70%乙醇
6．DEPC
作者: 椰子叶子    时间: 2011-9-7 17:14

二、操作步骤
1．将0.5-1.0g寡聚（dT）-纤维悬浮于0.1M的NaOH溶液中。
2．用DEPC处理的1ml注射器或适当的吸管，将寡聚（dT）-纤维素装柱0.5-1ml，用3倍柱床体积的DEPC H2O洗柱。
3．使用1×上样缓冲液洗柱，直至洗出液pH值小于8.0。
4．将RNA溶解于DEPC H2O中，在65℃中温育10min左右，冷却至室温后加入等体2×上样缓冲液，混匀后上柱，立即收集流出液。当RNA上样液全部进入柱床后，再用1×上样缓冲液洗柱，继续收集流出液。
5．将所有流出液于65℃加热5min，冷却至室温后再次上柱，收集流出液。
6．用5-10倍柱床体积的1×上样缓冲液洗柱，每管1ml分部收集，OD260测定RNA含量。前部分收集管中流出液的OD260值很高，其内含物为无Poly(A)尾的RNA。后部分收集管中流出液的OD260值很低或无吸收。
7．用2-3倍柱容积的洗脱缓冲液洗脱Poly(A+)RNA，分部收集，每部分为1/3-1/2柱体积。
8．OD260测定Poly(A+)RNA分布，合并含Poly(A+)RNA的收集管，加入1/10体积3M NaAc（pH5.2）、2.5倍体积的预冷无水乙醇，混匀，-20℃放置30min。
9．4℃离心，10000g×15min，小心吸弃上清。用70%乙醇洗涤沉淀。[注意：此时Poly(A+)RNA的沉淀往往看不到]。4℃离心，10000g×5min，弃上清，室温晾干。
10. 用适量的DEPC H2O溶解RNA。
三、注意事项
1．整个实验过程必须防止Rnase的污染。
2．步骤（4）中将RNA溶液置65℃中温育然后冷却至室温再上样的目的有两个，一个是破坏RNA的二级结构，尤其是mRNA Poly(A+)尾处的二级结构，使Poly(A+)尾充分暴露，从而提高Poly(A+)RNA的回收率；另一个目的是能解离mRNA与rRNA的结合，否则会导致rRNA的污染。所以此步骤不能省略。
3．十二烷基肌氨酸钠盐在18℃以下溶解度下降，会阻碍柱内液体流动，若室温低于18℃最好用LiCl替代NaCl。
4．寡聚（dT）-纤维素柱可在4℃贮存，反复使用。每次使用前应该依次用NaOH、灭菌 ddH2O、上样缓冲液洗柱。
5．一般而言，107哺乳动物培养细胞能提取1-5μg Poly(A+)RNA，约相当于上柱总RNA量的1%-2%。
作者: 椰子叶子    时间: 2011-9-7 17:14

RNA酶保护试验((RNase Protection Assay,RPA)是通过液相杂交的方式,用反义RNA探针与样品杂交，以检测RNA表达的技术。与Northern杂交和RT-PCR比较，RPA有以下几个优点：
1． 检测灵敏度比Northern杂交高。由于Northern杂交步骤中转膜和洗膜都将造成样品和探针的损失，使灵敏度下降，而RPA将所有杂交体系进行电泳，故损失小，提高了灵敏度。
2． 由于PCR扩增过程中效率不均一和反应“平台”问题，基于PCR产物量进行分析所得数据的可靠性将下降，而RPA没有扩增过程，因此，分析的数据真实性较高。
3． 由于与反义RNA探针杂交的样品RNA仅为该RNA分子的部分片段，因此，部分降解的RNA样品仍可进行分析。
4． 步骤较少，耗时短。与Northern杂交相比，省去了转膜和洗膜的过程。
5． RNA-RNA杂交体稳定性高，无探针自身复性问题，无须封闭。
6． 一个杂交体系中可同时进行多个探针杂交，无竞争性问题。
7． 检测分子长度可以任意设置，灵活性大。
RPA的缺点是需要同位素标记探针。
一、试剂准备
1． GACU POOL：取100mM ATP、CTP、GTP各2.78μl、100mM UTP 0.06μl，加DEPC H2O至100μl。
2. 杂交缓冲液IPES 0.134g、0.5M EDTA（pH8.0）20μl、5M NaCl 0.8ml、甲酰胺8ml，加DEPC H2O至10ml。
3. RNase消化液：5M NaCl 120μl、1M Tris-HCl(pH7.4) 20μl、0.5M EDTA（pH8.0）20μl、RNase A(10mg/ml) 8μl、RNase T1(250U/μl) 1μl，加DEPC H2O至2ml
作者: 椰子叶子    时间: 2011-9-7 17:15

二、操作步骤
1．反义RNA可由含T7或SP6启动子的重组质粒为模板制备，也可以用含启动子的PCR产物为模板制备，本文介绍后者。
（1）设计含T7启动子的PCR引物
由于PCR产物将作为合成反义RNA的模板，所以一对引物中的下游引物5’-端要含T7启动子序列:

T7启动子序列为：5’-TAATACGACTCACTATAGGG

　

引物设计的其他要求与一般PCR引物的设计相同。PCR产物的长度决定了反义RNA探针的长度，具体设计时可考虑100-400bp长。最好采用巢式PCR，即先扩增出一较长的片段，再以该片段为模板扩增出较短的片段，以保证探针的特异性，如下图所示：



上游引物

下游引物Ⅱ T7 启动子序列

下游引物Ⅰ
作者: 椰子叶子    时间: 2011-9-7 17:15

（2）PCR

先用上游引物和下游引物Ⅰ进行PCR，再以PCR 产物为模板,用上游引物和下游引物Ⅱ-T7进行二次PCR(具体操作参见PCR章节)。

（3）探针合成标记与纯化

在0.5ml 离心管中加入下列试剂：

RNasin （40U/μl） 0.5μl

GACU POOL GAC

（含GTP、CTP、ATP各2.75 mM,UTP 61μM） 2μl

[α-32P]UTP(10μCi/μl) 2.5μl

DTT (二硫苏糖醇，0.1M) 1μl

5×转录 buffer 2μl

模板（50ng/μl） 1μl

T7 RNA 聚合酶 (15U) 1μl

混合后，短暂离心，37OC保温1hr。

加入DNaseⅠ（10U/μl）1μl, 37OC 15min, 然后75 OC 10min以灭活DNAseⅠ和T7 RNA 聚合酶。

加入：饱和酚 50μl

氯仿 50μl

酵母tRNA（2μg/μl） 4μl

DEPC H2O 100μl
作者: 椰子叶子    时间: 2011-9-7 17:15

室温下充分混匀，离心10000g×2min。取上层液置另一0.5 ml离心管中，加入100μl氯仿，混匀，离心10000g×2min。将上层液转移至另一0.5ml 离心管中，再加入3M NaAc 10μl、预冷无水乙醇250μl，混匀后，-20OC静置30min。4OC离心13500g×10min。弃上清液，沉淀用75%乙醇100μl洗涤，4OC离心13500g×2min, 弃上清液。室温下挥发残留乙醇。加入50μl杂交缓冲液溶解沉淀，4OC下保存待用。可用尿素-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测探针质量。（参见本节电泳步骤）。

2．杂交

（1） RNA提取后溶解在杂交缓冲液中，浓度为1μg/μl。

（2）取8μl RNA加入1-3μl探针（根据探针检测结果调整）于0.5ml 离心管中。

（2） 80OC保温2min，然后40-45OC下杂交12-18hr。

3. 消化

(1) 杂交管于37 OC保温15min，加入RNase消化液，37 OC保温30min。

(2) 加入10%SDS 10μl、10μg/μl蛋白酶K 20μl，混匀，37 OC保温10min。

(3) 加入65μl饱和酚和65μl氯仿，混匀，室温离心，10000g×2min。

(4) 转移上层液到另一0.5离心管中，加入10μl酵母tRNA和3M NaAc 15μl，再加入200μl异丙醇，混匀后，置-20OC 30min，4 OC离心,135000g×10min。
作者: 椰子叶子    时间: 2011-9-7 17:16

(5) 弃上清液，室温下挥发乙醇，加入5-8μl上样缓冲液溶解沉淀。

4、电泳与放射自显影

（1）配制凝胶：(50ml)

40%丙烯酰胺-亚甲双丙烯酰胺（19：1） 6.25ml

5×TBE 10ml

尿素 24g

加H2O至50ml

溶解后加入25%过硫酸胺50μl，TEMED 50μl，混匀，注入电泳槽中，插入梳，待胶凝固。

（2）预电泳

以1×TBE为上下槽电泳缓冲液，加上电压后进行预电泳，如果用测序电泳装置，电压应达2000v以上，功率设定为100w，温度设为50 OC。待胶板温度达50 OC时，暂停电泳，准备加样。

（3）加样

将已溶解在加样缓冲液中的样品80 OC加热2min，立即加样到胶孔中，电泳1-2hr。（电泳条件同预电泳）。

（3） 电泳结束后，打开胶板，用滤纸取下胶，覆上一层保鲜膜，放置于暗盒中，暗室红光下，压上一张X片，盖上暗盒，-70OC曝光1-3天。暴光结束后，将X光片显影、定影、水洗、晾干。
作者: 椰子叶子    时间: 2011-9-7 17:16

三、注意事项



1．本实验大部分为RNA操作，注意RNA酶的污染。

2．RNase消化液消化未杂交的单链RNA和探针RNA，当探针与样品之间有碱基错配时，错配位点也将被消化，因此会产生片段较小的杂交片段。因此进行PCR时，采取尽量减少错配的措施。

3、 同位素对RNA合成有一定影响，有时会产生非全长的探针。因此，标记时间不宜过长。

4、 RNase消化液有时会产生过度消化而无检测信号，可以将消化液稀释10-100倍后使用。
作者: fangxiang    时间: 2011-9-7 17:17

请问，你那个survivin上下游引物的序列是哪里查来的？可以告知一下来源吗？
谢谢

对不起，最近忙实验，没看到。
我是在基因库中查的
作者: fangxiang    时间: 2011-9-7 17:17

逆转录-聚合酶链反应 (Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction，RT-PCR)的原理是：提取组织或细胞中的总RNA，以其中的mRNA作为模板，采用Oligo（dT）或随机引物利用逆转录酶反转录成cDNA。再以cDNA为模板进行PCR扩增，而获得目的基因或检测基因表达。RT-PCR使RNA检测的灵敏性提高了几个数量级，使一些极为微量RNA样品分析成为可能。该技术主要用于：分析基因的转录产物、获取目的基因、合成cDNA探针、构建RNA高效转录系统。
一、反转录酶的选择
1． Money 鼠白血病病毒（MMLV）反转录酶：有强的聚合酶活性，RNA酶H活性相对较弱。最适作用温度为37℃。
2． 禽成髓细胞瘤病毒（AMV）反转录酶：有强的聚合酶活性和RNA酶H活性。最适作用温度为42℃。
3．Thermus thermophilus、Thermus flavus等嗜热微生物的热稳定性反转录酶：在Mn2+存在下，允许高温反转录RNA，以消除RNA模板的二级结构。
4．MMLV反转录酶的RNase H-突变体：商品名为SuperScript 和SuperScriptⅡ。此种酶较其它酶能多将更大部分的RNA转换成cDNA，这一特性允许从含二级结构的、低温反转录很困难的mRNA模板合成较长cDNA。
二、合成cDNA引物的选择
1． 随机六聚体引物：当特定mRNA由于含有使反转录酶终止的序列而难于拷贝其全长序列时，可采用随机六聚体引物这一不特异的引物来拷贝全长mRNA。用此种方法时，体系中所有RNA分子全部充当了cDNA第一链模板，PCR引物在扩增过程中赋予所需要的特异性。通常用此引物合成的cDNA中96%来源于rRNA。
2． Oligo(dT)：是一种对mRNA特异的方法。因绝大多数真核细胞mRNA具有3’端Poly(A+)尾，此引物与其配对，仅mRNA可被转录。由于Poly(A+)RNA仅占总RNA的1-4%，故此种引物合成的cDNA比随机六聚体作为引物和得到的cDNA在数量和复杂性方面均要小。
3． 特异性引物：最特异的引发方法是用含目标RNA的互补序列的寡核苷酸作为引物，若PCR反应用二种特异性引物，第一条链的合成可由与mRNA 3’端最靠近的配对引物起始。用此类引物仅产生所需要的cDNA，导致更为特异的PCR扩增。
二、 试剂准备
1．RMA提取试剂
2．第一链cDNA合成试剂盒
3．dNTPmix：含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2mM
4．Taq DNA聚合酶
三、操作步骤
1. 总RNA的提取：见相关内容。
2. cDNA第一链的合成：目前试剂公司有多种cDNA第一链试剂盒出售，其原理基本相同，但操作步骤不一。现以GIBICOL公司提供的SuperScriptTM Preamplification System for First Strand cDNA Synthesis 试剂盒为例。
（1）在0.5ml微量离心管中，加入总RNA 1-5μg，补充适量的DEPC H2O使总体积达11μl。在管中加10μM Oligo（dT）12-18 1μl，轻轻混匀、离心。
（2）70℃加热10min，立即将微量离心管插入冰浴中至少1min。
然后加入下列试剂的混合物：
10×PCR buffer 2μl
25mM MgCl2 2μl
10mM dNTPmix 1μl
0.1M DTT 2μl
轻轻混匀，离心。42℃孵育2-5min。
（3）加入SuperscriptⅡ1μl ，在42℃水浴中孵育50min。
（4）于70℃加热15min以终止反应。
（5）将管插入冰中，加入RNase H 1μl ，37℃孵育20min，降解残留的RNA。-20℃保存备用。
3．PCR：
（1）取0.5ml PCR管，依次加入下列试剂：
第一链cDNA 2μl
上游引物（10pM） 2μl
下游引物（10pM） 2μl
dNTP(2mM) 4μl
10×PCR buffer 5μl
Taq 酶（2u/μl） 1μl
（２） 加入适量的ddH2O，使总体积达50μl。轻轻混匀，离心。
（３） 设定PCR程序。在适当的温度参数下扩增28-32个循环。为了保证实验结果的可靠与准确，可在PCR扩增目的基因时，加入一对内参（如G3PD）的特异性引物，同时扩增内参DNA，作为对照。
（４） 电泳鉴定：行琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下观察结果。
（５） 密度扫描、结果分析：采用凝胶图像分析系统，对电泳条带进行密度扫描。
四、注意事项
1． 在实验过程中要防止RNA的降解，保持RNA的完整性。在总RNA的提取过程中，注意避免mRNA的断裂。
2． 为了防止非特异性扩增，必须设阴性对照。
3． 内参的设定：主要为了用于靶RNA的定量。常用的内参有G3PD（甘油醛-3-磷酸脱氢酶）、β-Actin（β-肌动蛋白）等。其目的在于避免RNA定量误差、加样误差以及各PCR反应体系中扩增效率不均一各孔间的温度差等所造成的误差。
4． PCR不能进入平台期，出现平台效应与所扩增的目的基因的长度、序列、二级结构以及目标DNA起始的数量有关。故对于每一个目标序列出现平台效应的循环数，均应通过单独实验来确定。
5． 防止DNA的污染：
（１） 采用DNA酶处理RNA样品。
（２） 在可能的情况下，将PCR引物置于基因的不同外显子，以消除基因和mRNA的共线性。

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请问如何设立阴性对照，谢谢。
作者: 丸子妹    时间: 2011-9-7 17:18

诸位：有谁用过SCION Image软件测灰度，我从网上下载了一个，但当我用它打开扫描照片的文件时，出现对话框：无法打开压缩的TIFF。可我单独打开此文件时，可以打开。请教各位
作者: 何去何从    时间: 2011-9-7 17:19

我近来做一RT-PCR，用四种镁离子用量，跑了一个温度梯度(48~64oC)，用别人以前做过的引物和自购的引物分别做了N次(引物为同一条)，但始终不见目标条带。用actin做时可见条带，表明我的cDNA没有问题。而且目标条带的PCR体系是是别人以前的成功体系。不知何故，请各位帮忙!谢谢!
作者: 邓布利多    时间: 2011-9-7 17:19

我有一个疑问，为什么许多人都要什么RNA电泳图？是用来干什么呢？是不是自己跑不好，用来造假！！！
作者: 椰子叶子    时间: 2011-9-7 17:20

阴性对照不是不加DNA而是加无关的DNA，你可以参见cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=67&id=396061&sty=3&keywords=PCR%CE%DB%C8%BE%D3%EB%B6%D4%B2%DF')
作者: 胖小妮子    时间: 2011-9-7 17:20

文中提到， 合成cDNA引物的选择之“特异性引物：最特异的引发方法是用含目标RNA的互补序列的寡核苷酸作为引物，若PCR反应用二种特异性引物，第一条链的合成可由与mRNA 3’端最靠近的配对引物起始。”，是否可用PCR之上游引物为RT的“特异性引物”进行RT反应？？？？？？？
作者: 细水长流    时间: 2011-9-7 17:21

谢谢你们的帮助
我老大在我几次做实验都没结果的情况下自己做了逆转录和PCR，做出来的结果也和我做的是一样的。这几天我看了一些关于HCV的资料，对于我实验的不正确结果我真的是百思不得其解，对于PCR的条件应该没问题，而且RNA我是用T-GENE的试剂盒提的，提出RNA后我跑过琼脂糖电泳也没有问题，可就是没有结果，做这个实验我都焦头烂额的。 liuchengyuan你说你也在做HCV
，不知道你的实验有结果了吗？请各位再接着帮助我，谢谢了。
作者: 花裙子    时间: 2011-9-7 17:21

请教一个关于RT-PCR的问题
我准备从外周血中提取mRNA,然后做RT-PCR，希望扩增出特定的片段，
采用Gentra试剂盒提取RNA,提取完成跑电泳，正常人样品可见清楚两条带，而病人组要么只有一条带，要么什么也没有，不知是什么原因。
是RNA降解了吗？还是其它问题？（血样保存在-70度）
作者: 花裙子    时间: 2011-9-7 17:22

可能问题出在标本的保存：一般四小时之内就应处理，分离出细胞
作者: 喵咪    时间: 2011-9-7 17:22

谢谢你们的帮助
我老大在我几次做实验都没结果的情况下自己做了逆转录和PCR，做出来的结果也和我做的是一样的。这几天我看了一些关于HCV的资料，对于我实验的不正确结果我真的是百思不得其解，对于PCR的条件应该没问题，而且RNA我是用T-GENE的试剂盒提的，提出RNA后我跑过琼脂糖电泳也没有问题，可就是没有结果，做这个实验我都焦头烂额的。 liuchengyuan你说你也在做HCV
，不知道你的实验有结果了吗？请各位再接着帮助我，谢谢了。

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我的有结果啊
不知道你的引物是准备要把哪个区扩出来
目的是干什么啊??
你把它贴上来给大家看看
作者: 海鸥crazy    时间: 2011-9-7 17:23

请问其它的试剂例如氯仿、异丙醇、无水乙醇在提取mRNA时也需要用新的吗？他们会含有RNA酶吗？  
作者: 喵咪    时间: 2011-9-7 17:23

我做的时候大多现用现配的
作者: 海鸥crazy    时间: 2011-9-7 17:24

谢谢！可是异丙醇和氯仿不是直接用不用配的嘛？
作者: 喵咪    时间: 2011-9-7 17:25

在做之前分装的  
作者: Darcy    时间: 2011-9-7 17:26

我想向各位请教一下我遇到的问题。我做了多次RT-PCR,一直没得到我要的条带。我的基因是酿酒酵母细胞的GSH1，长度为1.5kb。做的是一步PCR。用的是特异性引物。提取的toyalRNA我没有定量。
我想问一下：提取的total RNA电泳一定要用RNA专用的变性电泳法吗？可否就用跑DNA的琼脂糖凝胶电泳，有几条RNA带啊？
作者: 海鸥crazy    时间: 2011-9-7 17:26

谢谢喵咪的详细解答!
还请教一件事情。我的课题是关于一个因子的在肿瘤中的表达的，初步设计用rt－pcr和免化测定。但是迄今为止还没有关于这个因子在哪一株肿瘤细胞中高表达的定论。那么我的实验除了设计癌、癌旁、正常组织中的表达水平之外，是否还需要设计阳性和阴性的对照，尤其是在跑rt－pcr的时候。
问题很幼稚，但我真的很困扰，希望指教。
作者: 大猫    时间: 2011-9-7 17:27

请教各位高手：
本人近段时间来一直在进行RT-PCR实验，开始采用一步法，结果什么也不见。后来先做RT，再进行PCR，得到的目的条带却很弱，要进行下面的载体构建等几乎是没有希望的。我已经换了许多引物，尝试N次PCR条件，目的条带仍是隐隐约约的。请问我能否用扩出的PCR产物进行第二次PCR？如果可以的话，应如何进行？请赐教！我都快焉了！
作者: 喵咪    时间: 2011-9-7 17:27

你说的是套式PCR,可以在你的第一次PCR两个引物内,再设计一对引物进行第二次PCR就行了
作者: 大猫    时间: 2011-9-7 17:28

我想继续请教的是：是否我在进行第一次PCR的时候，设计的引物必须比我想要的目的片段长，然后再用第二对引物扩出目的片段？另外进行第二次PCR时，所用的引物量，模板量等应注意什么呢？
作者: 喵咪    时间: 2011-9-7 17:28

如果你的第一次PCR刚好包括目的片段,那只好设计个更长的了
第二次的引物设计要求可以低一点
以50μl体系为例
引物各1μl
第一次PCR产物5μl
作者: 冰激凌小姐    时间: 2011-9-7 17:29

我的有结果啊
不知道你的引物是准备要把哪个区扩出来
目的是干什么啊??
你把它贴上来给大家看看

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我的引物是对HCV的全序列进行扩增，目的是鉴定HCV的亚种。不知你扩增的是哪个区，我做了几次换了很多条件都没有正确结果，每次扩增的条带大小都不对，你的RT－PCR做的程序能告诉我吗，我怀疑是不是我的RT－PCR哪里不对了。
作者: 喵咪    时间: 2011-9-7 17:29

我的师兄搞过HCV的全序列扩增
因为HCV高度变异和缺失
是不那么容易扩出来的
听说我那个师兄做了很长时间也没有做出来
祝你好运啦
RT－PCR做的程序我是扫描的图片
你的油箱是多少
我发给你吧
不过我想说你的可是超长序列扩增哦
作者: 菠萝菠萝蜜    时间: 2011-9-7 17:30

对于GC含量高的片段，作RT大家有什么好办法？
作者: 菠萝菠萝蜜    时间: 2011-9-7 17:30

二次PCR和巢式PCR，即设计两对引物进行扩增，不是一个概念，它是拿第一次的PCR产物，稀释100-1000倍做模板，加入底物，从新进行扩增反应，以期增加产物的量
作者: 冰激凌小姐    时间: 2011-9-7 17:31

我的师兄搞过HCV的全序列扩增
因为HCV高度变异和缺失
是不那么容易扩出来的
听说我那个师兄做了很长时间也没有做出来
祝你好运啦
RT－PCR做的程序我是扫描的图片
你的油箱是多少
我发给你吧
不过我想说你的可是超长序列扩增哦

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谢谢你。为什么你说我的是超长序列扩增呢？你的师兄到底做了多长时间啊，他到现在也没有做出来吗，他现在还在做么？
作者: 喵咪    时间: 2011-9-7 17:32

做了几个月
好象是没有做出来吧
具体我不是太清楚
作者: 花裙子    时间: 2011-9-8 09:24

为什么你说我的是超长序列扩增呢？
作者: 阿拉蕾    时间: 2011-9-8 09:24

我做RT-PCR时,提总RNA时,都是用灭菌DEPC水,按1:100稀释后测OD260和OD280,后根据公式:RNA浓度=OD260*稀释度/25(ug/ul),后用1mg total RNA分离mRNA.做逆转录及PCR,效果很好.
作者: 喵咪    时间: 2011-9-8 09:25

你不是全序列扩增吗
HCV的9K多吧
作者: 花裙子    时间: 2011-9-8 09:25

你不是全序列扩增吗
HCV的9K多吧

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哦，我没说明白，我是用16对引物对HCV全序列扩增。
作者: 兔纸    时间: 2011-9-8 09:26

作RT-pcr时，两个引物的Tm值不一,如何确定复性温度？
作者: 花裙子    时间: 2011-9-8 09:26

作RT-pcr时，两个引物的Tm值不一,如何确定复性温度？

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用较低的那个温度复性。
作者: 小荷尖尖    时间: 2011-9-8 09:27

一篇关于RT-PCR的好书，请看。cuturl('http://www.ebiotrade.com/bbsf/readnews.asp?recordno=B200392416239')。  
作者: jude    时间: 2011-9-8 09:27

我是一个新手,准备作rt:

请问各位前辈:我要 从外周血分离出单核细胞提取rna 作rt-pcr
1 分离出的细胞如何在-80c保存,加pbs1ml 保存可以吗?要不要离心一下保存,还是细胞的pbs悬液直接在-80c保存?
2 可以在离心沉淀后的细胞中加入trizol 后保存吗?要不要离心一下保存?
3 上边两种拿一个好一些那?
作者: 明天的明天    时间: 2011-9-8 09:28

大家好，我提的RNA含有DNA，于是我就用DNA酶处理了一下，电泳结果比较理想，但是DNA酶我不知道怎么灭活，如果做反转录的话，DNA酶肯定会影响反转录效果的。向大家请教如何灭活DNA酶。
作者: 圆圆圈圈    时间: 2011-9-8 09:29

各位大虾：
我有一个问题请教，RT-PCR要求模板RNA的260nm/280nm的比值最低为多少，如果太低是不是会影响结果？
作者: 圆圆圈圈    时间: 2011-9-8 09:29

各位大虾：
我有一个问题请教，RT-PCR要求模板RNA的260nm/280nm的比值最低为多少，如果太低是不是会影响结果？
作者: 圆圆圈圈    时间: 2011-9-8 09:29

各位大哥：
请问用来做RTPCR的RNA的260nm/280nm的比值为多少，1.5可以用来做反转录吗，先谢谢了。
作者: 阿福    时间: 2011-9-8 09:30

各位大哥：
我有一个问题请教，RT-PCR要求模板RNA的260nm/280nm的比值最低为多少，如果太低是不是会影响结果？

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最低到1.8，最好2.0，我感觉稍微低一点影响不算太大。
作者: 阿福    时间: 2011-9-8 09:30

各位大虾：
请问用来做RTPCR的RNA的260nm/280nm的比值为多少，1.5可以用来做反转录吗，先谢谢了。

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1.5有些小了，RNA有降解，不过建议你试一试
作者: 葡萄籽    时间: 2011-9-8 09:31

我是一个新手，最近请公司帮我设计了3个引物做RT-PCR，请高手帮我看一下，谢谢！
这是3个引物的具体情况：
目的基因：脂蛋白脂酶 lpl引物设计结果来自genebank序列文件: NM_012598.
原序列总长度为 1425
引物总数有 2 对
第 1 对引物
5'->3' 408 CAGGTTCATCAACTGGCTGG 427
3'->5' 888 GAAACTCTTTCCCGAGACGG 907

第 2 对引物
5'->3' 410 GGTTCATCAACTGGCTGGAG 429
3'->5' 890 AACTCTTTCCCGAGACGGAC 909

以下为内参照：
beta-actin引物设计结果来genebank自序列文件: NM_031144
原序列总长度为 1128
引物总数有 2 对

第 1 对引物
5'->3' 655 GTTGCCCTAGACTTCGAGCA 674
3'->5' 885 GTTGTGTCACGACAGACCAC 904

第 2 对引物
5'->3' 718 TATGAGCTGCCTGACGGTCA 737
3'->5' 948 CTAATGACGGGACCGAGGAT 967

3磷酸甘油醛脱氢酶GAPDH引物设计结果来自序列文件: X02231
原序列总长度为 1002
引物总数有 1 对

第 1 对引物
5'->3' 282 GGAGTCTACTGGCGTCTTCA 301
3'->5' 512 CCGAGTACTGGTGTCAGGTA 531
作者: 饭团团    时间: 2011-9-8 09:32

最近请公司帮我设计了3个引物做RT-PCR，请高手帮我看一下，谢谢！
看看Primer Premier中文使用说明PCR引物设计及软件使用技巧
cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=67&id=380010&sty=1&tpg=1&age=0')可能对你有帮助。初步看，这些引物可能会扩增你的产物，很多时候引物的位置是没办法前后挪动的，只有在长度上稍稍改动。为了保证合成的效果，一般可以不要太长20-25bp可。但我觉得如果为了保证特异性，最好长些，象上面的个数可以再加上几个，（我观察它们的GC含量倒可以）为了保证合成，一般要求引物5端为GC，因此是否GAPDH第 1 对引物中3'->5' 稍微修改，即5端稍加延伸，可能效果更好；beta-actin第 2 对引物3'->5' 同理。总之，最后的扩增结果才是金标准。
作者: 葡萄籽    时间: 2011-9-8 09:32

我用的Primer Premier5。0软件，可是发现没有一个好的，所有的Primer 都有‘’FOUND‘’，所以我有的点不知所措，究竟是相信别人公司的设计软件呢还是相信Primer Premier5。0软件输出结果。  
作者: Darcy    时间: 2011-9-8 09:33

为什么DD-PCR体系中的dNTP的浓度那么低啊，另外5‘端随机引物的浓度也很低，哪位大侠做过请赐教，先谢谢了。
作者: guagua    时间: 2011-9-8 09:33

请各位高手看看我这个Program:

94'c-2m
94'c-20s 　60'c-1m 　　　　四个循环
94'c-20s 56'c-40s 72'c-40s 四个循环　
94'c-20s 52'c-30s 72'c-40s 三十个循环
72'c-5m

这个Program是实验室一个RT-PCR大虾级老师给编的，我的目的产物在300kb,Tm值在54'c，上面的Program两次就P出来了，只是程序太复杂，俺看了半天还没有明白，请教各位：
第一个四个循环为什么不需要延伸阿？
退火温度那样梯度下降的道理何在？

请各位各叙己见！！！不胜感激！！
作者: guagua    时间: 2011-9-8 09:33

请各位高手看看我这个Program:

94'c-2m
94'c-20s 　60'c-1m 　　　　四个循环
94'c-20s 56'c-40s 72'c-40s 四个循环　
94'c-20s 52'c-30s 72'c-40s 三十个循环
72'c-5m

这个Program是实验室一个RT-PCR大虾级老师给编的，我的目的产物在300kb,Tm值在54'c，上面的Program两次就P出来了，只是程序太复杂，俺看了半天还没有明白，请教各位：
第一个四个循环为什么不需要延伸阿？
退火温度那样梯度下降的道理何在？

请各位各叙己见！！！不胜感激！！
作者: 8黑眼圈8    时间: 2011-9-8 09:34

请问PT-PCR体系中，引物和Taq man怎样设计  
作者: 葡萄籽    时间: 2011-9-8 10:14

你给我留的MESSAGE 我已回答，希望你满意。另外，luoyu10提到DD-PCR体系中的dNTP的浓度那么低啊，另外5‘端随机引物的浓度也很低，推荐你看看差异表达基因克隆技术的进展cuturl('http://life.ac.cn/xyls/smhx990514.htm')，另外可以看一下　Liang P, Pardee A B. Differential display of eukaryotic message RNA by means of the polymerase chain reaction. Science, 1992, 257: 967～971，可能在思路上有所帮助。另外关于hansontcm 的
Program：94'c-2m（RNA作RT这一步是必需，RNA变性；）
94'c-20s 　60'c-1m 　四个循环（94:RNA变性，特异引物RT时，防止局部双链等高级结构;同时完成CDNA的合成）
94'c-20s 56'c-40s 72'c-40s 四个循环　（增加PCR产物特异性）
94'c-20s 52'c-30s 72'c-40s 三十个循环（正常的产物括增，如果上面的四个循环无效，至少也有产物括增）
72'c-5m（充分延伸）
作者: dreaming    时间: 2011-9-8 10:15

还有一事请教：　
上面的Program在将三个退火温度提高三度后，非特异条带消失，产物条带清晰，我正准备开始做标本，
可我的老师说让我将温度定在57‘ｃ,
请问：这种 touchdown PCR只是摸条件吗？可以大规模P吗？
作者: dreaming    时间: 2011-9-8 10:15

还有一事请教：　
上面的Program在将三个退火温度提高三度后，非特异条带消失，产物条带清晰，我正准备开始做标本，
可我的老师说让我将温度定在57‘ｃ,
请问：这种 touchdown PCR只是摸条件吗？可以大规模P吗？
作者: 阿福    时间: 2011-9-8 10:16

I use Ambion kits. I don't have any problem .
作者: 丸子妹    时间: 2011-9-8 10:16

不知哪位高手抽提过神经组织的RNA，最近想做RT－PCR，坐骨神经的RNA抽提很不理想，以致没法进行下一步操作，不知哪位高手可以给予指导？不胜感激！
作者: 红豆冰    时间: 2011-9-8 10:17

我是新手有一个问题想请教大家:RT-PCR中RNA提取有什么好方法吗?谢谢!
作者: dreaming    时间: 2011-9-8 10:19

我提的是心肌细胞的RNA
作者: 七彩星星    时间: 2011-9-8 10:20

94'c-2m
94'c-20s 　60'c-1m 　　　　四个循环
94'c-20s 56'c-40s 72'c-40s 四个循环　
94'c-20s 52'c-30s 72'c-40s 三十个循环
72'c-5m

这个Program是实验室一个RT-PCR大虾级老师给编的，我的目的产物在300kb,Tm值在54'c，上面的Program两次就P出来了，只是程序太复杂，俺看了半天还没有明白，请教各位：
第一个四个循环为什么不需要延伸阿？
退火温度那样梯度下降的道理何在？

请各位各叙己见！！！不胜感激！！
这是一个降落PCR，可以同时增加扩增效率和特异性
作者: 七彩星星    时间: 2011-9-8 10:20

我用的Primer Premier5。0软件，可是发现没有一个好的，所有的Primer 都有‘’FOUND‘’，所以我有的点不知所措，究竟是相信别人公司的设计软件呢还是相信Primer Premier5。0软件输出结果。

其实所有的软件都是模拟，有时候我自己肉眼设计的比软件的还好。  
作者: dreaming    时间: 2011-9-8 10:26

如果上面的Program在将三个退火温度提高三度后，非特异条带消失，产物条带清晰，你不妨就用这个条件，大P最好。不过为了平衡你和老师的矛盾：可以按照温度定在57‘ｃ小做一管进行观察。如果特异条带依然清晰，证明两个条件差不多，否则说明在前面你已经取得了一个很好的临界条件。另外，一般的降落PCR是以2度的梯度进行摸索的。
lovinglife ，我们许多时候的引物有‘’FOUND‘’，但结果却还可以，这里边主要是避免引物形成的二聚体。另外，如果你把分析结果告诉公司，让他们继续优化一下，能稍微调整的地方让调整一下：比如稍微将引物加长些，以此增加特异性。如果再次使用软件分析，结果好些的时候，PCR结果得到阳性的可能性就更大。
作者: 微笑的海豚    时间: 2011-9-8 10:27

我是新手有一个问题想请教大家:RT-PCR中RNA提取有什么好方法吗?谢谢!

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不知b]elit123兄想问什么方面？具体的还是大概？提组织的RNA一般用Trizol提，具体的步骤你按Invitrogen的Protocol就行了，注意的事项就是带手套、口罩，防止RNA酶降解，不过我做的时候这些，也没出什么问题 不过建议你还是预防一下。另外，Takara的Ctrimox-14试剂盒俺用的也挺好，跟Invitrogen的Trizol相比，后者含有RNA酶抑制剂，常温下使用，不需低温处理，在-20'c或-80'c可以保存很长时间，－Trizol也可以保存很长时间的标本。
作者: dreaming    时间: 2011-9-8 10:28

94'c-2m
94'c-20s 　60'c-1m 　　　　四个循环
94'c-20s 56'c-40s 72'c-40s 四个循环　
94'c-20s 52'c-30s 72'c-40s 三十个循环
72'c-5m

这个Program是实验室一个RT-PCR大虾级老师给编的，我的目的产物在300kb,Tm值在54'c，上面的Program两次就P出来了，只是程序太复杂，俺看了半天还没有明白，请教各位：
第一个四个循环为什么不需要延伸阿？
退火温度那样梯度下降的道理何在？

请各位各叙己见！！！不胜感激！！
这是一个降落PCR，可以同时增加扩增效率和特异性

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多谢多谢！！
作者: 清风风铃    时间: 2011-9-8 10:28

本人想做受精卵中整合素的表达，但是每只老鼠只能得到20个左右的细胞，如果我想做RTPCR该怎么办？是不是需要很多只老鼠呢？
作者: 冰激凌小姐    时间: 2011-9-8 10:29

我有问题请教
有用RT-PCR进行细胞因子表达临床检验并出报告的吗？
如有的话是哪些细胞因子？
如没有又为什么？
RT-PCR方法做出来的文章到国外容易发表吗？
需要注意什么问题？
作者: 阿拉蕾    时间: 2011-9-8 10:29

我们实验室是用定量RT-PCR作临床检验的，细胞因子有但是不多，TNF和几种凝血因子。但是因为基因表达量个体差异大，定量或半定量都不好控制，真正能用到临床检验，很多工作需要作，不是很容易的。
作者: 王六六    时间: 2011-9-8 10:30

我想请问各位：做RT-PCR时会用到DEPC，我做的时候，经常会腐蚀我的手套，，尤其是用它浸泡塑料管时，以至于我每次做的时候都是心惊肉跳，每次都要沾到手上，请问你们是怎样操作的？还有，用剩下的DEPC我应该怎样处理掉，以达到环保，不危害环境？
作者: 快乐的大脚    时间: 2011-9-8 10:30

各位大侠，我做的是RT-PCR，反转录后我用随机引物和锚定引物做PCR，拉出了一个条带，但是比较弱，想把这个条带测序，但是量不够，能不能用这次的PCR的产物（就是PCR后的原液）来做二次PCR以获得较多的产物，如何做，反应条件和第一次一样吗（我第一次的退火温度为40度），请各位大侠赐教。
作者: 微笑的海豚    时间: 2011-9-8 10:31

你的问题实际上是挺麻烦的，不过我做时多戴 了两双一次性塑料手套，还要小心一点，这样可能会好一点。
作者: 花裙子    时间: 2011-9-8 10:32

提取总RNA后，如何对它进行定量？一般提取RNA后将其溶解在DEPC水中保存，那末将其溶解在多少的DEPC水中比较合适？请教，谢谢
作者: 我是一片云    时间: 2011-9-8 10:33

我在做大鼠脑组织中的TNF-alpha, ICAM-1和 IL-6的real time RT -PCR。
有这方面经验的大哥大姐可以帮我吗？
基因序列如何挑选，如何确定它的外显子序列，如何引物如何设计？怎么保证在外显子的区域？

新手菜鸟，请大家不要见笑
作者: 竹蜻蜓    时间: 2011-9-8 10:34

我是在读临床博士。对实验不懂，很多不明白。
请问：是否所有的PCR都可以做touchdown？如果那样不是可以不用摸索条件了吗？就很省事了？
我用的引物是前面的师姐留下的，但是我开始做试验时，她已经毕业了。我现在只是知道她的引物序列、以及大致文献出处，以及她的条件，另外一个人用过她的引物，据说用她的条件根本批不出来。所以我现在不知道该如何进行pcr。我们的区别是在：她用的是GIBCO的试剂盒，我用的是promega试剂盒，均为两步法，她用的扩增仪和我现在的也不一样。而且她用的是同管扩增。我想请问我是否应该找找文献，还是先做做看？
另外：她告诉我大部分引物来自一篇文章：the Journal of Immunology 2000,164, 5935-43 我已经看了，里面所有因子条件均是：95 9min preheating , 94 30 s, 56 30s , 72 30s,30 cycle, 72 10min.请问是否可行？？谢谢！
作者: 阿拉蕾    时间: 2011-9-8 10:34

我想请问各位：做RT-PCR时会用到DEPC，我做的时候，经常会腐蚀我的手套，，尤其是用它浸泡塑料管时，以至于我每次做的时候都是心惊肉跳，每次都要沾到手上，请问你们是怎样操作的？还有，用剩下的DEPC我应该怎样处理掉，以达到环保，不危害环境？

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怎么会呢?我是左手用长柄镊子夹住要处理的EP管或枪头,右手拿一根装好枪头的枪用来排除未浸到的空气,用密闭容器泡,同时在通风系统下操作,戴口罩(我戴双层)没有任何问题
剩下的DEPC应高温高压后即转为无害
作者: 冷眼相对    时间: 2011-9-8 10:35

请教各位大侠：
本人从人PBMC提总RNA做RT-PCR，上游引物为９bp的简并引物（不是随机引物），下游引物为Oligo(dT)，待扩增片段mRNA丰度不是很高，且为多个片段。做了几次，均未成功，只有一次有点儿意思，但只有一条模糊的带，很淡，退火温度为４５度，引物１００pmol（低浓度时未批出来），模板约２５微克。不知哪里出了问题，体系该如何进一步优化。
请教各位，谢谢。
作者: 冷眼相对    时间: 2011-9-8 10:35

请教各位大侠：
本人从人PBMC提总RNA做RT-PCR，上游引物为９bp的简并引物（不是随机引物），下游引物为Oligo(dT)，待扩增片段mRNA丰度不是很高，且为多个片段。做了几次，均未成功，只有一次有点儿意思，但只有一条模糊的带，很淡，退火温度为４５度，引物１００pmol（低浓度时未批出来），模板约２５微克。不知哪里出了问题，体系该如何进一步优化。
请教各位，谢谢。
作者: 麻瓜    时间: 2011-9-8 10:36

想知道什么是内参照，如何用内参照检验cDNA？XIEXIE
作者: 冰激凌小姐    时间: 2011-9-8 10:37

我想问一下：提取的total RNA电泳一定要用RNA专用的变性电泳法吗？可否就用跑DNA的琼脂糖凝胶电泳，有几条RNA带啊？
作者: 椰子叶子    时间: 2011-9-8 10:37

我想问一下：提取的total RNA电泳一定要用RNA专用的变性电泳法吗？可否就用跑DNA的琼脂糖凝胶电泳，有几条RNA带啊？

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可以的，不过所需的全部试剂都需要严格配制。如缓冲液必须用高压去离子四溜水。加样缓冲液也必须保证不被RNase污染。电泳槽必需清洗浸泡后再用，没问题的。
作者: 小荷尖尖    时间: 2011-9-8 10:38

昨天辛辛苦苦做了RT-PCR，但跑胶发现没有目的带，连杂带也没有，不知道是什么原因。是否是引物不行还是RT做得不好，亦或是RNA将解了？请高手不吝赐教。
作者: 丸子妹    时间: 2011-9-8 10:40

向各位同仁请教一个问题。
我用的是定量RT-PCR，同时扩增目的基因和内参时无结果，分别扩时则有结果。不知这种情况常见吗？有没有解决办法？
作者: 椰子叶子    时间: 2011-9-8 10:40

我想问一下：提取的total RNA电泳一定要用RNA专用的变性电泳法吗？可否就用跑DNA的琼脂糖凝胶电泳，有几条RNA带啊？

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total RNA电泳一定要用 变性电泳法检测;用跑DNA的琼脂糖凝胶电泳不行.真核生物细胞的total RNA电泳结果应该有三条带:28S带、18S带和5S带
作者: @木木@    时间: 2011-9-8 10:43

我做一个基因的克隆，为组织中的RNA，用Trizol试剂提取，测量浓度为500ng/微升，但是波长260/280只有1.5左右，说明纯度不够，不知道，这个比值是什么意思？最少应为多少，才能保证里面有我所需要的RNA，我提取了几次，都是这样，请各位老师先辈不吝赐教，学生在此谢过了。
作者: 喵咪    时间: 2011-9-8 10:44

我做一个基因的克隆，为组织中的RNA，用Trizol试剂提取，测量浓度为500ng/微升，但是波长260/280只有1.5左右，说明纯度不够，不知道，这个比值是什么意思？最少应为多少，才能保证里面有我所需要的RNA，我提取了几次，都是这样，请各位老师先辈不吝赐教，学生在此谢过了。

　抽取的ＲＮＡ　２６０／２８０在１．８　到１．９说明抽的比较好．分子克隆上有相关内容，你好好看看．
推荐一个很好的ＲＴ－ＰＣＲ相关的网站　　invitrogen的哦

cuturl('http://www.invitrogen.com.cn/Focus/Focus24/content/Frameset7.htm')
作者: 喵咪    时间: 2011-9-8 10:45

请问大家：你们用ＲＴ－ＰＣＲ做过的最长的基因是多少，我做过的是ＡＰＯＡ－１的ＣＤＮＡ全长８０４个，加上两边加上去的酶切位点一共８２５个碱基．是用普通的ＴＡＱ酶做ＰＣＲ的．觉得不难．
作者: 喵咪    时间: 2011-9-8 10:45

我要用RT－PCR钓一个基因，mRNA长约3kb，其间还有一个茎环结构，该如何应付？

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一个茎环结构倒不足为虑，大不了退火时间长点，我用有两个茎环结构的引物长４６个碱基的引物来做ＰＣＲ很容易就ＯＫ了．但３ＫＢ的确实有点长了，要用高保真酶，具体的你要自己插了．很贵的哦，我用的ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ的ＰＦＵ－ＴＵＲＢＯ才１００单位就要１６００块钱哦．
作者: 喵咪    时间: 2011-9-8 10:46

昨天辛辛苦苦做了RT-PCR，但跑胶发现没有目的带，连杂带也没有，不知道是什么原因。是否是引物不行还是RT做得不好，亦或是RNA将解了？请高手不吝赐教。

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ＲＴ－ＰＣＲ最重要的是模板，其他都是相对次要的，模板不好，抽的ＲＮＡ不好，做的ＲＴ不好ＣＤＮＡ浓度太低是很难Ｐ出来的，你连杂带都没有，我推荐你如下应对：
　　　　１，做ＲＮＡ电泳看看ＲＮＡ抽的怎么样１８Ｓ，２８Ｓ亮不亮．最好测一下２６０／２８０和浓度．
　　　　２，降低退火温度到５０度，５１度做ＰＣＲ看看结果如何．
　　　ＰＣＲ体系如下
　　　ＣＤＮＡ　　　　　　　　５ＵＬ
　　　１０＊ＢＵＦＦＥＲ　　　２ＵＬ
　　　２５＊ＭＧ　　　　　　　１．５ＵＬ
　　　１０＊dNTP 0.5uL
10*primers 0.5/0.5
　dd水　　　　　　　　　up to 20ul
聚合酶　　　　　　　　　０．５ul　　
作者: 喵咪    时间: 2011-9-8 10:48

一个茎环结构倒不足为虑，大不了退火时间长点，我用有两个茎环结构的引物长４６个碱基的引物来做ＰＣＲ很容易就ＯＫ了．但３ＫＢ的确实有点长了，要用高保真酶，具体的你要自己插了．很贵的哦，我用的ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ的ＰＦＵ－ＴＵＲＢＯ才１００单位就要１６００块钱哦．

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这里有点错了，应该是如果有茎环结构的话，大不了退火温度高些．　不好意思
作者: 微笑的海豚    时间: 2011-9-8 10:49

total RNA电泳一定要用 变性电泳法检测;用跑DNA的琼脂糖凝胶电泳不行.真核生物细胞的total RNA电泳结果应该有三条带:28S带、18S带和5S带

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我用过一般的琼脂糖凝胶电泳，没问题。
你可以试试，只要不用回收RNA。
作者: 开心蔬菜帮    时间: 2011-9-8 10:50

我们在设计RT-PCR引物时，如果作抑癌基因在肿瘤中的表达，通常以经常发生缺失的外显子设计引物。如果我们作癌基因在肿瘤中的表达，那么设计引物时，是不是用每个外显子都可以，而不用像抑癌基因那样考虑那么复杂，是不是？
作者: 嘉年华    时间: 2011-9-8 10:51

我用过一般的琼脂糖凝胶电泳，没问题。
你可以试试，只要不用回收RNA。

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请教吞吞兄几个问题：我也正是用琼脂糖凝胶电泳检验RNA的(因为我嫌变性胶麻烦），只可惜总是有降解，条带模糊。能否指点一二，不胜感激
作者: 椰子叶子    时间: 2011-9-8 10:55

向各位同仁请教一个问题。
我用的是定量RT-PCR，同时扩增目的基因和内参时无结果，分别扩时则有结果。不知这种情况常见吗？有没有解决办法？

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这是内参和目的基因同时扩常出现的问题，因为两者存在竞争。
作者: 椰子叶子    时间: 2011-9-8 10:56

请教吞吞兄几个问题：我也正是用琼脂糖凝胶电泳检验RNA的(因为我嫌变性胶麻烦），只可惜总是有降解，条带模糊。能否指点一二，不胜感激

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如你 所言，只要保证无RNase就行。用DEPC处理过的水配置TBE、并用DEPC水泡槽子。至于加样缓冲液确实困难，不过我没处理照样可以。你试试看。
作者: 阿拉蕾    时间: 2011-9-8 11:12

同意楼上的观点。
我也用普通琼脂糖凝胶电泳来检测RNA，电泳槽最好专门用于跑RNA的，否则
只能按照分子克隆介绍的方法去处理：1洗净电泳槽；2乙醇干燥；3双氧水
浸泡15-30分钟；DEPC水浸泡冲净。电泳液和上样缓冲液也用DEPC处理过的水配制。
但我采用这种方法跑过的rna都是三条带：28s，18s，5s
要求严格的话，最好还是跑变性胶。
作者: 饭团团    时间: 2011-9-8 11:13

我这几天由于做克隆去了,没有做令我心痛的RT-PCR.我现在就安你给我的建议去做.谢谢!
作者: 嘉年华    时间: 2011-9-8 11:14

各位朋友,我在RT-PCR实验中,遇到这样一个问题.当我的RNA模板为1uL时,两个目的基因扩出来,但条带很弱.于是我把模板增大到4uL,但这两个目的基因无法扩出,PCR条件和以前一致.想问当模板量增大到一定浓度,最终的目的基因就可能无法扩增出来,有这种可能,吗?我连续试了3次,可以肯定的是CDNA是没问题的.引物也是没问题的.请快快赐教!奇怪的是, 另外其它目的基因却扩出来了
作者: 微笑的海豚    时间: 2011-9-8 11:14

有这样的可能，多试试不同浓度，最好是进行定量后再进行RT-PCR，另你用的试剂盒是哪个公司的？用PROMEGA 的一步法 kit，效果很好。目的基因表达的强弱是相对而言的，用成像系统分析时修改一下对比度和亮度是否有用？
作者: 胖小妮子    时间: 2011-9-8 11:15

有哪位用过clontech的SMART cDNA 文库构建kit呀。我老板让用这个kit建库。请指教一二。
作者: 8黑眼圈8    时间: 2011-9-8 11:15

我作的目的条带和内参的丰度差别很大,无法同管扩增. 大家觉得分管的效果可信吗?
作者: 大猫    时间: 2011-9-8 11:19

各位高手, 在检测RNA质量时, OD260/OD280的值大于多少时才适合作RT?
作者: 椰子叶子    时间: 2011-9-8 11:20

我作的目的条带和内参的丰度差别很大,无法同管扩增. 大家觉得分管的效果可信吗?

===============================================================================================================

本来就是半定量，只能分管扩增也别无选择，可信度只能在国内发表论文，如在国外的话最好用比较新的方法，比如用定量PCR的方法，把RNA提好后给公司就行，不过比较贵，但有的老板不喜欢RT-PCR，而喜欢定量PCR。
作者: 椰子叶子    时间: 2011-9-8 11:20

各位高手, 在检测RNA质量时, OD260/OD280的值大于多少时才适合作RT?

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1.8~2.0为好。
作者: 椰子叶子    时间: 2011-9-8 11:21

各位高手, 在检测RNA质量时, OD260/OD280的值大于多少时才适合作RT?

================================================================================

一般是１．８到１．９的比较好，纯度比较高．
做ＲＴ当然还要看你的浓度，浓度低了，很不好扩的哦．我就曾经花了２个多月去扩一个基因的全长．
作者: 喵咪    时间: 2011-9-8 11:31

1.8~2.0为好。

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提ＤＮＡ的话一般是１．８比较好，纯度比较好．
如果提的是ＲＮＡ，最好比值大于２．０，小于２．０说明被蛋白或者酚等的污染．
作者: 花裙子    时间: 2011-9-10 11:59

各位高手, 在检测RNA质量时, OD260/OD280的值大于多少时才适合作RT?
作者: 微笑的海豚    时间: 2011-9-10 12:00

我作的目的条带和内参的丰度差别很大,无法同管扩增. 大家觉得分管的效果可信吗?

================================================================================================================

本来就是半定量，只能分管扩增也别无选择，可信度只能在国内发表论文，如在国外的话最好用比较新的方法，比如用定量PCR的方法，把RNA提好后给公司就行，不过比较贵，但有的老板不喜欢RT-PCR，而喜欢定量PCR。
作者: 微笑的海豚    时间: 2011-9-10 12:06

各位高手, 在检测RNA质量时, OD260/OD280的值大于多少时才适合作RT?

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1.8~2.0为好。
作者: 微笑的海豚    时间: 2011-9-10 12:07

各位高手, 在检测RNA质量时, OD260/OD280的值大于多少时才适合作RT?

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　　　一般是１．８到１．９的比较好，纯度比较高．
做ＲＴ当然还要看你的浓度，浓度低了，很不好扩的哦．我就曾经花了２个多月去扩一个基因的全长．
作者: 微笑的海豚    时间: 2011-9-10 12:07

1.8~2.0为好。

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提ＤＮＡ的话一般是１．８比较好，纯度比较好．
如果提的是ＲＮＡ，最好比值大于２．０，小于２．０说明被蛋白或者酚等的污染．
作者: 海鸥crazy    时间: 2011-9-10 12:09

请教大家:
为什么我越提高退火温度,非特异性条带越亮?这样的话,我该优化什么呢?
还有大家都用OD260/OD280看提取核酸的量,我的RNA很珍贵啊,你们是在紫外多少微升稀释才能有足够的量透过石英杯.
作者: 海鸥crazy    时间: 2011-9-10 12:09

请教大家:
为什么我越提高退火温度,非特异性条带越亮?这样的话,我该优化什么呢?
还有大家都用OD260/OD280看提取核酸的量,我的RNA很珍贵啊,你们是在紫外多少微升稀释才能有足够的量透过石英杯.
作者: 椰子叶子    时间: 2011-9-10 12:10

请教大家:
为什么我越提高退火温度,非特异性条带越亮?这样的话,我该优化什么呢?
还有大家都用OD260/OD280看提取核酸的量,我的RNA很珍贵啊,你们是在紫外多少微升稀释才能有足够的量透过石英杯.

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你应该降低退火温度，ＰＣＲ没有说有了非特异的条带就要升高退火温度，很多情况下是降低才行的．在一个适合的温度下才能Ｐ出来．
测２６０／２８０　　我一般是稀释１００倍
作者: 兔纸    时间: 2011-9-10 12:10

请教各位:在RT-PCR癌设计基因引物时是不是不用像TSG那样考虑那么多啊?是不是每个外显子都可以啊?
作者: 兔纸    时间: 2011-9-10 12:10

请教各位:在RT-PCR癌设计基因引物时是不是不用像TSG那样考虑那么多啊?是不是每个外显子都可以啊?
作者: 兔纸    时间: 2011-9-10 12:10

我正准备进行大鼠组织RNA 的提取,其具体方法是不是跟人组织的一样啊?
那位大虾做过,可不可以告诉一下具体的反应体系?
谢谢了!
作者: 椰子叶子    时间: 2011-9-10 12:11

我正准备进行大鼠组织RNA 的提取,其具体方法是不是跟人组织的一样啊?
那位大虾做过,可不可以告诉一下具体的反应体系?
谢谢了!

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原理都是一样的,可以的.
作者: 兔纸    时间: 2011-9-10 12:13

我是说反应体系的比例是不是跟提取人体组织的一样?
有没有什么区别?
作者: 兔纸    时间: 2011-9-10 12:13

我是说反应体系的比例是不是跟提取人体组织的一样?
有没有什么区别?
作者: 喵咪    时间: 2011-9-10 12:13

我是说反应体系的比例是不是跟提取人体组织的一样?
有没有什么区别?

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没比较过，不过我们实验室提人组织的RNA和提兔子的RNA体系没什么区别。 最后加DD水稀释的时候可以自己掌握。
作者: 兔纸    时间: 2011-9-10 12:14

检测肿瘤中癌基因的表达,进行引物设计时是不是没有什么特殊的原则
作者: 大猫    时间: 2011-9-10 12:15

提ＤＮＡ的话一般是１．８比较好，纯度比较好．
如果提的是ＲＮＡ，最好比值大于２．０，小于２．０说明被蛋白或者酚等的污染．

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是不是这样呀？

按protocol，在1。7~2。0；相对高则纯度高，低于它则多半抽提液不够，DNA蛋白层及其他污染；或RNA块溶解不充分等。
如果大于2。0；偶就不知如何解释了？曾在一网上看过，说是大于的话，说明RNA有被将解，但偶没想通这个理；今天又见一解释，不知真理到底掌握在谁手里，恳请该区的高手来澄清一下。附：偶做过大于2。0的RNA样本，最后扩出来了，还不错的效果。
作者: +田田+    时间: 2011-9-10 12:15

我做破骨细胞的OPG与OPGL的RT-PCR
都曾经做出来过
分别在58度，45秒，28个循环和59度，45秒，28个循环。
但是现在相同的条件，就是重复不出来。
特请教各位高手
指示一下~~~~~~~~~~
作者: 阿拉蕾    时间: 2011-9-10 12:16



QUOTE:
原帖由 +田田+ 于 2011-9-10 12:15 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
我做破骨细胞的OPG与OPGL的RT-PCR
都曾经做出来过
分别在58度，45秒，28个循环和59度，45秒，28个循环。
但是现在相同的条件，就是重复不出来。
特请教各位高手
指示一下~~~~~~~~~~ ...


你的条件没变，模板变了吗．如果还是以前的模板ＣＤＮＡ，可现在Ｐ不出来了．这中情况还很常见，解决的办法就是重新提一批ＲＮＡ再做ＲＴ－ＰＣＲ，同样的条件，可以很轻松的Ｐ出来．
希望，对你有用．　　这种情况，看来还很常见．
作者: 阿拉蕾    时间: 2011-9-10 12:18

按protocol，在1。7~2。0；相对高则纯度高，低于它则多半抽提液不够，DNA蛋白层及其他污染；或RNA块溶解不充分等。
如果大于2。0；偶就不知如何解释了？曾在一网上看过，说是大于的话，说明RNA有被将解，但偶没想通这个理；今天又见一解释，不知真理到底掌握在谁手里，恳请该区的高手来澄清一下。附：偶做过大于2。0的RNA样本，最后扩出来了，还不错的效果。

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我们在260和280nm测定样品的吸收值来分析RNA的得率和纯度。总RNA得率可由260nm处的吸收值来计算。RNA的纯度可通过260和280 nm吸收值的比值来确定(A260/A280)，纯RNA A260/280的比值应是2.0。那么，测的值会比２．０大吗！？　如果大的话，除了可能会是机器的问题，其他的原因我还真不知道．
作者: 阿拉蕾    时间: 2011-9-10 12:18

是不是这样呀？

按protocol，在1。7~2。0；相对高则纯度高，低于它则多半抽提液不够，DNA蛋白层及其他污染；或RNA块溶解不充分等。
如果大于2。0；偶就不知如何解释了？曾在一网上看过，说是大于的话，说明RNA有被将解，但偶没想通这个理；今天又见一解释，不知真理到底掌握在谁手里，恳请该区的高手来澄清一下。附：偶做过大于2。0的RNA样本，最后扩出来了，还不错的效果。

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哦，你ＲＴ－ＰＣＲ扩的是２ＫＢ的吗，厉害．不过我想你可能是用比较先进的酶吧．我是用普通的ＴＡＱ酶做ＲＴ－ＰＣＲ扩８２５ＢＰ的ＣＤＮＡ全长．觉得不难，当然这是在成功之后说的．如果在扩出来之前，我死也不承认扩出来容易．
作者: 喵咪    时间: 2011-9-10 12:19

我做破骨细胞的OPG与OPGL的RT-PCR
都曾经做出来过
分别在58度，45秒，28个循环和59度，45秒，28个循环。
但是现在相同的条件，就是重复不出来。
特请教各位高手
指示一下~

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　当然，我还是建议你再模一下退火温度，降低点看看．５０／５１／５３／５５　　如果真的不行的话，就再抽一批ＲＮＡ，再做就行了，相信会比较容易做出来的．
ＧＯＯＤ　ＬＵＣＫ！！
作者: 喵咪    时间: 2011-9-10 12:19

哦，你ＲＴ－ＰＣＲ扩的是２ＫＢ的吗，厉害．不过我想你可能是用比较先进的酶吧．我是用普通的ＴＡＱ酶做ＲＴ－ＰＣＲ扩８２５ＢＰ的ＣＤＮＡ全长．觉得不难，当然这是在成功之后说的．如果在扩出来之前，我死也不承认扩出来容易．

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呵呵，可能偶表达有误，你错解了。是比值大于2。0的RNA样本，长实际上6百多bp。 大概是机器的结果不准吧，后来自己又把RNA跑电泳，还不错的RNA。
作者: 冰激凌小姐    时间: 2011-9-10 12:20

氯仿、异丙醇、无水乙醇在提取mRNA时不需要用新的，他们不含有RNA酶。
作者: 兔纸    时间: 2011-9-10 12:20

今天在实验室看师姐作RT，tip头经过DEPC处理以后放在饭盒里面高压后，作试验时一个一个用枪往外挑，感觉非常麻烦，请问各位大虾，你们作试验时是怎么样弄的，没有能够经住高压的盛tip头的盒子吗？
作者: 喵咪    时间: 2011-9-10 12:21

天在实验室看师姐作RT，tip头经过DEPC处理以后放在饭盒里面高压后，作试验时一个一个用枪往外挑，感觉非常麻烦，请问各位大虾，你们作试验时是怎么样弄的，没有能够经住高压的盛tip头的盒子吗？

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我们是用DEPC处理过的枪头盒子装着,用的时候比较方便一些.
啊,难道你们没用可以做高压消毒的盒子吗!!
作者: 兔纸    时间: 2011-9-10 12:21

他们说盛tip头的盒子经不住高压,具体怎么回事我也不知道!
作者: 椰子叶子    时间: 2011-9-10 12:22

他们说盛tip头的盒子经不住高压,具体怎么回事我也不知道!

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没听说过,我们一直把枪头插到枪盒子里,再高压消毒.DNA用的比较简单,15到20分钟就OK了. RNA的要DEPC处理一下
作者: 椰子叶子    时间: 2011-9-10 12:22

是不是这样呀？

按protocol，在1。7~2。0；相对高则纯度高，低于它则多半抽提液不够，DNA蛋白层及其他污染；或RNA块溶解不充分等。
如果大于2。0；偶就不知如何解释了？曾在一网上看过，说是大于的话，说明RNA有被将解，但偶没想通这个理；今天又见一解释，不知真理到底掌握在谁手里，恳请该区的高手来澄清一下。附：偶做过大于2。0的RNA样本，最后扩出来了，还不错的效果。

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如果抽提的RNA 260/280 大于2.2就说明RNA的变成单核甘酸了,即降解.
如果同时有降解和蛋白/酚的污染,260/280可能还会在一个正常的水平哦!!
作者: =菓子=    时间: 2011-9-10 12:22

TGF-β1的大鼠引物序列，欲检测肾脏表达，我查了许多资料，但各不相同。请各位帮忙！！！

不胜感激，多谢！！！
作者: 阿福    时间: 2011-9-10 12:23

TGF-β1的大鼠引物序列，欲检测肾脏表达，我查了许多资料，但各不相同。请各位帮忙！！！

不胜感激，多谢！！！

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TGFβ1，大鼠肾脏，引物序列，不同文献结果不一，扩增产物、294BP 405bp 396bp 都有。请大家指教。
作者: 清风风铃    时间: 2011-9-10 12:24

我也是RT方面的新手，做过几次总RNA抽提，比较下来还是QIAGEN的抽提试剂盒效果好，与Trizon相比，不仅得率高而且RNA较完整。
作者: 阿拉蕾    时间: 2011-9-10 12:24

我也是RT方面的新手，做过几次总RNA抽提，比较下来还是QIAGEN的抽提试剂盒效果好，与Trizon相比，不仅得率高而且RNA较完整。
我想请各位高手看看我的电泳图。

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不错,没什么降解!!
支持!!
作者: 如影随形    时间: 2011-9-10 12:25

94'c-2m
94'c-20s 　60'c-1m 　　　　四个循环
94'c-20s 56'c-40s 72'c-40s 四个循环　
94'c-20s 52'c-30s 72'c-40s 三十个循环
72'c-5m

这个Program是实验室一个RT-PCR大虾级老师给编的，我的目的产物在300kb,Tm值在54'c，上面的Program两次就P出来了，只是程序太复杂，俺看了半天还没有明白，请教各位：
第一个四个循环为什么不需要延伸阿？
退火温度那样梯度下降的道理何在？

请各位各叙己见！！！不胜感激！！
这是一个降落PCR，可以同时增加扩增效率和特异性

我想请问：这个程序是不是适用于长片段扩增，那么我如果扩增几百个bp的片段，应该在哪个步骤上改变呢？
作者: 丸子妹    时间: 2011-9-10 12:25

我想请问一下，总RNA跑带为什么5S总不清楚呢，能跑出来吗？是不是因为和28S、18S相比，太少了，那么提纯效果怎样在这三条带中体现出来呢？哪条带亮是好的
作者: 阿拉蕾    时间: 2011-9-10 12:26

我想请问一下，总RNA跑带为什么5S总不清楚呢，能跑出来吗？是不是因为和28S、18S相比，太少了，那么提纯效果怎样在这三条带中体现出来呢？哪条带亮是好的

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第一个问题: 5S比较亮的话说明RNA有降解,当然如果18S,28S比较亮,5S不亮的话,不是很好吗,没有降解.如果有,18S,28S比较亮也行.做RT绝对可以.
第二个问题:当然是18S,28S亮比较好咯.
看看RT-PCR相应的攻略吧.
作者: 阿拉蕾    时间: 2011-9-10 12:28

94'c-2m
94'c-20s 　60'c-1m 　　　　四个循环
94'c-20s 56'c-40s 72'c-40s 四个循环　
94'c-20s 52'c-30s 72'c-40s 三十个循环
72'c-5m

这个Program是实验室一个RT-PCR大虾级老师给编的，我的目的产物在300kb,Tm值在54'c，上面的Program两次就P出来了，只是程序太复杂，俺看了半天还没有明白，请教各位：
第一个四个循环为什么不需要延伸阿？
退火温度那样梯度下降的道理何在？

请各位各叙己见！！！不胜感激！！
这是一个降落PCR，可以同时增加扩增效率和特异性

我想请问：这个程序是不是适用于长片段扩增，那么我如果扩增几百个bp的片段，应该在哪个步骤上改变呢？

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个人意见:本人不信什么邪,不信是越复杂的PCR程序越厉害,P出目的条带的可能性就越大.有个老牌博士后帮我编过一次很复杂的程序,结果也是一塌糊涂, 后来,我自己按经典方法编的普通程序解决了问题..
关于问题的个人看法:你这是个降落PCR,文献上来说降落PCR做起来比较的省力,不用怎么摸条件就可以P出来.不过本人感觉并不是那么好.倒不如自己摸一下普通PCR的条件以后,想怎么扩就怎么扩,很容易就OK了.
你的300个BP,应该很容易就P出来的.犯不上去招惹那些降落PCR 那些看似很高级的玩意儿!!
再有你所谓的长片段是多少,从语里行间看好象才几百个,并不算什么长片段的PCR,普通的TAQ用来P 1000~1300BP的没什么问题,一般也不会有突变.
建议:换一般的普通的PCR程序来做.
作者: 阿福    时间: 2011-9-10 12:28

向大家推荐一个关于PCR，RT-PCR的基础理论和很有价值的攻略！（非常好哦，我从中收益匪浅）
cuturl('http://www.invitrogen.com.cn/Focus/Focus24/Focus24_Top.htm')  
作者: 喵咪    时间: 2011-9-10 12:29

组织半定量RT-PCR，RT时组织无必要称重，估计大约有100微克即可。
作者: 许愿精灵    时间: 2011-9-10 12:29

请教各位高手:
以前我做内参基因,条带很特异,但最近一次,我用同样的反应条件进行PCR(除了模板不一样),很多条带,象Marker,而且有一条非特异条带特别亮,我的模板OD260/280=1.8~1.9之间
作者: 微笑的海豚    时间: 2011-9-10 12:30

请教各位高手:
以前我做内参基因,条带很特异,但最近一次,我用同样的反应条件进行PCR(除了模板不一样),很多条带,象Marker,而且有一条非特异条带特别亮,我的模板OD260/280=1.8~1.9之间.以下是我的前后两张图请帮我分析一下.

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分析:
1,你没加MARKER,不好看,不能决定在那两条带里是否有你的目的条带.(好象那两条要比你的目的条带小,可能没有 吧,是非特异性扩增)
2,有SMEAR,你的模板浓度是不是太高了.建议减少模板,并做个定量.
3,虽然是条件没有改变,但是并不能说你现在在这个条件下也可以P出来,可能要稍微动一下退火温度.(可以上下动个2度)(觉得这个可能性比较大哦)
4,也有可能会和你的ＭＧ量多点有关系．（不大）
　　　好运！！
作者: 微笑的海豚    时间: 2011-9-10 12:31

见有些新手朋友问一些很基础的问题，推荐一个网站可以下ＰＣＲ的幻灯，那里比较系统的介绍了ＰＣＲ，（包括ＲＴ－ＰＣＲ）．相信会有帮助的．里面也比较详细的介绍了
逆转录PCR
反向PCR
差示PCR（DD-PCR)
单链构象多态性PCR (SSCP-PCR)
等四种比较特殊的ＰＣＲ．
还可以下细胞生物学，ＷＥＡＴＥＲＮ基因诊断与治疗等一些很有价值的幻灯和资料．很好的网站哦
cuturl('http://swjsx.ntmc.edu.cn/Course/KJ.htm')
作者: 年轮    时间: 2011-9-10 12:31

请问：
我用华舜的小量组织RNA抽提试剂盒,最后用50纯水洗脱下来，我取10，用990纯水稀释，测值，只有0.024/0.013，约1.0，根本不能用，和试剂盒上说的260为0.15-0.50之间相差很远，我这种稀释方法是不是不对？请指教。
作者: 年轮    时间: 2011-9-10 12:32

对不起：忘了单位ul.
我用华舜的小量组织RNA抽提试剂盒,最后用50纯水洗脱下来，我取10ul，用990ul纯水稀释，测OD值，只有0.024/0.013，约1.0，根本不能用，和试剂盒上说的A260为0.15-0.50之间相差很远，我这种稀释方法是不是不对？请指教。

另外：请用过此试剂盒的战友帮个忙，指教一二。
作者: 阿拉蕾    时间: 2011-9-10 12:33

我正准备进行大鼠组织RNA 的提取,其具体方法是不是跟人组织的一样啊?
那位大虾做过,可不可以告诉一下具体的反应体系?
谢谢了!

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我做过大鼠的肾脏，提取和人的一样，反应体系也没有特殊的地方，你放心做好了！
作者: 阿拉蕾    时间: 2011-9-10 12:33

检测肿瘤中癌基因的表达,进行引物设计时是不是没有什么特殊的原则啊

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我们在设计RT-PCR引物时，如果作抑癌基因在肿瘤中的表达，通常以经常发生缺失的外显子设计引物。如果我们作癌基因在肿瘤中的表达，那么设计引物时，是不是用每个外显子都可以，而不用像抑癌基因那样考虑那么复杂，是不是？

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我的经验没有特殊的地方，而且抑癌基因也不是非要将引物设计再缺失的外显子上，这样容易将表达缺失和PCR失败混淆。可以跨越该外显子，根据产物的片断判断是否表达或表达缺失。
作者: 阿拉蕾    时间: 2011-9-10 12:34

请问：
我用华舜的小量组织RNA抽提试剂盒,最后用50纯水洗脱下来，我取10，用990纯水稀释，测值，只有0.024/0.013，约1.0，根本不能用，和试剂盒上说的260为0.15-0.50之间相差很远，我这种稀释方法是不是不对？请指教。

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这样100的稀释误差较大，推荐你用10倍稀释（10＋90）。如果非要稀释100倍，可以做连续稀释，误差小，测量更准确。不过我没有用过华舜的试剂盒，不知其效率如何，不敢妄言。
作者: 果冻也酸    时间: 2011-9-10 12:34

请教高手一个问题，我按预试的条件做RT-PCR，为什么不管怎么调温度都只有B-actin出来。
作者: 椰子叶子    时间: 2011-9-10 12:34

请教高手一个问题，我按预试的条件做RT-PCR，为什么不管怎么调温度都只有B-actin出来。

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希望说清楚点！！！
作者: 阿拉蕾    时间: 2011-9-10 12:35

对不起：忘了单位ul.
我用华舜的小量组织RNA抽提试剂盒,最后用50纯水洗脱下来，我取10ul，用990ul纯水稀释，测OD值，只有0.024/0.013，约1.0，根本不能用，和试剂盒上说的A260为0.15-0.50之间相差很远，我这种稀释方法是不是不对？请指教。

另外：请用过此试剂盒的战友帮个忙，指教一二。

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你的组织量是否太少了？100mg左右，你稀释的倍数是100倍，不算多。上海华顺的盒子我以前用过，还可以，提的RNA电泳条带很好，浓度也没有这么低，现在我喜欢用TRIZOL，TRIPURE能看到RNA沉淀，比较放心，也主要是我离开了上海，也不用华顺的东西了。另注意提高RNA得率的几个注意点，新鲜组织，适度延长裂解时间，无RNA环境等。你很快就成为RNA高手了，不过要多总结其中的技巧与大家分享，相信你的努力不会白费
作者: 阿拉蕾    时间: 2011-9-10 12:35

请教高手一个问题，我按预试的条件做RT-PCR，为什么不管怎么调温度都只有B-actin出来。

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你的目的基因条带没有吗？是否和内参的参数相差太多？分开P能出来吗？RT-PCR就是这样，没有出来前怎么弄都不行，你一旦P出来就会发现其时很简单，怎么做都有东西的。
作者: 阿拉蕾    时间: 2011-9-10 12:36

另外这个盒子最后加水时要加在正中间的，量少与未完全洗脱有无关系？  
作者: 许愿精灵    时间: 2011-9-10 12:36

非常感谢各位的指导， 我今天再试一试。
由于试剂盒要求每次放入组织的量不可超过50mg,否则新鲜组织的RNA酶会降解RNA,所以我没敢多放，而且水也是加在柱子中央的。但还是这样。急呀。
作者: 许愿精灵    时间: 2011-9-10 12:37

还有：请问，电泳时，是稀释100倍吗？
作者: dior    时间: 2011-9-10 12:38

谢谢高手指导，我一个月前用动物模型脑组织作了预试，将我的目的基因Caspase 3 及caspase 9的反应条件都摸出来了，这回我大量重复时用相同条件怎么也p不出了，而不管用什么温度,b-actin总能出条带，请问是哪里出了问题，我用的东西除模板不同，其余都是以前的东西，唉，郁闷！！！  
作者: 微笑的海豚    时间: 2011-9-10 12:38



QUOTE:
原帖由 dior 于 2011-9-10 12:38 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
谢谢高手指导，我一个月前用动物模型脑组织作了预试，将我的目的基因Caspase 3 及caspase 9的反应条件都摸出来了，这回我大量重复时用相同条件怎么也p不出了，而不管用什么温度,b-actin总能出条带，请问是哪里出了问题，我用的东 ...

OPINIONS:
1,你是做的RT-PCR吧，还是那句老话，RT-PCR最重要的是模板，RNA怎么样，CDNA怎么样直接影响到你的结果。你加模板的量可能要加大。
2，建议实验当中注意RNA的质量，CDNA的浓度不能太低。你还好条件是确定了的，比起其他的兄弟要幸福的多。
应该可以P出来的！！
作者: 羊咩咩    时间: 2011-9-10 12:39

我做RT-PCR时，本应该目的片段是350bp，但电泳的结果却是弥漫性的200bp左右（我的退火温度已经降到47度了），我同时还做了个阳性对照（就是以前用RT产物可以P出来的片段）是对的。我就不明白了难道是我的引物设计的有问题？我是用primer premier5.0设计的应该没有问题吧？请高手帮帮忙分析一下可能问题出在哪里？
作者: 微笑的海豚    时间: 2011-9-10 12:40



QUOTE:
原帖由 羊咩咩 于 2011-9-10 12:39 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
我做RT-PCR时，本应该目的片段是350bp，但电泳的结果却是弥漫性的200bp左右（我的退火温度已经降到47度了），我同时还做了个阳性对照（就是以前用RT产物可以P出来的片段）是对的。我就不明白了难道是我的引物设计的有问题？我是用pri ...

OPINIONS：
１，你的弥散的条带，会不会是引物二聚体！？
２，你的引物ＴＭ值是多少，有没有想过退火温度可能是太低了！
３，你的体系怎么样，有没有想过模板加的少了点．５ＵＬ～６ＵＬ／２０ＵＬ体系．
４，提的ＲＮＡ质量不要差了，会很大程度上影响你的ＰＣＲ．
作者: 微笑的海豚    时间: 2011-9-10 12:40

还有：请问，电泳时，是稀释100倍吗？

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电泳时不用稀释。加5～10ul就可以了，不过如你一直都做不出来，就要请人做一次看看。再者，换进口的试剂。没有好办法。我这里做的RNA也有不好的地方，离心机的转速太低，有时不易得到较好的产物。还有就是各方面的条件都要仔细考虑一下有没有可能出问题。如果你在上海，我可以介绍一个人帮你做一次。
作者: 胖小妮子    时间: 2011-9-10 12:41

我马上要做RT-PCR，我先要查目的基因（p27)序列。在ncbi里找了半天没找到，为什么？它定位在12p13上的。请帮下忙哦。谢谢  
作者: 微笑的海豚    时间: 2011-9-10 12:42

这里
cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=67&id=538858&sty=1&tpg=1&age=0')
作者: 橘子水儿    时间: 2011-9-10 12:42

我想请教各位高人:我第一次RT-PCR时内参和目的基因引物一起跑出来两条带,但目的条带很弱而内参条带很亮(跑三十个圈).考虑到可能是由于竞争机制所致,第二次PCR时只加目的基因引物,其它条件不变,可出来的条还是跟第一次一样不亮.是我的目的基因表达水平本身很低?是我的模板量不够(50ul的体系我用了10ulCDNA)?还是我买的鼎国的Taq酶活性不好?另外我还想请教一个非常愚蠢的问题:我用的反转录酶是MMLV,反转录的条件是42度一小时,99度5分钟,这样的温度没问题吧?
作者: 喵咪    时间: 2011-9-10 12:43

我想请教各位高人:我第一次RT-PCR时内参和目的基因引物一起跑出来两条带,但目的条带很弱而内参条带很亮(跑三十个圈).考虑到可能是由于竞争机制所致,第二次PCR时只加目的基因引物,其它条件不变,可出来的条还是跟第一次一样不亮.是我的目的基因表达水平本身很低?是我的模板量不够(50ul的体系我用了10ulCDNA)?还是我买的鼎国的Taq酶活性不好?另外我还想请教一个非常愚蠢的问题:我用的反转录酶是MMLV,反转录的条件是42度一小时,99度5分钟,这样的温度没问题吧?

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OPINIONS:
一，:首先，你RT步骤挺好，没错。
二，1，目的条带弱，可能是你的循环数少了，35个循环试试吧！
2，还有可能是那条不怎么亮的根本就不是你的目的条带，只是一个非特异性扩增罢了，目的条带的反应体系要单独摸一下。
你的模板加的不少了，TAQ酶一般不会有问题。
作者: 胖小妮子    时间: 2011-9-10 12:43

谢谢!我跑条带同时点了Marker,已证实亮的条是内参,暗的条是目的条带,此外还似乎看到一条杂带.是不是有了杂带,我的目的条带就暗了?
作者: 阿拉蕾    时间: 2011-9-10 12:44

谢谢!我跑条带同时点了Marker,已证实亮的条是内参,暗的条是目的条带,此外还似乎看到一条杂带.是不是有了杂带,我的目的条带就暗了?

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你先单独P目的条带，循环多一点，35个。试试看。
可以单独P内参和目的条带然后再混匀后跑电泳。也挺好的哦。呵呵
作者: 不懂    时间: 2011-9-10 12:44

主意不错,但是单日独P后再混匀跑电泳对我的半定量分析是否有影响?
作者: 阿拉蕾    时间: 2011-9-10 12:45

内参的TM和目的条带的TM是不是很接近啊，在同一个条件下P合适吗！！~~？
作者: 许愿精灵    时间: 2011-9-10 12:46

两者的TM确实很接近.我又去P了,跑了三十五个圈,模板的量加到了每50ul体系14ul,但郁闷的是没跑Marker(想省钱),跑出两条很亮的带,带距相差约300bp左右(估计的平方),我想请教一下内参易出现非特异性条带吗?是不是这两条带一条是内参,一条是杂带?可怜我跑电泳后要到别的实验室看条,我今天是没法再跑了!  
作者: 阿拉蕾    时间: 2011-9-10 12:46

两者的TM确实很接近.我又去P了,跑了三十五个圈,模板的量加到了每50ul体系14ul,但郁闷的是没跑Marker(想省钱),跑出两条很亮的带,带距相差约300bp左右(估计的平方),我想请教一下内参易出现非特异性条带吗?是不是这两条带一条是内参,一条是杂带?可怜我跑电泳后要到别的实验室看条,我今天晚上是没法再跑了!

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目的基因和内参照同时跑吗？片段个是多大？内参很少有非特异性条带的，至少我没见过。反应的体系和条件可不可以写出来？通常同管扩增的时候，内参照基因的引物浓度要低于目的基因的（为目的基因的一半或更低，需要摸一下），以减少两种引物间的竞争。电泳最好跑Marker，尤其是摸条件的时候，实在想省钱可以少上一点（亮度差点但能看清条带），在或者用以前的同Marker比过的PCR产物做对比，大体知道哪条带是你要的，如果结果很好你再点Marker跑了拍照，否则你都不知道哪条带是什么。
作者: 爱哭鬼    时间: 2011-9-10 12:47

内参和目的同时跑了,片断分别为457和702bp,反应体系:
CDNA7ul
目的引物10pmol
内参10pmol
Taq酶1.25u
含镁(20mM)buffer2.5ul
双蒸水加至25ul
反应条件:
94度2分钟一圈;94度1分钟,58度1分钟,72度1分钟三十五圈;72度7分钟一圈(TM:目的1: 61.4度,目的2: 59.55,内参1: 64.93,内参2: 62.45)
请多指教!
作者: 阿福    时间: 2011-9-10 12:47

兄弟你做“内参”的目的是什么？
现在如果已经通过它验证了很多的问题，不妨单独摸索扩目的条带的条件。
目的条带的条件不妨降到52-55间看看，如果想回收，只要有扩增就足够了。
作者: 爱哭鬼    时间: 2011-9-10 12:48

做内参的目的:检验CDNA,半定量,目的条件不能再降了,因为57度就有杂带了
作者: 椰子叶子    时间: 2011-9-10 12:48

内参和目的同时跑了,片断分别为457和702bp,反应体系:
CDNA7ul
目的引物10pmol
内参10pmol
Taq酶1.25u
含镁(20mM)buffer2.5ul
双蒸水加至25ul
反应条件:
94度2分钟一圈;94度1分钟,58度1分钟,72度1分钟三十五圈;72度7分钟一圈(TM:目的1: 61.4度,目的2: 59.55,内参1: 64.93,内参2: 62.45)
请多指教!

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建议你：
1.降低内参的引物浓度，内参基因的表达远高于目的基因，两者引物浓度相同肯定会抑制目的基因的扩增，我做过最大的引物比例是1：5（内参0.1，目的0.5）。你把目的引物的浓度固定，内参分别设成不同梯度，找出最佳浓度比。
2.CDNA的量不要再加了，目的基因不好不是CDNA的量不够，而是两者竞争的结果。
3.条件：94度3~5min，94度30s，58度30s，72度1m，35循环，72度7m
作者: 阿拉蕾    时间: 2011-9-10 12:49

同时出现两条很亮的条带时，首先应该降低退火温度再P，如果还是有两条带，且很清晰，那么就要考虑抽提过程中有DNA污染，解决办法：1。选用进口的质量好的TRIZOL；2。重新设计引物，注意上游引物要跨越两个外显子。
作者: 麻瓜    时间: 2011-9-10 12:50

引物如何设计？  
作者: 喵咪    时间: 2011-9-10 12:50

引物如何设计

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看看这个,相信对你有帮助的~!!!
cuturl('http://www.chemie.uni-marburg.de/~becker/welcome.html')
作者: 绿茶公子    时间: 2011-9-10 12:51

这段时间作肺组织及气管粘蛋白MUCIN5AC的RT－PCR，正常组及对照组均可跑出，但地塞米松处理组(0.1mg/kg)一直未跑出，最近将β－actin和MUCIN5AC的引物一起跑PCR，每次均有β－actin出来，但目的片段MUCIN5AC一直未出现，不知为何？我的目的片段MUCIN5AC 500bp,β－actin200bp.  
作者: 绿茶公子    时间: 2011-9-10 12:51

这段时间作肺组织及气管粘蛋白MUCIN5AC的RT－PCR，正常组及对照组均可跑出，但地塞米松处理组(0.1mg/kg)一直未跑出，最近将β－actin和MUCIN5AC的引物一起跑PCR，每次均有β－actin出来，但目的片段MUCIN5AC一直未出现，不知为何？我的目的片段MUCIN5AC 500bp,β－actin200bp.  
作者: finger    时间: 2011-9-10 12:51

这段时间作肺组织及气管粘蛋白MUCIN5AC的RT－PCR，正常组及对照组均可跑出，但地塞米松处理组(0.1mg/kg)一直未跑出，最近将β－actin和MUCIN5AC的引物一起跑PCR，每次均有β－actin出来，但目的片段MUCIN5AC一直未出现，不知为何？我的目的片段MUCIN5AC 500bp,β－actin200bp.

是DXM的抑制作用？还是引物的问题？
作者: 微笑的海豚    时间: 2011-9-10 12:52

正常组及对照组均可跑出，但地塞米松处理组(0.1mg/kg)一直未跑出，
是DXM的抑制作用？还是引物的问题？

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你的实验目的是什么，DXM对该基因的抑制作用？查一下文献有无相关报道。
作者: 微笑的海豚    时间: 2011-9-10 12:52

最近将β－actin和MUCIN5AC的引物一起跑PCR，每次均有β－actin出来，但目的片段MUCIN5AC一直未出现

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降低内参β－actin的引物浓度，内参基因的表达远高于目的基因，两者引物浓度相同肯定会抑制目的基因的扩增。你把目的引物的浓度固定，内参分别设成不同梯度，找出最佳浓度比。
作者: 跳跳糖    时间: 2011-9-10 12:53

文献报道DXM可抑制刺激因素引起的MUCIN5AC表达，但对正常组无影响。另外，我今天跑了MUCIN5AC上下游引物的电泳，上游引物较强，而下游引物非常弱，跑电泳时如何处理。
作者: 8黑眼圈8    时间: 2011-9-10 12:53

如果你的引物溶解、稀释步骤均正确，二者浓度相同，上样量也相同的话，一强一弱可能是合成时下游引物的量不足，导致引物浓度不匹配。这种情况可与公司联系要求重新合成。
作者: 兔纸    时间: 2011-9-10 12:58

请问大鼠与人的内参照是不是一样的？
作者: 哇啦    时间: 2011-9-10 13:01

各路高手，我想问问．在RT-PCR过程中，我提高退火温度到了62度，依旧有非特异性条带，怎么解决．加急！！！  
作者: 阿拉蕾    时间: 2011-9-10 13:01

各路高手，我想问问．在RT-PCR过程中，我提高退火温度到了62度，依旧有非特异性条带，怎么解决．加急！！！

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你为什么不想想降低退火温度呢?
难道,有非特异性条带就非要升高温度吗？
看看其他的贴子,研究研究吧？
作者: 冷眼相对    时间: 2011-9-10 13:02

各位兄弟:我今天P出来了两条带:一条通过Marker定位可以肯定是我的内参条,可另一条约比我的目的条小10个bp左右(内参:457bp，目的705bp)，且其间无杂带，这是为什么？
作者: 旋转木马    时间: 2011-9-10 13:03

大家好!由于我做的RT-PCR的目的基因是没有内含子的,所以对RNA提取过程中的痕量DNA很敏感,我觉得用DNase 1消化的过程对RNA的得率影响很大,而且有时候消化完全,有时候不完全,想求助大家推荐那种盒子能达到完全去除基因组和DNA,或者有比较好的DNase消化的protocols,谢谢啦
作者: 旋转木马    时间: 2011-9-10 13:03

大家好!由于我做的RT-PCR的目的基因是没有内含子的,所以对RNA提取过程中的痕量DNA很敏感,我觉得用DNase 1消化的过程对RNA的得率影响很大,而且有时候消化完全,有时候不完全,想求助大家推荐那种盒子能达到完全去除基因组和DNA,或者有比较好的DNase消化的protocols,谢谢啦
作者: wawa    时间: 2011-9-10 13:04

各路高手，我想问问．在RT-PCR过程中，我提高退火温度到了62度，依旧有非特异性条带，怎么解决．加急！！！

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你为什么不想想降低退火温度呢!!!!!~~~?
难道,有非特异性条带就非要升高温度吗!!!
看看其他的贴子,研究研究吧!!!

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事实上，我设计引物时，PRIMER5.0推荐最佳退火温度是56度，我从56，57，58，60，61，62都做了，在60.7的时候做过一次有很淡的非特异性条带的，但重复时又很明显了.今天跑了一管阳性对照，就是模板不做RT直接做PCR，发现模板有DNA，我出现非特异性条带是否跟这有关呢？用DNA酶消化RNA后效果如何呢？还有，在用TRIZOL提总RNA过程中，同样的条件，提取脑和胃,用同样的引物P，结果脑没有非特异性条带，而胃有，这种情况怎么解决呢？
作者: 阿拉蕾    时间: 2011-9-10 13:05



QUOTE:
原帖由 wawa 于 2011-9-10 13:04 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
各路高手，我想问问．在RT-PCR过程中，我提高退火温度到了62度，依旧有非特异性条带，怎么解决．加急！！！

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你为什么不想想降低退火温度呢!!!!!~~~?
难道,有非特异性条带就非要升高温度吗! ...

ＯＰＩＮＩＯＮＳ：
　１，ＰＲＩＭＥＲ５．Ｏ推荐的退火温度不一定就很好，最好是根据自己的ＰＣＲ经验来判断决定．你的ＰＲＩＭＥＲＳ　的ＴＭ值是多少，退火温度怎么明显偏高．
　２，非特异性条带的出现太难说，不用深想．就按最经典的方法做，别想一些怪招数，事实证明只是在绕弯路．
　３，不同组织，ＲＮＡ成分和量相差太大了，这个出现非特意性条带，那个不出现能证明什么．不是情理之中的事情吗，同样组织提的ＲＮＡ做ＲＴ－ＰＣＲ一个出来另一个什么都没有也很常见．
建议：
　１，可能要调整模板的量．
　２，最重要的是把退火温度摸好，从５０度摸起，２度为一单位，做ＰＣＲ．５５度以下看能不能Ｐ出来．
　３，建议看看ＰＣＲ区ＲＴ－ＰＣＲ区近２周的帖子，研究研究，吸取下别人的经验，融为己用．多想想．
作者: 阿拉蕾    时间: 2011-9-10 13:05

各位兄弟:我今天P出来了两条带:一条通过Marker定位可以肯定是我的内参条,可另一条约比我的目的条小10个bp左右(内参:457bp，目的705bp)，且其间无杂带，这是为什么？

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１０个ＢＰ怎么可能看得出来，就是你的目的条带了．
老大．祝贺你！
作者: 牙牙    时间: 2011-9-10 13:05

请教各位：
我打算进行RNA的鉴定，包括纯度、量以及它的完整性。
可不可以介绍一下你们的经验？比如测OD值的注意事项，以及RNA电泳时与DNA电泳的区别和注意事项。
先谢谢各位。
作者: 许愿精灵    时间: 2011-9-10 13:06

请问各位战友:

我用华舜的小量组织RNA抽提试剂盒,最后用50ul纯水洗脱下来，柱子上总见有白色的东西，那是RNA吗？我按照试剂盒上的时间洗脱，因为纯度达不到，所以我怀疑是不是没洗下来？
作者: 圆圆圈圈    时间: 2011-9-10 13:07

我想请教一下各路高人:我的PCR条件是94度2分钟;94度1分钟,58度1分钟,72度1分钟,三十五个圈;72度7分钟.扩增有时见目的条,有时不肯出现,有人建议我用94度30秒,58度30秒,72度1分钟,三十五圈,退火时间缩短有何好处?
作者: 椰子叶子    时间: 2011-9-10 13:07

我用华舜的小量组织RNA抽提试剂盒,最后用50ul纯水洗脱下来，柱子上总见有白色的东西，那是RNA吗？我按照试剂盒上的时间洗脱，因为纯度达不到，所以我怀疑是不是没洗下来？

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柱子上见到白色的东西?
我高度怀疑你所说的白色东西是柱子上的树脂，有1，2mm的高度，用来吸附RNA的。如果觉得洗脱效果不好，洗脱时间可适当延长。
作者: 椰子叶子    时间: 2011-9-10 13:16

我想请教一下各路高人:我的PCR条件是94度2分钟;94度1分钟,58度1分钟,72度1分钟,三十五个圈;72度7分钟.扩增有时见目的条,有时不肯出现,有人建议我用94度30秒,58度30秒,72度1分钟,三十五圈,退火时间缩短有何好处?

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因为你的片段不长，长的才700多，所以我觉得变性、复性没有必要那么长时间，30s足以，相对减少变性、复性、延伸的时间（PCR循环加快），可增加产物的特异性。复性时间短，引物的非特异性结合会减少，相应可以降低一下复性温度，有利于减少非特异性扩增，增加目的基因的扩增。但鉴于PCR反应的复杂性，具体条件你还是要自己摸一下。
作者: fangxiang    时间: 2011-9-10 13:16

谢谢版主 ，我每次P产物引物二聚体都非常明显（条亮时亦是如此），是不是我的引物浓度太高了？我的引物配法：目的基因-1(1OD):加双蒸水量=4.9nmol/2再乘以100=245(ul)，上下游引物等体积混合后，20ul反应体系加1ul引物混合物。
作者: 岸上的鱼    时间: 2011-9-10 13:18

有没有同志用Trizol提取植物的总RNA能够提出很清晰的两条带的而没有弥散的。另外，在做RT-PCR的时候，大家是用什么做内参比的？用的是什么试剂盒？有没有某种试剂盒里是带18s rRNA PCR引物的？ 多谢喽！：）
作者: 许愿精灵    时间: 2011-9-10 13:18

谢谢，好象就是，哈哈
作者: 森林木    时间: 2011-9-10 13:19

请教高手们，帮助看看 引物设计 的问题，最近郁闷呀

下面的三个连接 分别是待检测的受体三个亚型的mRNA序列，来自NCBI。
RYR2 cuturl('http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=nucleotide&list_uids=34855650&dopt=GenBank&term=RyR+rat&qty=1&linkbar=jsmenu2')
RYR3 cuturl('http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=nucleotide&list_uids=34857573&dopt=GenBank&term=RyR+rat&qty=1&linkbar=jsmenu2')
RYR1 cuturl('http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=nucleotide&list_uids=34855648&dopt=GenBank&term=RyR+rat&qty=1&linkbar=jsmenu2')

目的是想知道三型在特定组织中的mRNA表达情况。
三个的基因特异性引物设计分别如下：
Gene Primer PCR product/bp

RyR2 Forward 5′ GAATCAGTGAGTTACTGGGCATGG 3′ 635

Reverse 5′ CTGGTCTCTGAGTTCTCCAAAAGC 3′

RyR3 Forward 5′ CCTTCGCTATCAACTTCATCCTGC 3′ 505

Reverse 5′ TCTTCTACTGGGCTAAAGTCAAGG 3′

RyR1 Forward 5′ GAAGGTTCTGGACAAACACGGG 3′ 435

Reverse 5′ TCGCTCTTGTTGTAGAATTTGCGG 3′

并建立内参如下：
β actin Forward 5′ TGTATGCCTCTGGTCGTACCAC 3′ 592

Reverse 5′ ACAGAGTACTTGCGCTCAGGAG 3′


一开始偶是做第一个连接中的亚型 RYR2 的表达情况，但用promegra的一步法RT-PCR试了很多次，p不出目的带，有两次依据marker似乎有很淡的目的带，但后来尝试有没有了，只有很强的二聚体，anneal也尝试过几个，touchdown也不行，在大多数的情况下β actin p得多很好，但也有dimer存在，这只能让偶最后怀疑到引物的问题了 。因为头一次接触吧，引物设计当时是参照文献的，而且不止一篇文献是用此引物的，这次贴出来，希望引物设计的高手帮助分析一下，引物到底要不要换，如果可以不换，那p的条件怎么样设；如果要换，如何重新更好的设计。快过年了，经不起折腾了，

附上反应体系，其中有些条件在后面的几次中分别有调整。
帮忙分析分析，望高手赐教，谢谢了。
作者: 森林木    时间: 2011-9-10 13:19

如下图：
作者: 森林木    时间: 2011-9-10 13:19

如下图：

图片附件: 1.gif (2011-9-10 13:20, 19.51 KB) / 该附件被下载次数 9
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=8557



图片附件: 2.gif (2011-9-10 13:20, 19.51 KB) / 该附件被下载次数 11
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=8558

作者: 微笑的海豚    时间: 2011-9-10 13:21

请教高手们，帮助看看 引物设计 的问题，最近郁闷呀

下面的三个连接 分别是待检测的受体三个亚型的mRNA序列，来自NCBI。
RYR2 cuturl('http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=')
三个的基因特异性引物设计分别如下：
Gene

==========================================================

鄙人拙见：
1，引物，不用怎么看，应该没问题。
2，为什么不试下两步法呢。两步法具有对困难RT-PCR的优化能力。也更为常用。
3，退火温度，反应条件要合理。这要对你的引物TM值综合考虑喽。
作者: 许愿精灵    时间: 2011-9-10 13:23

鄙人拙见：
1，引物，不用怎么看，应该没问题。
2，为什么不试下两步法呢。两步法具有对困难RT-PCR的优化能力。也更为常用。
3，退火温度，反应条件要合理。这要对你的引物TM值综合考虑喽。
附上我自己找的的PCR攻略，大家共享。

===================================================================

但现在只有一步法的kit，能不能分开做，但RT时就用这基因特异性的引物可以吗？
作者: 微笑的海豚    时间: 2011-9-10 13:24



QUOTE:
原帖由 许愿精灵 于 2011-9-10 13:23 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
鄙人拙见：
1，引物，不用怎么看，应该没问题。
2，为什么不试下两步法呢。两步法具有对困难RT-PCR的优化能力。也更为常用。
3，退火温度，反应条件要合理。这要对你的引物TM值综合考虑喽。
附上我自己找的的PCR攻略，大家共享。

== ...



ＲＴ时候，用特异的引物当然可以，不过得率，我想不会高的．这样做，你还要合成新的引物，（因为，这个模板是ＲＮＡ啊）．这又何必呢，两步法得了．
不过，一步法，我没做过，不敢批评太多．
我也并不建议你马上换用两步法，因为，理论上一步发也是可以做出来的．
还是摸下条件吧！！！　　　你说呢～！！
另：：：：：　　建议你和该ＫＩＴ公司的技术支持多交流交流，你的话，快过年了，人家也快放假回家抱孩子了，你可要抓紧时间哦．
：）
作者: 阿拉蕾    时间: 2011-9-10 13:25

我提供一点经验：
promega的一步法RT-PCR Kit我用过，一开始也是按照试剂盒的条件怎么也做不出来，后来我按照以前两步法的经验，将Mg2+的浓度调到5mM，dNTP调到1mM（这是两步法时RT的常用条件，可以看一下AMV的使用说明书），结果一下就出来了。后来我想这可能正是问题的根源，两步法尚且用到这么高的浓度，一步法只能高不能低才对，不知道公司是怎样优化条件到这么低的浓度的，可能是我们的待检基因拷贝数太低的缘故。该试剂盒用特异性引物做RT，我的引物用到0.4uM，看不到二聚体。你不妨先试一下，根据你所说的估计引物问题不大，不要着急换引物。
作者: 微笑的海豚    时间: 2011-9-10 13:26

我提供一点经验：
promega的一步法RT-PCR Kit我用过，一开始也是按照试剂盒的条件怎么也做不出来，后来我按照以前两步法的经验，将Mg2+的浓度调到5mM，dNTP调到1mM（这是两步法时RT的常用条件，可以看一下AMV的使用说明书），结果一下就出来了。后来我想这可能正是问题的根源，两步法尚且用到这么高的浓度，一步法只能高不能低才对，不知道公司是怎样优化条件到这么低的浓度的，可能是我们的待检基因拷贝数太低的缘故。该试剂盒用特异性引物做RT，我的引物用到0.4uM，看不到二聚体。你不妨先试一下，根据你所说的估计引物问题不大，不要着急换引物。

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阿拉蕾：
十分感谢你来分析， mg的浓度加过倍的，引物量也减半过，就是dNTP没调过。但内参跑的可以，
还有关于引物，想请教一下，有没有问题？
作者: 阿福    时间: 2011-9-10 13:26

大鼠的rna的提取的方法比较的经典，就是很多的书上写的，用液氮速冻的方法保存组织，然后-70摄氏度保存即可。。
作者: free    时间: 2011-9-10 13:27

向大家推荐一个关于PCR，RT-PCR的基础理论和很有价值的攻略！（非常好哦，我从中收益匪浅）
cuturl('http://www.invitrogen.com.cn/Focus/Focus24/Focus24_Top.htm')

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谢谢！
前段时间刚刚接触PCR,想找些中文的文献资料，但是很郁闷找到的都是长长的英文资料，很头痛地稀里糊涂看了个似懂非懂，很火光。
谢
作者: 阿拉蕾    时间: 2011-9-10 13:28

十分感谢你来分析， mg的浓度加过倍的，引物量也减半过，就是dNTP没调过。但内参跑的可以，
还有关于引物，想请教一下，有没有问题？

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引物应该问题不大，你先调一下体系，试试看吧。
作者: 幸福无罪    时间: 2011-9-10 13:29

请问：谁有Rnase Protection Assay 这方面的经验？
作者: @花开花落@    时间: 2011-9-10 13:31

各位专家，你们好！我是一名分子生物学方面的新手。有个问题想请教大家，还请不吝赐教！
我现在做的RT-PCR，目的片段已出来，但是内参照出不来，请帮我瞧瞧：

大鼠GAPDH产物为250bp，genebank序列文件X02231.引物设计：
5'->3'1131ggagtctact ggcgtcttca
5'->3'1380atggactgtg gtcatgagcc
试剂盒是 TaKaRa One Step RNA PCR Kit (AMV).退火温度57。5，其他按试剂盒操作；RNA 260/280：1。9，电泳条带清晰；
谢谢大家！！
作者: 阿拉蕾    时间: 2011-9-10 13:32



QUOTE:
原帖由 @花开花落@ 于 2011-9-10 13:31 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
各位专家，你们好！我是一名分子生物学方面的新手。有个问题想请教大家，还请不吝赐教！
我现在做的RT-PCR，目的片段已出来，但是内参照出不来，请帮我瞧瞧：
大鼠GAPDH产物为250bp，genebank序列文件X02231.引物设计：
5'->3'1131ggag ...

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图片附件: 47712396.jpg (2011-9-10 13:32, 12.54 KB) / 该附件被下载次数 7
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=8559

作者: 假小子    时间: 2011-9-10 13:32

我想咨询各位大虾
小鼠MCP-1（单核细胞趋化蛋白-1）引物设计，谢谢！
作者: mogu    时间: 2011-9-10 13:33

我是ＲＴ－ＰＣＲ的新手，想请教引物如何设计？
作者: mogu    时间: 2011-9-10 13:33

我是ＲＴ－ＰＣＲ的新手，想请教引物如何设计？
作者: 椰子叶子    时间: 2011-9-10 13:34     标题: 回复 #537 mogu 的帖子

好的引物所具有的令人满意的特点：
*  典型的引物18到24个核苷长。引物需要足够长，保证序列独特性，并降低序列存在于非目的序列位点的可能性。但是长度大于24核苷的引物并不意味着更高的特异性。较长的序列可能会与错误配对序列杂交，降低了特异性，而且比短序列杂交慢，从而降低了产量。
*  选择GC含量为40％到60％或GC含量反映模板GC含量的引物。
*  设计5'端和中间区为G或C的引物。这会增加引物的稳定性和引物同目的序列杂交的稳定性。
*  避免引物对3'末端存在互补序列，这会形成引物二聚体，抑制扩增。
*  避免3'末端富含GC。设计引物时保证在最后5个核苷中含有3个A或T。
*  避免3'末端的错误配对。3'端核苷需要同模板退火以供聚合酶催化延伸。
*  避免存在可能会产生内部二级结构的序列，这会破坏引物退火稳定性。
目的序列上并不存在的附加序列，如限制位点和启动子序列，可以加入到引物5'端而不影响特异性。当计算引物Tm值时并不包括这些序列，但是应该对其进行互补性和内部二级结构的检测。
有时候，仅有有限的序列信箱可供用于引物设计。比如，如果仅知道氨基酸序列，可以设计简并引物。简并引物是指代表编码单个氨基酸所有不同碱基可能性的不同序列的混合物。为了增加特异性，可以参考密码子使用表，根据不同生物的碱基使用偏好，减少简并性。次黄嘌呤可以同所有的碱基配对，降低引物的退火温度。不要在引物的3'端使用简并碱基，因为3'端最后3个碱基的退火足以在错误位点起始PCR。使用较高的引物浓度（1μM到3μM），因为许多简并混合物中的引物不是特异性针对目的模板。
作者: @花开花落@    时间: 2011-9-10 13:34

是我表述有误，我想应该是这样的：
大鼠GAPDH，genebank登陆号AF106860.引物设计：
上游引物5'->3'1131ggagtctact ggcgtcttca
下游引物5'->3'1380atggactgtg gtcatgagcc ；RT-PCR产物为250bp。
试剂盒是 TaKaRa One Step RNA PCR Kit (AMV).退火温度57。5，其他按试剂盒操作；RNA 260/280：1。9，电泳条带清晰；
请各位高手帮我看看，谢谢！！！
作者: 椰子叶子    时间: 2011-9-10 13:35

gapdh 序列
ccgtattcagcattctatgctctcaagttatgaaacaggaaatgatgacctcctgaacttgaggcagtttaactactactttttttaaaaaggcaccaagatacttacaaaaacatttttcttgttttgtttctccatggtttgagtttacttttaaaactttcttttcaccagctattttggagattaatctaacaaaaaacatgaaacttaaatatattttggaaatctaaattatacttagagacttaaatacattttgctgatgactggttacaatacagttacagactaggtatatgttaaatttgaataaaaagttattaaagcattaatctttttcctttcgcaaaacaagttcaccaccatgtgaaataatttcaaattaatgcataagatgtttcttccatttacaaccacaacgattcttctgtaagtcaagctcctaccattcatgctgacatttaggtagaaatttgactgttaaaaaatatgagcttcatttaaactcacctttggtcaatccctgggatttgctttcaaacataaagatcaccacaaagtattaaagaacaggctcttagcacagcaaaacttgtaaaggataaaatcattcatccttgcctctcagacaatgcctggatccctaaagagacaatccatttccaagactgacagccccagagtgtgtatccaattgaatatcgcgatgagtttattcgtcttgactggaatttggtagtaagagaaggaacatccaagtataagtaagggctggcctaaatgataccccaccgtgtgaggtgaccgcatcttcttgtgcagtgccagcctcgtctcatagacaagatggtgaaggtcggtgtgaacggatttggccgtatcggacgcctggttaccagggctgccttctcttgtgacaaagtggacattgttgccatcaacgaccccttcattgacctcaactacatggtctacatgttccagtatgactctacccacggcaagttcaacggcacagtcaaggctgagaatgggaagctggtcatcaacgggaaacccatcaccatcttccaggagcgagatcccgctaacatcaaatggggtgatgctggtgctgagtatgtcgtggagtctactggcgtcttcaccaccatggagaaggctggggctcacctgaagggtggggccaaaagggtcatcatctccgccccttccgctgatgcccccatgtttgtgatgggtgtgaaccacgagaaatatgacaactccctcaagattgtcagcaatgcatcctgcaccaccaactgcttagcccccctggccaaggtcatccatgacaactttggcatcgtggaagggctcatgaccacagtccatgccatcactgccactcagaagactgtggatggcccctctggaaagctgtggcgtgatggccgtggggcagcccagaacatcatccctgcatccactggtgctgccaaggctgtgggcaaggtcatcccagagctgaacgggaagctcactggcatggccttccgtgttcctacccccaatgtatccgttgtggatctgacatgccgcctggagaaacctgccaagtatgatgacatcaagaaggtggtgaagcaggcggccgagggcccactaaagggcatcctgggctacactgaggaccaggttgtctcctgtgacttcaacagcaactcccattcttccacctttgatgctggggctggcattgctctcaatgacaactttgtgaagctcatttcctggtatgacaatgaatatggctacagcaacagggtggtggacctcatggcctacatggcctccaaggagtaagaaaccctggaccacccagcccagcaaggatactgagagcaagagagaggccctcagttgctgaggagtccccatcccaactcagcccccaacactgagcatctccctcacaattccatcccagaccccataacaacaggaggggcctggggagccctcccttctctcgaataccatcaataaagttc
//
我用自己的软件算你引物的TM值如下：
上游引物 ggagtctactggcgtcttca TM 54
下游引物 atggactgtggtcatgagcc TM 54
评价（个人意见）：
**二引物TM虽然很相近，但是偏低，你用的退火温度是57度，一般是P不出来的。建议用50度试下，再不行的话，再降几度进行PCR。引物TM值低了，就是这点烦人，退火温度可能低的吓人。我自己设计的引物，TM从来会控制在60以上。在进行PCR的时候自己心里会有谱，大概知道会在什么温度P出来。
祝你好运喽。！！~~
作者: @花开花落@    时间: 2011-9-10 13:35

非常感谢你的热情帮组！我的这个引物是请公司帮忙设计合成的，建议的上游引物和下游引物的 TM值皆是62。5，然后二者相加之和再减5，就得到退火温度57。5的，这主要是想与我的目的片段一致，可以一起P。我不知道这样对不对，现在公司已经主动帮忙再合成一次，如果还不行的话，我就将底退火温度，分开P了
作者: 喵咪    时间: 2011-9-10 13:36

是我表述有误，我想应该是这样的：
大鼠GAPDH，genebank登陆号AF106860.引物设计：
上游引物5'->3'1131ggagtctact ggcgtcttca
下游引物5'->3'1380atggactgtg gtcatgagcc ；RT-PCR产物为250bp。
试剂盒是 TaKaRa One Step RNA PCR Kit (AMV).退火温度57。5，其他按试剂盒操作；RNA 260/280：1。9，电泳条带清晰；
请各位高手帮我看看，谢谢！！！

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我把你的引物比了一下，也没有什么大的问题。而且这种情况很少见的，一般都是内参照出来了，目的基因出不来，你的正好相反。我建议你把引物电泳一下看看，是否浓度匹配，有时候引物的量不足，或者干脆有一条见不到电泳带，这样肯定会影响结果的。
作者: 春雨    时间: 2011-9-10 13:37

我想请教一下:引物二聚体的形成是否与上下游引物的比例、浓度有关?我的引物上下游浓度不一致,上游跑电泳亮度还可,但下游亮度不是很弱就是没有,我该怎么办?
作者: 阿拉蕾    时间: 2011-9-10 13:38

引物二聚体的形成主要与引物的序列有关，引物浓度高时可增加二聚体形成 的可能性，但二者的比例与二聚体的形成关系不大。不过如果是浓度不匹配，对PCR可产生致命的影响，象你说的情况，可以与合成引物的公司联系，要求重新合成或投诉。
作者: 小荷尖尖    时间: 2011-9-10 13:39

用 BD SMART.TM RACE cDNA
Amplication Kit 扩基因全长,实验情况是这样：5`及3`cDNA均按程序合成，并分别做模板做TFR的阳性对照时，其对照及内对照均不能做出，所用方法步骤及Touchdown
PCR均完全按说明书进行，将退火温度降至58度亦没能做出，以TFR的引物做普通PCR亦不能扩出任何条带，而我用另一看家基因GAPDH的引物用同样的5`cDNA为模板做Touchdown
PCR，只是退火温度有所降低，却做出了对照与内对照，并且其普通PCR亦扩出了一单一的目的片断。我想这应该能说明我的第一链合成是成功的，但为什么TFR的对照却做不出，我想应该是试剂盒中的TFR的引物出了问题，如果真是这样，那就难保其他成分没问题，所以我希望大家帮忙出出办法,非常感谢!  
作者: 阿拉蕾    时间: 2011-9-10 13:40

非常感谢你的热情帮组！我的这个引物是请公司帮忙设计合成的，建议的上游引物和下游引物的 TM值皆是62。5，然后二者相加之和再减5，就得到退火温度57。5的，这主要是想与我的目的片段一致，可以一起P。我不知道这样对不对，现在公司已经主动帮忙再合成一次，如果还不行的话，我就将底退火温度，分开P了。

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公司不同，对引物TM值的计算方法差异很大，结果也当然大相径庭，不知道你是怎么做的，无论公司怎么说TM值，我是要自己用个小东西算下的，这样才有一致的评价水平，对退火温度的把握会准一点。我还是，那句话，你的退火温度太高了，我不能说是公司对引物的TM值计算有误，他们给你这样高的TM值，肯定退火温度要在很大的区间中变动，毕竟自己的尺度自己把握。我有自己的尺度，建议你也要有自己的计算方法，以便对引物把握的更准确，也是为了长时间做PCR考虑。
作者: 阿拉蕾    时间: 2011-9-10 13:40

用 BD SMART.TM RACE cDNA
Amplication Kit 扩基因全长,实验情况是这样：5`及3`cDNA均按程序合成，并分别做模板做TFR的阳性对照时，其对照及内对照均不能做出，所用方法步骤及Touchdown
PCR均完全按说明书进行，将退火温度降至58度亦没能做出，以TFR的引物做普通PCR亦不能扩出任何条带，而我用另一看家基因GAPDH的引物用同样的5`cDNA为模板做Touchdown
PCR，只是退火温度有所降低，却做出了对照与内对照，并且其普通PCR亦扩出了一单一的目的片断。我想这应该能说明我的第一链合成是成功的，但为什么TFR的对照却做不出，我想应该是试剂盒中的TFR的引物出了问题，如果真是这样，那就难保其他成分没问题，所以我希望大家帮忙出出办法,非常感谢!

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这些问题问生产及销售该KIT的公司销售部，技术部比较合适，他们比我们了解的多的多。
作者: 阿拉蕾    时间: 2011-9-10 13:41

引物二聚体的形成主要与引物的序列有关，引物浓度高时可增加二聚体形成 的可能性，但二者的比例与二聚体的形成关系不大。不过如果是浓度不匹配，对PCR可产生致命的影响，象你说的情况，可以与合成引物的公司联系，要求重新合成或投诉。

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呵呵，痛主任，浓度不一样，可以浓的稀释一点啊，重新合成或投诉没什么必要吧
作者: HOT兔    时间: 2011-9-10 13:41

RT-PCR实验有三步较为关键：抽提RNA，RT，PCR。
我的建议是：1. 做RT前最好测一下RNA浓度，逆转录体系对RNA量还是有一些要求，我的印象是至少大于1ng。

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最近实验需要用RT-PCR半定量方法检测受试物对培养的细胞c-fos基因mRNA转录水平的影响，选用β-actin为内标。由于以前没有经验，前段时间做RT之前，RNA没定量，PCR之后，β-actin的浓度相差很大。最近用OD260/OD280定量RNA，但是觉得稳定性不好，每次测量相差很大，比值一般不在1.7-2.0之间，要么小于1.7要么大于2.0。请问RNA定量的方法还有几种？最好说得仔细一点。
谢谢！！
作者: 阿拉蕾    时间: 2011-9-10 13:42

最近实验需要用RT-PCR半定量方法检测受试物对培养的细胞c-fos基因mRNA转录水平的影响，选用β-actin为内标。由于以前没有经验，前段时间做RT之前，RNA没定量，PCR之后，β-actin的浓度相差很大。最近用OD260/OD280定量RNA，但是觉得稳定性不好，每次测量相差很大，比值一般不在1.7-2.0之间，要么小于1.7要么大于2.0。请问RNA定量的方法还有几种？最好说得仔细一点。
谢谢！！

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我提供以下这些，再详细的你看看分子可隆或者其他的什么资料吧，定量一般就是用分光光度，或者GENEQUNT吧。
【经验】如何确认RNA的质量
各位都知道，提取到质量良好的RNA（包括总RNA和mRNA，以下同）是非常困难，关于RNA的提取技术，我就不说了，为什么呢？或许各位非常关心呢，我是这样想的，我可以看到的资料或者是厂家的说明书，各位也同样可以看到的，内容当然都是一样的了，所以实验做的好不好，主要是心的投入多少的问题，所以希望大家自己多多思考啊！
以下两种方法，相信大家都知道的：
1）检测RNA溶液的吸光度
280、320、230、260nm下的吸光度分别代表了核酸、背景（溶液浑浊度）、盐浓度和蛋白等有机物的值。一般的，我们只看OD260/OD280（Ratio，R）。
1.82.0时，我们认为RNA中蛋白或者时其他有机物的污染是可以容忍的，不过要注意，当你用Tris作为缓冲液检测吸光度时，R值可能会大于2（一般应该是<2.2的）。当R<1.8时，溶液中蛋白或者时其他有机物的污染比较明显，你可以根据自己的需要决定这份RNA的命运。当R>2.2时，说明RNA已经水解成单核酸了。
如果RNA的量够，可在260nm（A260）用分光光度法测定RNA的得率，1个单位等于40ug/mlssRNA。纯RNA的A260/A280的比值为2.0。A260/A230的比值还表明RNA的纯度，其值小于2.0表明裂解液中有亚硫氰胍和belta-巰基乙醇残留，其值大于2.4，需用乙酸盐，乙醇沉淀RNA。
2）RNA的电泳图谱
一般的，RNA的电泳都是用变性胶进行的，但是根据我的经验，如果你仅仅是为了检测RNA的质量是没有必要进行如此麻烦的实验的，用普通的琼脂糖胶就可以了。
电泳的目的是在于检测28S和18S条带的完整性和他们的比值，或者是mRNA smear的完整性。一般的，如果28S和18S条带明亮、清晰、条带锐利（指条带的边缘清晰），并且28S的亮度在18S条带的两倍以上，我们认为RNA的质量是好的（见下图）。
以上是我们常用的两种方法，但是这两种方法都无法明确的告诉我们RNA溶液中有没有残留的RNA酶。如果溶液中有非常微量的RNA酶，用以上方法我们很难察觉，但是大部分后续的酶学反应都是在37度以上并且是长时间进行的。这样，如果RNA溶液中有非常微量的RNA酶，那么在后续的实验中就会有非常适合的环境和时间发挥它们的作用了，当然这时你的实验也就完了。
下面，我们介绍一个可以确认RNA溶液中有没有残留的RNA酶的方法。
3）保温试验
方法很简单的，按照样品浓度，从RNA溶液中吸取两份1000 ng的RNA加入至0.5 ml的离心管中,并且用pH7.0的Tris缓冲液补充到10 ul的总体积，然后密闭管盖。把其中一份放入70℃的恒温水浴中,保温1 h。另一份放置在-20℃冰箱中保存1 h。
时间到了之后，取出两份样本进行电泳。电泳完成后，比较两者的电泳条带。如果两者的条带一致或者无明显差别（当然，它们的条带也要符合方法2中的条件），则说明RNA溶液中没有残留的RNA酶污染，RNA的质量很好。相反的，如果70℃保温的样本有明显的降解，则说明RNA溶液中有RNA酶污染。
如果你的RNA样本通过了保温实验的检测并且你在后续的实验中还是非常小心的防范RNA酶的骚扰，那么你的实验应该是很难失败了！
以上内容有任何错误之处，请指正！感谢！
作者: 阿福    时间: 2011-9-10 13:43

呵呵，浓度不一样，可以浓的稀释一点啊，重新合成或投诉没什么必要吧。

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果然是你啊！！昨天看到“铃声”就想可能是你改名了，今天看到你的LOGO才最后确认了。
我想我们对浓度不同的理解不同：我理解你所说的浓度不同是指一开始就溶解成不同的浓度吧（加入等量的水或TE），那个浓度已知，当然我们把浓的稀释一下就可以了。我所说的是稀释成相同浓度时，如果电泳结果一个很亮，而一个不亮或没有，那是合成时的过错，其中的一个量不足，当然要找合成的公司，因为我们不知道合成不足的那一条究竟量是多少，也可能完全没有。当然如果较真的话，可以测一下OD值，自己再算一下，但这是公司的过错，干嘛不找他们。
作者: loli    时间: 2011-9-10 13:43

我是分子生物学实验新手，我在做RT-PCR,现在我碰到一个问题即目的基因单跑时效果很好，但是和内参B-actin,合在一起跑时却弱得很，请问这是什么原因？
所有的实验条件都是相同的。
作者: loli    时间: 2011-9-10 13:43

我是分子生物学实验新手，我在做RT-PCR,现在我碰到一个问题即目的基因单跑时效果很好，但是和内参B-actin,合在一起跑时却弱得很，请问这是什么原因？
所有的实验条件都是相同的。
作者: 微笑的海豚    时间: 2011-9-10 13:44

我想我们对浓度不同的理解不同：我理解你所说的浓度不同是指一开始就溶解成不同的浓度吧（加入等量的水或TE），那个浓度已知，当然我们把浓的稀释一下就可以了。我所说的是稀释成相同浓度时，如果电泳结果一个很亮，而一个不亮或没有，那是合成时的过错，其中的一个量不足，当然要找合成的公司，因为我们不知道合成不足的那一条究竟量是多少，也可能完全没有。当然如果较真的话，可以测一下OD值，自己再算一下，但这是公司的过错，干嘛不找他们。

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同意
作者: 哇啦    时间: 2011-9-10 13:44

我配制的引物浓度约35pM,听你的建议，我会把引物电泳一下看看，希望我在过年前顺利过关。
谢谢铃声的建议，我会自己注意这方面的问题的，
作者: 小葵    时间: 2011-9-10 13:45

我是分子生物学实验新手，我在做RT-PCR,现在我碰到一个问题即目的基因单跑时效果很好，但是和内参B-actin,合在一起跑时却弱得很，请问这是什么原因？
所有的实验条件都是相同的。

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你的意思是说单独扩效果不错？而同管扩增效果不好？如果是这样，原因可能有很多，例如引物之间的相互竞争，dNTP的利用，基因丰度不同导致你的目的基因与内参之间的不对称竞争，这些都是同管扩展要考虑的.
作者: 绵绵    时间: 2011-9-10 13:46

请各位帮忙分析：今天行PCR产物电泳，在所作的两个标本的PCR产物均处于2000bp位置，条带很亮，无其他条带。而我进行的巢式PCR，引物均设计为20bp，目的条带应在250bp位置。怎么回事？请不吝赐教！！！
作者: 喵咪    时间: 2011-9-10 13:47

请各位帮忙分析：今天行PCR产物电泳，在所作的两个标本的PCR产物均处于2000bp位置，条带很亮，无其他条带。而我进行的巢式PCR，引物均设计为20bp，目的条带应在250bp位置。怎么回事？请不吝赐教！！！


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2000BP的条带是非特意性的扩增，有什么好说的，继续摸下PCR条件，主要是退火温度。~！！
作者: guagua    时间: 2011-9-10 13:48

我是分子生物学实验新手，我在做RT-PCR,现在我碰到一个问题即目的基因单跑时效果很好，但是和内参B-actin,合在一起跑时却弱得很，请问这是什么原因？
所有的实验条件都是相同的。

你的意思是说单独扩效果不错？而同管扩增效果不好？如果是这样，原因可能有很多，例如引物之间的相互竞争，dNTP的利用，基因丰度不同导致你的目的基因与内参之间的不对称竞争，这些都是同管扩展要考虑的.


还想请教一下各位高手,如果有那么多的因素影响同一管中加入内参和目的基因的扩增效,那怎样才能避免或如何解决这个冲突和矛盾呢?或者那位高手指点一下我在哪儿可以找到相关资料?
作者: 荷塘青蛙！    时间: 2011-9-10 13:48

我是分子生物学新手.我想就内参和目的基因同一管中的几个问题再请教一下您。 一般来说cDNA的量加多少就行了？您说的内参引物浓度0.1，目的基因引物浓度0.5的单位是什么？体积单位吗？我现在也存在这样的问题，目的基因较单扩增时弱的很。您觉的将B-actin 的浓度降为0.5ul（20umol ）可以出结果吗？1ul时我已经扩增出来了
作者: 过路甲    时间: 2011-9-10 13:49

请教WW：
我是RT-PCR新手，结果不理想，以下是我最近的电泳图，我的目的基因是670BP，内参是451BP，退火温度是57度，55度，但是杂带很多，目的基因和内参均没有出现，电泳图中MARK中最亮为500BP，能不能帮我分析一下原因，谢谢了！

图片附件: 88545052.jpg (2011-9-10 13:49, 12.68 KB) / 该附件被下载次数 4
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=8560

作者: 柠檬籽    时间: 2011-9-10 13:50

请问：两条引物的bp数量要求一致吗？我查的文献，VEGF的引物，一条是20bp，一条是19bp，不知道可不可以。
先谢谢各位大虾了！
作者: @木木@    时间: 2011-9-10 13:51

请各位高手帮我看一下电泳图吧，虽然黑了点，

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非特异的扩增啊，老大。
建议你再做做吧，摸下退火温度，降低下退火温度，从51度开始P。
起码内参应该能P出来。
作者: Darcy    时间: 2011-9-10 13:52

请问：两条引物的bp数量要求一致吗？我查的文献，VEGF的引物，一条是20bp，一条是19bp，不知道可不可以。
先谢谢各位大虾了！

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长度的区别没什么关系，主要是看GC含量和TM值，以及各引物本身的特点，有没有茎环啊，等等。
作者: 去看海    时间: 2011-9-10 13:52

请教各位高手:我用RT-PCR跑出了目的基因,但是OMIM上却显示Northern blot结果是阴性的.这两者如何解释?是否RT-PCR结果不可信?我有没有必要再做下去?
作者: free    时间: 2011-9-10 13:53

请教各位大虾：
我的cDNA总是不稳定，在-20度下只能保存1周内目的基因能跑出来,一周后就不行了,但内参一直都能跑出来,不知是什么原因????
作者: 椰子叶子    时间: 2011-9-10 13:53

请教各位大虾：
我的cDNA总是不稳定，在-20度下只能保存1周内目的基因能跑出来,一周后就不行了,但内参一直都能跑出来,不知是什么原因????

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不是CDNA不稳定，而是你的PCR不稳定。
这种情况很常见的。如果真的P不出来，只有再提次RNA了。
作者: @木木@    时间: 2011-9-10 13:53

感谢楼上的兄弟：
不是CDNA不稳定，而是你的PCR不稳定。是指的哪一步，还是整个体系？？？？
作者: 按秒计算    时间: 2011-9-10 13:54

各位大虾好：
快过年了，不知道大家都回家休息去了没有？我却郁闷的很呀。做了好长时间的RT-PCR，结果都不好。开始目的条带都跑出来了，但是杂带特别多，提高了温度效果还是不理想，也不知道是不是引物的问题？真的是很烦呀，经费又特别紧张，该怎么办呢?是继续摸条件呀？还是换引物呀？请大家抽点时间给我点建议，好吗？多谢了！！要不我真的不知道该怎么过年了。
还有一个问题cDNA在-20度能保存多久呀？怎么原来能跑出来的，现在什么也跑不出来了呀？就连内参都没有
作者: 喵咪    时间: 2011-9-10 13:55

我是这里的新人，也是分子生物学方面的新手。
我的几个问题如下：1）RT和PCR时的引物设计是不是一定要先知道目的基因的序列？2）RT-PCR 的说明书上写，在RT时，引物设计有3种方法即a：Random 9mers；b：Oligo dT-Adaptor Primer；和c：特异的下游引物。如果用a和b方法，那么其他非目的基因不是也会RT和PCR吗？那么电泳后又怎么知道哪个条带是所要的目的片段呢，它的预期大小又是多少呢？3）如果用c方法，那么要去那里查它的序列呢？4）是不是可以完全参考相关实验内容的文献给出的引物进行我的实验呢？
我希望朋友能指点我，虽然这是一些很菜鸟的问题！谢谢！

goodfreecn

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PCR 或RT-PCR时扩增的是两引物之间的一段基因序列，做pCR一般来说要知道目的基因的序列或氨基酸序列，但反向PCR可以扩增已知序列以外的序列。
PT-PCR在逆转录阶段，应用不同的引物扩增的片断可能不同，但在PCR阶段它只是扩增你的上下游引物之间的片段，PCR经过25-30次循环后你所要的基因片段得到大大的扩增。电泳时如果没有意外的话应用一条条带，并且在大小相同的mark处。
到参考文献查相应的引物，国外的文献，参考价值大，但自己还是要看一看。


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给你推荐一个网站是专门查基因序列的cuturl('http://www.ncbi.nlm.nih.gov/'),我现在P的序列就是在GENBANK里找到的。
作者: 喵咪    时间: 2011-9-10 13:56

本人在做RT-PCR遇到一怪现象，即本人对同一动物不同组织扩增同一段基因，结果从一种组织中可以扩出我的目的基因，条带非常的好，而另一组织在同样的条件下却得到许多非特异性的条带，尝试其他条件同样无法得到满意的结果，百思不得其解！（注：已肯定该基因在两种组织中都表达，且内参照在两种组织都可扩增出来）
从这两种组织中提取的RNA的量是不一样的，我测过吸光度，差异还很大，会不会和这有关呢？ 请高手指教！

你说的此现象，在做“给予某种干预后测目的基因在各胀器中的表达的变化”中太常见了，我认为是否与目的基因在各脏器中的表达不一致有关呢？内参之所以能成为内参也因为它在各组织表达稳定。
作者: 白鸟之翼    时间: 2011-9-10 13:56

各位大虾好：
快过年了，不知道大家都回家休息去了没有？我却郁闷的很呀。做了好长时间的RT-PCR，结果都不好。开始目的条带都跑出来了，但是杂带特别多，提高了温度效果还是不理想，也不知道是不是引物的问题？真的是很烦呀，经费又特别紧张，该怎么办呢?是继续摸条件呀？还是换引物呀？请大家抽点时间给我点建议，好吗？多谢了！！要不我真的不知道该怎么过年了。
还有一个问题cDNA在-20度能保存多久呀？怎么原来能跑出来的，现在什么也跑不出来了呀？就连内参都没有跑出来。
各位大虾一定要帮帮我呀，我真是没办法了。多谢了！！！

美钱做实验的感觉呀！嗨，可就别提了，找个有钱的老板就不会操此心。我好同情你，我劝你就找个高手p一次。倘若不行，趁早换引物吧。cDNA保成时间可不好说，本人体会10天半月应该还行。不过，既然做出来，就一汽呵成较好。 还是先回家开开心心过年吧，有压力时，实验多半做不好。喜喜，本人的一点小体会。
作者: 阿拉蕾    时间: 2011-9-10 13:57

做RT-PCR后用分光光度剂测量RNA量的时候，用什么方法处理装提取物的玻璃管？多谢！！
如果你还想要RNA，就按照分子克隆上的方法处理。

用微量比色杯时，去离子水洗10次,每次洗完后甩干最好用真空泵把水吸干。

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如果是玻璃制品的话，用0.01%的DEPC水处理，再在300度下烘干4个小时即可
如果是塑料制品的话，用DEPC水过夜处理后还有高温高压灭菌30分钟，操作时戴手套即可
作者: 喵咪    时间: 2011-9-10 15:46

做RT-PCR后用分光光度剂测量RNA量的时候，用什么方法处理装提取物的玻璃管？多谢！！

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用DEPC水润洗1，2遍后
如果你的总RNA是溶于DEPC水，则用DEPC水为对照调零，然后用你的RNA溶液充池测量就可以了
作者: 喵咪    时间: 2011-9-10 15:47

请教各位大虾：
我的cDNA总是不稳定，在-20度下只能保存1周内目的基因能跑出来,一周后就不行了,但内参一直都能跑出来,不知是什么原因????

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内参能出来，说明cDNA的质量没大的问题

那出问题的，很可能是你PCR的体系的不稳定造成的。
具体需要考虑的是：

1）是否换过机器，不同机器还是存在微小差别的
2）是否换过试剂，不同的品牌，即便同品牌，不同批次的产品性能也有出入
3）试剂是否失效，或者被污染。
4）是否存在人为的失误，加样的准确度？

总之很多因素，谨慎一些
作者: 喵咪    时间: 2011-9-10 15:47

请教各位高手:我用RT-PCR跑出了目的基因,但是OMIM上却显示Northern blot结果是阴性的.这两者如何解释?是否RT-PCR结果不可信?我有没有必要再做下去?

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把你跑出的“目的”片段回收，送去测序
这样就都OK了

看看是否是非特异性扩增，或者是OMIM里的记录有问题
作者: @花开花落@    时间: 2011-9-10 15:47

我现在很郁闷,年前的RT-PCR做的好好的,可年后用年前的模板扩增它就是死也不肯出条带(连内参都没有),是CDNA降解了吗?有高手帮我解难吗?我想跳楼了
作者: =菓子=    时间: 2011-9-10 15:54

请教各位一个很菜的问题:同时对几条不同引物进行PCR,各个引物之间的长度是不是应该有区别?区别有多大跑出来带的才明显?引物有没有种属区别?同一个物质,用来做鼠的引物也可以用来做人的吗?谢谢!请不要见笑!
作者: 阿拉蕾    时间: 2011-9-10 15:55

我现在很郁闷,年前的RT-PCR做的好好的,可年后用年前的模板扩增它就是死也不肯出条带(连内参都没有),是CDNA降解了吗?有高手帮我解难吗?我想跳楼了

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你的问题可能是：1）如你所想的一样，CDNA降解了，但可能性不大。这么短的时间内就有问题了。可以再提些RNA做一下，能行的话，就是CDNA有问题。
2）PCR体系出问题，注意你的酶的有效期，以及操作上应注意的问题，多看看丁香园内PCR攻略，应该能解决你的问题。
3) 实验出各种问题的现象比比皆是，出现问题要有办法去解决才能提高，一帆风顺的事情在任何地方都不会时刻相伴，但问题和困难却会这样。把自己的难题多想想，把做的东西多对照，问题解决了，你也就学到东西了。
作者: 阿拉蕾    时间: 2011-9-10 15:56

请教各位一个很菜的问题:同时对几条不同引物进行PCR,各个引物之间的长度是不是应该有区别?区别有多大跑出来带的才明显?引物有没有种属区别?同一个物质,用来做鼠的引物也可以用来做人的吗?谢谢!请不要见笑!

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同时对几条引物进行PCR，不知你准备扩几个目的片段？一般情况下都是要的目的基因加内参，两对引物就可以了，不要太多。我做的时候连内参也分开做。因此引物的差别大小就不必考虑了。
一般来说有种属的区别，不能混用。但在特定的基因上会有相同的，引物的设计上也会相同，这仅是极少的现象，不应这样去考虑和操作。
作者: =菓子=    时间: 2011-9-10 15:56

我不仅要目的基因，还要分辨出目的基因是我设想的细胞产生的，而不是可能混入的其它细胞产生的，所一我还得设计针对可能混入细胞的特异分子的引物，为了更能说明问题，最好还得设计设想的细胞的特异分子的引物，怎么办呢？谢谢！
作者: 微笑的海豚    时间: 2011-9-10 15:57

我想若设计只在你所设想的细胞中表达而不在其它细胞表达的基因的引物便可解决你的问题.
作者: =菓子=    时间: 2011-9-10 15:57

问题是目前的观点是：我的目的基因还没发现在我设想的细胞上表达，而公认在可能混入的细胞上有表达。我可以纯化我设想的细胞，但是不可能100%纯化呀。
作者: 椰子叶子    时间: 2011-9-10 15:59

Real-Time RT-PCR

by Subbu Dharmaraj, MS

RT-PCR (reverse transcription-polymerase chain reaction) is the most sensitive technique for mRNA detection and quantitation currently available. Compared to the two other commonly used techniques for quantifying mRNA levels, Northern blot analysis and RNase protection assay, RT-PCR can be used to quantify mRNA levels from much smaller samples. In fact, this technique is sensitive enough to enable quantitation of RNA from a single cell.

This article first discusses the advantages of real-time RT-PCR compared to end-point methods. This discussion is followed by a description of the different methods for quantitating gene expression by real-time RT-PCR with respect to the different chemistries available, the quantitation methods used and the instrumentation options available. Subsequently, the “traditional” methods of quantitating gene expression by RT-PCR, i.e. end-point techniques, are presented.

Why Real-Time RT-PCR?

Over the last several years, the development of novel chemistries and instrumentation platforms enabling detection of PCR products on a real-time basis has led to widespread adoption of real-time RT-PCR as the method of choice for quantitating changes in gene expression. Furthermore, real-time RT-PCR has become the preferred method for validating results obtained from array analyses and other techniques that evaluate gene expression changes on a global scale.

To truly appreciate the benefits of real-time PCR, a review of PCR fundamentals is necessary. At the start of a PCR reaction, reagents are in excess, template and product are at low enough concentrations that product renaturation does not compete with primer binding, and amplification proceeds at a constant, exponential rate. The point at which the reaction rate ceases to be exponential and enters a linear phase of amplification is extremely variable, even among replicate samples, but it appears to be primarily due to product renaturation competing with primer binding (since adding more reagents or enzyme has little effect). At some later cycle the amplification rate drops to near zero (plateaus), and little more product is made.

For the sake of accuracy and precision, it is necessary to collect quantitative data at a point in which every sample is in the exponential phase of amplification (since it is only in this phase that amplification is extremely reproducible). Analysis of reactions during exponential phase at a given cycle number should theoretically provide several orders of magnitude of dynamic range. Rare targets will probably be below the limit of detection, while abundant targets will be past the exponential phase. In practice, a dynamic range of 2-3 logs can be quantitated during end-point relative RT-PCR. In order to extend this range, replicate reactions may be performed for a greater or lesser number of cycles, so that all of the samples can be analyzed in the exponential phase.

Real-time PCR automates this otherwise laborious process by quantitating reaction products for each sample in every cycle. The result is an amazingly broad 107-fold dynamic range, with no user intervention or replicates required. Data analysis, including standard curve generation and copy number calculation, is performed automatically. With increasing numbers of labs and core facilities acquiring the instrumentation required for real-time analysis, this technique is becoming the dominant RT-PCR-based quantitation technique.
作者: 椰子叶子    时间: 2011-9-10 15:59

Real-Time PCR Chemistries

Currently four different chemistries, TaqMan® (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA), Molecular Beacons, Scorpions® and SYBR® Green (Molecular Probes), are available for real-time PCR. All of these chemistries allow detection of PCR products via the generation of a fluorescent signal. TaqMan probes, Molecular Beacons and Scorpions depend on Förster Resonance Energy Transfer (FRET) to generate the fluorescence signal via the coupling of a fluorogenic dye molecule and a quencher moeity to the same or different oligonucleotide substrates. SYBR Green is a fluorogenic dye that exhibits little fluorescence when in solution, but emits a strong fluorescent signal upon binding to double-stranded DNA.

TaqMan Probes

TaqMan probes depend on the 5'- nuclease activity of the DNA polymerase used for PCR to hydrolyze an oligonucleotide that is hybridized to the target amplicon. TaqMan probes are oligonucleotides that have a fluorescent reporter dye attached to the 5' end and a quencher moeity coupled to the 3' end. These probes are designed to hybridize to an internal region of a PCR product. In the unhybridized state, the proximity of the fluor and the quench molecules prevents the detection of fluorescent signal from the probe. During PCR, when the polymerase replicates a template on which a TaqMan probe is bound, the 5'- nuclease activity of the polymerase cleaves the probe. This decouples the fluorescent and quenching dyes and FRET no longer occurs. Thus, fluorescence increases in each cycle, proportional to the amount of probe cleavage

Well-designed TaqMan probes require very little optimization. In addition, they can be used for multiplex assays by designing each probe with a spectrally unique fluor/quench pair. However, TaqMan probes can be expensive to synthesize, with a separate probe needed for each mRNA target being analyzed.

Molecular Beacons

Like TaqMan probes, Molecular Beacons also use FRET to detect and quantitate the synthesized PCR product via a fluor coupled to the 5' end and a quench attached to the 3' end of an oligonucleotide substrate. Unlike TaqMan probes, Molecular Beacons are designed to remain intact during the amplification reaction, and must rebind to target in every cycle for signal measurement. Molecular Beacons form a stem-loop structure when free in solution. Thus, the close proximity of the fluor and quench molecules prevents the probe from fluorescing. When a Molecular Beacon hybridizes to a target, the fluorescent dye and quencher are separated, FRET does not occur, and the fluorescent dye emits light upon irradiation.

Molecular Beacons, like TaqMan probes, can be used for multiplex assays by using spectrally separated fluor/quench moieties on each probe. As with TaqMan probes, Molecular Beacons can be expensive to synthesize, with a separate probe required for each target.
作者: 椰子叶子    时间: 2011-9-10 15:59

Scorpions

With Scorpion probes, sequence-specific priming and PCR product detection is achieved using a single oligonucleotide. The Scorpion probe maintains a stem-loop configuration in the unhybridized state. The fluorophore is attached to the 5' end and is quenched by a moiety coupled to the 3' end. The 3' portion of the stem also contains sequence that is complementary to the extension product of the primer. This sequence is linked to the 5' end of a specific primer via a non-amplifiable monomer. After extension of the Scorpion primer, the specific probe sequence is able to bind to its complement within the extended amplicon thus opening up the hairpin loop. This prevents the fluorescence from being quenched and a signal is observed.

SYBR Green

SYBR Green provides the simplest and most economical format for detecting and quantitating PCR products in real-time reactions. SYBR Green binds double-stranded DNA, and upon excitation emits light. Thus, as a PCR product accumulates, fluorescence increases. The advantages of SYBR Green are that it is inexpensive, easy to use, and sensitive. The disadvantage is that SYBR Green will bind to any double-stranded DNA in the reaction, including primer-dimers and other non-specific reaction products, which results in an overestimation of the target concentration. For single PCR product reactions with well designed primers, SYBR Green can work extremely well, with spurious non-specific background only showing up in very late cycles.

SYBR Green is the most economical choice for real-time PCR product detection. Since the dye binds to double-stranded DNA, there is no need to design a probe for any particular target being analyzed. However, detection by SYBR Green requires extensive optimization. Since the dye cannot distinguish between specifc and non-specifc product accumulated during PCR, follow up assays are needed to validate results.

Real-time Reporters for Multiplex PCR

TaqMan probes, Molecular Beacons and Scorpions allow multiple DNA species to be measured in the same sample (multiplex PCR), since fluorescent dyes with different emission spectra may be attached to the different probes. Multiplex PCR allows internal controls to be co-amplified and permits allele discrimination in single-tube, homogeneous assays. These hybridization probes afford a level of discrimination impossible to obtain with SYBR Green, since they will only hybridize to true targets in a PCR and not to primer-dimers or other spurious products.
作者: 椰子叶子    时间: 2011-9-10 16:00

Quantitation of Results

Two strategies are commonly employed to quantify the results obtained by real-time RT-PCR; the standard curve method and the comparative threshold method. These are discussed briefly below.

Standard Curve Method

In this method, a standard curve is first constructed from an RNA of known concentration. This curve is then used as a reference standard for extrapolating quantitative information for mRNA targets of unknown concentrations. Though RNA standards can be used, their stability can be a source of variability in the final analyses. In addition, using RNA standards would involve the construction of cDNA plasmids that have to be in vitro transcribed into the RNA standards and accurately quantitated, a time-consuming process. However, the use of absolutely quantitated RNA standards will help generate absolute copy number data.

In addition to RNA, other nucleic acid samples can be used to construct the standard curve, including purified plasmid dsDNA, in vitro generated ssDNA or any cDNA sample expressing the target gene. Spectrophotometric measurements at 260 nm can be used to assess the concentration of these DNAs, which can then be converted to a copy number value based on the molecular weight of the sample used. cDNA plasmids are the preferred standards for standard curve quantitation. However, since cDNA plasmids will not control for variations in the efficiency of the reverse transcription step, this method will only yield information on relative changes in mRNA expression. This, and variation introduced due to variable RNA inputs, can be corrected by normalization to a housekeeping gene.

Comparative Ct Method

Another quantitation approach is termed the comparative Ct method. This involves comparing the Ct values of the samples of interest with a control or calibrator such as a non-treated sample or RNA from normal tissue. The Ct values of both the calibrator and the samples of interest are normalized to an appropriate endogenous housekeeping gene.

The comparative Ct method is also known as the 2–[delta][delta]Ct method, where

[delta][delta]Ct = [delta]Ct,sample - [delta]Ct,reference

Here, [delta]CT,sample is the Ct value for any sample normalized to the endogenous housekeeping gene and [delta]Ct, reference is the Ct value for the calibrator also normalized to the endogenous housekeeping gene.

For the [delta][delta]Ct calculation to be valid, the amplification efficiencies of the target and the endogenous reference must be approximately equal. This can be established by looking at how [delta]Ct varies with template dilution. If the plot of cDNA dilution versus delta Ct is close to zero, it implies that the efficiences of the target and housekeeping genes are very similar. If a housekeeping gene cannot be found whose amplification efficiency is similar to the target, then the standard curve method is preferred.

Instrumentation for Real-Time PCR

Real-time PCR requires an instrumentation platform that consists of a thermal cycler, a computer, optics for fluorescence excitation and emission collection, and data acquisition and analysis software. These machines, available from several manufacturers, differ in sample capacity (some are 96-well standard format, others process fewer samples or require specialized glass capillary tubes), method of excitation (some use lasers, others broad spectrum light sources with tunable filters), and overall sensitivity. There are also platform-specific differences in how the software processes data. Real-time PCR machines are not inexpensive, currently about $25K - $95K, but are well within purchasing reach of core facilities or labs that have the need for high throughput quantitative analysis. For a comprehensive list of real-time thermal cyclers please see the weblink at the end of this article.
作者: 椰子叶子    时间: 2011-9-10 16:00

Tools for Real-Time RT-PCR

Ambion’s MessageSensor™ RT Kit includes an RNase H+ MMLV RT that clearly outperforms MMLV RT enzymes that have abolished RNase H activity in real-time RT-PCR experiments. Unlike many other qRT-PCR kits, MessageSensor includes a total RNA control, a control human GAPDH primer set, RNase inhibitor, and nucleotides, as well as a buffer additive that enables detection with SYBR® Green dye.

The Cells-to-cDNA™ II Kit produces cDNA from cultured mammalian cells in less than 2 hours. No RNA isolation is required. This kit is ideal for those who want to perform reverse transcription reactions on small numbers of cells, numerous cell samples, or for scientists who are unfamiliar with RNA isolation. Ambion's Cells-to-cDNA II Kit contains a novel Cell Lysis Buffer that inactivates endogenous RNases without compromising downstream enzymatic reactions. After inactivation of RNases, the cell lysate can be directly added to a cDNA synthesis reaction. Cells-to-cDNA II is compatible with both one-step and two-step real-time RT-PCR protocols.

Genomic DNA contamination can lead to false positive RT-PCR results. Ambion offers a variety of tools for eliminating genomic DNA contamination from RNA samples prior to RT-PCR. Ambion’s DNA-free™ DNase Treatment and Removal Reagents are designed for removing contaminating DNA from RNA samples and for the removal of DNase after treatment without Proteinase K treatment and organic extraction. In addition, Ambion has also developed TURBO™ DNase, a hyperactive enzyme engineered from wild-type bovine DNase. The proficiency of TURBO DNase in binding very low concentrations of DNA means that the enzyme is particularly effective in removing trace quantities of DNA contamination.

Ambion now also offers an economical alternative to the high cost of PCR reagents for the ABI 7700 and other 0.2 ml tube-based real-time instruments. SuperTaq™ Real-Time performs as well or better than the more expensive alternatives, and includes dNTPs and a Reaction Buffer optimized for SYBR Green, TaqMan, and Molecular Beacon chemistries.

End-Point RT-PCR: Relative vs. Competitive vs. Comparative

In spite of the rapid advances made in the area of real-time PCR detection chemistries and instrumentation, end-point RT-PCR still remains a very commonly used technique for measuring changes in gene-expression in small sample numbers.

End-point RT-PCR can be used to measure changes in expression levels using three different methods: relative, competitive and comparative. The most commonly used procedures for quantitating end-point RT-PCR results rely on detecting a fluorescent dye such as ethidium bromide, or quantitation of P32-labeled PCR product by a phosphorimager or, to a lesser extent, by scintillation counting.
作者: 椰子叶子    时间: 2011-9-10 16:00

Relative quantitation compares transcript abundance across multiple samples, using a co-amplified internal control for sample normalization. Results are expressed as ratios of the gene-specific signal to the internal control signal. This yields a corrected relative value for the gene-specific product in each sample. These values may be compared between samples for an estimate of the relative expression of target RNA in the samples; for example, 2.5-fold more IL-12 in sample 2 than in sample 1.

Absolute quantitation, using competitive RT-PCR, measures the absolute amount (e.g., 5.3 x 105 copies) of a specific mRNA sequence in a sample. Dilutions of a synthetic RNA (identical in sequence, but slightly shorter than the endogenous target) are added to sample RNA replicates and are co-amplified with the endogenous target. The PCR product from the endogenous transcript is then compared to the concentration curve created by the synthetic "competitor RNA."

Comparative RT-PCR mimics competitive RT-PCR in that target message from each RNA sample competes for amplification reagents within a single reaction, making the technique reliably quantitative. Because the cDNA from both samples have the same PCR primer binding site, one sample acts as a competitor for the other, making it unnecessary to synthesize a competitor RNA sequence.

Both relative and competitive RT-PCR quantitation techniques require pilot experiments. In the case of relative RT-PCR, pilot experiments include selection of a quantitation method and determination of the exponential range of amplification for each mRNA under study. For competitive RT-PCR, a synthetic RNA competitor transcript must be synthesized and used in pilot experiments to determine the appropriate range for the standard curve. Comparative RT-PCR yields similar sensitivity as relative and competitive RT-PCR, but requires significantly less optimization and does not require synthesis of a competitor.
作者: 椰子叶子    时间: 2011-9-10 16:01

Relative RT-PCR

Relative RT-PCR uses primers for an internal control that are multiplexed in the same RT-PCR reaction with the gene specific primers. Internal control and gene-specific primers must be compatible — that is, they must not produce additional bands or hybridize to each other. The expression of the internal control should be constant across all samples being analyzed. Then the signal from the internal control can used to normalize sample data to account for tube-to-tube differences caused by variable RNA quality or RT efficiency, inaccurate quantitation or pipetting. Common internal controls include ß-actin and GAPDH mRNAs and 18S rRNA. Unlike Northerns and nuclease protection assays, where an internal control probe is simply added to the experiment, the use of internal controls in relative RT-PCR requires substantial optimization.

For relative RT-PCR data to be meaningful, the PCR reaction must be terminated when the products from both the internal control and the gene of interest are detectable and are being amplified within exponential phase (see Determining Exponential Range in PCR). Because internal control RNAs are typically constituitively expressed housekeeping genes of high abundance, their amplification surpasses exponential phase with very few PCR cycles. It is therefore difficult to identify compatible exponential phase conditions where the PCR product from a rare message is detectable. Detection methods with low sensitivity, like ethidium bromide staining of agarose gels, are therefore not recommended. Detecting a rare message while staying in exponential range with an abundant message can be achieved several ways: 1) by increasing the sensitivity of product detection, 2) by decreasing the amount of input template in the RT or PCR reactions and/or 3) by decreasing the number of PCR cycles.

Ambion recommends using 18S rRNA as an internal control because it shows less variance in expression across treatment conditions than ß-actin and GAPDH (see Choosing and Validating Your Internal Control for more information). However, because of its abundance, it is difficult to detect the PCR product for rare messages in the exponential phase of amplification of 18S rRNA. Ambion's patented Competimer™ Technology solves this problem by attenuating the 18S rRNA signal even to the level of rare messages. Attenuation results from the use of competimers — primers identical in sequence to the functional 18S rRNA primers but that are "blocked" at their 3'-end and, thus, cannot be extended by PCR. Competimers and primers are mixed at various ratios to reduce the amount of PCR product generated from 18S rRNA. Figure 1 illustrates that 18S rRNA primers without competimers cannot be used as an internal control because the 18S rRNA amplification overwhelms that of clathrin (compare panels A and . Mixing primers with competimers at a 3:7 ratio attenuates the 18S rRNA signal, making 18S rRNA a practical internal control (panel C).


Figure 1. Ambion's QuantumRNA™ Technology in Multiplex Quantitative RT-PCR using 18S rRNA as an Internal Control. RT-PCR reactions on brain, embryo, liver, and spleen total RNA using A) primers for clathrin,  primers for clathrin and 18S, or C) primers for clathrin, 18S rRNA primers and 18S rRNA Competimers. Note that without Competimers, 18S cannot be used as an internal control because of its high abundance (. Addition of Competimers (C) makes multiplex PCR possible, providing sample-to-sample relative quantitation.
作者: 椰子叶子    时间: 2011-9-10 16:01

Ambion's QuantumRNA 18S Internal Standards contain 18S rRNA primers and competimers designed to amplify 18S rRNA in all eukaryotes. The Universal 18S Internal Standards function across the broadest range of organisms including plants, animals and many protozoa. The Classic I and Classic II 18S Internal Standards can be used with any vertebrate RNA sample. All 18S Internal Standards work well in multiplex RT-PCR. These kits also include control RNA and an Instruction Manual detailing the series of experiments needed to make relative RT-PCR data significant. For those researchers who have validated ß-actin as an appropriate internal control for their system, the QuantumRNA ß-actin Internal Standards are available.

The research team at Ambion has also generated over 50 Gene Specific Relative RT-PCR Kits. These kits contain primer pairs for specific human, mouse and rat genes, positive control DNA, a detailed Instruction Manual, and Ambion's exclusive QuantumRNA 18S rRNA primers and competimers. Kits are available for analysis of apoptosis genes, cytokines, cytokine receptors, growth factors, growth factor receptors and oncogenes.

Competitive RT-PCR

Competitive RT-PCR precisely quantitates a message by comparing RT-PCR product signal intensity to a concentration curve generated by a synthetic competitor RNA sequence. The competitor RNA transcript is designed for amplification by the same primers and with the same efficiency as the endogenous target. The competitor produces a different-sized product so that it can be distinguished from the endogenous target product by gel analysis. The competitor is carefully quantitated and titrated into replicate RNA samples. Pilot experiments are used to find the range of competitor concentration where the experimental signal is most similar. Finally, the mass of product in the experimental samples is compared to the curve to determine the amount of a specific RNA present in the sample.

Some protocols use DNA competitors or random sequences for competitive RT-PCR. These competitors do not effectively control for variations in the RT reaction or for the amplification efficiency of the specific experimental sequence, as do RNA competitors. See The Accuracy of Competitive RT-PCR Depends on Using the Right Exogenous Standard for a further discussion on competitor choice and design.

Ambion's RT-PCR Competitor Construction Kit (patent pending) provides transcription reagents for the synthesis of an RNA competitor that is RNase-resistant (Figure 2). RNase resistance is conferred by the incorporation of modified rNTP's into the competitor transcript. This makes the competitor highly resistant to RNase digestion which helps maintain its copy number even over extended storage. Long-term stability is important since enough competitor is synthesized in one reaction to perform thousands of experiments. Along with the reagents to transcribe an RNA competitor, the RT-PCR Competitor Construction Kit includes a detailed Instruction Manual describing the design, synthesis, quantitation, and storage of the RNA competitor sequence as well as protocols for competitive quantitative RT-PCR.
作者: 椰子叶子    时间: 2011-9-10 16:02

Figure 2. Nuclease Stability of RNA Synthesized with the RT-PCR Competitor Construction Kit. RNase A at the concentrations indicated was incubated at room temperature for one hour with radiolabeled standard RNA or RNA synthesized by the RT-PCR Competitor Construction Kit in 1X Transcription Buffer. The samples were assessed on 8% denaturing polyacrylamide gels and products were detected by autoradiography.

Comparative RT-PCR

While exquisitely sensitive, both relative and competitive methods of qRT-PCR have drawbacks. Relative RT-PCR requires extensive optimization to ensure that the PCR is terminated when both the gene of interest and an internal control are in the exponential phase of amplification. Competitive RT-PCR requires that an exogenous "competitor" be synthesized for each target to be analyzed. Ambion’s IntraSpec™ Comparative RT-PCR Kit (patent pending) achieves the same level of sensitivity as these standard methods of qRT-PCR, with significantly less optimization. Target mRNAs from 2 samples are assayed simultaneously, each serving as a competitor for the other, making it possible to compare the relative abundance of target between samples. Comparative RT-PCR is ideal for analyzing target genes discovered by screening methods such as array analysis and differential display.
作者: 小米虫子    时间: 2011-9-10 16:02

因为不想跑变性凝胶，所以就直接用琼脂糖跑，
但是都很注意的。

电泳槽和制胶板都用3%过氧化氢泡过夜，用无水乙醇挥发干，
再用DEPC水润洗；
电泳液是用DEPC水配的TBE，高压灭菌过
所用的枪头离心管什么的用DEPC处理过再高压灭菌
trizol是invitrogen的，氯仿异丙醇和乙醇也都是新开的
RNA上样缓冲液也是用DEPC水配的，

电泳用110V，跑20min,上样6ul,3ul,1.5ul,1ul都试过，
RNA的260/280一般都在2.0左右徘徊，
可是还是有一点降解，而且，为什么老是有很严重的拖尾啊！！！
（就象用墨水笔画一杠，然后被人用手一抹的感觉，难看死了！！）

本来想把电泳图扫描下来，无奈扫描仪坏了，sigh...
请各位大侠不吝赐教！感激不尽！！！
作者: 丁香@@    时间: 2011-9-10 16:03

rt-pcr出现非特异的条带可能有基因组DNA污染所致,除用ACTIN内含子引物检测外,要设不加逆转录酶的对照,如果RNA质量很好,可把特异带和非特带回收测序(BLAST)可能得到意想不到的结果.(请指正)
作者: 微笑的海豚    时间: 2011-9-10 16:04

因为不想跑变性凝胶，所以就直接用琼脂糖跑，
但是都很注意的。

电泳槽和制胶板都用3%过氧化氢泡过夜，用无水乙醇挥发干，
再用DEPC水润洗；
电泳液是用DEPC水配的TBE，高压灭菌过
所用的枪头离心管什么的用DEPC处理过再高压灭菌
trizol是invitrogen的，氯仿异丙醇和乙醇也都是新开的
RNA上样缓冲液也是用DEPC水配的，

电泳用110V，跑20min,上样6ul,3ul,1.5ul,1ul都试过，
RNA的260/280一般都在2.0左右徘徊，
可是还是有一点降解，而且，为什么老是有很严重的拖尾啊！！！
（就象用墨水笔画一杠，然后被人用手一抹的感觉，难看死了！！）

本来想把电泳图扫描下来，无奈扫描仪坏了，sigh...
请各位大侠不吝赐教！感激不尽！！！

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RNA跑出来有很严重的拖尾可能还是RNA部分降解了
作者: 还是孩子    时间: 2011-9-10 16:04

各位高手，偶打算做一组RT-PCR（加上ACTIN共5条），可是细胞太少（5*106），可不可以一起做？
作者: 还是孩子    时间: 2011-9-10 16:04

各位高手，偶打算做一组RT-PCR（加上ACTIN共5条），可是细胞太少（5*106），可不可以一起做？
作者: 糊涂虫    时间: 2011-9-10 16:25

本人近期需作肺组织的RT-PCR，请问在我取材时是否可以取大块冻存而后分次切下小许提取RNA?还是必须取100mg左右/管取多管呀？还有肺组织血液丰富，我怎样正确取材才能避免血液对RT-PCR的影响呀？盼佳音！甚感激！  
作者: 糊涂虫    时间: 2011-9-10 16:25

本人近期需作肺组织的RT-PCR，请问在我取材时是否可以取大块冻存而后分次切下小许提取RNA?还是必须取100mg左右/管取多管呀？还有肺组织血液丰富，我怎样正确取材才能避免血液对RT-PCR的影响呀？盼佳音！甚感激！  
作者: 嗨皮    时间: 2011-9-10 16:27

请问各位高手如何用RT-PCR来定量检测目的基因在转录水平上的表达情况？（与northern相比哪个效果更好一点？目的基因大约3000-4000bp）
作者: 喵咪    时间: 2011-9-10 16:28

各位大侠，本人近期需作肺组织的RT-PCR，请问在我取材时是否可以取大块冻存而后分次切下小许提取RNA?还是必须取100mg左右/管取多管呀？还有肺组织血液丰富，我怎样正确取材才能避免血液对RT-PCR的影响呀？盼佳音！甚感激！

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大块组织可以冻存在液氮或者-80，提取RNA时，敲一块即可。血液RNA含量很少，可以忽略吧。
作者: 蝴蝶结子    时间: 2011-9-10 16:29

各位大侠：
本人也做RT-PCR，以及RNA的原位杂交方面的实验。为防止RNA的降解，用DEPC水来处理试剂那是当然。可是本人不知道在这方面实验中所用的试剂哪些不能用DEPC水来处理。如配制一定浓度的SDS，EDTA，SSC，蛋白酶K等不知能否用DEPC水来配制。
我本来还想省事，配些用量大的缓冲液如PBS，采用方法是先配好PBS，再加上DEPC，灭菌后备用。可是有的书上又说DEPC在这种溶液中不稳定。可是其它要用的缓冲液我没有查到用这种方法配制是否可行？真是菜鸟！
作者: 海鸥crazy    时间: 2011-9-10 16:29

我的课题准备做肿瘤患者外周血特异mRNA的RT-PCR检测，现有几个问题请教热心人，盼不吝解答，在此先谢谢了！
1、采集外周血标本应注意什么问题（选怎样的试管，采血后的试管液氮保存好还是－80保存好等）；
2、外周血标本直接冻存还是抽提出总RNA再冻存；
再次感谢！
作者: 冰激凌小姐    时间: 2011-9-10 16:30

用GADPH做内参，按文献报道在559bp出现条带，但现在的带子位置却在500bp偏下一点，怎么可能这样子呢？
作者: 喵咪    时间: 2011-9-10 16:31

提RNA最好在一个干净的环境中进行.我都是在细胞超净工作台上进行.所用物品最好是专用的.别忘记带手套.
作者: 细水长流    时间: 2011-9-10 16:33

请教各位大哥一个问题:我提出的RAR用DEPC水溶解不开,进行定量时浓度很低,而且OD260/OD280的比值非常高超过2.0.我应用GIBCO的TRIZOL试剂.而且感觉吸上清时很仔细,没有把PROTEIN吸上.

百思不得其解,请各位大哥指点迷津.

THANKS!
作者: 浆果儿cc    时间: 2011-9-10 16:34

各位好。我是新人，没做过PCR。现在我正在用质粒转染细胞，选择稳定转染的细胞建系。那么，鉴定的时候肯定得用RT-PCR证明有目的片断在转录。我从书上看到，做PCR是应该设立阳性对照，应该怎么做？能否用我做转染的质粒做阳性对照？盼望不吝赐教。
作者: 回眸    时间: 2011-9-10 16:35

各位高手：请问一下上下游引物的浓度怎末确定？如果上下游引物的浓度不匹配对PCR有何影响？
作者: 喵咪    时间: 2011-9-10 16:35

用GADPH做内参，按文献报道在559bp出现条带，但现在的带子位置却在500bp偏下一点，怎么可能这样子呢？

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你到NCBI上查一下GAPDH的具体序列，按照你的引物来确定一下到底应该多长，不要含糊，另外，不要太相信文献，自己去查下子吧。
我也是在做GAPDH。手上就有它的序列，引物也是自己设计的。
自己去查吧，锻炼下自己。
作者: 喵咪    时间: 2011-9-10 16:36

请教各位大哥一个问题:我提出的RAR用DEPC水溶解不开,进行定量时浓度很低,而且OD260/OD280的比值非常高超过2.0.我应用GIBCO的TRIZOL试剂.而且感觉吸上清时很仔细,没有把PROTEIN吸上.

百思不得其解,请各位大哥指点迷津.

THANKS!

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260/280比值是反映RNA质量的一个非常关键的标准 ，一般要在1。8到2。0比较好。小于1。8就证明有酚，蛋白的污染，大于2。0就说明降解成单核甘酸的情况比较严重。
你做下变性胶电泳看看，我觉得很可能你的5S会非常亮。
不过如果18S 和 19S 也比较的亮的话，那么恭喜你了，RT-PCR出来应该没什么问题。
作者: 喵咪    时间: 2011-9-10 16:36

各位好。我是新人，没做过PCR。现在我正在用质粒转染细胞，选择稳定转染的细胞建系。那么，鉴定的时候肯定得用RT-PCR证明有目的片断在转录。我从书上看到，做PCR是应该设立阳性对照，应该怎么做？能否用我做转染的质粒做阳性对照？盼望不吝赐教。

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pc要做阳性对照，没听说过。具体到你自己的实验，我不能说不做阳性对照，也可能是我没有正确理解你所谓的的对照。
不过，我明白你的意思。你是做转染以后，再做RT-PCR以证明你的目的片段有表达，转染成功了。这个直接做就行了，不用做什么阳性的对照。不用的。你转染的时候是要做阴性对照的。
作者: 喵咪    时间: 2011-9-10 16:37

各位高手：请问一下上下游引物的浓度怎末确定？如果上下游引物的浓度不匹配对PCR有何影响？

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Primer 1 0.1-0.5µM
Primer 2 0.1-0.5µM
引物在体系中的浓度是有一个区间的，这个你可以看下书。上面也有。
浓度不一样的话，PCR会受影响。很多时候也可以P出来。毕竟引物浓度在决定PCR是否成功的因素中不怎么重要。 在做一些困难的PCR，或者RT-PCR的时候，就不能这么马虎了。一种引物教另一种引物多很多的话，会影响引物与摸板的结合而导致PCR失败 ，或者降低PCR的质量。
作者: 米米    时间: 2011-9-10 16:37

各位高手：我也准备做RT-PCR，但是遇到了一个很尴尬的问题：我用的是别人的组织，但是他把我要的组织和别的组织放在一个冻存管里面了存在液氮里面，我要怎么才能把他们分开阿，天哪！急死了，盼回复，各位高手指点指点阿！万分感激～～～
作者: 邓布利多    时间: 2011-9-10 16:38

请问：我在两个月前开始做RT－PCR，当时提取的RNA（－70℃保存）和逆转录的cDNA（－20℃保存），不知道现在还可以用来PCR吗？ 上述RNA和cDNA电泳用普通的琼脂糖凝胶还行？与上样缓冲液的比例也是6：1吗？
作者: 微笑的海豚    时间: 2011-9-10 16:39

各位高手：我也准备做RT-PCR，但是遇到了一个很尴尬的问题：我用的是别人的组织，但是他把我要的组织和别的组织放在一个冻存管里面了存在液氮里面，我要怎么才能把他们分开阿，天哪！急死了，盼回复，各位高手指点指点阿！万分感激～～～

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这有什么办法，都取出来，看看哪个是你的不就行了。
不过，能看出来吗~！！？
作者: 微笑的海豚    时间: 2011-9-10 16:39

请问：我在两个月前开始做RT－PCR，当时提取的RNA（－70℃保存）和逆转录的cDNA（－20℃保存），不知道现在还可以用来PCR吗？ 上述RNA和cDNA电泳用普通的琼脂糖凝胶还行？与上样缓冲液的比例也是6：1吗？

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1： 可以用来做PCR。两个月，没问题。
2： 可以，不过CDNA做电泳意义不大。
3： 上样缓冲液多点也好。关系不大。
作者: 微笑的海豚    时间: 2011-9-10 16:40

各位高手：我也准备做RT-PCR，但是遇到了一个很尴尬的问题：我用的是别人的组织，但是他把我要的组织和别的组织放在一个冻存管里面了存在液氮里面，我要怎么才能把他们分开阿，天哪！急死了，盼回复，各位高手指点指点阿！万分感激～～～

这有什么办法，都取出来，看看哪个是你的不就行了。
不过，能看出来吗~！！？

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但是在一个冻存管里面都冻成块了阿，怎么分阿
作者: 微笑的海豚    时间: 2011-9-10 16:40

各位高手：我也准备做RT-PCR，但是遇到了一个很尴尬的问题：我用的是别人的组织，但是他把我要的组织和别的组织放在一个冻存管里面了存在液氮里面，我要怎么才能把他们分开阿，天哪！急死了，盼回复，各位高手指点指点阿！万分感激～～～

这有什么办法，都取出来，看看哪个是你的不就行了。
不过，能看出来吗~！！？
那位老兄！~~！ 猛~！！

但是在一个冻存管里面都冻成块了阿，怎么分阿

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4度解冻！！！
作者: 胖小妮子    时间: 2011-9-10 16:41

请问 当260/280比值小于1.8时，酚和蛋白的污染对做RT-PCR的结果有何影响，很大吗？
作者: 椰子叶子    时间: 2011-9-10 16:41

请问 当260/280比值小于1.8时，酚和蛋白的污染对做RT-PCR的结果有何影响，很大吗？

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看你做的RT-PCR是怎么样的了,对摸板的要求高不高,如果所P片段比较小, RNA浓度比较高的话,应该没什么问题. 但做一些有难度的最好要好一点.我P GAPDH的时候,比值是1,3的都能P出来. 长度 530BP.一般来说1,6 ~1,7做出来也没什么问题的.
作者: 胖小妮子    时间: 2011-9-10 16:42

实验做的断断续续，cDNA有的是两三个月前合成有的是新合成的，都是在-40度保存，做出来得实验结果不稳定，有的cDNA反复冻溶了4-5次，会讲解吗？真不希望是模板的问题！：（  
作者: 阿福    时间: 2011-9-10 16:42

实验做的断断续续，cDNA有的是两三个月前合成有的是新合成的，都是在-40度保存，做出来得实验结果不稳定，有的cDNA反复冻溶了4-5次，会讲解吗？真不希望是模板的问题！：（

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不会,应该没问题.
如果不放心,干脆,再做一次RT,但原来的CDNA不要放弃哦.
作者: 萌芽    时间: 2011-9-10 16:49

大家好！我就要做RT-PCR了，但是我有一个问题需要帮助，做此试验时，我先要提取mRNA,在转录成cDNA时，是不是一定要转录全部基因，还是直接通过引物直接形成目的DNA?  
作者: 萌芽    时间: 2011-9-10 16:49

大家好！我就要做RT-PCR了，但是我有一个问题需要帮助，做此试验时，我先要提取mRNA,在转录成cDNA时，是不是一定要转录全部基因，还是直接通过引物直接形成目的DNA?  
作者: 冰激凌小姐    时间: 2011-9-10 16:55

刚才看了很多大家法的消息说时有一种可以设计引物的软件，请问从那里可以搞得到啊！我要做的是开角型青光眼的MYOC/TIGR基因，别说国内了，就连国外做得懂特别少，现成的因无根本就查不到，对于我这样一个临床的研究生来讲，好难啊！我所用的材料是大鼠的眼球，请问大鼠的基因组库在那里可以查得到啊。摆脱了，各位高手！
作者: 阿拉蕾    时间: 2011-9-10 16:56

大家好！我就要做RT-PCR了，但是我有一个问题需要帮助，做此试验时，我先要提取mRNA,在转录成cDNA时，是不是一定要转录全部基因，还是直接通过引物直接形成目的DNA?

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这就是一步法和两步法的比较了.
一般还是前者多见.
作者: 胖小妮子    时间: 2011-9-10 16:56

我还想请教一下，引物是用人家已经用过的呢还是自己重新设计的好呢？
作者: 喵咪    时间: 2011-9-10 16:57     标题: 回复 #627 胖小妮子 的帖子

要看你自己衡量了,你拿别人的引物自己分析一下,好的话用也挺好.不满意的话,自己设计.我是偏向于自己设计,放心.
作者: 丸子妹    时间: 2011-9-10 16:58

大块组织可以冻存在液氮或者-80，提取RNA时，敲一块即可。血液RNA含量很少，可以忽略吧。

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请问，为什么血液中RNA含量很少？如要检测组织中的中性粒细胞内某种多肽的mRNA，能忽略血液来源的吗？  
作者: 微笑的海豚    时间: 2011-9-10 16:58

人在做RT-PCR遇到一怪现象，即本人对同一动物不同组织扩增同一段基因，结果从一种组织中可以扩出我的目的基因，条带非常的好，而另一组织在同样的条件下却得到许多非特异性的条带，尝试其他条件同样无法得到满意的结果，百思不得其解！（注：已肯定该基因在两种组织中都表达，且内参照在两种组织都可扩增出来）
从这两种组织中提取的RNA的量是不一样的，我测过吸光度，差异还很大，会不会和这有关呢？ 请高手指教！

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有一种可能原因，即不同组织基因表达谱有差别，当PCR引物的特异性不高时，有可能会扩增出其他基因。本人也有类似遭遇，但当换用引物后，非特异产物消失了。  
作者: 鲁西西    时间: 2011-9-10 16:59

大鼠的基因组可以在pubmed上查到,请问RT-PCR产物为什么不能直接与表达载体连接,而要先与T载体相连??谢谢!
作者: 椰子叶子    时间: 2011-9-10 17:00

刚才看了很多大家法的消息说时有一种可以设计引物的软件，请问从那里可以搞得到啊！我要做的是开角型青光眼的MYOC/TIGR基因，别说国内了，就连国外做得懂特别少，现成的因无根本就查不到，对于我这样一个临床的研究生来讲，好难啊！我所用的材料是大鼠的眼球，请问大鼠的基因组库在那里可以查得到啊。摆脱了，各位高手！
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可以在pubmed的nucleotide中查到,试试看,挺容易的,祝你好运!
作者: 魔法师A    时间: 2011-9-10 17:01

我的pcr在年前做了4次全都ok，特异性高，条带也亮，可年后怎麽也作不出了，只有引物二聚体。cDNA和试剂都经别人验证没问题，难道是引物的问题？可为什麽之前作出来了？急人那？等着这结果毕业呢！有哪位高人能帮帮忙呀？！
作者: 8黑眼圈8    时间: 2011-9-10 17:01

我怎样才能将我从文献上查到的碱基拿到基因库去验证呀?谢谢!!
作者: 蒲公英    时间: 2011-9-13 14:37

我现在作提取细胞总RNA的实验，但是细胞很少（2.4×10e5），而且很珍贵。现细胞离心后保存在－20C冰箱中，没有加TRIZOL。请问如何提取RNA?有没有可能作RT-PCR?
作者: 我是一片云    时间: 2011-9-13 14:38

请问作相对半定量RT-PCR有必要对产物测序吗？
从marker看来，产物的大小正是我想要的，实验室的实验员说最好去测一下序，不知由没有必要。除了测序之外，还有什么办法能证实产物的正确性呢？
请各位前辈不吝指教。
作者: 椰子叶子    时间: 2011-9-13 14:39

我的pcr在年前做了4次全都ok，特异性高，条带也亮，可年后怎麽也作不出了，只有引物二聚体。cDNA和试剂都经别人验证没问题，难道是引物的问题？可为什麽之前作出来了？急人那？等着这结果毕业呢！有哪位高人能帮帮忙呀？！
救命热线：谢谢！！！

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你用的模板没问题吗？
作者: 橘子水儿    时间: 2011-9-13 14:39

各位前辈,我正要进行反转录,但是教研室资金短缺,老板认为我自己买一个试剂盒有些浪费.我想请问各位,我分开买各种试剂,这样做出来地效果怎么样?
是不是既可以省钱又不影响试验结果呢?
谢谢了!
作者: 椰子叶子    时间: 2011-9-13 14:40

各位前辈,我正要进行反转录,但是教研室资金短缺,老板认为我自己买一个试剂盒有些浪费.我想请问各位,我分开买各种试剂,这样做出来地效果怎么样?
是不是既可以省钱又不影响试验结果呢?
谢谢了!

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不知道你要做多少份标本。我曾经比较过用试剂盒和不用试剂盒的价钱比较，按做100份算（采用试剂说明书的标准条件），用试剂盒便宜，而且不用摸条件。不用的话，本身价钱就高，还要摸条件浪费不少，所以我现在倾向直接用试剂盒。如果做的标本很少，小包装的试剂盒相对要贵些，你可以再算算看。
作者: 邓布利多    时间: 2011-9-13 14:40

我怎样才能将我从文献上查到的碱基拿到基因库去验证呀?谢谢!!
作者: 邓布利多    时间: 2011-9-13 14:40

我怎样才能将我从文献上查到的碱基拿到基因库去验证呀?谢谢!!
作者: 阿福    时间: 2011-9-13 14:41

直接输入NCBI 不行吗？！这方面不妨去生物信息版看看！
作者: 小蜜蜂    时间: 2011-9-13 14:41

大家好！
如果大家有在做rT-PCR的同行，请多多指教
作者: 小蜜蜂    时间: 2011-9-13 14:41

大家好！
如果大家有在做rT-PCR的同行，请多多指教
作者: 兔纸    时间: 2011-9-13 14:42

我是RT-PCR的新手，请教各位高手，引物一定要设计在基因序列的CDS区中吗？
作者: 兔纸    时间: 2011-9-13 14:42

我估计要做30份，今天问了一下代理商，说是只有100份的。要将近3000元。
不知道我应该怎样做？那家公司有份数较少的试剂河？
谢谢！
作者: 邓布利多    时间: 2011-9-13 14:43

模板一定没问题，因为师兄用此模板作出了他的目的片断。
作者: 阿拉蕾    时间: 2011-9-13 14:44

谢谢各位对我的帮助！至于yjs的问题我实在是解决不了，等到两个月以后我也要做克隆了，那时也许可以回答你了！
作者: 喵咪    时间: 2011-9-13 14:44

我估计要做30份，今天问了一下代理商，说是只有100份的。要将近3000元。
不知道我应该怎样做？那家公司有份数较少的试剂河？
谢谢！

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你问的是哪家的代理商啊，我的同学都说上海的试剂盒便宜，你不妨问一下！
作者: 兔纸    时间: 2011-9-13 14:45

我问的是爱普公司。不知道你说的是那家公司？
作者: 微笑的海豚    时间: 2011-9-13 14:45

我现在作提取细胞总RNA的实验，但是细胞很少（2.4×10e5），而且很珍贵。现细胞离心后保存在－20C冰箱中，没有加TRIZOL。请问如何提取RNA?有没有可能作RT-PCR?

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1X10e5细胞足够了, 加100ulTRIzol其他试剂按比例减少即可.我用此法提取的RNA做RT-PCR效果很好.
作者: 椰子叶子    时间: 2011-9-13 14:46

爱普公司？你在青岛？
你说的是promega的A3500吧？如果你没有做过RT－PCR，不如用它的A1250，一步法RT-PCR，20份包装，不到1000元，30份有2个盒子就够了。
或者Takara的DRR024，DRR012A，50份包装，DRR019A，100份包装，1400～1700左右，也是一步法。
Qiagen和invitro的也不错，就是价钱贵，可以去他们的网站查询一下或直接咨询代理。
作者: 兔纸    时间: 2011-9-13 14:46

厉害啊
我确实是在青岛。
也的确是刚刚开始做RT-PCR.没有什么经验。
具体用什么样的试剂合并不清楚。
只是我们这里的好像都是用的爱普代理的promega
至于好不好，我也不清楚
不知道在那个网站可以查到比较详细的信息？
作者: 椰子叶子    时间: 2011-9-13 14:47

你是哪个学校的？爱普高磊？
promega的性价比算比较好吧，它的一步法和两步法的盒子我都用过，结果也不错。cuturl('www.promega.com.cn')
takara的我自己没有用过，只是见别人用的。cuturl('www.takara.com.cn')
或者你从google里很容易就能找到他们的网址。

生物通商城：cuturl('http://www.ebiotrade.com/buyf/sj/')
作者: 兔纸    时间: 2011-9-13 14:48

我现在的问题是能不能买到比较便宜的试剂合。50份的就行。
作者: 竹蜻蜓    时间: 2011-9-13 14:48

我是一名新手，问一个简单的问题。在半定量RT-PCR时，怎么保证每次提取的RNA浓度一样，只有这样才有可比性。
作者: 阿拉蕾    时间: 2011-9-13 14:49

请问：我在两个月前开始做RT－PCR，当时提取的RNA（－70℃保存）和逆转录的cDNA（－20℃保存），不知道现在还可以用来PCR吗？ 上述RNA和cDNA电泳用普通的琼脂糖凝胶还行？与上样缓冲液的比例也是6：1吗？

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我感觉RNA基本上降解差不多了，因为我曾经也那样作过，RNA放－70℃保存两天后电泳检测就什么都没有了，当然当时保存时我没有加RNA抑制剂，但我想你保存这么久估计也没有了。
至于cDNA好象保存这么长时间效果也不是很好
作者: 旋转木马    时间: 2011-9-13 14:49

我准备做关于大鼠肾脏基因表达的半定量RT-PCR，我是一位新手，不知从肾脏组织中提取RNA应该准备什么，可否将肾脏组织放入液氮并在-80度冻存，过一段时间再提RNA，组织可冻存多长时间？一步法与俩步法有啥不同，哪一个好？所用的试剂盒有啥，多谢！
作者: 微笑的海豚    时间: 2011-9-13 14:50

我是RT-PCR的新手，请教各位高手，引物一定要设计在基因序列的CDS区中吗？

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不知你是否作克隆，如果是，需考虑载体的情况才能决定引物是否在CDS内，如果不，看你要扩哪一段，不一定在CDS区内，比如你要扩某个分子的全长，就不一定在CDS内。
作者: 微笑的海豚    时间: 2011-9-13 14:50

谢谢各位对我的帮助！至于yjs的问题我实在是解决不了，等到两个月以后我也要做克隆了，那时也许可以回答你了！

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我已经知道了，并不是所有的RT-PCR产物都必须先与T载体连接，与它连接有时是为了置换它两侧的酶切位点，有时有利于目的基因的保存，你找到设计引物的软件了吗？primer primier5.0就很好用，可以从网上下载，你搜搜，很容易就找到，我就是从网上下的。
作者: 微笑的海豚    时间: 2011-9-13 14:51

请问：我在两个月前开始做RT－PCR，当时提取的RNA（－70℃保存）和逆转录的cDNA（－20℃保存），不知道现在还可以用来PCR吗？ 上述RNA和cDNA电泳用普通的琼脂糖凝胶还行？与上样缓冲液的比例也是6：1吗？

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我也遇到类似的问题，因为边收集临床标本，边抽提RNA、反转录，做了一些PCR来摸索条件，前后有三四个月了，近几天想把合成的cDNA进行PCR扩增，发现原来条件下扩增出的目的基因已经扩不出来，正在找原因，挺郁闷。

我想模板cDNA（我的在-40度）在-20度保存是不保险的，虽然书上说可以长久保存。
作者: 格格巫    时间: 2011-9-13 14:51

刚开始做PCR,随便在文献上找了对引物,听别人说要到BLAST 上验证才行,于是拿去验证,却看不懂出来的结果.问周围的人也说不出所以然,毕竟大家都是搞临床的.郁闷!!现在总怀疑自己的引物不够好.哪位高手能帮忙指点迷津,救救急呀!!!周围的人真的是一个也帮不上忙,我的帖子已经发了几天也没人理睬,快急死了,现在只好厚着脸皮又在这里发一回,真的是没办法了,我的标本很珍贵,做一次很不容易.刚开始做什么都不顺,实验室条件又不好,而我的时间又紧,罗嗦这么多,希望能得到你们的帮助!!
上游:ACGCTCCTGCTCGGCTGGGT
下游:CGTCTGCTTCACATCCTTCA
另外一对为
上游:CCCCCACTGAAAAAGATGAG
下游:TCACTCAATCCAAATGCGGC
作者: 冰激凌小姐    时间: 2011-9-13 14:51

你的情况跟我的差不多。我想做RT-PCR, 在一个牛人发的paper上找了一个引物。也不知道怎么验证，我想不会这么这么坏，给一个假的吧。但是可能由于实验室条件不一样会造成一些差别。如果要验证，可以拿目的基因的序列来对一对，还可以看看有没有形成太多的pin,dimer。
作者: 兔纸    时间: 2011-9-13 14:55

请问有没有用过日本takara公司生产的反转录试剂盒。性能怎么样啊?  
作者: 小蜜蜂    时间: 2011-9-13 14:57

不知你是否作克隆，如果是，需考虑载体的情况才能决定引物是否在CDS内，如果不，看你要扩哪一段，不一定在CDS区内，比如你要扩某个分子的全长，就不一定在CDS内。

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我不作克隆，只是看子宫内膜整合素的表达量。我知道不在cds区可以，但是不是在此区更好一些。是不是引物最后设计在靠近poly尾的地方？
再请教一个问题，那个公司合成引物好一些。上海博亚可以吗？
oligo dt买试剂盒好还是请公司合成好？
作者: 花裙子    时间: 2011-9-13 14:57

急问：有谁知道新西兰大白兔的SR-BI的mRNA 的引物序列？ 我要用RT-PCR 方法测定它在肝脏和肾上腺上的表达。
作者: 开心蔬菜帮    时间: 2011-9-13 14:58

请问各位高手：
如果曾经P出过结果，但如今只有引物二聚体，而模板和PCR试剂盒一定没问题，其原因是否考虑引物降解？？？？
作者: 椰子叶子    时间: 2011-9-13 14:58

我问的是爱普公司。不知道你说的是那家公司？

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上海的公司名称我不是太清楚，如果你需要的话，我可以给你问问；我所知道的大连宝生物的一步法试剂盒才1200元左右，可以做50次，而且，如果你可以预付的话，他们可以打八五折呢。
作者: 小蜜蜂    时间: 2011-9-13 14:59

谢谢你，我已经找到软件了，但是，我太笨了，设计出来的引物我自己不敢用，我已经请华美的老师帮忙设计了。  
作者: 阿拉蕾    时间: 2011-9-13 15:02

开始做PCR,随便在文献上找了对引物,听别人说要到BLAST 上验证才行,于是拿去验证,却看不懂出来的结果.问周围的人也说不出所以然,毕竟大家都是搞临床的.郁闷!!现在总怀疑自己的引物不够好.哪位高手能帮忙指点迷津,救救急呀!!!周围的人真的是一个也帮不上忙,我的帖子已经发了几天也没人理睬,快急死了,现在只好厚着脸皮又在这里发一回,真的是没办法了,我的标本很珍贵,做一次很不容易.刚开始做什么都不顺,实验室条件又不好,而我的时间又紧,罗嗦这么多,希望能得到你们的帮助!!
上游:ACGCTCCTGCTCGGCTGGGT
下游:CGTCTGCTTCACATCCTTCA
另外一对为
上游:CCCCCACTGAAAAAGATGAG
下游:TCACTCAATCCAAATGCGGC

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你看看这个吧，实在不会你找到你的目的序列自己找找看序列对不对
首先登陆到cuturl('http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/')
然后选择需要比对的序列类型（核酸或蛋白质），然后copy你的序列到相应的窗口，注意，这里要求一定的格式。然后其它都选择默认设置就可以了。一般需要等一小会儿（最多几十秒）。
此外，该链接处还有关于其它的blast，如基因组序列的blast等，你可以参考该站点的使用说明。
你说进行多序列比对，是否是几个序列之间的比对而不是和Genbank的database比对呢？如果是前者，有好多软件可用，比如Dnaman和Vec torNTI，更多的软件见cuturl('www.bio-soft.net')
什么是BLAST?
BLAST (Basic Local Alignment Search Tool)是一套在蛋白质数据库或DNA数据库中进行相似性比较的分析工具。BLAST程序能迅速与公开数据库进行相似性序列比较。BLAST结果中的得分是对一种对相似性的统计说明。
BLAST 采用一种局部的算法获得两个序列中具有相似性的序列。如果您想进一步了解BLAST算法，您可以参考NCBI的BLAST Course ，该页有BLAST算法的介绍。
作者: 阿拉蕾    时间: 2011-9-13 15:07

BLAST功能是什么？
BLAST对一条或多条序列(可以是任何形式的序列)在一个或多个核酸或蛋白序列库中进行比对。BLAST还能发现具有缺口的能比对上的序列。
BLAST是基于Altschul等人在J.Mol.Biol上发表的方法(J.Mol.Biol.215:403-410(1990)),在序列数据库中对查询序列进行同源性比对工作。从最初的BLAST发展到现在NCBI提供的BLAST2.0,已将有缺口的比对 序列也考虑在内了。BLAST可处理任何数量的序列,包括蛋白序列和核算序列;也可选择多个数据库但数据库必须是同一类型的,即要么都是蛋白数据库要么都是核酸数据库。所查询的序列和调用的数据库则可 以是任何形式的组合,既可以是核酸序列到蛋白库中作查询,也可以是蛋白序列到蛋白库中作查询,反之亦然。
GCG及EMBOSS等软件包中包含有五种BLAST：
1、BLASTP是蛋白序列到蛋白库中的一种查询。库中存在的每条已知序列将逐一地同每条所查序列作一对一的序列比对。
2、BLASTX是核酸序列到蛋白库中的一种查询。先将核酸序列翻译成蛋白序列（一条核酸序列会被翻译成可能的六条蛋白），再对每一条作一对一的蛋白序列比对。
3、BLASTN是核酸序列到核酸库中的一种查询。库中存在的每条已知序列都将同所查序列作一对一地核酸序列比对。
4、TBLASTN是蛋白序列到核酸库中的一种查询。与BLASTX相反，它是将库中的核酸序列翻译成蛋白序列，再同所查序列作蛋白与蛋白的比对。
5、TBLASTX是核酸序列到核酸库中的一种查询。此种查询将库中的核酸序列和所查的核酸序列都翻译成蛋白（每条核酸序列会产生6条可能的蛋白序列），这样每次比对会产生36种比对阵列。由于这种比对?
作者: 阿拉蕾    时间: 2011-9-13 15:07

细胞离心后,最好能够加trizol放置,否则离心后的细胞保存在-20℃,RNA降解会很快的.INVIROGEN的trizol试剂盒，抽提组织和细胞的RNA，用的是最广泛的，照说明书操作就行了，接下来可做RT-PCR。

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我现在作提取细胞总RNA的实验，但是细胞很少（2.4×10e5），而且很珍贵。现细胞离心后保存在－20C冰箱中，没有加TRIZOL。请问如何提取RNA?有没有可能作RT-PCR?
作者: 阿拉蕾    时间: 2011-9-13 15:11

上海的公司名称我不是太清楚，如果你需要的话，我可以给你问问；我所知道的大连宝生物的一步法试剂盒才1200元左右，可以做50次，而且，如果你可以预付的话，他们可以打八五折呢。

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这一试剂盒的效果怎么样啊？
作者: 快乐的大脚    时间: 2011-9-13 15:34

新手请问，作PCR时设计引物应根据DNA序列，那么RT-PCR时是不是应根据CDNA序列设计引物呢，在线盼复。先谢谢各位大侠
作者: 椰子叶子    时间: 2011-9-13 15:35

新手请问，作PCR时设计引物应根据DNA序列，那么RT-PCR时是不是应根据CDNA序列设计引物呢，在线盼复。先谢谢各位大侠

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引物是成对的,sense and antisense。与cDNA配对的是antisense,第一次pcr形成了一条双链cDNA, 引物是根据这个双链cDNA设计的。我也是新手，不知道回答的对不对。
作者: 椰子叶子    时间: 2011-9-13 15:36

这一试剂盒的效果怎么样啊？

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宝生物是大家公认的质量最好的，应该没问题。
作者: 椰子叶子    时间: 2011-9-13 15:36

这一试剂盒的效果怎么样啊？

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顺便跟你说一声，上海的公司叫做生工，但是也只有100次的
作者: 大猫    时间: 2011-9-13 15:36

对于细胞内有可能微量表达的mRNA，我做RT-PCR没有做出来，想请教各位有没有什么优化条件或高招可以支一下？
作者: 麻瓜    时间: 2011-9-13 15:37

各位兄弟姐妹们：我现在遇到一个大问题了，我要克隆的基因(约1800bp)没有现成的载体可以参考，我打算用PUC118/119载体,行不行啊！
作者: 兔纸    时间: 2011-9-13 15:38

请问日本takara的反转录试剂盒效果怎么样？
有没有战友用过？
作者: 兔纸    时间: 2011-9-13 15:38

宝生物是大家公认的质量最好的，应该没问题。

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为什么价格要比其他公司的便宜呢？
它那里50份的才要1200左右啊！
作者: 椰子叶子    时间: 2011-9-13 15:39

请问日本takara的反转录试剂盒效果怎么样？
有没有战友用过？

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说的宝生物就是此公司，我的同学都说他家的试剂很好，我也在他家定的试剂。
作者: 喵咪    时间: 2011-9-13 15:40

为什么价格要比其他公司的便宜呢？
它那里50份的才要1200左右啊！

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对不起，是打折之后1200元！
作者: 速冻虾米    时间: 2011-9-13 15:40

我将要做RT-PCR,引物已让博亚合成.
今天才注意到不同目的基因地长度差别太少,没法在一个泳道里跑开.目的基因地长度分别是,245bp,278bp,312bp,340bp,362bp. 而且师姐剩下的内参GAPDH的长度是212bp.
请教各位高手我该怎么办,将内参换成500bp就可以了吗?跑电泳时该怎样设计才省时省力一些.
作者: 喵咪    时间: 2011-9-13 15:41

用1。5%的胶可能还是可以区分开的。内参可以单独做一管，以便和其他的样品对照。  
作者: 麻瓜    时间: 2011-9-13 15:41

问个很笨的问题，我想用RT-PCR验证我的细胞稳定转染，已经用合成的引物试验过一回，转染的细胞阳性，正常细胞阴性，那么我是否一定还要做GAPDH呢？对于鉴定转染与否来说，是否需要？
作者: 阿拉蕾    时间: 2011-9-13 15:42

问个很笨的问题，我想用RT-PCR验证我的细胞稳定转染，已经用合成的引物试验过一回，转染的细胞阳性，正常细胞阴性，那么我是否一定还要做GAPDH呢？对于鉴定转染与否来说，是否需要？

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没必要。
作者: @木木@    时间: 2011-9-13 15:42

我已经知道了，并不是所有的RT-PCR产物都必须先与T载体连接，与它连接有时是为了置换它两侧的酶切位点，有时有利于目的基因的保存，你找到设计引物的软件了吗？primer primier5.0就很好用，可以从网上下载，你搜搜，很容易就找到，我就是从网上下的。
您好呀。我在网上找到的primer primier5.0是domo版，不能用呀。我按照本论坛的方法改了win.ini的也不行，怎麽办呀？还有，我找到的序列是mRNA序列，没有cDNA序列，在设计引物时怎麽办呢？
谢谢您，帮帮我吧。
作者: 阿拉蕾    时间: 2011-9-13 15:43

用1。5%的胶可能还是可以区分开的。内参可以单独做一管，以便和其他的样品对照。

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你是说用长度212bp的内参能与各目的基因在同一泳道里跑开吗?但师姐师兄们都说不可能,要换内参的,内参的长度最好是500多个碱基的.而且各目的基因不可能在同一泳道里跑开,只有将内参与每个目的基因在同一泳道里分别跑.
作者: 阿拉蕾    时间: 2011-9-13 15:43

做RT-PCR后用分光光度剂测量RNA量的时候，用什么方法处理装提取物的玻璃管？多谢！！

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做RT-PCR后还测RNA量?
作者: 阿拉蕾    时间: 2011-9-13 15:44

我已经用了inner control.我就是用housekeeping-gene来做inner control的，因为我有很多个样品，不同发育阶段的，所以我想先用housekeeping gene做PCR来调每个样品的起始模板量，等到每个样品用housekeeping gene primer扩出的产物经电泳后，每一条带的亮度一致以后，我再用同样的模板量以特异引物PCR。这样得到的结果我就当作是半定量的结果。可我调了2个多月了，还是调不一致，CDAN模板也降解了。所以现在我又要从头做起。头疼！
能否具体地告诉我该怎么做？万分感激！

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有条件的话做quantitative PCR 是最好的了,这样可以不必调节样本起始的模板量,而是根据每分样品中同内参的比较来定量. 不能做quantitative PCR 的话可以这样:
提取RNA后用紫外法测定浓度,在RT时加入同样量的RNA(eg: 1ug).这样能够大致定量.
另,最好避免cDNA反复冻融,如已多次冻融最好放弃重新RT.
作者: 微笑的海豚    时间: 2011-9-13 15:44

我已经知道了，并不是所有的RT-PCR产物都必须先与T载体连接，与它连接有时是为了置换它两侧的酶切位点，有时有利于目的基因的保存，你找到设计引物的软件了吗？primer primier5.0就很好用，可以从网上下载，你搜搜，很容易就找到，我就是从网上下的。
您好呀。我在网上找到的primer primier5.0是domo版，不能用呀。我按照本论坛的方法改了win.ini的也不行，怎麽办呀？还有，我找到的序列是mRNA序列，没有cDNA序列，在设计引物时怎麽办呢？
谢谢您，帮帮我吧。

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cDNA不就是mRNA的互补序列吗你设计引物时上游是和你所查到的mRNA序列一致,下游是互补的不行你告诉我你的邮箱我看能否把primer primier5.0的原装程序给你发过去!  
作者: 微笑的海豚    时间: 2011-9-13 15:45

刚开始做PCR,随便在文献上找了对引物,听别人说要到BLAST 上验证才行,于是拿去验证,却看不懂出来的结果.问周围的人也说不出所以然,毕竟大家都是搞临床的.郁闷!!现在总怀疑自己的引物不够好.哪位高手能帮忙指点迷津,救救急呀!!!周围的人真的是一个也帮不上忙,我的帖子已经发了几天也没人理睬,快急死了,现在只好厚着脸皮又在这里发一回,真的是没办法了,我的标本很珍贵,做一次很不容易.刚开始做什么都不顺,实验室条件又不好,而我的时间又紧,罗嗦这么多,希望能得到你们的帮助!!
上游:ACGCTCCTGCTCGGCTGGGT
下游:CGTCTGCTTCACATCCTTCA
另外一对为
上游:CCCCCACTGAAAAAGATGAG
下游:TCACTCAATCCAAATGCGGC

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你找到原序列核实一下,从文献上找到的有时有改动,我帮我同学找的引物就被原作者改了一个碱基!
作者: 微笑的海豚    时间: 2011-9-13 15:45

做RT-PCR后还测RNA量?

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你是提取RNA后测吧?用DEPC 处理就可以吧!
作者: 8黑眼圈8    时间: 2011-9-13 15:52

想请教一下：用于做RT-PCR的组织块取出后可以常温放多长时间？不用立即就低温放置吧。还有，我将要把PCR产物双切作克隆，所以在引物两端设计了EcoR I及Sal I两酶的识别位点，可以吗？
哪位高手可以指教啊！
作者: free    时间: 2011-9-13 15:53

请问大家个问题，我买的premega公司的一步法RT-PCR试剂盒，AMV逆转录酶和 TFL聚合酶体积是一样多的每次也用的是一样多的，但我的AMV逆转录酶已用完，TFL聚合酶还剩下好多次，上次也是这种情况是浓度大些每次用多了吗？而且换了premega公司的AMV逆转录酶（10U/UL，原来的为5U/UL），就做不出来了。连B-ACTIN都做不出来了怎么办呀？难道要从新买，还有那么多别的试剂怎么办？先谢过各位大虾了
作者: 椰子叶子    时间: 2011-9-13 15:54

问一下公司是怎么回事，有没有可能是量不足。
AMV逆转录酶单卖品的buffer与试剂盒的不一样，需要重新调整条件的。
作者: 胖小妮子    时间: 2011-9-13 15:58

在做半定量RT-PCR时，同管扩增，用RNA做模板进行扩增作为对照，同时加入了我的目的基因的引物和内参的引物进行扩增，我的目的基因没有扩出，但是为什么内参18srRNA扩出了呢？想不明白？不知是和道理？盼高人指点！谢了！
作者: fangxiang    时间: 2011-9-13 16:04

我在做半定量RT-PCR时，用反转录的cDNA做模板，用18srRNA做内参同管扩增，能够扩出目的条带。我知道如果用RNA做模板也同样能扩出我的目的基因，那么我的RNA样品中可能会有DNA模板存在。现在的问题是我在做同管扩增时，不是会有四条引物嘛，也就是两条我的目的基因引物，两条内参引物（内参我用的是18srRNA）。我的RNA样品扩增后没有扩出目的基因，但是扩出了18srRNA，也就是内参的条带（跟同管扩增时18srRNA位置相同）。我是疑惑为什么用总RNA做模板能够扩出18srRNA来呢？
作者: fangxiang    时间: 2011-9-13 16:05

顺便请教：

请教以下：RT－PCR产物需作半定量即目的产物／内参，目的产物与内参经琼脂糖电泳后照相，图片能用软件Bandscan计算其平均光密度值吗？但该软件好像只能计算条带的总灰度值及最高灰度值，如该软件不能用，还有没有其他的软件可代替，网上能够下载的？

谢谢
作者: 米米    时间: 2011-9-13 16:06

请问一下,有书上写AMV-RT酶的最适温度是42℃.而PROMEGA试剂盒程序上用的是48℃,而LIHGTCYCLER说明书上说最好用55℃.温度过低会产生非特异性cDNA,我到底该用哪个温度呢?总不会是一个一个试吧,各位导师有何建议提供吗?谢谢!
作者: 米米    时间: 2011-9-13 16:06

还有个问问题想问下子,GAPDH产物的长度是多少,如有可能的话,能不能帮我看看下列两对引物扩增后"产物"的长度和Tm值,谢谢.
S1:5'-GTTACCAGGGCTGCCTTCTC-3'
S2:5'-GGGTTTCCCGTTGATGACC-3'
P1:5'-CACAGCGCCAGCAACTATCA-3'
P2:5'-GATATTACCGATGGCCACGG-3'
作者: 浆果儿cc    时间: 2011-9-13 16:07

哪位战友做人的vcam-1的rt-pcr 吗？可以推荐一下vcam-1的引物吗？不胜感激！
作者: dior    时间: 2011-9-13 16:22

我用一个别人已p出的引物（文献报道），按作者提供的循环参数跑pcr，结果却是一条比目的基因小300bp的清晰条带，无smear带，无其它条带。
WHY ?????急盼回音！！！
作者: dior    时间: 2011-9-13 16:22

我用一个别人已p出的引物（文献报道），按作者提供的循环参数跑pcr，结果却是一条比目的基因小300bp的清晰条带，无smear带，无其它条带。
WHY ?????急盼回音！！！
作者: 微笑的海豚    时间: 2011-9-13 16:23

我用一个别人已p出的引物（文献报道），按作者提供的循环参数跑pcr，结果却是一条比目的基因小300bp的清晰条带，无smear带，无其它条带。
WHY ?????急盼回音！！！

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最常见原因：
1，退火温度不合适。
2，模板质量不好。
引物最好不要乱用别人的 ，老外的酶好，P出来很轻松，咱可比不了人家。最好自己设计引物，比较放心。
作者: dior    时间: 2011-9-13 16:23

谢谢！引物参照国内文献，模板是2月前合成的。不过根据你的提示我准备重新合成再p。再次感谢！
作者: 兔纸    时间: 2011-9-13 16:24

各位老大
有没有知道SSR的，给小弟讲解一下
谢谢了
作者: Darcy    时间: 2011-9-13 16:24

大家好，我是新手，想请教各位高手一个问题：在mRNA表达定量中，（竞争性PCR）内部标准RNA是怎么得到的呢？还请各位指导一下步骤，非常感谢
作者: guagua    时间: 2011-9-13 16:26

请问各位战友，我做rt时，跑电泳结果全是非特异性条带（５００bp以下），而目的条带（700bp)则没有，而该片段以前曾跑出来过．另一管内参很清晰且无杂带．我百思不得其解．有高手告诉我下步该如何做？不胜感激！！
作者: 快乐的大脚    时间: 2011-9-13 16:26

各位大侠，为什么我的PCR产物1400bp克隆以后老是出现空载体的情况呢请问怎么改进。
作者: HOT兔    时间: 2011-9-13 16:27

请教
我用两步法做RT-PCR ,但是反转录后没有灭活反转录酶，以致该酶把模板降解了。
请问：1。如何灭活该酶？是否可以用95度5分钟来灭活
2。如果是的话，灭活时用不用加石蜡油？
3。如果加石蜡油，再进行PCR时，会不会影响所加量？因为石蜡油总会在枪头上沾一点的
备注：我做RT是42度，所以不加石蜡油
作者: HOT兔    时间: 2011-9-13 16:27

请教：
1。提取出来的RNA在用分光计进行检测时，如何来计算样品中的中RNA量？
2。在进行反转录时，对模板有没有量的要求？是多少？
3。反转录后进行PCR时，因该取多少的CDNA就可以了？
4。我看到文献上好多都说去反转录产物2ul再进行PCR，我在做PCR时取2ul也行吗？
非常感谢  
作者: HOT兔    时间: 2011-9-13 16:28

请教：
在做PCR时，需要做内参照。内参照是每一管都要做还是每一组做一个就行了？ 内参照和所需检测的指标要在同一个退火温度做吗？
我看到有的国外文献上，每组内参照只有一个，而且好多指标都用这个内参照，同时还说该内参照最适退火温度是多少，和所测得指标不一样。这样行吗？
作者: 韩梅梅    时间: 2011-9-13 16:28

请教
我用两步法做RT-PCR ,但是反转录后没有灭活反转录酶，以致该酶把模板降解了。
请问：1。如何灭活该酶？是否可以用95度5分钟来灭活
2。如果是的话，灭活时用不用加石蜡油？
3。如果加石蜡油，再进行PCR时，会不会影响所加量？因为石蜡油总会在枪头上沾一点的
备注：我做RT是42度，所以不加石蜡油

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1可以
2我们不加石蜡油,因我们的pcr仪有盖子温度,不需要这样.
3应该不会影响的,石蜡油总是在上层的
作者: 韩梅梅    时间: 2011-9-13 16:29

请教：
1。提取出来的RNA在用分光计进行检测时，如何来计算样品中的中RNA量？
2。在进行反转录时，对模板有没有量的要求？是多少？
3。反转录后进行PCR时，因该取多少的CDNA就可以了？
4。我看到文献上好多都说去反转录产物2ul再进行PCR，我在做PCR时取2ul也行吗？
非常感谢

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1 我是取2ulRNA,加DEPC水稀释100倍,空白对照为200ulDEPC水.设测的A260为y,则浓度为y*40*100/1000=4y ug/ul
2因要进行半定量,模板的量要一致,我一般定为4ug(30ul RT体系),还好
3我是取5ul(50ul体系)
作者: 韩梅梅    时间: 2011-9-13 16:29

请教：
在做PCR时，需要做内参照。内参照是每一管都要做还是每一组做一个就行了？ 内参照和所需检测的指标要在同一个退火温度做吗？
我看到有的国外文献上，每组内参照只有一个，而且好多指标都用这个内参照，同时还说该内参照最适退火温度是多少，和所测得指标不一样。这样行吗？

=============================

外文上说的可行啊,我就是这样做的!
作者: 荷塘青蛙！    时间: 2011-9-13 16:30

接上贴：大家多交流。
5)同一般常用方法相比较，Access RT-PCR系统有什么优点？
Access RT-PCR系统在单个管子中完成反应，不需要对反应混合物作任何添加，同一般常用方法相比, 减少了操作时间，减少了污染反应混合物的机会。同单酶反应相比较，即用rTthDNA聚合酶对总RNA中的目标RNA作扩增，双酶反应更灵敏。

6)使用Access RT-PCR系统需要优化哪些条件？
有多个因素需要优化以获得最佳引物模板结合,这包括硫酸镁的浓度, 引物退火的温度，扩增的次数。
A)Access RT-PCR系统中AMV反转录酶和Tf1DNA聚合酶对镁的需要受核苷酸，引物和模板终浓度的影响。建议选择0.5-3.0mM(相差0.5mM)的硫酸镁作初步实验。
对于具有较高Tm的引物，增加退火和延伸时的温度对反应有利。较高的温度有利于减少非特异的引物结合，因而提高特异产物的得率。
C)大多数目标RNA经40轮PCR反应就能观察倒。但如果目标RNA太稀少，或者只有很少的起始材料，有必要增加扩增的次数到45-50次。

7)Tf1DNA聚合酶是否有反转录酶活力？
Tf1DNA聚合酶本身在测试的条件下不具有反转录酶活力。

8)为什么Access RT-PCR系统不使用MMLV反转录酶而使用AMV反转录酶？
要使反转录有效，必须消除RNA中的多数次级结构。为次，合成cDNA的第1条链必须在较高的温度下进行。MMLV反转录酶能采用的最高温度是42oC, AMV的活力在Access RT-PCR系统中可以达到48oC。因此，使用AMV反转录酶，可以消除RNA次级结构的负面影响。

9)在使用反转录系统时，能否用氯化镁代替硫酸镁？
不能用氯化镁代替硫酸镁。Tf1DNA聚合酶在用硫酸镁和AMV/Tf15X反应液中的的活力有很大提高。
共进步，同学习
作者: 荷塘青蛙！    时间: 2011-9-13 16:30

对不住大家，帖子顺序反了，大家看看或许有用，多提意见！
1)什么是RT-PCR？
RT-PCR是将RNA模板的反转录（RT）,和cDNA的聚合酶链式扩增（PCR）相结合的技术。RT-PCR技术灵敏而且用途广，可用于检测产生的转录产物，分析表达的水平，不需构建和筛选cDNA文库而能直接克隆cDNA产物。

2)什么是Access RT-PCR系统？
Access RT-PCR系统用于从总RNA或mRNA中, 对特异RNA模板进行反转录（RT）和聚合酶链式扩增（PCR）。这一系统在单个管子中，使用两个酶，可对极其稀少的RNA进行灵敏,快速,重复好的分析。这一系统使用禽类成髓细胞瘤病毒的反转录酶合成cDNA的第1条链，用来自黄栖热菌的热稳定Tf1DNA聚合酶合成cDNA的第2条链,和PCR扩增DNA。

3)总RNA能否作为模板，是否一定需要poly(A)+RNA?
RNA模板可以是总RNA， mRNA[poly(A)+RNA], 或者合成的RNA转录产物。无论使用何种RNA，关键是保持在RNA提取过程中无RNA酶污染。使用Promega公司的SV总RNA提取系统（目录号Z3100和Z3101），RNAgents 总RNA提取系统(目录号Z5110)和PolyATtract-mRNA提取系统,所获得的RNA的纯度好, 适用于Access RT-PCR系统。 应注意降低提取所得RNA中残留DNA的量。用Promega公司的RQ1无RNA酶的DNase（目录号M6101）处理RNA样品（随后抽提和沉淀）,除去其中残留的DNA。

4)使用Access RT-PCR系统需要RNA的量是多少？
使用Access RT-PCR系统扩增RNA的低限取决于模板和引物。用正对照RNA，RNA量的低限为103个分子。总RNA模板的量在1pg-1ug的范围内，poly(A)+RNA模板的量在1-100ng的范围内, 可获的很好的结果。

多交流 ，多学习，共进步
作者: 阿福    时间: 2011-9-13 16:31

把你的引物和你要批的基因全长序列Blast，能完全吻合就说明引物是好的
作者: 阿福    时间: 2011-9-13 16:42

还有个问问题想问下子,GAPDH产物的长度是多少,如有可能的话,能不能帮我看看下列两对引物扩增后"产物"的长度和Tm值,谢谢.
S1:5'-GTTACCAGGGCTGCCTTCTC-3'
S2:5'-GGGTTTCCCGTTGATGACC-3'
P1:5'-CACAGCGCCAGCAACTATCA-3'
P2:5'-GATATTACCGATGGCCACGG-3'

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42℃就可以，我们一直在用。
GAPDH产物的长度是根据引物来决定的。
你的目的基因是什么，光贴出引物序列神仙才能算出产物的长度：）
作者: 阿福    时间: 2011-9-13 16:43

还有个问问题想问下子,GAPDH产物的长度是多少,如有可能的话,能不能帮我看看下列两对引物扩增后"产物"的长度和Tm值,谢谢.
S1:5'-GTTACCAGGGCTGCCTTCTC-3'
S2:5'-GGGTTTCCCGTTGATGACC-3'
P1:5'-CACAGCGCCAGCAACTATCA-3'
P2:5'-GATATTACCGATGGCCACGG-3'

=====================================================

42℃就可以，我们一直在用。
GAPDH产物的长度是根据引物来决定的。
你的目的基因是什么，光贴出引物序列神仙才能算出产物的长度]
作者: 童童    时间: 2011-9-13 16:44

人想做RT-PCR，但不知给患者抽血后怎样保存，是直接保存血液还是抽提RNA后保存RNA?能保存多长时间，这样的问题不要见怪，多谢。
作者: 童童    时间: 2011-9-13 16:44

人想做RT-PCR，但不知给患者抽血后怎样保存，是直接保存血液还是抽提RNA后保存RNA?能保存多长时间，这样的问题不要见怪，多谢。
作者: 韩梅梅    时间: 2011-9-13 16:45

FEATURES Location/Qualifiers
source 1..2334
/organism="Homo sapiens"
/mol_type="mRNA"
/db_xref="taxon:9606"
/chromosome="20"
/map="20q11.2-q13.1"
gene 1..2334
/gene="MMP9"
/note="synonyms: GELB, CLG4B"
/db_xref="GeneID:4318"
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/db_xref="MIM:120361"
CDS 20..2143
/gene="MMP9"
/EC_number="3.4.24.35"
/note="92kD type IV collagenase; matrix metalloproteinase
9 (gelatinase B, 92kD gelatinase, 92kD type IV
collagenase); macrophage gelatinase; type V collagenase;
go_component: extracellular matrix [goid 0005578]
[evidence IEA];
go_component: extracellular space [goid 0005615] [evidence
TAS] [pmid 2551898];
go_function: collagenase activity [goid 0008133] [evidence
TAS] [pmid 2551898];
go_function: zinc ion binding [goid 0008270] [evidence
TAS] [pmid 2551898];
go_function: gelatinase B activity [goid 0004229]
[evidence IEA];
go_function: hydrolase activity [goid 0016787] [evidence
IEA];
go_process: proteolysis and peptidolysis [goid 0006508]
[evidence E] [pmid 2551898];
go_process: collagen catabolism [goid 0030574] [evidence
IEA]"
/codon_start=1
/product="matrix metalloproteinase 9 preproprotein"
/protein_id="NP_004985.1"
/db_xref="GI:4826836"
/db_xref="GeneID:4318"
/db_xref="LocusID:4318"
/db_xref="MIM:120361"
作者: 韩梅梅    时间: 2011-9-13 16:46

我做rt-pcr要做5个指标,有4个作的还好,但MMP9就第一次作出来了,后来几次电泳结果都没有理想的带子.这是什么原因,我分别试了几种退火温度,都不理想,不知该怎么办,是不是要换引物.是不是引物设计的太靠前,逆转录没得到多量的完整的cdna而造成的.
引物及基因序列如下,请大家帮忙分析分析!!!
(855) 5'GGGACGGCAATGCTGAT3' (871) 17BP 362BP
(1216) 5'CGCCACGAGGAACAAACT3' (1199) 18BP

LOCUS NM_004994 2334 bp mRNA linear PRI 20-DEC-2003
DEFINITION Homo sapiens matrix metalloproteinase 9 (gelatinase B, 92kDa
gelatinase, 92kDa type IV collagenase) (MMP9), mRNA.
ACCESSION NM_004994
VERSION NM_004994.1 GI:4826835
KEYWORDS .
SOURCE Homo sapiens (human)
ORGANISM Homo sapiens
Eukaryota; Metazoa; Chordata; Craniata; Vertebrata; Euteleostomi;
Mammalia; Eutheria; Primates; Catarrhini; Hominidae; Homo.
作者: 韩梅梅    时间: 2011-9-13 16:46

/translation="MSLWQPLVLVLLVLGCCFAAPRQRQSTLVLFPGDLRTNLTDRQL
AEEYLYRYGYTRVAEMRGESKSLGPALLLLQKQLSLPETGELDSATLKAMRTPRCGVP
DLGRFQTFEGDLKWHHHNITYWIQNYSEDLPRAVIDDAFARAFALWSAVTPLTFTRVY
SRDADIVIQFGVAEHGDGYPFDGKDGLLAHAFPPGPGIQGDAHFDDDELWSLGKGVVV
PTRFGNADGAACHFPFIFEGRSYSACTTDGRSDGLPWCSTTANYDTDDRFGFCPSERL
YTRDGNADGKPCQFPFIFQGQSYSACTTDGRSDGYRWCATTANYDRDKLFGFCPTRAD
STVMGGNSAGELCVFPFTFLGKEYSTCTSEGRGDGRLWCATTSNFDSDKKWGFCPDQG
YSLFLVAAHEFGHALGLDHSSVPEALMYPMYRFTEGPPLHKDDVNGIRHLYGPRPEPE
PRPPTTTTPQPTAPPTVCPTGPPTVHPSERPTAGPTGPPSAGPTGPPTAGPSTATTVP
LSPVDDACNVNIFDAIAEIGNQLYLFKDGKYWRFSEGRGSRPQGPFLIADKWPALPRK
LDSVFEEPLSKKLFFFSGRQVWVYTGASVLGPRRLDKLGLGADVAQVTGALRSGRGKM
LLFSGRRLWRFDVKAQMVDPRSASEVDRMFPGVPLDTHDVFQYREKAYFCQDRFYWRV
SSRSELNQVDQVGYVTYDILQCPED"
misc_feature 95..328
/gene="MMP9"
/note="Peptidase_M10_N; Region: Matrix metalloprotease,
N-terminal domain"
/db_xref="CDD:8860"
misc_feature 344..664
/gene="MMP9"
/note="Peptidase_M10; Region: Matrixin"
/db_xref="CDD:9149"
misc_feature 686..832
/gene="MMP9"
/note="FN2; Region: Fibronectin type 2 domain"
/db_xref="CDD:22668"
misc_feature 860..1006
/gene="MMP9"
/note="FN2; Region: Fibronectin type 2 domain"
/db_xref="CDD:22668"
misc_feature <953..>1351
/gene="MMP9"
/note="KOG1565; Region: Gelatinase A and related matrix
metalloproteases [Posttranslational modification, protein
turnover, chaperones, Extracellular structures]"
/db_xref="CDD:19353"
misc_feature 1037..1183
作者: 韩梅梅    时间: 2011-9-13 16:46

/gene="MMP9"
/note="FN2; Region: Fibronectin type 2 domain"
/db_xref="CDD:22668"
misc_feature <1160..1351
/gene="MMP9"
/note="ZnMc; Region: Zinc-dependent metalloprotease"
/db_xref="CDD:22715"
misc_feature 1559..2131
/gene="MMP9"
/note="HX; Region: Hemopexin-like repeats"
/db_xref="CDD:14815"
misc_feature 77..2140
/gene="MMP9"
/note="matrix metalloproteinase 9 proprotein"
variation 78
/gene="MMP9"
/replace="T"
/replace="C"
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variation 78
/gene="MMP9"
/replace="T"
/replace="C"
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variation 263
/gene="MMP9"
/replace="G"
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variation 400
/gene="MMP9"
/replace="G"
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variation 499
/gene="MMP9"
/replace="G"
/replace="C"
/db_xref="dbSNP:25650"
variation 512
/gene="MMP9"
/replace="G"
作者: 韩梅梅    时间: 2011-9-13 16:47

/replace="A"
/db_xref="dbSNP:8125581"
variation 855
/gene="MMP9"
/replace="G"
/replace="A"
/db_xref="dbSNP:2664538"
variation 855
/gene="MMP9"
/replace="G"
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variation 1359
/gene="MMP9"
/replace="T"
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variation 1365
/gene="MMP9"
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variation 1740
/gene="MMP9"
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variation 1840
/gene="MMP9"
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variation 1855
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variation 1881
/gene="MMP9"
/replace="G"
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/db_xref="dbSNP:6104428"
variation 2022
/gene="MMP9"
/replace="G"
/replace="A"
/db_xref="dbSNP:2274756"
variation 2022
/gene="MMP9"
/replace="G"
作者: 韩梅梅    时间: 2011-9-13 16:47

/replace="A"
/db_xref="dbSNP:17577"
variation 2041
/gene="MMP9"
/replace="T"
/replace="C"
/db_xref="dbSNP:1802909"
variation 2181
/gene="MMP9"
/replace="C"
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variation 2198
/gene="MMP9"
/replace="G"
/replace="A"
/db_xref="dbSNP:1802908"
polyA_signal 2310..2315
/gene="MMP9"
/evidence=experimental
polyA_site 2334
/gene="MMP9"
ORIGIN
1 agacacctct gccctcacca tgagcctctg gcagcccctg gtcctggtgc tcctggtgct
61 gggctgctgc tttgctgccc ccagacagcg ccagtccacc cttgtgctct tccctggaga
121 cctgagaacc aatctcaccg acaggcagct ggcagaggaa tacctgtacc gctatggtta
181 cactcgggtg gcagagatgc gtggagagtc gaaatctctg gggcctgcgc tgctgcttct
241 cc
作者: 韩梅梅    时间: 2011-9-13 16:47

1501 aggtcccccc actgctggcc cttctacggc cactactgtg cctttgagtc cggtggacga
1561 tgcctgcaac gtgaacatct tcgacgccat cgcggagatt gggaaccagc tgtatttgtt
1621 caaggatggg aagtactggc gattctctga gggcaggggg agccggccgc agggcccctt
1681 ccttatcgcc gacaagtggc ccgcgctgcc ccgcaagctg gactcggtct ttgaggagcc
1741 gctctccaag aagcttttct tcttctctgg gcgccaggtg tgggtgtaca caggcgcgtc
1801 ggtgctgggc ccgaggcgtc tggacaagct gggcctggga gccgacgtgg cccaggtgac
1861 cggggccctc cggagtggca gggggaagat gctgctgttc agcgggcggc gcctctggag
1921 gttcgacgtg aaggcgcaga tggtggatcc ccggagcgcc agcgaggtgg accggatgtt
1981 ccccggggtg cctttggaca cgcacgacgt cttccagtac cgagagaaag cctatttctg
2041 ccaggaccgc ttctactg
作者: 韩梅梅    时间: 2011-9-13 16:47

1501 aggtcccccc actgctggcc cttctacggc cactactgtg cctttgagtc cggtggacga
1561 tgcctgcaac gtgaacatct tcgacgccat cgcggagatt gggaaccagc tgtatttgtt
1621 caaggatggg aagtactggc gattctctga gggcaggggg agccggccgc agggcccctt
1681 ccttatcgcc gacaagtggc ccgcgctgcc ccgcaagctg gactcggtct ttgaggagcc
1741 gctctccaag aagcttttct tcttctctgg gcgccaggtg tgggtgtaca caggcgcgtc
1801 ggtgctgggc ccgaggcgtc tggacaagct gggcctggga gccgacgtgg cccaggtgac
1861 cggggccctc cggagtggca gggggaagat gctgctgttc agcgggcggc gcctctggag
1921 gttcgacgtg aaggcgcaga tggtggatcc ccggagcgcc agcgaggtgg accggatgtt
1981 ccccggggtg cctttggaca cgcacgacgt cttccagtac cgagagaaag cctatttctg
2041 ccaggaccgc ttctactggc gcgtgagttc ccggagtgag ttgaaccagg tggaccaagt
2101 gggctacgtg acctatgaca tcctgcagtg ccctgaggac tagggctccc gtcctgcttt
2161 gcagtgccat gtaaatcccc actgggacca accctgggga aggagccagt ttgccggata
2221 caaactggta ttctgttctg gaggaaaggg aggagtggag gtgggctggg ccctctcttc
2281 tcacctttgt tttttgttgg agtgtttcta ataaacttgg attctctaac cttt
//
作者: 韩梅梅    时间: 2011-9-13 16:48

本人想做RT-PCR，但不知给患者抽血后怎样保存，是直接保存血液还是抽提RNA后保存RNA?能保存多长时间，这样的问题不要见怪，多谢。

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放－80度可以很长时间，一年是绝对没什么问题的，无论是RNA还是血。
这些问题最好是查些资料，比问DXYER好，可以血好多冬冬，还比较权威。
作者: 鲁西西    时间: 2011-9-13 16:48

请问：做PCR时，有时阴性对照也有扩增，要解决这个问题，应注意些什么？
作者: 丸子妹    时间: 2011-9-13 16:49

组织RT－PCR时，对组织有没有什么要求，一定要是新鲜未经任何处理的标本吗？
请教大家，因急用，谢谢不吝赐教！！
作者: 清风风铃    时间: 2011-9-13 16:50

"我前后两次用一步法做rt-pcr，温度和试剂浓度等条件都相同，用的是同一种引物，电泳结果第一次有且仅有一条600多bp的带，而第二次却有且仅有一条500bp的带。如果引物的特异性强为什么相同方法作两遍会出现两条bp值不同的带，如果引物特异性不高又为何每次只有一条带。我百思不得其解：（！（另：引物设计时是233bp）"
mainidea扩的带大于引物设计时预想的。我引物设计时是977bp，却扩得600bp。而对同一RT后的样品，采用另一引物（设计时900bp），PCR后能得到预想的。我想请教各位高手，在我的RT-PCR过程中估计哪一步有问题？
另请问各位高手，对于表达同一产物不同的品种，能否通过RT-PCR比较品种间量的差异。
作者: finger    时间: 2011-9-13 16:50

RT-PCR时,用trupure一步法提出的RNA需要鉴定吗?用什么方法鉴定比较好?是不是RNA鉴定后才作RT-PCR?那位知道的请回答,谢谢!
作者: 丸子妹    时间: 2011-9-13 16:51

我是RT-PCR新手，准备取甲状腺标本作实验，想请教大家几个问题
1 甲状腺组织我准取手术标本，取下来之后放在消毒好的冻存管里，放在冰壶里，然后才能拿回实验室的－80度冰箱保存。组织在冰壶中大概放30分钟左右，不知道做RT-PCR 会不会有影响？
2 PCR的引物我是在国外文献上查到的，我的上游引物有18个，一个共同的下游引物。我自己也不会设计引物，不知道国外文献上的资料可不可靠！
作者: 椰子叶子    时间: 2011-9-13 16:52

各位大侠，为什么我的PCR产物1400bp克隆以后老是出现空载体的情况呢请问怎么改进。

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你的PCR产物纯化过没有？如纯化过，纯化的效果怎么样？我们觉得克隆的时候目的基因的纯度是一定要保证的，目的基因不太纯一般会影响连接的效果。另外，你的目的基因和载体的摩尔浓度比也要适宜。一般保持在1：1和1：3之间。
作者: 大虾米    时间: 2011-9-13 16:52

各位大大侠，我想请问做细菌RNA的PT-PCR，你们都用的什么做内标准啊？不能用B-actin吧。谢谢！
作者: 阿拉蕾    时间: 2011-9-13 16:53

内参一般是定量研究某一个基因的表达的工具，因此你在原核中比较时可以选择组成性的并且相对恒定的基因，但是由于原核细胞对环境的适应性，它自身的很多蛋白表达都是变化，我还没有查到哪个基因一直象真核生物常用内参有beta-ACTIN，GAPDH如此稳定。即使是16sRNA，我估计其表达也不一定是恒定。
这样的话，你估计就得想其他的办法来定量某一个基因RNA的量，其中Real-time 应该不错的。
至于通过内参看反转录的效果，随便找个有引物的RNA来做就行。
作者: 大虾米    时间: 2011-9-13 16:54

谢谢！我知道有人用过16s rRNA做内参的，我想用细胞色素类不知理论上可行否？real-time PCR好像比较麻烦费用也比较昂贵哈，研究生经费不够用。  
作者: 森林木    时间: 2011-9-13 16:55

各位大虾：我现在要做PCR，无奈序列中GC含量太高，我只有cDAN序列，请教如何设计引物？另外，表达载体pGEX4T系列是pharmacia biotech 的产品，但我为什么总是找不到该公司的主页哪？
作者: 森林木    时间: 2011-9-13 16:55

各位大虾：我现在要做PCR，无奈序列中GC含量太高，我只有cDAN序列，请教如何设计引物？另外，表达载体pGEX4T系列是pharmacia biotech 的产品，但我为什么总是找不到该公司的主页哪？
作者: 邓布利多    时间: 2011-9-13 17:00

我是RT-PCR新手，准备取甲状腺标本作实验，想请大家您几个问题
1 甲状腺组织我准取手术标本，取下来之后放在消毒好的冻存管里，放在冰壶里，然后才能拿回实验室的－80度冰箱保存。组织在冰壶中大概放30分钟左右，不知道做RT-PCR 会不会有影响？
2 PCR的引物我是在国外文献上查到的，我的上游引物有18个，一个共同的下游引物。我自己也不会设计引物，不知道国外文献上的资料可不可靠！

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你好：我也是个要做PCR的新手，看了你的帖子，感觉你的取材方法不错，只是组织块儿在进－80度冰箱保存前，你不妨先分装一下，最好不要反复冻融。另国外的引物有一定的可信度， 但你自己最好再设计一下，定好如酶切位点之类的碱基，在测试一下引物，网上有相应的软件。
作者: =菓子=    时间: 2011-9-13 17:00

请问哪位大虾有 pharmacia 公司的目录或网址，我急需该公司的原核表达载体pGEX4T系列的图谱和酶切位点。
作者: 冰激凌小姐    时间: 2011-9-13 17:00

我现要克隆一序列，文献报道的原核表达载体是pGEX1-landa-T，那我用pGEX4T行吗？引物设计时就选用pGEX4T-2的酶切位点可以吗？我表达出来的蛋白是用于作抗体的，因此我选用的表达载体必须与文献一致吗？
作者: 丸子妹    时间: 2011-9-13 17:01

你好：我也是个要做PCR的新手，看了你的帖子，感觉你的取材方法不错，只是组织块儿在进－80度冰箱保存前，你不妨先分装一下，最好不要反复冻融。另国外的引物有一定的可信度， 但你自己最好再设计一下，定好如酶切位点之类的碱基，在测试一下引物，网上有相应的软件。

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感谢！请教，保存组织的冻存管是否要用DEPC水泡呢？
作者: 微笑的海豚    时间: 2011-9-13 17:06

我现要克隆一序列，文献报道的原核表达载体是pGEX1-landa-T，那我用pGEX4T行吗？引物设计时就选用pGEX4T-2的酶切位点可以吗？我表达出来的蛋白是用于作抗体的，因此我选用的表达载体必须与文献一致吗？

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http://www1.amershambiosciences.com/aptrix/upp01077.nsf/Content/NewSearch_Result?OpenDocument&QueryString=pgex&countryvalue=null&SearchForm=FullSiteSearch&SearchKeywords=products&zone=Proteomics&doctitle=Proteomics_Homepage

上面是你需要的东西。
无论选择pGEX1-landa-T，pGEX4T系列理论上都是可行的。不过采用融合表达将来会给筛选带来困难，除非去处融合的GST！蛋白纯化后免疫制Ab，载体按照你实验室喜好的习惯选择即可。
作者: 细水长流    时间: 2011-9-13 17:07

各位高手你们好!
本人做RT-PCR可每一次抽提RNA时都降解的很厉害！可我完全按照说明书操作的，tip头Eppendorf管也是用DEPC泡过后高压的，取的组织先经过液氮速冻后放－70度冰箱的，可为什么RNA都降解的那么厉害呀？我百思不得其解！因RNA降解，我就没信心做下去，望各位帮帮我分析一下原因，本人感激不尽！
作者: guagua    时间: 2011-9-13 17:08

各位高手你们好!
我想问一下做组织的RT-PCR时，是将组织取出先经过液氮速冻后放－80度冰箱保存，还是将组织加入Trizol后冰冻保存，这俩种方法哪一个比较好一些，能够保存多长时间？是整个组织放在冻存管，还是每管分装好呢？谢谢！  
作者: HOT兔    时间: 2011-9-13 17:08

cuturl('http://www1.amershambiosciences.com/aptrix/upp01077.nsf/Content/NewSearch_Result?OpenDocument&QueryString=pgex&countryvalue=null&SearchForm=FullSiteSearch&SearchKeywords=products&zone=Proteomics&doctitle=Proteomics_Homepage')

上面是你需要的东西。
无论选择pGEX1-landa-T，pGEX4T系列理论上都是可行的。不过采用融合表达将来会给筛选带来困难，除非去处融合的GST！蛋白纯化后免疫制Ab，载体按照你实验室喜好的习惯选择即可。

=======================================================================================================

不过"不过采用融合表达将来会给筛选带来困难"这句话的意思是什么？用融合蛋白来免疫动物，得到的抗体去除抗GST的抗体不就可以了吗？
作者: 喵咪    时间: 2011-9-13 17:09

感谢！请教，保存组织的冻存管是否要用DEPC水泡呢？

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如果是新的，一次性的不处理也行，想处理的话也不麻烦。
作者: 喵咪    时间: 2011-9-13 17:09

各位高手你们好!
我想问一下做组织的RT-PCR时，是将组织取出先经过液氮速冻后放－80度冰箱保存，还是将组织加入Trizol后冰冻保存，这俩种方法哪一个比较好一些，能够保存多长时间？是整个组织放在冻存管，还是每管分装好呢？谢谢！

===============================

一定要分装，防止反复冻容。
作者: dreaming    时间: 2011-9-13 17:10

大家好！我是一个分子生物学新手，课题是RT-PCR方面的，我很想知道引物设计中β-Actin 是什麽意思？谢谢！
作者: 大仙    时间: 2011-9-13 17:10

cuturl('http://www1.amershambiosciences.com/aptrix/upp01077.nsf/Content/NewSearch_Result?OpenDocument&QueryString=pgex&countryvalue=null&SearchForm=FullSiteSearch&SearchKeywords=products&zone=Proteomics&doctitle=Proteomics_Homepage')

上面是你需要的东西。
无论选择pGEX1-landa-T，pGEX4T系列理论上都是可行的。不过采用融合表达将来会给筛选带来困难，除非去处融合的GST！蛋白纯化后免疫制Ab，载体按照你实验室喜好的习惯选择即可。

============================================================================================================

老兄：
你好，我到了你提的网站，找到了所需的序列，但那么多酶切位点，哪个是多克隆位点呀，找不到他们的图谱，是不是我不会用呀？快帮帮我吧！
作者: +田田+    时间: 2011-9-13 17:11

各位大虾：你们好！
我摸出条件后只做出了几个目的基因，很清晰，没有杂带，其余很多标本老P不出来，我不知道是临床标本不纯造成的，还是条件没有摸清楚。我现在是继续做PCR好些呢，还是重新转CDNA。请哪位大虾指点一二。谢了  
作者: 韩梅梅    时间: 2011-9-13 17:12

我的内参和目的基因是分别p的，然后加到一个泳道里电泳。
请问各位，是不是每管cdna作pcr时都需要做一管内参呢？？
作者: 晶晶亮    时间: 2011-9-13 17:13

我用逆转录得到的CDNA进行PCR，引物有三个，其中两个PCR后结果不错，另一个只是有结果，可是条带不亮，，而且引物二聚体带很亮。请各位帮忙找找原因。
1、引物：CAACGCACCGAATAGTTACG
AGCACCACCAGCGTGTC
2、PCR反应条件：
MASTER MIX ：dNTP 1.8
MgCl2 8.5
Buffer 9.8
H2O 54.9
Total 75

PCR体系
MASTER MIX 16.0
Primer sense 0.75
Antisense 0.75
cDNA 2
Taq 0.5
20

95℃ 5分钟
94℃，45秒---52℃，45秒----72℃，50秒 35循环
72℃，7分钟
4℃，-----
作者: 晶晶亮    时间: 2011-9-13 17:13

我用逆转录得到的CDNA进行PCR，引物有三个，其中两个PCR后结果不错，另一个只是有结果，可是条带不亮，，而且引物二聚体带很亮。请各位帮忙找找原因。
1、引物：CAACGCACCGAATAGTTACG
AGCACCACCAGCGTGTC
2、PCR反应条件：
MASTER MIX ：dNTP 1.8
MgCl2 8.5
Buffer 9.8
H2O 54.9
Total 75

PCR体系
MASTER MIX 16.0
Primer sense 0.75
Antisense 0.75
cDNA 2
Taq 0.5
20

95℃ 5分钟
94℃，45秒---52℃，45秒----72℃，50秒 35循环
72℃，7分钟
4℃，-----
作者: 小荷尖尖    时间: 2011-9-13 17:13

大家好！看到有些刚开始进行RT-PCR 的战友问了一些基本的问题，以前有的战友已经贴了PCR 有关问题的解决办法及注意事项。稍花些时间就可以找到的。
楼上第24页有铃声贴的RT-PCR常见问题及回答，请多看看书及各种试剂盒的说明书，有些问题很好解决的！  
作者: 兔纸    时间: 2011-9-13 17:14

大家好！我是一个分子生物学新手，课题是RT-PCR方面的，我很想知道引物设计中β-Actin 是什麽意思？谢谢！

=================================================

β-Actin 是内参照，不需要单独设计引物的。都有固定的引物。
所谓内参照通常是一些管家基因，能够稳定表达的一些基因。
作者: 兔纸    时间: 2011-9-13 17:14

不知道各位战友又没有用过宝生物的反转录试剂盒，100份，1600的那种。
你们用的时候是按照试剂盒上提供的10微升反应体系吗？
谢谢了！
作者: panda王    时间: 2011-9-13 17:15

请教：
我做RT-PCR时，PCR产物点样跑胶时，总会发现在点样孔附近有一条很亮的 条带，很清晰，而且感觉总是跑不开。请问这条带是什么？为什么会有这种现 象？
谢谢指点
作者: panda王    时间: 2011-9-13 17:15

请教：
我做RT-PCR时，PCR产物点样跑胶时，总会发现在点样孔附近有一条很亮的 条带，很清晰，而且感觉总是跑不开。请问这条带是什么？为什么会有这种现 象？
谢谢指点
作者: panda王    时间: 2011-9-13 17:15

请教：
如果已知该种产物的RNA是选择性表达的，也就是说有的外显子表达，有的不表达，而且不同时间表达的不同，那么你在扩增整段该CDNA时，在跑胶时出现几条带，那么你如何说明它不是非特异性产物？是否可以通过测序来解决？如果可以的话，测序后怎么证明该产物不是非特异性的产物？
作者: panda王    时间: 2011-9-13 17:16

各位大虾：你们好！
我摸出条件后只做出了几个目的基因，很清晰，没有杂带，其余很多标本老P不出来，我不知道是临床标本不纯造成的，还是条件没有摸清楚。我现在是继续做PCR好些呢，还是重新转CDNA。请哪位大虾指点一二。谢了

==================================================================================


请问你的反转录产物才CDNA放置了多久才作作PCR的。
如果你在反转录后没有高温灭活反转录酶的话，该没会降解CDNA的。建议每次反转录后要95度，20分钟。  
作者: HOT兔    时间: 2011-9-13 17:17

请问你的反转录产物才CDNA放置了多久才作作PCR的。
如果你在反转录后没有高温灭活反转录酶的话，该没会降解CDNA的。建议每次反转录后要95度，20分钟。

============

反转录
作者: HOT兔    时间: 2011-9-13 17:20

请问你的反转录产物才CDNA放置了多久才作作PCR的。
如果你在反转录后没有高温灭活反转录酶的话，该没会降解CDNA的。建议每次反转录后要95度，20分钟。

===============================================================================================================

反转录后用70度20分钟，可不可以？因为我没有用过95度。曾经我克隆第一个基因时非常的顺利，现在要克隆另外一个基因，却总是出不来，很迷茫。
作者: fangxiang    时间: 2011-9-13 17:22

哪位大侠提供一下半定量PCR 的原理及方法？不胜感激！
作者: 菠萝菠萝蜜    时间: 2011-9-13 17:22

哪位大侠赐教一下半定量PCR的原理及方法？不胜感激！
作者: 飞天小鹿    时间: 2011-9-13 17:23

请教：我看不懂基因bank中对CD44s的说明
那位大虾帮我看看如何知道某段序列将来翻译成蛋白后，就有这种功能。
我想要cd44 和透明质酸结合的那一段序列。
望多多赐教，不胜感激。

: NM_000610. Homo sapiens CD44...[gi:21361192] Links

LOCUS NM_000610 3091 bp mRNA linear PRI 07-MAR-2004
DEFINITION Homo sapiens CD44 antigen (homing function and Indian blood group
system) (CD44), mRNA.
ACCESSION NM_000610
VERSION NM_000610.2 GI:21361192
KEYWORDS .
SOURCE Homo sapiens (human)

gene 1..3091
/gene="CD44"
/note="synonyms: IN, INLU, MC56, MDU2, MDU3, MIC4, Pgp1,
CD44R"
/db_xref="GeneID:960"
/db_xref="LocusID:960"
/db_xref="MIM:107269"
prim_transcript <1..>3091
/gene="CD44"
variation 167
/gene="CD44"
/replace="G"
/replace="A"
/db_xref="dbSNP:12293021"
CDS 179..2407
/gene="CD44"
/function="hyaluronate receptor"
/note="homing function; Lutheran inhibitor, dominant
作者: 飞天小鹿    时间: 2011-9-13 17:23

(monoclonal antibody A3D8); Indian blood group system;
go_component: integral to plasma membrane [goid 0005887]
[evidence NAS] [pmid 1991450];
go_component: membrane [goid 0016020] [evidence IEA];
go_function: collagen binding [goid 0005518] [evidence
NAS] [pmid 2471973];
go_function: hyaluronic acid binding [goid 0005540]
[evidence NAS] [pmid 1991450];
go_function: cell adhesion receptor activity [goid
0004895] [evidence IEA];
go_function: receptor activity [goid 0004872] [evidence
IEA];
go_process: cell-matrix adhesion [goid 0007160] [evidence
NAS] [pmid 1922057];
go_process: cell-cell adhesion [goid 0016337] [evidence
NAS] [pmid 1922057];
go_process: cell adhesion [goid 0007155] [evidence IEA]"
/codon_start=1
/product="CD44 antigen"
/protein_id="NP_000601.2"
/db_xref="GI:21361193"
/db_xref="GeneID:960"
/db_xref="LocusID:960"
/db_xref="MIM:107269"
/translation="MDKFWWHAAWGLCLVPLSLAQIDLNITCRFAGVFHVEKNGRYSI
SRTEAADLCKAFNSTLPTMAQMEKALSIGFETCRYGFIEGHVVIPRIHPNSICAANNT
GVYILTYNTSQYDTYCFNASAPPEEDCTSVTDLPNAFDGPITITIVNRDGTRYVQKGE
YRTNPEDIYPSNPTDDDVSSGSSSERSSTSGGYIFYTFSTVHPIPDEDSPWITDSTDR
IPATTLMSTSATATETATKRQEAWDWFSWLFLPSESKNHLHTTTQMAGTSSNTISAGW
EPNEENEDERDRHLSFSGSGIDDDEDFISSTISTTPRAFDHTKQNQDWTQWNPSHSNP
EVLLQTTTRMTDVDRNGTTAYEGNWNPEAHPPLIHHEHHEEEETPHSTSTIQATPSST
TEETATQKEQWFGNRWHEGYRQTPREDSHSTTGTAAASAHTSHPMQGRTTPSPEDSSW
TDFFNPISHPMGRGHQAGRRMDMDSSHSTTLQPTANPNTGLVENLDRTGPLSMTTQQS
NSQSFSTSHEGLEEDKDHPTTSTLTSSNRNDVTGGRRDPNHSEGSTTLLEGYTSHYPH
TKESRTFIPVTSAKTGSFGVTAVTVGDSNSNVNRSLSGDQDTFHPSGGSHTTHGSESD
GHSHGSQEGGANTTSGPIRTPQIPEWLIILASLLALALILAVCIAVNSRRRCGQKKKL
VINSGNGAVEDRKPSGLNGEASKSQEMVHLVNKESSETPDQFMTADETRNLQNVDMKI
GV"
作者: 飞天小鹿    时间: 2011-9-13 17:24

sig_peptide 179..250
/gene="CD44"
mat_peptide 248..2404
/gene="CD44"
/product="transmembrane glycoprotein"
misc_feature 272..538
/gene="CD44"
/note="LINK; Region: Link (Hyaluronan-binding)"
/db_xref="CDD:400"
variation 504
/gene="CD44"
/replace="C"
/replace="A"
/db_xref="dbSNP:1058200"
variation 1300
/gene="CD44"
/replace="G"
/replace="A"
/db_xref="dbSNP:11033026"
variation 1356
/gene="CD44"
/replace="T"
/replace="C"
/db_xref="dbSNP:11607491"
variation 1428
/gene="CD44"
/replace="G"
/replace="A"
/db_xref="dbSNP:9666607"
variation complement(1614)
/replace="G"
/replace="A"
/db_xref="dbSNP:1467558"
variation 1658
/gene="CD44"
/replace="G"
/replace="C"
/db_xref="dbSNP:12273397"
作者: 丸子妹    时间: 2011-9-13 17:24

我要扩增的是TCRVa基因，根据文献上的报道，T细胞受体Va基因可以分为18个家族，我在国外文献上也查到了相应的引物，有18个上游引物和一个共同的下游引物，但总觉得心里不踏实，恳请高人指教，类似于这种情况怎样设计引物？谢谢！

1: X02592. Human mRNA for T-...[gi:36944] Links

LOCUS HSTCRAR 1508 bp mRNA linear PRI 29-JAN-1995
DEFINITION Human mRNA for T-cell receptor alpha chain (TCR-alpha).
ACCESSION X02592 M12959
VERSION X02592.1 GI:36944
KEYWORDS membrane protein; T-cell receptor; T-cell receptor alpha.
SOURCE Homo sapiens (human)
ORGANISM Homo sapiens
Eukaryota; Metazoa; Chordata; Craniata; Vertebrata; Euteleostomi;
Mammalia; Eutheria; Primates; Catarrhini; Hominidae; Homo.
REFERENCE 1 (bases 1 to 1508)
AUTHORS Rabbitts,T.H., Lefranc,M.P., Stinson,M.A., Sims,J.E., Schroder,J.,
Steinmetz,M., Spurr,N.L., Solomon,E. and Goodfellow,P.N.
TITLE The chromosomal location of T-cell receptor genes and a T cell
作者: 丸子妹    时间: 2011-9-13 17:25

rearranging gene: possible correlation with specific translocations
in human T cell leukaemia
JOURNAL EMBO J. 4 , 1461-1465 (1985)
MEDLINE 85284934
PUBMED 3875483
COMMENT On Jul 31, 2003 this sequence version replaced gi:338734.
FEATURES Location/Qualifiers
source 1..1508
/organism="Homo sapiens"
/mol_type="mRNA"
/strain="T-cell leukaemic cell line JM"
/db_xref="taxon:9606"
CDS 129..962
/codon_start=1
/product="TCR-alpha chain"
/protein_id="CAA26435.1"
/db_xref="GI:36945"
/db_xref="REMTREMBL:CAA26435"
/translation="MLLLLVPVLEVIFTLGGTRAQSVTQLGSHVSVSEGALVLLRCNY
SSSVPPYLFWYVQYPNQGLQLLLKYTSAATLVKGINGFEAEFKKSETSFHLTKPSAHM
SDAAEYFCAVSDLEPNSSASKIIFGSGTRLSIRPNIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCL
FTDFDSQTNVSQSKDSDVYITDKTVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSII
PEDTFFPSPESSCDVKLVEKSFETDTNLNFQNLSVIGFRILLLKVAGFNLLMTLRLWS
S"
misc_feature 468..485
/note="pot. variable region (aa 114-119)"
misc_feature 486..533
/note="pot. joining region (aa 120-135)"
misc_feature 534..959
/note="pot. constant region (aa 136-277)"
misc_feature 1492..1497
/note="pot. polyA signal"
ORIGIN
作者: 丸子妹    时间: 2011-9-13 17:29

1 ttttgaaacc cttcaaaggc agagacttgt ccagcctaac ctgcctgctg ctcctagctc
61 ctgaggctca gggcccttgg cttctgtccg ctctgctcag ggccctccag cgtggccact
121 gctcagccat gctcctgctg ctcgtcccag tgctcgaggt gatttttacc ctgggaggaa
181 ccagagccca gtcggtgacc cagcttggca gccacgtctc tgtctctgaa ggagccctgg
241 ttctgctgag gtgcaactac tcatcgtctg ttccaccata tctcttctgg tatgtgcaat
301 accccaacca aggactccag cttctcctga agtacacatc agcggccacc ctggttaaag
361 gcatcaacgg ttttgaggct gaatttaaga agagtgaaac ctccttccac ctgacgaaac
421 cctcagccca tatgagcgac gcggctgagt acttctgtgc tgtgagtgat ctcgaaccga
481 acagcagtgc ttccaagata atctttggat cagggaccag actcagcatc cggccaaata
541 tccagaaccc tgaccctgcc gtgtaccagc tgagagactc taaatccagt gacaagtctg
601 tctgcctatt caccgatttt gattctcaaa caaatgtgtc acaaagtaag gattctgatg
661 tgtatatcac agacaaaact gtgctagaca tgaggtctat ggacttcaag agcaacagtg
721 ctgtggcctg gagcaacaaa tctgactttg catgtgcaaa cgccttcaac aacagcatta
781 ttccagaaga caccttcttc cccagcccag aaagttcctg tgatgtcaag ctggtcgaga
841 aaagctttga aacagatacg aacctaaact ttcaaaacct gtcagtgatt gggttccgaa
901 tcctcctcct gaaagtggcc gggtttaatc tgctcatgac gctgcggctg tggtccagct
961 gagatctgca agattgtaag acagcctgtg ctccctcgct ccttcctctg cattgcccct
1021 cttctccctc tccaaacaga gggaactctc ctacccccaa ggaggtgaaa gctgctacca
1081 cctctgtgcc cccccggtaa tgccaccaac tggatcctac ccgaatttat gattaagatt
1141 gctgaagagc tgccaaacac tgctgccacc ccctctgttc ccttattgct gcttgtcact
1201 gcctgacatt cacggcagag gcaaggctgc tgcagcctcc cctggctgtg cacattccct
1261 cctgctcccc agagactgcc tccgccatcc cacagatgat ggatcttcag tgggttctct
1321 tgggctctag gtcctggaga atgttgtgag gggtttattt ttttttaata gtgttcataa
1381 agaaatacat agtattcttc ttctcaagac gtggggggaa attatctcat tatcgaggcc
1441 ctgctatgct gtgtgtctgg gcgtgttgta tgtcctgctg ccgatgcctt cattaaaatg
1501 atttggaa
//
作者: guagua    时间: 2011-9-13 17:30

我是分子生物学方面的新新新手: 请教:

本人最近做大鼠实验，有一问题请教各位，取大鼠肝脏做RT-PCR，是否需要对大鼠肝脏进行灌洗处理？如需灌洗则是否是从股动脉或颈动脉放血后，从肝动脉进行冲洗？用生理盐水做冲洗液是否可以？不灌洗，取小块肝脏后，用生理盐水冲洗后放入液氮中是否就可以用来提取RNA？

thank you for help!
作者: jude    时间: 2011-9-13 17:31

请教各位，你们做RT－PCR时所用引物是用溶解的？双蒸水还是DEPC处理水？或者有其他方法？
作者: 韩梅梅    时间: 2011-9-13 17:32

请教各位，你们做RT－PCR时所用引物是用溶解的？双蒸水还是DEPC处理水？或者有其他方法？

=============================================================

最好是用DEPC水溶解，每0.5OD 值的引物溶解在100ul DEPC水中就可以了
作者: 喵咪    时间: 2011-9-13 17:34

不知道各位战友又没有用过宝生物的反转录试剂盒，100份，1600的那种。
你们用的时候是按照试剂盒上提供的10微升反应体系吗？
谢谢了！

=====================================

我用的就是TaKaRa 的试剂盒,量可以自己摸索!
作者: 喵咪    时间: 2011-9-13 17:34

最好是用DEPC水溶解，每0.5OD 值的引物溶解在100ul DEPC水中就可以了

=================================================

用dd水就可以 了,用量根据为你做primr的公司所给公式计算
作者: 喵咪    时间: 2011-9-13 17:34

请教：
我做RT-PCR时，PCR产物点样跑胶时，总会发现在点样孔附近有一条很亮的 条带，很清晰，而且感觉总是跑不开。请问这条带是什么？为什么会有这种现 象？
谢谢指点

======================================

一般认为是有所污染,或者是Agarose gel 浓度太大
作者: 喵咪    时间: 2011-9-13 17:35

请教：我看不懂基因bank中对CD44s的说明
那位大虾帮我看看如何知道某段序列将来翻译成蛋白后，就有这种功能。 我想要cd44 和透明质酸结合的那一段序列。
望多多赐教，不胜感激。

===============================================

/CDS 179..2407
/gene="CD44"
/function="hyaluronate receptor"
/note="homing function; Lutheran inhibitor, dominant
(monoclonal antibody A3D8); Indian blood group system;
go_component: integral to plasma membrane [goid 0005887]
[evidence NAS] [pmid 1991450];
go_component: membrane [goid 0016020] [evidence IEA];
go_function: collagen binding [goid 0005518] [evidence
NAS] [pmid 2471973];
go_function: hyaluronic acid binding [goid 0005540]
[evidence NAS] [pmid 1991450];
go_function: cell adhesion receptor activity [goid
0004895] [evidence IEA];
go_function: receptor activity [goid 0004872] [evidence
IEA]; /
作者: 喵咪    时间: 2011-9-13 17:36

接上面：

hyaluronate acid应该是透明质酸，我没有去验证 应该是序列 179..2407起此作用
当然此序列还有其他作用见“ go_function”，如果设计引物建议在此区域内，如果做质粒转染等，还须进一步查询。
另外，此基因还有变异体，设计引物应考虑在内，以免扩出多个带
也是新手，望筒子们指点
作者: 喵咪    时间: 2011-9-13 17:36

用dd水就可以 了,用量根据为你做primr的公司所给公式计算

=====================================================================================================

用dd水或TE均可，TE更好一些。用量根据合成报告上的量计算，一般引物用的浓度是10pmol/ul。1pmol＝10-3nmol＝10-6umol
作者: loli    时间: 2011-9-13 17:45

请教下：我提猪肝脏的RNA，用-70冻存的组织为什么总提不出来，管底用白色物质，但测不出，RT-PCR 也做不出，电泳只有一条带，怎么回事？
谢谢指教
作者: 冰激凌小姐    时间: 2011-9-13 17:46

我的RNA只有一条带？怎么回事呢？请指教
作者: 冰激凌小姐    时间: 2011-9-13 17:46

dd水或TE均可，TE更好一些。用量根据合成报告上的量计算，一般引物用的浓度是10pmol/ul。1pmol＝10-3nmol＝10-6umol

====================================================================

用dd水的话，没有经过DEPC处理，不是可能会含有RNase或其它可能的DNA吗？
作者: 庄梦蝶    时间: 2011-9-13 17:46

SOS,SOS!!
请教主任、铃声及所有高手：
我前两个星期做RT-PCR很顺， 但最近一周有一个基因却扩出不来了，以前也做出来的，而且同一管cDNA能做出内参及另一个基因。请问这是怎麽回事，问题何在，期待高手指教！
作者: 胖小妮子    时间: 2011-9-13 17:47

用dd水的话，没有经过DEPC处理，不是可能会含有RNase或其它可能的DNA吗？

===============================================================================================================

pcr这一步好像不用太注意防RNase吧，至于DNA污染，dd水一般问题不大，如果不放心可以放在高压灭菌锅里蒸一下。一般20min即可。我就是这样用的还好啊！  
作者: 魔法师A    时间: 2011-9-13 17:47

怎样在genebank里,进行高级检索呢,我想查rabbit的心肌的bata-actin的核酸序列,但查来查去,都是一堆乱七八糟的东西,可能是我不会用,原来的引物是别人设计好的,有谁会吗,请讲一下这个菜鸟问题.  
作者: 萌芽    时间: 2011-9-13 17:48

我是新手。本人做半定量RT-PCR，目的带在214bp左右，内参带在450bp左右。每次内参都相当的好，而由于目的序列较短，和引物二具体混在一起，也不知道是P出来了，还是因物二具体，该带比较亮，很宽。基本分布在Marker两条带250bp和100bp之间的一大片区域。而我降低引物的浓度，也不见亮度减弱。请各位老师帮我分析下。附：我的条件是94度18S 55度30S 72度1分34循环72度5分。而目的引五的TM植为P1：61.5度，P2：59.9度。请教各位老师指教！
作者: 橘子水儿    时间: 2011-9-13 17:48

我是新手，做RT-PCR，内参可以跑的出，但目的条带跑不出，还是和引物二具体混合一起了呢？（目的带是210bp）,而且这个带（可能是混合带）比较宽，不锐，象是斑点斑团样的东西，但亮度较内参高的多。谢谢帮助分析
作者: 蝴蝶结子    时间: 2011-9-13 17:49

help me!有哪位高人能够告诉我CGRP（降钙素基因相关肽）受体引物系列(鼠）是什么吗？CGRP（降钙素基因相关肽）受体有二个：CGRP-1；CGRP-2。本人要的是CGRP-1。还有有做ADM（肾上腺髓质素）方面的实验的同伴记得和我联系啊！
作者: 不懂    时间: 2011-9-13 17:50

请问RT后的CDNA怎么测它的浓度，同DNA的测法吗?哪位高手知道望告知，在此先谢了！！！
作者: 飞天小鹿    时间: 2011-9-13 17:50

我们实验室都是用分光光度计测的，测单链DNA！不知还有什么方法!
作者: 如影随形    时间: 2011-9-13 17:50

请问，大家觉得做RT－PCR是用一步法好还是用两步法好？用一步法没有做出来的，有没有可能用两步法慢慢摸索能做出来？
作者: 阿拉蕾    时间: 2011-9-13 17:51

大家好！我是一个分子生物学新手，课题是RT-PCR方面的，我很想知道引物设计中β-Actin 是什麽意思？谢谢！


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半定量RT-PCR原理：（自定义）
半定量RT-PCR是指通过总RNA逆转录为cDNA后，扩增目标cDNA和内参cDNA，通过PCR产物量推测样品中特异mRNA的相对数量。内参是基因组中保守的DNA序列，其表达恒定，因此在总RNA中所占的比例是大致恒定的。目标基因在受到处理因素影响后，其表达量一般有所改变。这样扩增后目标产物与内参产物量的比会有所变化，可以说明目标基因的表达量的改变，做到半定量！内参一般选用如：β-actin（β肌动蛋白），GAPDH（三磷酸甘油醛脱氢酶）等
我手里有几个人β-actin序列，如有需要，可发信给我！
作者: 阿拉蕾    时间: 2011-9-13 17:52

我们实验室都是用分光光度计测的，测单链DNA！不知还有什么方法!

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能说一下具体操作吗？如：对照是多少ul的，样本直接取rt后的cdna还是应该用depc水稀释成多少体积？
作者: 阿拉蕾    时间: 2011-9-13 17:53

请问，大家觉得做RT－PCR是用一步法好还是用两步法好？用一步法没有做出来的，有没有可能用两步法慢慢摸索能做出来？

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我觉得两步法稳定一些，而且能比较好的模条件。而且一次的rt结果可以做多次的pcr！
作者: 葡萄籽    时间: 2011-9-13 17:53

请问一下有谁做过pcr循环次数的梯度没有？
应怎样做梯度曲线，一般作几个点，在什么范围内作，例20-25循环次，30循环等！
作者: 大仙    时间: 2011-9-13 17:54

请问一下有谁做过pcr循环次数的梯度没有？
应怎样做梯度曲线，一般作几个点，在什么范围内作，例20-25循环次，30循环等！

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你好，我没有做过PCR循环次数梯度，但觉得你的问题同定量PCR原理很相似，可以参照实行。（我在其他贴子曾经谈到过）即PCR的扩增反应产物量是呈S型递增的。也就是说，随循环次数增加，产物最初很少，到达某一阶段，产物量急剧增加，之后，产物量再次减少，达到平台期。本人认为通常产物增加最快的次数在26--35个循环左右，之后再增加循环次数，产量不会明显增加！你做循环次数梯度，就是想抓住上述S型曲线的上升段。以我的经验，可将循环次数范围定在18--37次共20个点！仅供参考。如有不对，请不吝赐教！
作者: 阿拉蕾    时间: 2011-9-13 17:54

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你好，我没有做过PCR循环次数梯度，但觉得你的问题同定量PCR原理很相似，可以参照实行。（我在其他贴子曾经谈到过）即PCR的扩增反应产物量是呈S型递增的。也就是说，随循环次数增加，产物最初很少，到达某一阶段，产物量急剧增加，之后，产物量再次减少，达到平台期。本人认为通常产物增加最快的次数在26--35个循环左右，之后再增加循环次数，产量不会明显增加！你做循环次数梯度，就是想抓住上述S型曲线的上升段。以我的经验，可将循环次数范围定在18--37次共20个点！仅供参考。如有不对，请不吝赐教！

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谢谢你回帖！我是想让rt－pcr的结果更有可靠性，所以摸一下梯度，让各目的基因在平台期内扩增。你是说要设20个点，要这么多吗？能告诉我关于这方面的资料吗？
作者: 小米虫子    时间: 2011-9-13 17:55

请问一下，我在论坛里面看大家都提到了内参，可是我是想做mRNA差异显示，是要找差异表达基因，可以不用内参吗？
作者: 阿拉蕾    时间: 2011-9-13 17:57

谢谢你回帖！我是想让rt－pcr的结果更有可靠性，所以摸一下梯度，让各目的基因在平台期内扩增。你是说要设20个点，要这么多吗？能告诉我关于这方面的资料吗？


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本以为你是要做梯度曲线，所以有以上建议，按你的目的，你完全可以只跑两三个循环次数梯度，如28、32、35。而且我觉得这个梯度不必做，你要让各目的基因在平台期内扩增，只要用35个循环，就应该在平台期了！手边本有一份资料，是invitrogen RT-PCR指南，可一时没找到。你可以看一些有关定量PCR内容，来参考！
作者: 不懂    时间: 2011-9-13 17:58

我觉得两步法稳定一些，而且能比较好的模条件。而且一次的rt结果可以做多次的pcr！

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请问rt之后怎样鉴定那个结果的含量及长度是否正确？电泳可以跑出来吗？
作者: 阿拉蕾    时间: 2011-9-13 17:58

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本以为你是要做梯度曲线，所以有以上建议，按你的目的，你完全可以只跑两三个循环次数梯度，如28、32、35。而且我觉得这个梯度不必做，你要让各目的基因在平台期内扩增，只要用35个循环，就应该在平台期了！手边本有一份资料，是invitrogen RT-PCR指南，可一时没找到。你可以看一些有关定量PCR内容，来参考！

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非常感谢你，如果作梯度曲线就要做20个点吗？
作者: 阿拉蕾    时间: 2011-9-13 17:59

请问rt之后怎样鉴定那个结果的含量及长度是否正确？电泳可以跑出来吗？

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可以测cdna的浓度！
作者: 明天的明天    时间: 2011-9-13 17:59

非常感谢你，如果作梯度曲线就要做20个点吗？

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你好，我对你的问题了解也不是很多，但觉得很像定量PCR的过程，我想你要真的做曲线也不用做得很多，可以每间隔两循环做一个点。给你一个定量PCR图，可能有所帮助！

图片附件: 98596696.jpg (2011-9-13 18:00, 35.65 KB) / 该附件被下载次数 13
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=8564

作者: 柠檬籽    时间: 2011-9-13 18:00

请问跑RNA电泳时,一般点样需要点多少含量的RNA才能看到电泳条带?  
作者: 微笑的海豚    时间: 2011-9-13 18:01

请问一下，我在论坛里面看大家都提到了内参，可是我是想做mRNA差异显示，是要找差异表达基因，可以不用内参吗？

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仔细看一下差异显示的原理你就明白了差显可以不用内参照。  
作者: 微笑的海豚    时间: 2011-9-13 18:01

我的RNA只有一条带？怎么回事呢？请指教

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你的一条带是哪一条？如果是18s我认为是你的样品的28s降解了。因为28s如果有降解的话，它可以象征性地降解为18s的大小。这样你就只看到一条带了。试试加强一下防降解措施：如保持低温、离体组织在最短的时间内进行提取的过程，防止内源性RNA酶的对RNA降解等。
作者: 微笑的海豚    时间: 2011-9-13 18:02

请问跑RNA电泳时,一般点样需要点多少含量的RNA才能看到电泳条带?

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这个很难说，一般的琼脂糖凝胶有厚度和EB含量的差别。我觉得如果达到上百ng或者上ug级的含量，总可以看见了吧。如果是DNA 几十ng就可以看见了。
作者: 微笑的海豚    时间: 2011-9-13 18:02

怎样在genebank里,进行高级检索呢,我想查rabbit的心肌的bata-actin的核酸序列,但查来查去,都是一堆乱七八糟的东西,可能是我不会用,原来的引物是别人设计好的,有谁会吗,请讲一下这个菜鸟问题.

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你输入rabbit 的学名，然后输入bata-actin gene 两个关键词应该可以查得出来。脊椎动物的bata-actin gene 基因是比较保守的，原来的引物可以拿来使用。先进入ncbi:
cuturl('www.ncbi.nlm.nih.gov'),然后在Search框中选择nucleotide，在for后面的窗口中输入你的关键词就可以了。
作者: 嘉年华    时间: 2011-9-13 18:02

大家好,请问一下哪种RT--PCR试剂盒效果较好价格又合理?我发现promeger公司的试剂盒比其他公司的要贵好几倍,是不是很好呀?而其他的用起来问题就会多一些?我第一次做这方面的实验,没什么经验,出问题了就不好解决了!所以想买个效果好一些的试剂盒,但promeger公司的也太贵了,请问有经验的高手们我有必要买这么贵的吗?你们用过其他的试剂盒是不是做实验也比较顺利呀?谢谢大家了!
作者: 幸福无罪    时间: 2011-9-13 18:15

谢谢指导,不过我是问反转录试剂盒呀!我是要从雌雄线虫中提取总RNA,反转录成cDNA后做差异显示,要找性别决定基因.主要是反转录试剂盒价格差别比较大!所以我想问一下这方面的情况!谢谢大家提供信息!
作者: 8黑眼圈8    时间: 2011-9-13 18:16

大家好,请问一下哪种RT--PCR试剂盒效果较好价格又合理?我发现promeger公司的试剂盒比其他公司的要贵好几倍,是不是很好呀?

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RT-PCR反应中，反转录酶的选择是很重要的。其实Promega并不是最贵的,它在进口试剂里面算相对比较便宜的,Invitrogen的RT两步法试剂盒比Promega的贵很多,但是很好用,Invitrogen的贵就贵在反转录酶比较好,如果是初次做rt的话,建议买个好的试剂盒,最好是两步法的,这样反转录后可以放心对PCR反应摸索条件而排除了反转录的问题.我用过Invitrogen的两步法RT试剂盒,100T 7000多人民币,很贵,但是实验一直都很顺利。还有Takara的试剂也不错。
祝你好运！
作者: 8黑眼圈8    时间: 2011-9-13 18:16

大家好,请问一下哪种RT--PCR试剂盒效果较好价格又合理?我发现promeger公司的试剂盒比其他公司的要贵好几倍,是不是很好呀?

===============================================================================================================

RT-PCR反应中，反转录酶的选择是很重要的。其实Promega并不是最贵的,它在进口试剂里面算相对比较便宜的,Invitrogen的RT两步法试剂盒比Promega的贵很多,但是很好用,Invitrogen的贵就贵在反转录酶比较好,如果是初次做rt的话,建议买个好的试剂盒,最好是两步法的,这样反转录后可以放心对PCR反应摸索条件而排除了反转录的问题.我用过Invitrogen的两步法RT试剂盒,100T 7000多人民币,很贵,但是实验一直都很顺利。还有Takara的试剂也不错。
祝你好运！
作者: 喵咪    时间: 2011-9-13 18:16

谢谢指导,不过我是问反转录试剂盒呀!我是要从雌雄线虫中提取总RNA,反转录成cDNA后做差异显示,要找性别决定基因.主要是反转录试剂盒价格差别比较大!所以我想问一下这方面的情况!谢谢大家提供信息!

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我觉得promega的不一定好,我一个师兄就用promega的,但是阳性对照老也做不出来,另一个师兄用的是一个德国产的,好像没什么名气的牌子,也很便宜,只要700多,但是一做就做出来了,很顺利.不过我也是觉得RT-PCR最好用两步法的试剂盒比较好
作者: Darcy    时间: 2011-9-13 18:17

问一个稍微题外的话，请问DEPC致癌的原理是什么？如果不小心把DEPC弄到手上，并且吸入鼻腔的话，过后可以有什么补救方法吗？
作者: 丸子妹    时间: 2011-9-13 18:17

第一次作RT-PCR，请问提取RNA的试剂盒用哪家公司的比较好，我打算用两步法作，RT的盒子和PCR的盒子那家的更好用，谢谢！
作者: 还是孩子    时间: 2011-9-13 18:18

请问各位大侠：
RNA提取后需较长时间储存，需加RNA酶抑制剂吗？浓度是多少？
谢谢！

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我看到的资料上说，要用0.1%的DEPC水溶解后保存在-70的低温冰箱中。
作者: 丸子妹    时间: 2011-9-13 18:18

第一次作RT-PCR，请问提取RNA的试剂盒用哪家公司的比较好，我打算用两步法作，RT的盒子和PCR的盒子那家的更好用，谢谢！
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RNA提取试剂盒应该是promega公司的货号Z3100,方便且质量比较好。但我觉得匀浆的时间应尽量缩短，如15秒内匀好，加入lysis,提出来的效果绝对好。反转录的盒子应该是宝生物工程有限公司（TaKaRa)的较好，我们实验室一直在用。  
作者: 大猫    时间: 2011-9-13 18:19

我做RT-PCR从水稻中 扩两个目的基因,采用Invitrogen的SUPERSCRIPII二步法,反转录两次,PCR N次,都未扩出来.一直很郁闷.后来对目的基因序列进行研究发现GC值太高,某些地方甚至大于90%,且5'端存在复杂二级结构,没有办法,最后只好大出血,用了SUPPERSCRIPIII（极贵）,52C延伸（因为这种酶可耐至55C的高温）了2个小时，中间加酶一次，PCR一看，哇！两个都出来，这次血出的真值！！！！！！！！！！！！！！
作者: 丸子妹    时间: 2011-9-13 18:20

RNA 操作注意事项与实验技巧

操作注意事项：
　　由于RNA酶的广泛存在与难以灭活的顽固特性。使得RNA的提取纯化和后续工作变得非常困难。为了保证RNA的研究工作成功，请仔细阅读下列注意事项，相信它能帮助您解决常见的问题。

　　归根究底，RNA工作的主要问题是防止RNA酶的污染。RNA酶无处不在，在实验操作的任何一步，任何偶然的疏忽或不当操作都有可能造成RNA酶污染，从而导致整个实验失败。因此，严格控制实验条件，避免任何可能的污染是保证实验成功的关键，必须做到以下几点：

1.如果可能，实验室应辟出专门RNA操作区，离心机、移液枪、试剂等均应专用。RNA操作区应保持清洁，并定期进行消毒。

2.操作过程中应自始至终佩戴抛弃式橡胶或乳胶手套，并经常更换，以避免将手、臂上的细菌和真菌以及人体自身分泌的RNA酶带入试管或污染用具。尽量避免使用抛弃式塑料手套。塑料手套不贴身，常常造成操作不便，而且多出部分还容易在器具上遭RNA酶污染并向未污染处传递，扩大污染。

3.尽量使用一次性枪头、离心管等塑料制品，尽量避免与其它实验共享器具，以防止交叉污染。推荐使用出厂前已经灭菌的枪头和离心管，大多国外厂商供应的无菌塑料制品很少有RNA酶污染，买来后可直接用于RNA操作。许多研究者用DEPC等处理的塑料制品，往往由于二次污染而带有RNA酶，从而导致实验失败。

4.配制溶液用的酒精，异丙醇、Tris等应采用未开封的新品。溶液需用DEPC水配制（加0.01%(体积比)DEPC至重蒸水或Mili Q级水中，处理过夜，灭菌即成DEPC水）。

5.所有玻璃制品都必须在240℃烘烤4小时。所有旧塑料制品都必须用0.5M的NaOH处理10分钟，并用DEPC-H2O彻底冲洗后灭菌，也可考虑用0.01%的DEPC水浸泡过夜，然后灭菌，烘干。无法用DEPC处理的用具可以用氯仿擦拭若干次，这样通常可以消除RNA酶的活性。
作者: 丸子妹    时间: 2011-9-13 18:20

样本保存的注意事项：
　　样本一旦从生物体中分离后，细胞内的RNA就变得非常不稳定，容易降解。因此取样后，如何保证取样前后基因的表达模式不变，就变得非常重要。传统方法是用液氮速冻，再放到超低温冰箱中保存。
　　目前有些厂家开发出专门的RNA保护剂，如Qiagen公司的RNAlater是具有抑制RNase和稳定RNA作用的试剂，将采集的组织样本等直接放入到RNAlater中，即可起到稳定样本中RNA的作用。无需液氮或干冰，方便安全地在室温下保存一段时间，低温可长期保存。还有对细菌样本专用的RNAprotect Bacteria Reagent及对血液样本专用的PAXgene? Blood RNA System。

RNA的定量与纯度：
　　RNA通常用分光光度计定量，测量在260 nm处的吸收值（A260）。通常分光光度计A260的读数要介于0.15-1.0之间才是可靠的，因此RNA提取结束后，要根据大概产量稀释（推荐用10 mM Tris.HCl, pH 7.0稀释）到适当浓度范围，再用分光光度计测量。A260为1相当于RNA的浓度为40 μg/ml。

　　为了检测RNA的纯度，可以测量A260与A280的比值，通常纯RNA的A260/A280为1.9-2.1。

常见细胞与组织的RNA含量：

样本来源 Total RNA(μg) mRNA(μg)

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细胞培养物* – 30–500 0.3–25
NIH/3T3 120 3
HeLa 150 3
COS-7 350 5

--------------------------------------------------------------------------------

小鼠 — 发育期? Unfertilized egg 0.43 ng nd
Oocyte 0.35 ng nd
2-cell 0.24 ng nd
8–16-cell 0.69 ng nd
32-cell 1.47 ng nd
13-day-old embryo 450 13
作者: 丸子妹    时间: 2011-9-13 18:20

--------------------------------------------------------------------------------
小鼠组织? Brain 120 5
Heart 120 6
Intestine 150 2
Kidney 350 9
Liver 400 14
Lung 130 6
Spleen 350 7

--------------------------------------------------------------------------------

　

107 cells ? Per organism ? 100 mg nd = not determined
作者: 兔纸    时间: 2011-9-13 18:21

请问有谁用过宝生物的DRR019A反转录试剂合？它提供的RT体系是10微升的，用来摸
PCR条件能够吗？
请用过的战友告诉一二。
还有这一试剂合的效果怎么样？
作者: 丸子妹    时间: 2011-9-13 18:23

请教：第一次作RT-PCR，取得手术标本，然后放在冰壶中，大概零下5，6度的样子，30分钟后送至－70度冰箱保存，这样的话，RNA会不会降解掉阿？
提取RNA时，冰冻得组织怎么搞碎阿？
大家知不知道RNALater?怎么用呢？
谢谢各位大侠不吝赐教！
小妹万分感激！
作者: +田田+    时间: 2011-9-13 18:24

谢谢，请问你是怎样将组织弄碎的，可否指点迷津！！
作者: dreaming    时间: 2011-9-13 18:24

请教：第一次作RT-PCR，取得手术标本，然后放在冰壶中，大概零下5，6度的样子，30分钟后送至－70度冰箱保存，这样的话，RNA会不会降解掉阿？
提取RNA时，冰冻得组织怎么搞碎阿？

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1.为什么不用液氮速冻呢？
2.冰冻组织用研钵不断添加液氮捣碎。
这方面的知识DXY很多的，你检索一下吧，祝你好运。
作者: 大猫    时间: 2011-9-13 18:25

最近遇到问题：在两个公司共合成4对引物，模板都能扩出GAPDH，可4对引物都扩不出来，要不什么都没有，要不就是在1000多或100－200处出现条带（我的目的条带在300－400bp），梯度也摸过了，就是不行（可在刚稀释完引物的时候，在没加镁离子的情况下，倒扩出过很亮的一条带，位置也对，真是歪打正着，不过仅此一次），

我两年以前刚开始做试验时，就接触到RT-PCR，一扩就出，根本没遇到什么问题，可最近毕业在即，为了验证结果，重新操作，可一直都扩不出来，郁闷啊。我已经花了2个多月了，马上要交论文了。请教高手，帮我看看我的问题出在何处。
作者: 椰子叶子    时间: 2011-9-13 18:25

请问有谁用过宝生物的DRR019A反转录试剂合？它提供的RT体系是10微升的，用来摸
PCR条件能够吗？
请用过的战友告诉一二。
还有这一试剂合的效果怎么样？

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我现在用的就是该KIT，我作实验时摸PCR条件没怎么费力，比较容易，有点幸运吧。其效果，重现性不怎么好，有时能P 出来，有时白费力！
作者: 椰子叶子    时间: 2011-9-13 18:26

请问各位大侠：
RNA提取后需较长时间储存，需加RNA酶抑制剂吗？浓度是多少？
谢谢！

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通常用0.1％DEPC水溶解放在－80度冰箱保存即可，不需要加RNA酶抑制剂。但最好不要放太长时间。
可以在组织中加trizol后放在－80度冰箱或在加乙醇洗涤这一步放在－80度冰箱中这样保存时间可以长一些，在准备做下步试验时在完全提取rna及测浓度和纯度，这样测得的浓度纯度会准一些。
作者: 果冻也酸    时间: 2011-9-13 18:26

我们要做real-time PCR，请教有没有现成的试剂盒？
探针哪个公司的比较好？
作者: 冰激凌小姐    时间: 2011-9-13 18:27

我从卵巢癌细胞HO-8910中提rna做rt-pcr，但做了两个月了，什么也没跑出来，连条杂带都没有，请各位老师帮我分析分析。
我的引物Survivin上游引物为5’gcatgggtgccccgacgttg3’,下游引物为5’gctccggccagaggcctcaa3’。买的宝生物BcaBest的试剂盒。逆转录的条件根据试剂盒提供的，pcr时为94 30s,50 30s,72 30s,30个循环，跑电泳后，阳性对照有，但连内参都没有，是什么原因呀？
很着急，很上火，很郁闷，很绝望，很。。。。。。

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我现在有跟你一样 的经历，请问你当时怎么找出原因的？我也郁闷死了！
作者: 冰激凌小姐    时间: 2011-9-13 18:27

请问跑RNA电泳时,一般点样需要点多少含量的RNA才能看到电泳条带?

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RNA结合EB的能力要较DNA差，所以电泳时要多加，推荐：百纳克-微克
作者: free    时间: 2011-9-13 18:28

TaKaRa试剂盒有没有2不法的？
作者: 童童    时间: 2011-9-13 18:29

我想请教一下：用于做RT-PCR的组织块取出后可以常温放多长时间？不用立即就低温放置吧。还有，我将要把PCR产物双切作克隆，所以在引物两端设计了EcoR I及Sal I两酶的识别位点，可以吗？
哪位高手可以指教啊！

===================================================================

我看文献上报道做多不要超过30分钟，最好尽快用液氮速冻，然后低温保存！这样比较保险！
作者: 小蜜蜂    时间: 2011-9-13 18:30

电泳时不用稀释。加5～10ul就可以了，不过如你一直都做不出来，就要请人做一次看看。再者，换进口的试剂。没有好办法。我这里做的RNA也有不好的地方，离心机的转速太低，有时不易得到较好的产物。还有就是各方面的条件都要仔细考虑一下有没有可能出问题。如果你在上海，我可以介绍一个人帮你做一次。

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我在上海,能否告诉我那个高人是谁?我正在做RTPCR，做的 目的条带都是两条。很焦急。
作者: 兔纸    时间: 2011-9-13 18:31

TaKaRa试剂盒有没有2不法的？

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DRR019A就是两步法试剂合
100份装，1600
作者: 海鸥crazy    时间: 2011-9-13 18:31

我最近要做细胞周期素依赖激酶４（cdk4)基因的RT-PCR，查到国外文献中用到的内参是次黄嘌呤磷酸核糖基转移酶（HPRT），问周围的人好象都不知道这个内参，一般都用β－actin或GAPDH做内参的，不知各位有没有知道的？另外，我查到的引物：
cdk4：5' CTT CCC GTC AGC ACA GTTC 3'
5' GGT CAG CAT TTC CAG TAGC 3' 长度687bp；
HPRT：5' GTA ATG ATC AGT CAA CGG GGG AC 3'
5' CCA GCA AGC TTG CAA CCT TAA CCA 3' 长度177bp.
这两个引物我可以直接拿来用吗？好象引物设计中要注意一些问题的，比如要看引物之间是否会形成发夹结构等，这些我都不太懂，希望各位能不吝赐教！·万分感谢！
作者: 丸子妹    时间: 2011-9-13 18:32

我在做组织RT-PCR的,需要用到的玻璃用品怎么消毒阿?
作者: 丸子妹    时间: 2011-9-14 12:51

我在做组织RT-PCR的,需要用到的玻璃用品怎么消毒阿?  
作者: +田田+    时间: 2011-9-14 12:51

清洗干净后用烤箱180℃ 干烤6小时以上就可以了.
作者: 阿福    时间: 2011-9-14 12:52

我在一本书上看到也可以300度烤1个小时就可以了
作者: 菠萝菠萝蜜    时间: 2011-9-14 12:53

我最近要做细胞周期素依赖激酶４（cdk4)基因的RT-PCR，查到国外文献中用到的内参是次黄嘌呤磷酸核糖基转移酶（HPRT），问周围的人好象都不知道这个内参，一般都用β－actin或GAPDH做内参的，不知各位有没有知道的？另外，我查到的引物：
cdk4：5' CTT CCC GTC AGC ACA GTTC 3'
5' GGT CAG CAT TTC CAG TAGC 3' 长度687bp；

HPRT：5' GTA ATG ATC AGT CAA CGG GGG AC 3'
5' CCA GCA AGC TTG CAA CCT TAA CCA 3' 长度177bp.
这两个引物我可以直接拿来用吗？好象引物设计中要注意一些问题的，比如要看引物之间是否会形成发夹结构等，这些我都不太懂，希望各位能不吝赐教！·万分感谢！

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从国外文献查的引物很多都是不好的，这是我的体会，周围的人也又用国外文献上的，可总是P不出来，相信大家也经常见到这种现象。
总之不要乱相信别人的引物，要自己去查目的基因的序列，并自己去设计引物。自己去做吧，你会学到很多东西。
我就是这样！！
作者: 冰激凌小姐    时间: 2011-9-14 12:54

前一段时间做RT-PCR非常顺手。可最近总RNA的260/280总是1.4左右，影响RT，有点不爽了，哪位高手能告诉我是什么原因吗？谢谢
作者: 丸子妹    时间: 2011-9-14 12:54

我要做的的是TCR受体Va基因的反转录PCR,因为Va有18个家族,要使用18个上游引物和一个共同的下游引物,我在国外文献上查到的引物序列如下:

人T细胞受体Va基因家族特异性引物
基因家族 序列 待扩增片段大小
Va 1 5’CTG AGG TGC AAC TAC TCA3’ 342
Va 2 5’GTG TTC CAG AGG GAG CCA TTG CC  369
Va 3 5’GGT GAA CAG TCA ACA GGG AGA   413
Va 4 5’ACA AGC ATT ACT GTA CTC CTA   438
Va 5 5’GGC CCT GAA CAT TCA GGA   376
Va 6 5’GTC ACT TTC TAG CCT GCT GA   460
Va 7 5’AGG AGC CAT TGT CCA GAT AAA   358
Va 8 5’GGA GAG AAT GTG GAG CAG CATC   401
Va 9 5’ATC TCA GTG CTT GTG ATA ATA   444
Va10 5’ACC CAG CTG CTG GAG CAG AGC CCT  406
Va11 5’AGA AAG CAA GGA CCA AGT GTT   413
Va12 5’CAG AAG GTA ACT CAA GCG CAG ACT  411
Va13 5’GCT TAT GAG AAC ACT GCG T   345
Va14 5’GCA GCT TCC CTT CCA GCA AT   356
Va15 5’AGA ACC TGA CTG CCC AGG AA   381
Va16 5’CAT CTC CAT GGA CTC ATA TGA   3 91
Va17 5’GAC TAT ACT AAC AGC ATG T   346
Va18 5’TGT CAG GCA ATG ACA AGG   263
Ca 5’GGT GAA TAG GCA GAC AGA CTT GTC ACT GGA

能帮我看看他能不能用阿?因为上下游引物的碱基相差太大??
作者: 丸子妹    时间: 2011-9-14 12:55

是人TCR Va基因(T细胞受体),
作者: 椰子叶子    时间: 2011-9-14 12:56

我在做组织RT-PCR的,需要用到的玻璃用品怎么消毒阿?

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将玻璃容器用牛皮纸包好,180度干烤10个小时以上即可.
作者: 椰子叶子    时间: 2011-9-14 12:56

前一段时间做RT-PCR非常顺手。可最近总RNA的260/280总是1.4左右，影响RT，有点不爽了，哪位高手能告诉我是什么原因吗？谢谢

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很有可能是RNA提取中受到污染,使RNA降解.
作者: 小葵    时间: 2011-9-14 12:57

可跑的RNA是现眼的四条带，很漂亮啊！溴酚蓝处无亮点
作者: 丁香@@    时间: 2011-9-14 12:58

请问各位高手：
RT -PCR 和NORTHERN BLOT 均可对RNA进行定性或定量分析，它们有什麽不同？
作者: mogu    时间: 2011-9-14 13:00

我的课题是要构建一个真核表达载体，第一步就是通过RT-PCR扩增目的基因，非常不幸的是我已经奋战了一个多月，未果，内对照设的b-actin条带很亮，就是没有目的条带（768bp),我已对体系进行过优化，也无明显效果，引物序列已找多人核对，不知是什么原因，急死我了，那位好心大虾帮帮我！
作者: 丸子妹    时间: 2011-9-14 13:01

你好,你们用的宝生物工程有限公司（TaKaRa)的反转录试剂盒,效果好不好?他有没有50次的,两步法.
还有,大家有谁用过感觉较好的PCR盒子,推建议下!
感谢!
作者: 绵绵    时间: 2011-9-14 13:03

大家好，我用的是宝生物的两步法RT试剂盒DRR019A（Ver3.0），里面的PCR体系说明书上面没有加Mg2+，但是我看见他和旧的RT试剂盒（Ver2.1）没有什么区别，但是Ver2.1里面就写了加Mg2+，不知道有没有那位前辈用过这个新的试剂盒，到底需不需要加Mg2+阿？
作者: 绵绵    时间: 2011-9-14 13:03

大家好，我用的是宝生物的两步法RT试剂盒DRR019A（Ver3.0），里面的PCR体系说明书上面没有加Mg2+，但是我看见他和旧的RT试剂盒（Ver2.1）没有什么区别，但是Ver2.1里面就写了加Mg2+，不知道有没有那位前辈用过这个新的试剂盒，到底需不需要加Mg2+阿？
作者: 喵咪    时间: 2011-9-14 13:04

楼上：我用的宝生物的试剂盒，现在还没有p出来哦，我用的是他们新的RT试剂盒，据说老的2.1版的还不错，旧的2.1版的就是五十次的，3.0版的是100次的，但是对比起来两个是一样的，因为前者是RT和PCR分别是20微升和80微升的体系，而新的是10微升和40微升体系，其实各种试剂的总量是一样的，说的好听罢了。
作者: 冷太阳    时间: 2011-9-14 13:04

我是RT-PCR的新手
我对引物的设计有点不知所错
找到了一对引物,虽然理论上符合,但还是没底.
请问各位老兄的引物是看别人的文献的,还是自己设计的?
作者: 春雨    时间: 2011-9-14 13:05

各位高手：我也准备做RT-PCR，但是遇到了一个很尴尬的问题：我用的是别人的组织，但是他把我要的组织和别的组织放在一个冻存管里面了存在液氮里面，我要怎么才能把他们分开阿，天哪！急死了，盼回复，各位高手指点指点阿！万分感激～～～
=====================================
我有一个办法,呵呵!!!!
-----------------------都拿出来融了就可以分开了
作者: 春雨    时间: 2011-9-14 13:05

各位高手：我也准备做RT-PCR，但是遇到了一个很尴尬的问题：我用的是别人的组织，但是他把我要的组织和别的组织放在一个冻存管里面了存在液氮里面，我要怎么才能把他们分开阿，天哪！急死了，盼回复，各位高手指点指点阿！万分感激～～～
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我有一个办法,呵呵!!!!
-----------------------都拿出来融了就可以分开了
作者: 小鼹鼠    时间: 2011-9-14 13:06

我欲做家兔金属硫蛋白-1（MT-1)的半定量RT-PCR，可是迄今为止Genebank中只有家兔MT-1mRNA的编码序列,长186bp,
具体是：
1GAC CCC AAC TGC TCC TGC GCC ACA GGC AAC TCC TGC ACC TGT GCC AGC TCC TGC A AA TGC 60
61AAA GAA TGC AAA TGC ACC TCC TGC AAG AAG AGC TGC TGC TCC TGC TGC CCC GCC GGC TGC 120
121 ACC AAG TGT GCC CAG GGC TGC ATC TGC AAA GGG GCA TCG GAC A AG TGC AGC TGC TGC GCC 180
181TGA
查文献有人做过家兔MT-1基因克隆和表达,其设计的引物为:
上游引物: 5'-GAA GAT CTG ACC CCA ACT GCT CCT GCG CCA CAG GCA-3' (36bp)
说明: 5'端的A GAT CT 6个bp是引入的PstI切点
下游引物: 5'-AAC TGC AGT CAG GCG CAG CAG CTG CAC TTG TCC GAT GC-3'(38bp)
说明: 5'端的C TGC AG 6个bp是引入的PstI切点
请各位高手帮我分析一下，我能否利用他的这对引物做半定量RT-PCR用。
作者: 按秒计算    时间: 2011-9-14 13:06

各位大虾：我从组织中提总RNA，组织是用冰盒取的（从取下到我拿到约2-3个小时，回来后我立即在冰上切开组织的厚厚包膜，进行分装，直接放到-70的冰箱里，这样做不会影响提RNA吧，快告诉我，帮帮我！！！！
作者: 丸子妹    时间: 2011-9-14 13:07

各位大虾：我从组织中提总RNA，组织是用冰盒取的（从取下到我拿到约2-3个小时，回来后我立即在冰上切开组织的厚厚包膜，进行分装，直接放到-70的冰箱里，这样做不会影响提RNA吧，快告诉我，帮帮我！！！！

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你跟我犯了一样的错误，组织取下来之后RNA就很不稳定，应立即用液氮速冻，然后放至低温冰箱保存！
作者: @花开花落@    时间: 2011-9-14 13:08

大家好，我是新手，以前有作过一点pcr，最近要做rt，目的是检测在小鼠胚胎中的不同部位（如肝或胰腺等）的某种基因表达，rt打算用宝生物的mrna seletive pcr kit ver1.1,可以吗？提取rna用什么试剂盒比较好啊？可从那里购买呢？我在厦门，实验还有什么需要特别注意的吗？盼恢复，谢谢，
作者: 丸子妹    时间: 2011-9-14 13:09

不如直接提取总RNA，用总RNA为模板进行反转录就可以了。提取总RNA试剂盒：promege 产品，货号Z3100还不错，可以试试。
作者: 喵咪    时间: 2011-9-14 13:10

提取RNA主要试剂有：invitrogen 和Qiagen产品，二种试剂合非常好！前者的trizol 更常用，可能是价格比较后者便宜缘故。我们最近用另外一家美国MRC产品（Tri REGEANT）效果也很好！（注意：还没有经长时间考验！），invitrogen 和Qiagen是经过考验的！三种试剂国内都有代理经销商，MRC产品（Tri REGEANT）试剂合参考价格是：1000.0（RMB），invitrogen 是：1300（RMB）和Qiagen要2000元以上！invitrogen的trizol 最常用，最近价格有上升，但不应该超过1500元！，1500元以上有被宰的嫌疑。RT-PCR试剂盒主要有：promega和invitrogen和MBI产品，都可以！或者买原材料，自己配制，价格会合算！
从组织中提总RNA，组织标本最好是越早提取RNA越好！并且提取的RNA要转录成为cdna，保存，受到实验条件限制，组织用冰盒取的（从取下到RNA提取2-3个小时内），可能有些影响，但还不至于失败，不同组织受影响不同，胎盘，肝脏等含血液丰富的组织受到影响可能大些。组织标本长时间存放-70的冰箱里，也会使RNA降解，（
作者: 喵咪    时间: 2011-9-14 13:10

很多朋友在RNA提取后通常采用以下两种方法进行RNA质量鉴定：
1 通过紫外分光仪器测RNA的浓度和纯度。
2 跑琼脂糖凝胶电泳判断RNA的完整性。

需要注意的是，目前国内外紫外分光仪器测量数值往往有误差，我们对测量数值只能参考，即使是有些数值没有达到要求，也不要轻易放弃，仍然可以继续实验， 另外，琼脂糖电泳时，如果28SRNA 和18SRNA有出现并且前者的亮度是后者的两倍以上，就说明RNA提取的非常成功了，不太影响所做的实验，完全可以继续进行RT-PCR，不必强求5SRNA的出现。只要PCR最终结果能P得出来，你就是牛人了！（个人意见 ，仅供参考）
作者: 喵咪    时间: 2011-9-14 13:10

将玻璃容器用牛皮纸包好,180度干烤10个小时以上即可.

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牛皮纸在180度10个小时早着了
要用锡箔纸
作者: 韩梅梅    时间: 2011-9-14 13:11

扩增人 vWF的引物： 5'-tct ggc tga ggg agg taa aa-3'
5‘-ggc att gag aac ctc atg gt-3’
扩增片断为300bp，条件为94 °C 30 s, 54 °C 1 min， 72 °C 1 min , 35 cycles

Flk-1 引物： 5‘－ CTGGCATGGTCTTCTGTGAAGCA-3’
5‘－AATACCAGTGGATGTGATGCGG-3’.
扩增片断为790bp，条件为94°C 1 min, 58°C 1 min, 72°C 2 min，25 cycles
模板RNA为OD260：OD280为2：1，取500ng扩增，但始终不见条带。  
作者: @花开花落@    时间: 2011-9-14 13:12

你跟我犯了一样的错误，组织取下来之后RNA就很不稳定，应立即用液氮速冻，然后放至低温冰箱保存！

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多谢关心，还比较幸运，提出来了，还没P，不知能否P出来。
作者: 跳跳糖    时间: 2011-9-14 13:12

求教主任及各位大虾：
用DRR025A TAKARA盒子
RT-30度 10min 42度 15min 5度 5min 可扩出内参actin
RT-42度 60min 扩不出actin 但可以扩出目的基因，只是非特异性带很多
以上TAQ酶2U/20微升（26个循环）
P的条件：RT-30度 10min 42度 15min 5度 5min
actin 85度 1 min
actin 47.1 48.5 50.8 1min
72度 1min
可扩出内参actin只是非特异性带很多
RT-42度 60min
actin 85度 1 min
actin 49.3 1min
72度 1min
扩不出actin
按道理不应该的？
此外 TAQ酶1U/20微升RT-42度 60min 扩不出内参actin（49.3,52.4），目的基因(45.3 46.1 47.4 48.4 ) 带了弥漫一片
好惨！！！非特异带可以通过提高退火温度，降低引物浓度，增加模板量改变的
怎么办〉？〉为什么〉
作者: 阿拉蕾    时间: 2011-9-14 13:13

前一段时间做RT-PCR非常顺手。可最近总RNA的260/280总是1.4左右，影响RT，有点不爽了，哪位高手能告诉我是什么原因吗？谢谢

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260/280的值低除了rna讲解、不纯外，还可能是溶解rna的DEPC水的原因，若DEPC水是酸性的也会导致260/280值低，不防调一下ph值试一下，说不定解决了你的问题。这不是提的rna的问题，而是测纯度的问题。祝你好运！！！
作者: 韩梅梅    时间: 2011-9-14 13:13

牛皮纸在180度10个小时早着了
要用锡箔纸

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没着呀,只要烤的时候不打开烘箱就可以了
作者: 爱哭鬼    时间: 2011-9-14 13:13

各位前辈：请教RT-PCR通用试剂盒哪家公司的使用较好，又价格比较便宜，打算做50次
作者: 喵咪    时间: 2011-9-14 13:14

请阅读本栏目2004.4-26的内容关于RT-PCR中 提取试剂盒的比较，RNA提取后，进行的RT-PCR，MBI公司价格最便宜，可以用。或者通过华美公司购买：MMLV或AMV，RNAsin，dNTP等材料，自己用时，混合加入。  
作者: 嘉年华    时间: 2011-9-14 13:14

急急急：我买的普洛麦格公司的TAQ酶，他的BUFFER和MG离子是分开的，20微升体系应该加多少BUFFER和镁离子呀！快救我！
作者: 阿拉蕾    时间: 2011-9-14 13:15

20ul 体系：
加10×buffer 2ul，（若是5×buffer则 加4ul）
镁离子终浓度为：1.5mmol（即25mmol的MgCl2 取 1.2ul 就可以了）
作者: 阿拉蕾    时间: 2011-9-14 13:16

不同组织中的mRNA种类不同，可以回头看看你的引物特异性，先排除一下非特异扩增的问题
作者: 羊咩咩    时间: 2011-9-14 13:18

我也遇到过和ebon一样的问题，结果换了DEPC水以后就测的纯度比较好了，那么请问到底DEPC水的PH值要调到多少算合适呢？
作者: 微笑的海豚    时间: 2011-9-14 13:18

我做RT-PCR从水稻中 扩两个目的基因,采用Invitrogen的SUPERSCRIPII二步法,反转录两次,PCR N次,都未扩出来.一直很郁闷.后来对目的基因序列进行研究发现GC值太高,某些地方甚至大于90%,且5'端存在复杂二级结构,没有办法,最后只好大出血,用了SUPPERSCRIPIII（极贵）,52C延伸（因为这种酶可耐至55C的高温）了2个小时，中间加酶一次，PCR一看，哇！两个都出来，这次血出的真值！
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你好：有钱就是好啊！！！我这段时间也在RT，可PCR毫无结果，我把情况说说，请各位高手指点迷津。
基因长度：852bp.
引物：5‘端：5’ GCC GAA TTC ATG CTC CTA TCG CGG ATT3‘（ECORI位点，GC%：51.85%，Tm:65.04,27bp）
3’端：5‘ GAC CTC GAG TCG TAC GTT GCA ACC AGC 3' (XHOI位点，GC%：59.26%，Tm：68.08，27bp)
PCR条件：94度10分；94度40秒，55/60度30秒，72度40秒，30循环；72度5分；4度。
提RNA和反转录的试剂盒（二步法）是上海生工的。
可是只有引物二聚体和200bp左右的片段出现，条带非常单纯且清晰，不仅没有目的条带，连杂带都几乎没有？
作者: 不懂    时间: 2011-9-14 13:19

到DD-PCR体系中的dNTP的浓度那么低啊，另外5‘端随机引物的浓度也很低，推荐你看看差异表达基因克隆技术的进展cuturl('http://life.ac.cn/xyls/smhx990514.htm')，另外可以看一下　Liang P, Pardee A B. Differential display of eukaryotic message RNA by means of the polymerase chain reaction. Science, 1992, 257: 967～971，可能在思路上有所帮助。另外关于hansontcm 的
Program：94'c-2m（RNA作RT这一步是必需，RNA变性；）
94'c-20s 　60'c-1m 　四个循环（94:RNA变性，特异引物RT时，防止局部双链等高级结构;同时完成CDNA的合成）
94'c-20s 56'c-40s 72'c-40s 四个循环　（增加PCR产物特异性）
94'c-20s 52'c-30s 72'c-40s 三十个循环（正常的产物括增，如果上面的四个循环无效，至少也有产物括增）
72'c-5m（充分延伸）

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看了你对这个程序的评价，感觉你很是内行，能否帮忙设计一个PCR程序。多谢！
作者: 许愿精灵    时间: 2011-9-14 13:20

提总RNA电泳图：在胶孔的附近有一条亮带，是什么带？另外18S、28S都有，并且28S很亮，不见5S，这样的RNA用来反转录可以吗？为什么PCR就不出结果呢？
作者: 许愿精灵    时间: 2011-9-14 13:20

有文献说用扩增级的DAN酶消化基因组DNA以减少基因组DNA对RNA的污染，然后用2毫摩尔的EDTA65度10分钟终止反应，那EDTA怎么配成无RNA酶污染的溶液呀·！
作者: 丸子妹    时间: 2011-9-14 13:21

各位大侠:你们好
我要做的的是TCR受体Va基因的反转录PCR,因为Va有18个家族,要使用18个上游引物和一个共同的下游引物,我在国外文献上查到的引物序列如下:

人T细胞受体Va基因家族特异性引物
基因家族 序列 待扩增片段大小
Va 1 5’CTG AGG TGC AAC TAC TCA3’ 342
Va 2 5’GTG TTC CAG AGG GAG CCA TTG CC 369
Va 3 5’GGT GAA CAG TCA ACA GGG AGA 413
Va 4 5’ACA AGC ATT ACT GTA CTC CTA 438
Va 5 5’GGC CCT GAA CAT TCA GGA 376
Va 6 5’GTC ACT TTC TAG CCT GCT GA 460
Va 7 5’AGG AGC CAT TGT CCA GAT AAA 358
Va 8 5’GGA GAG AAT GTG GAG CAG CATC 401
Va 9 5’ATC TCA GTG CTT GTG ATA ATA 444
Va10 5’ACC CAG CTG CTG GAG CAG AGC CCT 406
Va11 5’AGA AAG CAA GGA CCA AGT GTT 413
Va12 5’CAG AAG GTA ACT CAA GCG CAG ACT 411
Va13 5’GCT TAT GAG AAC ACT GCG T 345
Va14 5’GCA GCT TCC CTT CCA GCA AT 356
Va15 5’AGA ACC TGA CTG CCC AGG AA 381
Va16 5’CAT CTC CAT GGA CTC ATA TGA 3 91
Va17 5’GAC TAT ACT AAC AGC ATG T 346
Va18 5’TGT CAG GCA ATG ACA AGG 263
Ca 5’GGT GAA TAG GCA GAC AGA CTT GTC ACT GGA

能帮我看看他能不能用阿?因为上下游引物的碱基相差太大??
作者: 许愿精灵    时间: 2011-9-14 13:22

今天我又作了一次PCR，退火温度调到65度（已做过60，55无目的条带），镁离子浓度梯度：1.2，2.0，2.6，3.0微升，20的体系，可是结果还是引物二聚体和200多BP的条带，连内参B-ACTIN也在200左右，这是为什么呀？请各位大虾指点迷津，大虾们快点上班吧！！！
基因片段长度：852bp.
引物：5‘端：5’ GCC GAA TTC ATG CTC CTA TCG CGG ATT3‘（ECORI位点，GC%：51.85%，Tm:65.04,27bp）
3’端：5‘ GAC CTC GAG TCG TAC GTT GCA ACC AGC 3' (XHOI位点，GC%：59.26%，Tm：68.08，27bp)
作者: finger    时间: 2011-9-14 13:23

退火温度的调整是不是太大了，我们实验室做的一般是2度一个间隔进行调整，另外，你做了RT了吧，这一步有没有问题！我觉得应该清楚！
作者: 喵咪    时间: 2011-9-14 13:23

退火温度的调整是不是太大了，我们实验室做的一般是2度一个间隔进行调整，另外，你做了RT了吧，这一步有没有问题！我觉得应该清楚！

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是的，RT了，RNA的电泳图共有三条带，离孔最近的是不是DNA污染？RT后没有检测CDNA就直接P了，RT的逆转录酶用的是上海生工的AMV，PCR电泳图是昨天65度的，1MARKE，2内参，3镁1.2，4镁2.0，5镁2.6，6镁3.0（镁：镁离子浓度，微升）。但全没有我的目的片段（852BP）。帮我看看吧？问题到底出在哪？
作者: 麻瓜    时间: 2011-9-14 13:24

各位大虾：
用DRR025A TAKARA盒子
RT-30度 10min 42度 15min 5度 5min 可扩出内参actin
RT-42度 60min 扩不出actin 但可以扩出目的基因，只是非特异性带很多
以上TAQ酶2U/20微升（26个循环）
P的条件：RT-30度 10min 42度 15min 5度 5min
actin 85度 1 min
actin 47.1 48.5 50.8 1min
72度 1min
可扩出内参actin只是非特异性带很多
RT-42度 60min
actin 85度 1 min
actin 49.3 1min
72度 1min
扩不出actin
按道理不应该的？
此外 TAQ酶1U/20微升RT-42度 60min 扩不出内参actin（49.3,52.4），目的基因(45.3 46.1 47.4 48.4 ) 带了弥漫一片
好惨！！！非特异带可以通过提高退火温度，降低引物浓度，增加模板量改变的
怎么办〉？〉为什么〉

请帮忙看看把
作者: 圆圆圈圈    时间: 2011-9-14 13:25

求助各位大虾:
我的课题是有关RT-PCR,目前尚未进试验室,但老板要我把采购计划给弄出来,现真是一个头两个大.
大约40例标本,真不知需要具体多少东东(少了怕不够,多了没银子).但还是编了一下,请各位前辈指点指点:
Trizol 100ml
DEPC 5g
AMV 1000U
dNTP(each 10mM) 0.5ml
Taq DNA 聚合酶 1000U
RT-PCR引物对 ????(不知O.D为何东东)

请帮忙看看吧,不胜感激
作者: 圆圆圈圈    时间: 2011-9-14 13:25

求助各位大虾:
我的课题是有关RT-PCR,目前尚未进试验室,但老板要我把采购计划给弄出来,现真是一个头两个大.
大约40例标本,真不知需要具体多少东东(少了怕不够,多了没银子).但还是编了一下,请各位前辈指点指点:
Trizol 100ml
DEPC 5g
AMV 1000U
dNTP(each 10mM) 0.5ml
Taq DNA 聚合酶 1000U
RT-PCR引物对 ????(不知O.D为何东东)

请帮忙看看吧,不胜感激
作者: 绿茶公子    时间: 2011-9-14 13:25

一个十分简单的问题：试剂盒里都有些什么东东啊？我老板叫我写一个分子生物学实验的过程，可怜我还是一个研一的新生，know nothing about it,刚刚看了实验手册，比如RT-PCR，书上说要设计引物并且合成第一链引物有三种，还有些酶，后来我又看到试剂盒这个词，心中有个疑问：试剂盒里是不是包括一个实验步骤所需的所有酶、试剂等？

作者: 绿茶公子    时间: 2011-9-14 13:25

一个十分简单的问题：试剂盒里都有些什么东东啊？我老板叫我写一个分子生物学实验的过程，可怜我还是一个研一的新生，know nothing about it,刚刚看了实验手册，比如RT-PCR，书上说要设计引物并且合成第一链引物有三种，还有些酶，后来我又看到试剂盒这个词，心中有个疑问：试剂盒里是不是包括一个实验步骤所需的所有酶、试剂等？

作者: 麻瓜    时间: 2011-9-14 13:27

是包括一个实验步骤所需的所有酶、试剂等？  
作者: wawa    时间: 2011-9-14 13:28

我在香港用过一种试剂，里面含RNase inhibitor, 但记不得叫什么名字了， 提RNA时所用的仪器，耗材如不能用DEPC泡，或来不及处理，用它擦一下就可以了，很方便的。如有条件买瓶试试。

=============================================================================================================

深圳华氏生物（cuturl('www.huass.com')）有试用装Erasol送，喷在桌面或者工作区可以灭活RNA酶，耗材擦一下就可以。我试用过，效果不错。具体信息可以登陆他们公司网站查询。
祝所有从事RT-PCR 的朋友好运！
作者: wawa    时间: 2011-9-14 13:28

我在香港用过一种试剂，里面含RNase inhibitor, 但记不得叫什么名字了， 提RNA时所用的仪器，耗材如不能用DEPC泡，或来不及处理，用它擦一下就可以了，很方便的。如有条件买瓶试试。

=============================================================================================================

深圳华氏生物（cuturl('www.huass.com')）有试用装Erasol送，喷在桌面或者工作区可以灭活RNA酶，耗材擦一下就可以。我试用过，效果不错。具体信息可以登陆他们公司网站查询。
祝所有从事RT-PCR 的朋友好运！
作者: 岸上的鱼    时间: 2011-9-14 13:28

我是RT新手，请人设计一对引物 ，P1, 5‘－CACTCACCTGCTGCTACTCATTCACTG-3' P2，5’－CTCTGTCATACTGGTCACTTCTAC-3',我用PRIMER算出Tm值分别为79度和66度，由于对该软件不太熟练，不知是否有误，请教高手，如果是正确的，相差这么大，我该怎样选择退火温度，不胜感激。序列如下，1 caactctcac tgaagccaga tctctcttcc tccaccacta tgcaggtctc tgtcacgctt
61 ctgggcctgt tgttcacagt tgctgcctgt agcatccacg tgctgtctca gccagatgca
121 gttaatgccc cactcacctg ctgctactca ttcactggca agatgatccc aatgagtcgg
181 ctggagaact acaagagaat caccagcagc aggtgtccca aagaagctgt agtatttgtc
241 accaagctca agaga
作者: 牙牙    时间: 2011-9-14 13:29

我在做组织RT-PCR的,需要用到的玻璃用品怎么消毒阿?

================================================================================================================

先用普通洗涤剂清洗一遍，然后泡酸六小时或过夜。自来水冲洗十五遍去酸，然后蒸馏水冲洗三遍，再用三蒸水冲洗一遍后放如烤箱内烘干，然后再用锡箔纸将玻璃器皿包裹后，放入烤箱300度干烤三小时即可。
作者: 牙牙    时间: 2011-9-14 13:29

我在做组织RT-PCR的,需要用到的玻璃用品怎么消毒阿?

================================================================================================================

先用普通洗涤剂清洗一遍，然后泡酸六小时或过夜。自来水冲洗十五遍去酸，然后蒸馏水冲洗三遍，再用三蒸水冲洗一遍后放如烤箱内烘干，然后再用锡箔纸将玻璃器皿包裹后，放入烤箱300度干烤三小时即可。
作者: 阿拉蕾    时间: 2011-9-14 13:30

先用普通洗涤剂清洗一遍，然后泡酸六小时或过夜。自来水冲洗十五遍去酸，然后蒸馏水冲洗三遍，再用三蒸水冲洗一遍后放如烤箱内烘干，然后再用锡箔纸将玻璃器皿包裹后，放入烤箱300度干烤三小时即可。
===================================================================================

可以简单些:关键在灭活RNA酶，刷洗干净后0.1%DEPC水浸泡过夜，180度烤箱8小时或300度3小时即可。
作者: 丸子妹    时间: 2011-9-14 13:30

我准备做组织的反转录PCR,打算提取总RNA之后用两步法P,可否推荐大家用过的感觉比较好的反转录试剂盒!谢谢!
作者: 浆果儿cc    时间: 2011-9-14 13:31

各位大虾：这是我将引物输入BLAST的检测结果，可我看不懂，请教教我！谢。

BLASTN 2.2.9 [May-01-2004]

Reference:
Altschul, Stephen F., Thomas L. Madden, Alejandro A. Schäffer,
Jinghui Zhang, Zheng Zhang, Webb Miller, and David J. Lipman (1997),
"Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search
programs", Nucleic Acids Res. 25:3389-3402.

RID: 1084088745-15152-180999400030.BLASTQ3

Query=
(54 letters)

Database: All GenBank+EMBL+DDBJ+PDB sequences (but no EST, STS,
GSS,environmental samples or phase 0, 1 or 2 HTGS sequences)
2,191,357 sequences; 10,
作者: 浆果儿cc    时间: 2011-9-14 13:31

各位大虾：这是我将引物输入BLAST的检测结果，可我看不懂，请教教我！谢。

BLASTN 2.2.9 [May-01-2004]

Reference:
Altschul, Stephen F., Thomas L. Madden, Alejandro A. Schäffer,
Jinghui Zhang, Zheng Zhang, Webb Miller, and David J. Lipman (1997),
"Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search
programs", Nucleic Acids Res. 25:3389-3402.

RID: 1084088745-15152-180999400030.BLASTQ3

Query=
(54 letters)

Database: All GenBank+EMBL+DDBJ+PDB sequences (but no EST, STS,
GSS,environmental samples or phase 0, 1 or 2 HTGS sequences)
2,191,357 sequences; 10,537,999,113 total letters

If you have any problems or questions with the results of this search please refer to the BLAST FAQs
No significant similarity found. For reasons why, click here.

Lambda K H
1.37 0.711 1.31

Gapped
Lambda K H
1.37 0.711 1.31
作者: 浆果儿cc    时间: 2011-9-14 13:31

Gap Penalties: Existence: 5, Extension: 2
Number of Hits to DB: 401,494
Number of Sequences: 2191357
Number of extensions: 515
Number of successful extensions: 0
Number of sequences better than 10.0: 0
Number of HSP's better than 10.0 without gapping: 0
Number of HSP's successfully gapped in prelim test: 0
length of query: 54
length of database: 10,537,999,113
A: 0
X1: 11 (20.0 bits)
X2: 15 (30.0 bits)
X3: 25 (50.0 bits)
S1: 12 (25.0 bits)
作者: 浆果儿cc    时间: 2011-9-14 13:31

Gap Penalties: Existence: 5, Extension: 2
Number of Hits to DB: 401,494
Number of Sequences: 2191357
Number of extensions: 515
Number of successful extensions: 0
Number of sequences better than 10.0: 0
Number of HSP's better than 10.0 without gapping: 0
Number of HSP's successfully gapped in prelim test: 0
length of query: 54
length of database: 10,537,999,113
A: 0
X1: 11 (20.0 bits)
X2: 15 (30.0 bits)
X3: 25 (50.0 bits)
S1: 12 (25.0 bits)
作者: 椰子叶子    时间: 2011-9-14 13:32

我用了众多的反转录试剂盒中，觉得invitrogen的反转录试剂盒较好！“Superscript II Reverse Transcriptase" 非常好用！不过比较贵，你可以试试。
作者: 椰子叶子    时间: 2011-9-14 13:32

如何进行BLAST,如何分析BLAST后的结果,你可以访问
cuturl('http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Education/BLASTinfo/tut1.html')

对于初级使用者，下边几个参数就足够了，
eg: 现在我有一个自己克隆的基因，全序列为myGene.fasta(注意，要用fasta格式
，如果不清楚，请参见本版相关帖子),现在我想在已知的人类基因中找找有没有和
我克隆的基因相似的gene，所以用humanRNA作为要进行比对的数据库(注意：1.这
个数据库本身得是fasta格式 2. 在进行blast比对前，要进行formatdb程序再格式
化一下，这是blast比较必须的！相关formatdb参见相关帖子)
开始比对时，在命令行键入下列命令：
blastall -p blastn -i myRNA.fasta -d humanRNA.fasta -o myresult.blastout
-a 2 -F F -T T -e 1e-10
解释如下：
blastall: 这是本地化/命令行执行blast时的程序名字！(Tips:blastall直接回车
就会给出你所有的参数帮助，但是英文的)
-p: p 是program的简写,program在计算机领域中是程序的意思。此参数是指定要
使用何种子程序，所谓子程序，就是针对不同的需要，如核酸序列和核酸序列进行
比对、蛋白质序列和蛋白质序列进行比对、假设翻译后核酸序列于蛋白质序列进行
比对，选择相应的子程序: blastn 是用于核酸对核酸 blastp 是蛋白质对蛋白质
序列 等等，一共5个自程序。
作者: 椰子叶子    时间: 2011-9-14 13:33

-i: i 是input的简写，意思是输入文件，就是你自己的要进行比对的序列文件
(fasta格式）

-d: d是database的简写,意思是要比对的目标数据库,在例子中就是humanRNA.
fasta (别忘了要formatdb)

-o: o是output的简写，意思是结果文件名字，这个根据你自己的习惯起名字，可
以带路径，(上边两个参数-i -d 也都可以带路径)

*注意以上4个参数是必须的，缺一不可，下面的参数是为了得到更好的结果自己可
调的参数，如果你不加也没有关系，blastall程序本身会给一个默认值！
-a: 是指计算时要用的CPU个数，我的机器有两个CPU，所以用-a 2，这样可以并行
化进行计算，提高速度，当然你的计算机就一个CPU,可以不用这个参数，系统默认
值为1,就是一个CPU

-F: 是filter的简写，blastall程序中有对简单的重复序列和低复杂度的一些
repeats过滤调，默认是T (注意以后的有几种参数就两个选项，T/F T就是ture,真
，你可以理解为打开该功能; F就是false，假，理解为关闭该功能)

-T: 是HTML的简写，是指blast结果文件是否用HTML格式，默认是F!如果你想用IE
看，我建议用-T T

-e: 是Expectation value，期望值，默认是10，我用的10-10！

以上是简单的介绍，其实blastall的参数远远不止这些，有空在说了！
大家可以看看NCBI上的详细介绍，虽然是英文的！
Good luck for everyone!
作者: 椰子叶子    时间: 2011-9-14 13:33

blastall 2.2.4 arguments:
-p Program Name [String]
-d Database [String]
default = nr
-i Query File [File In]
default = stdin
-e Expectation value (E) [Real]
default = 10.0
-m alignment view options:
0 = pairwise,
1 = query-anchored showing identities,
2 = query-anchored no identities,
3 = flat query-anchored, show identities,
4 = flat query-anchored, no identities,
5 = query-anchored no identities and blunt ends,
6 = flat query-anchored, no identities and blunt ends,
7 = XML Blast output,
8 = tabular,
9 tabular with comment lines [Integer]
default = 0
-o BLAST report Output File [File Out] Optional
default = stdout
-F Filter query sequence (DUST with blastn, SEG with others) [String]
default = T
-G Cost to open a gap (zero invokes default behavior) [Integer]
default = 0
-E Cost to extend a gap (zero invokes default behavior) [Integer]
default = 0
作者: 椰子叶子    时间: 2011-9-14 13:34

-X X dropoff value for gapped alignment (in bits) (zero invokes
default behavior)
blastn 30, megablast 20, tblastx 0, all others 15 [Integer]
default = 0
-I Show GI's in deflines [T/F]
default = F
-q Penalty for a nucleotide mismatch (blastn only) [Integer]
default = -3
-r Reward for a nucleotide match (blastn only) [Integer]
default = 1
-v Number of database sequences to show one-line descriptions for (V)
[Integer]
default = 500
-b Number of database sequence to show alignments for ( [Integer]
default = 250
-f Threshold for extending hits, default if zero
blastp 11, blastn 0, blastx 12, tblastn 13
tblastx 13, megablast 0 [Integer]
default = 0
-g Perfom gapped alignment (not available with tblastx) [T/F]
default = T
-Q Query Genetic code to use [Integer]
default = 1
-D DB Genetic code (for tblast[nx] only) [Integer]
default = 1
-a Number of processors to use [Integer]
default = 1
-O SeqAlign file [File Out] Optional
-J Believe the query defline [T/F]
default = F
-M Matrix [String]
default = BLOSUM62
-W Word size, default if zero (blastn 11, megablast 28, all others 3)
[Integer]
default = 0
作者: 椰子叶子    时间: 2011-9-14 13:34

-z Effective length of the database (use zero for the real size)
[Real]
default = 0
-K Number of best hits from a region to keep (off by default, if used
a value of 100 is recommended) [Integer]
default = 0
-Y Effective length of the search space (use zero for the real size)
[Real]
default = 0
-S Query strands to search against database (for blast[nx], and
tblastx)
3 is both, 1 is top, 2 is bottom [Integer]
default = 3
-T Produce HTML output [T/F]
default = F
-l Restrict search of database to list of GI's [String] Optional
-U Use lower case filtering of FASTA sequence [T/F] Optional
default = F
-y X dropoff value for ungapped extensions in bits (0.0 invokes
default behavior)
blastn 20, megablast 10, all others 7 [Real]
default = 0.0
-Z X dropoff value for final gapped alignment in bits (0.0 invokes
default behavior)
blastn/megablast 50, tblastx 0, all others 25 [Integer]
default = 0
-R PSI-TBLASTN checkpoint file [File In] Optional
-n MegaBlast search [T/F]
default = F
作者: 椰子叶子    时间: 2011-9-14 13:34

-L Location on query sequence [String] Optional
-A Multiple Hits window size, default if zero (blastn/megablast 0, all
others 40 [Integer]
default = 0
-w Frame shift penalty (OOF algorithm for blastx) [Integer]
default = 0
-t Length of the largest intron allowed in tblastn for linking HSPs (0
disables linking) [Integer]
default = 0

------自BIOINFORMATICS转贴。
作者: 幸福无罪    时间: 2011-9-14 13:35

求救：

我用的是progema 公司的试剂和来提取RNA ，由于本人不慎，裂解液本来应保存于4-22度，但是我却在-20度存放了5天才发现，今天提取RNA，没有提出来，我想知道，裂解液是否失效，请各位高手指教！急！
谢谢各位
作者: 幸福无罪    时间: 2011-9-14 13:35

求救：

我用的是progema 公司的试剂和来提取RNA ，由于本人不慎，裂解液本来应保存于4-22度，但是我却在-20度存放了5天才发现，今天提取RNA，没有提出来，我想知道，裂解液是否失效，请各位高手指教！急！
谢谢各位
作者: 丸子妹    时间: 2011-9-14 13:36

请教以下:Blast的结果怎么看阿?我把自己的引物输进去之后,出现以下的结果,帮我看一下吧!谢谢!
BLASTN 2.2.9 [May-01-2004]

Reference:
Altschul, Stephen F., Thomas L. Madden, Alejandro A. Schäffer,
Jinghui Zhang, Zheng Zhang, Webb Miller, and David J. Lipman (1997),
"Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search
programs", Nucleic Acids Res. 25:3389-3402.

RID: 1084155634-31562-113261863480.BLASTQ3

Query=
(21 letters)

Database: All GenBank+EMBL+DDBJ+PDB sequences (but no EST, STS,
GSS,environmental samples or phase 0, 1 or 2 HTGS sequences)
2,192,053 sequences; 10,542,095,270 total letters

If you have any problems or questions with the results of this search please refer to the BLAST FAQs
Taxonomy reports

Distribution of 37 Blast Hits on the Query Sequence


--------------------------------------------------------------------------------

Score E
Sequences producing significant alignments: (bits) Value
作者: 丸子妹    时间: 2011-9-14 13:36

gi|21363121|ref|NG_001332.1| Homo sapiens T cell receptor a... 42 0.007
gi|2358042|gb|AE000660.1|HUAE000660 Homo sapiens T-cell rec... 42 0.007
gi|29469970|gb|AY232283.1| Homo sapiens T cell receptor alp... 42 0.007
gi|29469962|gb|AY232282.1| Homo sapiens T cell receptor alp... 42 0.007
gi|29293740|gb|AY247834.1| Homo sapiens T cell receptor alp... 42 0.007
gi|1049176|gb|U32540.1|HSU32540 Human T-cell receptor V-alp... 42 0.007
gi|642988|emb|X58333.1|HSTCRAM3 H.sapiens TCRA PS7 mRNA 42 0.007
gi|1477409|emb|Z77832.1|HSPEC29VA H.sapiens mRNA for TCR al... 42 0.007
gi|1256809|gb|U51444.1|HSU51444 Human T cell receptor V-alp... 42 0.007
gi|36902|emb|X04955.1|HSTCRA20 Human mRNA for T-cell recept... 42 0.007
gi|36891|emb|X04948.1|HSTCRA14 Human mRNA for T-cell recept... 42 0.007
gi|19880128|gb|AF361088.1| Macaca mulatta killer-cell Ig-li... 34 1.6
gi|29540488|gb|AC135559.4| Oryza sativa chromosome 3 BAC OS... 34 1.6
gi|45593051|gb|AC093483.6| Mus musculus chromosome 9, clone... 34 1.6
gi|13447894|gb|AF334644.1|AF334644 Macaca mulatta killer im... 34 1.6
gi|25013386|gb|AC079682.29| Mus musculus chromosome 3 clone... 34 1.6
gi|623100|gb|L38862.1|MACTCRAAD Macaca mulatta (clone MMVA3... 34 1.6
gi|39652668|gb|AC099948.9| Mus musculus chromosome 10, clon... 32 6.3
gi|27413946|gb|AC125351.3| Mus musculus BAC clone RP23-442M... 32 6.3
gi|23334939|gb|AC121573.4| Mus musculus BAC clone RP23-236G... 32 6.3
gi|28893807|gb|AC122292.4| Mus musculus BAC clone RP23-256J... 32 6.3
gi|37574221|gb|AC129544.7| Mus musculus chromosome 12, clon... 32 6.3
gi|31455631|gb|AC096310.9| Rattus norvegicus 1 BAC CH230-12... 32 6.3
gi|21210036|gb|AY106958.1| Zea mays PCO100533 mRNA sequence 32 6.3
gi|37936295|emb|BX663531.3| Chicken DNA sequence from clone... 32 6.3
gi|20197427|gb|AC005700.3| Arabidopsis thaliana chromosome ... 32 6.3
gi|46358395|gb|AC127224.3| Mus musculus chromosome 10 clone... 32 6.3
作者: 丸子妹    时间: 2011-9-14 13:36

gi|46358395|gb|AC127224.3| Mus musculus chromosome 10 clone... 32 6.3
gi|46240965|gb|AC141647.3| Mus musculus chromosome 10 clone... 32 6.3
gi|15451505|gb|AC009352.5| Drosophila melanogaster, chromos... 32 6.3
gi|22946358|gb|AE003638.2| Drosophila melanogaster chromoso... 32 6.3
gi|13429919|dbj|AP000751.4| Homo sapiens genomic DNA, chrom... 32 6.3
gi|14017482|gb|AC008332.11|AC008332 Drosophila melanogaster... 32 6.3
gi|28374996|emb|AL928926.9| Mouse DNA sequence from clone R... 32 6.3
gi|17065727|emb|AL591488.7| Mouse DNA sequence from clone R... 32 6.3
gi|21998252|emb|AL732503.8| Mouse DNA sequence from clone R... 32 6.3
gi|23953902|emb|AL137860.22| Human DNA sequence from clone ... 32 6.3
gi|16972917|emb|AL359075.15| Human DNA sequence from clone ... 32 6.3

Alignments


>gi|21363121|ref|NG_001332.1| Homo sapiens T cell receptor alpha delta locus (TCRA/TCRD) on chromosome
14
Length = 1071646

Score = 42.1 bits (21), Expect = 0.007
Identities = 21/21 (100%)
Strand = Plus / Plus
作者: 丸子妹    时间: 2011-9-14 13:36

Query: 1 ggtgaacagtcaacagggaga 21
|||||||||||||||||||||
Sbjct: 503768 ggtgaacagtcaacagggaga 503788

>gi|2358042|gb|AE000660.1|HUAE000660 Homo sapiens T-cell receptor alpha delta locus from bases 501613 to
752736 (section 3 of 5) of the Complete Nucleotide
Sequence
Length = 251124

Score = 42.1 bits (21), Expect = 0.007
Identities = 21/21 (100%)
Strand = Plus / Plus


Query: 1 ggtgaacagtcaacagggaga 21
|||||||||||||||||||||
Sbjct: 2156 ggtgaacagtcaacagggaga 2176

>gi|29469970|gb|AY232283.1| Homo sapiens T cell receptor alpha chain AV17S1 J48 AC mRNA,
complete cds
Length = 813

Score = 42.1 bits (21), Expect = 0.007
Identities = 21/21 (100%)
Strand = Plus / Plus


Query: 1 ggtgaacagtcaacagggaga 21
|||||||||||||||||||||
Sbjct: 54 ggtgaacagtcaacagggaga 74
作者: 丸子妹    时间: 2011-9-14 13:37

>gi|1049176|gb|U32540.1|HSU32540 Human T-cell receptor V-alpha 3 (TCRA) gene, partial exons 1 and 2,
partial cds
Length = 350

Score = 42.1 bits (21), Expect = 0.007
Identities = 21/21 (100%)
Strand = Plus / Plus


Query: 1 ggtgaacagtcaacagggaga 21
|||||||||||||||||||||
Sbjct: 158 ggtgaacagtcaacagggaga 178

>gi|642988|emb|X58333.1|HSTCRAM3 H.sapiens TCRA PS7 mRNA
Length = 399

Score = 42.1 bits (21), Expect = 0.007
Identities = 21/21 (100%)
Strand = Plus / Plus


Query: 1 ggtgaacagtcaacagggaga 21
|||||||||||||||||||||
Sbjct: 54 ggtgaacagtcaacagggaga 74

>gi|1477409|emb|Z77832.1|HSPEC29VA H.sapiens mRNA for TCR alpha variable region (clone XPEC29 I)
Length = 406
作者: 丸子妹    时间: 2011-9-14 13:38

Score = 42.1 bits (21), Expect = 0.007
Identities = 21/21 (100%)
Strand = Plus / Plus


Query: 1 ggtgaacagtcaacagggaga 21
|||||||||||||||||||||
Sbjct: 1 ggtgaacagtcaacagggaga 21

>gi|1256809|gb|U51444.1|HSU51444 Human T cell receptor V-alpha 3.1 (TCRA) mRNA, partial cds
Length = 417

Score = 42.1 bits (21), Expect = 0.007
Identities = 21/21 (100%)
Strand = Plus / Plus


Query: 1 ggtgaacagtcaacagggaga 21
|||||||||||||||||||||
Sbjct: 54 ggtgaacagtcaacagggaga 74

>gi|36902|emb|X04955.1|HSTCRA20 Human mRNA for T-cell receptor alpha-chain HAP44 V3.1-JK
Length = 419

Score = 42.1 bits (21), Expect = 0.007
Identities = 21/21 (100%)
Strand = Plus / Plus


Query: 1 ggtgaacagtcaacagggaga 21
|||||||||||||||||||||
Sbjct: 54 ggtgaacagtcaacagggaga 74

>gi|36891|emb|X04948.1|HSTCRA14 Human mRNA for T-cell receptor alpha-chain HAP05 V3.1/JP
Length = 401

Score = 42.1 bits (21), Expect = 0.007
Identities = 21/21 (100%)
Strand = Plus / Plus


Query: 1 ggtgaacagtcaacagggaga 21
|||||||||||||||||||||
Sbjct: 54 ggtgaacagtcaacagggaga 74

>gi|19880128|gb|AF361088.1| Macaca mulatta killer-cell Ig-like receptor KIR2DL4.1 mRNA,
complete cds
Length = 1608
作者: 丸子妹    时间: 2011-9-14 13:38

Score = 34.2 bits (17), Expect = 1.6
Identities = 17/17 (100%)
Strand = Plus / Plus


Query: 4 gaacagtcaacagggag 20
|||||||||||||||||
Sbjct: 880 gaacagtcaacagggag 896

>gi|29540488|gb|AC135559.4| Oryza sativa chromosome 3 BAC OSJNBa0030J19 genomic sequence, complete
sequence
Length = 133843

Score = 34.2 bits (17), Expect = 1.6
Identities = 17/17 (100%)
Strand = Plus / Minus


Query: 3 tgaacagtcaacaggga 19
|||||||||||||||||
Sbjct: 105368 tgaacagtcaacaggga 105352

>gi|45593051|gb|AC093483.6| Mus musculus chromosome 9, clone RP23-79K5, complete sequence
Length = 262048

Score = 34.2 bits (17), Expect = 1.6
Identities = 17/17 (100%)
Strand = Plus / Plus


Query: 1 ggtgaacagtcaacagg 17
|||||||||||||||||
Sbjct: 162773 ggtgaacagtcaacagg 162789

>gi|13447894|gb|AF334644.1|AF334644 Macaca mulatta killer immunoglobulin-like receptor KIR2DL4.1
(KIR2DL4) mRNA, KIR2DL4-1 allele, partial cds
Length = 1543

Score = 34.2 bits (17), Expect = 1.6
Identities = 17/17 (100%)
Strand = Plus / Plus
作者: 丸子妹    时间: 2011-9-14 13:38

Query: 4 gaacagtcaacagggag 20
|||||||||||||||||
Sbjct: 824 gaacagtcaacagggag 840

>gi|25013386|gb|AC079682.29| Mus musculus chromosome 3 clone rp23-463h24 strain C57BL/6J, complete
sequence
Length = 181082

Score = 34.2 bits (17), Expect = 1.6
Identities = 17/17 (100%)
Strand = Plus / Plus


Query: 1 ggtgaacagtcaacagg 17
|||||||||||||||||
Sbjct: 111605 ggtgaacagtcaacagg 111621

>gi|623100|gb|L38862.1|MACTCRAAD Macaca mulatta (clone MMVA33) T-cell receptor alpha (TCR A) mRNA,
5' end of cds
Length = 435

Score = 34.2 bits (17), Expect = 1.6
Identities = 20/21 (95%)
Strand = Plus / Plus


Query: 1 ggtgaacagtcaacagggaga 21
||||||||||||||| |||||
Sbjct: 54 ggtgaacagtcaacaaggaga 74

>gi|39652668|gb|AC099948.9| Mus musculus chromosome 10, clone RP23-19D21, complete sequence
Length = 203086

Score = 32.2 bits (16), Expect = 6.3
Identities = 16/16 (100%)
Strand = Plus / Plus


Query: 6 acagtcaacagggaga 21
||||||||||||||||
Sbjct: 50301 acagtcaacagggaga 50316

>gi|27413946|gb|AC125351.3| Mus musculus BAC clone RP23-442M3 from chromosome 12, complete
sequence
Length = 188024
作者: 丸子妹    时间: 2011-9-14 13:39

Score = 32.2 bits (16), Expect = 6.3
Identities = 16/16 (100%)
Strand = Plus / Minus


Query: 4 gaacagtcaacaggga 19
||||||||||||||||
Sbjct: 3835 gaacagtcaacaggga 3820

>gi|23334939|gb|AC121573.4| Mus musculus BAC clone RP23-236G6 from 6, complete sequence
Length = 170559

Score = 32.2 bits (16), Expect = 6.3
Identities = 16/16 (100%)
Strand = Plus / Minus


Query: 4 gaacagtcaacaggga 19
||||||||||||||||
Sbjct: 25539 gaacagtcaacaggga 25524

>gi|28893807|gb|AC122292.4| Mus musculus BAC clone RP23-256J8 from 10, complete sequence
Length = 159736

Score = 32.2 bits (16), Expect = 6.3
Identities = 16/16 (100%)
Strand = Plus / Plus


Query: 5 aacagtcaacagggag 20
||||||||||||||||
Sbjct: 116617 aacagtcaacagggag 116632

>gi|37574221|gb|AC129544.7| Mus musculus chromosome 12, clone RP23-258H6, complete sequence
Length = 232275

Score = 32.2 bits (16), Expect = 6.3
Identities = 16/16 (100%)
Strand = Plus / Plus


Query: 6 acagtcaacagggaga 21
||||||||||||||||
Sbjct: 70602 acagtcaacagggaga 70617
作者: 丸子妹    时间: 2011-9-14 13:40

>gi|31455631|gb|AC096310.9| Rattus norvegicus 1 BAC CH230-121B19 (Children's Hospital Oakland
Research Institute) complete sequence
Length = 218258

Score = 32.2 bits (16), Expect = 6.3
Identities = 16/16 (100%)
Strand = Plus / Plus


Query: 6 acagtcaacagggaga 21
||||||||||||||||
Sbjct: 161004 acagtcaacagggaga 161019

>gi|21210036|gb|AY106958.1| Zea mays PCO100533 mRNA sequence
Length = 1311

Score = 32.2 bits (16), Expect = 6.3
Identities = 19/20 (95%)
Strand = Plus / Plus


Query: 2 gtgaacagtcaacagggaga 21
||||| ||||||||||||||
Sbjct: 465 gtgaagagtcaacagggaga 484

>gi|37936295|emb|BX663531.3| Chicken DNA sequence from clone WAG-18M1, complete sequence
Length = 111106

Score = 32.2 bits (16), Expect = 6.3
Identities = 16/16 (100%)
Strand = Plus / Minus


Query: 6 acagtcaacagggaga 21
||||||||||||||||
Sbjct: 2781 acagtcaacagggaga 2766

>gi|20197427|gb|AC005700.3| Arabidopsis thaliana chromosome 2 clone T32F6 map TEn5, complete
sequence
Length = 100424

Score = 32.2 bits (16), Expect = 6.3
Identities = 16/16 (100%)
Strand = Plus / Minus


Query: 2 gtgaacagtcaacagg 17
||||||||||||||||
Sbjct: 98714 gtgaacagtcaacagg 98699

>gi|46358395|gb|AC127224.3| Mus musculus chromosome 10 clone RP24-498F21, complete sequence
Length = 162143

Score = 32.2 bits (16), Expect = 6.3
Identities = 16/16 (100%)
Strand = Plus / Minus


Query: 5 aacagtcaacagggag 20
||||||||||||||||
Sbjct: 157814 aacagtcaacagggag 157799

>gi|46240965|gb|AC141647.3| Mus musculus chromosome 10 clone RP23-64E12, complete sequence
Length = 217745

Score = 32.2 bits (16), Expect = 6.3
Identities = 16/16 (100%)
Strand = Plus / Minus
作者: 丸子妹    时间: 2011-9-14 13:40

Query: 5 aacagtcaacagggag 20
||||||||||||||||
Sbjct: 65143 aacagtcaacagggag 65128

>gi|15451505|gb|AC009352.5| Drosophila melanogaster, chromosome 2L, region 34A-34A, BAC clone
BACR11M13, complete sequence
Length = 190301

Score = 32.2 bits (16), Expect = 6.3
Identities = 16/16 (100%)
Strand = Plus / Plus


Query: 1 ggtgaacagtcaacag 16
||||||||||||||||
Sbjct: 159574 ggtgaacagtcaacag 159589

>gi|22946358|gb|AE003638.2| Drosophila melanogaster chromosome 2L, section 47 of 83 of the complete
sequence
Length = 254309

Score = 32.2 bits (16), Expect = 6.3
Identities = 16/16 (100%)
Strand = Plus / Plus


Query: 1 ggtgaacagtcaacag 16
||||||||||||||||
Sbjct: 103010 ggtgaacagtcaacag 103025

>gi|13429919|dbj|AP000751.4| Homo sapiens genomic DNA, chromosome 11q, clone:RP11-679A11, complete
sequence
Length = 176713

Score = 32.2 bits (16), Expect = 6.3
Identities = 16/16 (100%)
Strand = Plus / Minus


Query: 5 aacagtcaacagggag 20
||||||||||||||||
Sbjct: 100987 aacagtcaacagggag 100972

>gi|14017482|gb|AC008332.11|AC008332 Drosophila melanogaster, chromosome 2L, region 34A-34A, BAC clone
BACR410, complete sequence
Length = 153250
作者: 丸子妹    时间: 2011-9-14 13:40

Score = 32.2 bits (16), Expect = 6.3
Identities = 16/16 (100%)
Strand = Plus / Plus


Query: 1 ggtgaacagtcaacag 16
||||||||||||||||
Sbjct: 99762 ggtgaacagtcaacag 99777

>gi|28374996|emb|AL928926.9| Mouse DNA sequence from clone RP23-443G7 on chromosome 2, complete
sequence
Length = 211456

Score = 32.2 bits (16), Expect = 6.3
Identities = 16/16 (100%)
Strand = Plus / Minus


Query: 4 gaacagtcaacaggga 19
||||||||||||||||
Sbjct: 115653 gaacagtcaacaggga 115638

>gi|17065727|emb|AL591488.7| Mouse DNA sequence from clone RP23-36P22 on chromosome 2, complete
sequence
Length = 191494

Score = 32.2 bits (16), Expect = 6.3
Identities = 16/16 (100%)
Strand = Plus / Minus


Query: 6 acagtcaacagggaga 21
||||||||||||||||
Sbjct: 129996 acagtcaacagggaga 129981

>gi|21998252|emb|AL732503.8| Mouse DNA sequence from clone RP23-28O9 on chromosome 4, complete
sequence
Length = 148526
作者: 丸子妹    时间: 2011-9-14 13:41

Score = 32.2 bits (16), Expect = 6.3
Identities = 16/16 (100%)
Strand = Plus / Minus


Query: 4 gaacagtcaacaggga 19
||||||||||||||||
Sbjct: 110871 gaacagtcaacaggga 110856

>gi|23953902|emb|AL137860.22| Human DNA sequence from clone RP4-633N17 on chromosome 1p34.1-34.3,
complete sequence
Length = 121010

Score = 32.2 bits (16), Expect = 6.3
Identities = 16/16 (100%)
Strand = Plus / Minus


Query: 5 aacagtcaacagggag 20
||||||||||||||||
Sbjct: 113611 aacagtcaacagggag 113596

>gi|16972917|emb|AL359075.15| Human DNA sequence from clone RP11-568K15 on chromosome 1, complete
sequence
Length = 119859

Score = 32.2 bits (16), Expect = 6.3
Identities = 16/16 (100%)
Strand = Plus / Plus


Query: 5 aacagtcaacagggag 20
||||||||||||||||
Sbjct: 47716 aacagtcaacagggag 47731



Lambda K H
1.37 0.711 1.31
作者: 丸子妹    时间: 2011-9-14 13:41

Gapped
Lambda K H
1.37 0.711 1.31

Gap Penalties: Existence: 5, Extension: 2
Number of Hits to DB: 336,224
Number of Sequences: 2192053
Number of extensions: 2758
Number of successful extensions: 12
Number of sequences better than 10.0: 0
Number of HSP's better than 10.0 without gapping: 0
Number of HSP's successfully gapped in prelim test: 11
length of query: 21
length of database: 10,542,095,270
A: 0
X1: 11 (20.0 bits)
X2: 15 (30.0 bits)
X3: 25 (50.0 bits)
S1: 12 (25.0 bits)
作者: =菓子=    时间: 2011-9-14 13:42

今天我又作了一次PCR，退火温度调到65度（已做过60，55无目的条带），镁离子浓度梯度：1.2，2.0，2.6，3.0微升，20的体系，可是结果还是引物二聚体和200多BP的条带，连内参B-ACTIN也在200左右，这是为什么呀？请各位大虾指点迷津，大虾们快点上班吧！！！
基因片段长度：852bp.
引物：5‘端：5’ GCC GAA TTC ATG CTC CTA TCG CGG ATT3‘（ECORI位点，GC%：51.85%，Tm:65.04,27bp）
3’端：5‘ GAC CTC GAG TCG TAC GTT GCA ACC AGC 3' (XHOI位点，GC%：59.26%，Tm：68.08，27bp)

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我也遇到了同样的问题，已经一个多月了，目的基因还没有扩出来，各种条件都试了，急得我都要哭了，有好的建议一起分享！
作者: 阿拉蕾    时间: 2011-9-14 13:42

求救：我用的是progema 公司的试剂和来提取RNA ，由于本人不慎，裂解液本来应保存于4-22度，但是我却在-20度存放了5天才发现，今天提取RNA，没有提出来，我想知道，裂解液是否失效，请各位高手指教！急！



试剂中的成分是否容易失效，很大程度决定于它所含的成分；普通的化学试剂一般比较稳定，在化学反应中的效应是以浓度为单位， （如 克%或者摩尔浓度），-20C和4-8C存放，（不太影响其化学作用，浓度变化不大）；而酶的试剂就不同了，酶的反应是以活力为单位，有些酶只能存在某个温度有活力，当酶在某个温度失活了（如：高温或者冻存），即使是温度再恢复到有活力的温点，但酶的活力已经尚失，无法恢复。温度变化对酶的影响大于对普通的化学试剂。
progema 公司的提取RNA试剂的主要成分是：变性剂（含：亚硫氢胍，巯基乙醇，n-月桂肌氨酸），苯酚：氯仿：异戊醇（125：24：1），乙酸钠，异丙醇；这些成分都是化学试剂，比较稳定，虽然说明书是要求保存于4-22度，但是即使是在-20度存放，应该也没有问题！（具体可以向progema 公司技术部询问，免费电话：8008108133）；RNA没有提出来，可能有其他原因要考虑。



附：progema 公司的RNAgents®总RNA提取系统的各组分的作用功能：
(1) 变性剂: 柠檬酸钠溶液中含亚硫氢胍，巯基乙醇，n-月桂肌氨酸 。可变性细胞内及核蛋白复合物，释放RNA。这些试剂还可有效抑制核酸酶。
(2) 苯酚：氯仿：异戊醇（125：24：1）（pH4.7）:酸平衡苯仿可抽提去除杂物。DNA及蛋白沉淀到有机相，RNA留在水相。酸性有机溶剂的抽提可免除用氯化锂选择沉淀RNA。用锂沉淀导致小于5.8sRNA的丢失，并不利于下游操作。
(3) 乙酸钠（pH4.0）：维持变性的细胞裂解液的pH值，及沉淀RNA所需。
(4) 异丙醇：沉淀浓缩RNA。
作者: 8黑眼圈8    时间: 2011-9-14 13:43

我也遇到了同样的问题，已经一个多月了，目的基因还没有扩出来，各种条件都试了，急得我都要哭了，有好的建议一起分享！

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咱们都是可怜的同路人哪。你试着用槽式PCR做作，换反转录酶了吗？
作者: 夕阳    时间: 2011-9-14 13:44

我是做RT-PCR的新新手。请问：要查一段序列的内切酶位点，在哪个网站可以查到？两条链先后都要输进去吗？恳请赐教！
作者: 麻瓜    时间: 2011-9-14 13:44

请问RT-PCR英文全称怎么写？
谢谢！
作者: 韩梅梅    时间: 2011-9-14 13:45

走过路过的各位仁兄仁姐：
我是做RT-PCR的新新手。请问：要查一段序列的内切酶位点，在哪个网站可以查到？两条链先后都要输进去吗？恳请赐教！

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将你的序列输入一般的引物设计软件如DNACLUB，PRIMER5.0等，点击限制性酶切位点分析就可以看到结果了，引物设计软件可从网上下载。另外，多在咱这园子里转转，你能学到好多东东，真的！祝你实验顺利。
作者: 韩梅梅    时间: 2011-9-14 13:45

请问RT-PCR英文全称怎么写？
谢谢！

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REVERSE TRANSCRIPT POLYMERASE CHAIN REACTION,再校对一遍，核实一下看是否合适？
作者: 兔纸    时间: 2011-9-14 13:45

小弟准备进行RT，以前把RNA冻存于－80，请问怎样解冻？谢谢！
作者: 微笑的海豚    时间: 2011-9-14 13:46

小弟准备进行RT，以前把RNA冻存于－80，请问怎样解冻？谢谢！

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其他的帖子里有的！
4度，或冰上！
作者: 速冻虾米    时间: 2011-9-14 13:47

我是从卵里面提取RNA,然后用一步法做RT-PCR的，但是电泳后出现了两条带，一个在400bp左右，一个在1000bp左右，我的目的条带是500bp左右，不知道什么原因？看文献说从卵中提取RNA，由于存在卵黄细胞和胚胎细胞，会有杂质干扰，请问各位高手该如何解决RNA纯化得问题？有人说用氯化锂，但浓度如何,如何操作？为谢
作者: 韩梅梅    时间: 2011-9-14 13:48

请教以下:Blast的结果怎么看阿?我把自己的引物输进去之后,出现以下的结果,帮我看一下吧!谢谢!
BLASTN 2.2.9 [May-01-2004]

Reference: ………………………………………………………………………(参考的文献）
Altschul, Stephen F., Thomas L. Madden, Alejandro A. Schäffer,
Jinghui Zhang, Zheng Zhang, Webb Miller, and David J. Lipman (1997),
"Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search
programs", Nucleic Acids Res. 25:3389-3402.

RID: 1084155634-31562-113261863480.BLASTQ3…………检索号

Query= (21 letters)…………………………………………查询为21的碱基

Database: All GenBank+EMBL+DDBJ+PDB sequences (but no EST, STS,
GSS,environmental samples or phase 0, 1 or 2 HTGS sequences)
2,192,053 sequences; 10,542,095,270 total letters………………数据库及特征

If you have any problems or questions with the results of this search please refer to the BLAST FAQs
Taxonomy reports

Distribution of 37 Blast Hits on the Query Sequence……分类报告，37个可以匹配的序列，下面一列为其详细列表，可以不理会

Score E
Sequences producing significant alignments: (bits) Value

gi|21363121|ref|NG_001332.1| Homo sapiens T cell receptor a... 42 0.007
Alignments


>gi|21363121|ref|NG_001332.1|
所匹配的序列号，点击可以链接得到
Homo sapiens T cell receptor alpha delta locus (TCRA/TCRD) on chromosome 14
所属基因为人类14号染色体TCR
Length = 1071646
长度1071646 Score = 42.1 bits (21), Expect = 0.007
Identities = 21/21 (100%)
Strand = Plus / Plus……………………………………21碱基100％匹配

Query: 1 ggtgaacagtcaacagggaga 21
|||||||||||||||||||||
Sbjct: 503768 ggtgaacagtcaacagggaga 503788
匹配基因对应为503768－503788个碱基>gi|29540488|gb|

Lambda K H
1.37 0.711 1.31

Gapped
Lambda K H
1.37 0.711 1.31

Gap Penalties: Existence: 5, Extension: 2
Number of Hits to DB: 336,224
Number of Sequences: 2192053
Number of extensions: 2758
Number of successful extensions: 12
Number of sequences better than 10.0: 0
Number of HSP's better than 10.0 without gapping: 0
Number of HSP's successfully gapped in prelim test: 11
length of query: 21
length of database: 10,542,095,270
A: 0
X1: 11 (20.0 bits)
X2: 15 (30.0 bits)
X3: 25 (50.0 bits)
S1: 12 (25.0 bits)

==============================================================================================================

下面部分我也不会，还请主任和其他战友补充。另外想说的是此引物的同源性较差一些，还需要看你需要哪个物种基因，如果是人的同源性不是太好。
作者: 兔纸    时间: 2011-9-14 13:48

其他的帖子里有的！
4度，或冰上！

===================

直接从-80转移到4度吗?
作者: 夕阳    时间: 2011-9-14 13:49

我是从卵里面提取RNA,然后用一步法做RT-PCR的，但是电泳后出现了两条带，一个在400bp左右，一个在1000bp左右，我的目的条带是500bp左右，不知道什么原因？看文献说从卵中提取RNA，由于存在卵黄细胞和胚胎细胞，会有杂质干扰，请问各位高手该如何解决RNA纯化得问题？有人说用氯化锂，但浓度如何,如何操作？为谢

===================

请各位给予帮助。谢谢啦！
作者: 森林木    时间: 2011-9-14 13:49

直接从-80转移到4度吗?

===============================================================================================================

你要是马上做，直接从-80拿出放在冰上即可，很快就会融化，不用专门融它，4度RNA容易降解
作者: 假小子    时间: 2011-9-14 13:50

我有一问题,希望高手们指点迷津,急!
为了检测引物合成的质量,把引物单独拿来跑胶,请问引物条带的亮度都和哪些因素有关
作者: 假小子    时间: 2011-9-14 13:50

我还有一个问题,是不是所有的PCR产物都可以用EB染色观察
作者: 王六六    时间: 2011-9-14 13:51

各位大虾：我请教大家一个问题，设计PT-PCR引物，酶切位点的选择也很重要吗？比如我的片段希望克隆到PGEX4T3表达载体中，引物我选用了ECOR1、XHOI位点，RT一直没结果，有位高手说ECORI位点不好，让我换成BAMHI位点，我需要重新设计引物吗？
作者: 麻瓜    时间: 2011-9-14 13:51

关于primer5.0,还有算号器 大家可以到中华检验网|软件下载|Primer Premier区下载该软件和补丁1、2，具体用法网上有说明，我已经成功下载了好几台机器了！
作者: 喵咪    时间: 2011-9-14 13:52

我还有一个问题,是不是所有的PCR产物都可以用EB染色观察

=================================================

应该是吧，不过不同片段长度用的琼脂糖胶的浓度不一样。
作者: 丸子妹    时间: 2011-9-14 13:52

各位大虾：我请教大家一个问题，设计PT-PCR引物，酶切位点的选择也很重要吗？比如我的片段希望克隆到PGEX4T3表达载体中，引物我选用了ECOR1、XHOI位点，RT一直没结果，有位高手说ECORI位点不好，让我换成BAMHI位点，我需要重新设计引物吗？

===============================================================================================================

应该不是酶切位点的问题。关键是你的引物除了酶切位点之外的部分与你的目的基因的同源性好不好的问题。所谓的酶切位点不好使说克隆的时候会不好连接，也有可能连接上了，但酶切不了，不能进行酶切检测重组子。
作者: @花开花落@    时间: 2011-9-14 13:53

应该不是酶切位点的问题。关键是你的引物除了酶切位点之外的部分与你的目的基因的同源性好不好的问题。所谓的酶切位点不好使说克隆的时候会不好连接，也有可能连接上了，但酶切不了，不能进行酶切检测重组子。

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多谢！今天的实验结果出来了，终于拉出目的片段了，看来关键还是退火温度呀！！！关于酶切位点的疑问我看懂了，至于能否酶切或连接，是不是只有看运气了？ECORI真的不好吗？难道没有人用这个位点？
作者: 跳跳糖    时间: 2011-9-14 13:53

今天我又提了一次，异丙醇沉淀后，什么都没有，真是郁闷死了！
其实我已经用BBI的试剂盒成功的提取到RNA ，只是实验对RNA 的要求比较高，我有PROGEMA 的试剂盒为了得到更高质量的RNA，可是却提不出来。而且以前用TRIZOL也没有提出来。我比较了这三种方法，其实除试剂盒本身的特点外，它们三种最大的区别就是TRIZOL和PROGEMA 的试剂盒是直接在培养瓶中裂解细胞，而BBI的试剂盒需要消化下来细胞在裂解，难道是细胞贴壁能力强，没有裂解下来吗？可是显微镜下没有看见流在壁上的细胞呀？什么原因哪？
朋友，如果您用过PROGEMA 的试剂盒，可不可以告诉我可能在哪个环节出了问题，或者是提取RNA更好的方法。
作者: Darcy    时间: 2011-9-14 13:53

请教各位：
1.我从组织中抽提的RNA,跑电泳有三条带，正常的不是两条吗？为什么是三条？三条比两条结果更好吗？
2.如果RNA跑电泳条带不清晰，有托尾现象是否说明RNA有降解？可以做PCR吗？
3.我们测RNA吸光度比值1.8-2.0之间，但电泳结果不好。可以做PCR吗？
测RNA吸光度比值不在此范围内，但电泳结果很好，可跑出两条带或三条 带，这样的标本可以做PCR吗？
作者: 阿拉蕾    时间: 2011-9-14 13:54

请教各位：
1.我从组织中抽提的RNA,跑电泳有三条带，正常的不是两条吗？为什么是三条？三条比两条结果更好吗？
2.如果RNA跑电泳条带不清晰，有托尾现象是否说明RNA有降解？可以做PCR吗？
3.我们测RNA吸光度比值1.8-2.0之间，但电泳结果不好。可以做PCR吗？
测RNA吸光度比值不在此范围内，但电泳结果很好，可跑出两条带或三条 带，这样的标本可以做PCR吗？

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1、分子量有大到小是：28S，18S，5S？要前条就足够了，并且28S要比18S亮度高出2倍，就证明PNA没有降解。
2、关于RNA的鉴定，我问过许多人，有的只跑电泳，有的只测OD值，OD值好的也不一定能做出来，不好的也不一定作不出来。我跑的是电泳，条带清晰，我就直接往下做了，经过PCR的反复调整，刚刚拉出目的片段。咱们专区有不错的RNA电泳图，你不妨对比一下，再决定是否做PCR。
作者: 花裙子    时间: 2011-9-14 13:54

请教各位：
请问有人做过cDNA的电泳吗？
我提RNA后跑电泳发现有三条带，做RT-PCR后，连内参都没有条带。我想看是RT的问题还是PCR的问题时，做了cDNA的电泳，但不知道的cDNA的电泳条带是怎么样的？请问有人做过cDNA的电泳吗？能不能发给cDNA的电泳图谱？非常感谢！
作者: 微笑的海豚    时间: 2011-9-14 13:55

目的片段最好是和管家基因分开p,虽然说服力不一定强,但是应该好跑.
作者: 米米    时间: 2011-9-14 13:55

各位高人啊，提取出来的RNA用depc水稀释后老是成琼脂糖一样的胶冻状，应该是水状吧，为什么？
作者: fangxiang    时间: 2011-9-14 13:56

各位高人啊，提取出来的RNA用depc水稀释后老是成琼脂糖一样的胶冻状，应该是水状吧，为什么？

胶冻状的是多糖啊
作者: 细水长流    时间: 2011-9-14 13:56

我以前用碱裂解或煮沸DNA时也出现过，好象蛋白太多了。不过你的RNA会不会RNA太多了，加水稀释呢？
作者: 冰激凌小姐    时间: 2011-9-14 13:56

我提完RNA，按照说明，应该保存很长时间，但是在做RT的时候，却发现有很大问题！
不知道是为什么？
作者: dior    时间: 2011-9-14 13:57

求助：请问哪位大虾有hTERT全长cDNA的质粒？我急需做转染用，可否赠送或购买？
作者: 去看海    时间: 2011-9-14 14:39

我提完RNA，按照说明，应该保存很长时间，但是在做RT的时候，却发现有很大问题！
不知道是为什么？
作者: 去看海    时间: 2011-9-14 14:39

我提完RNA，按照说明，应该保存很长时间，但是在做RT的时候，却发现有很大问题！
不知道是为什么？
作者: 小困    时间: 2011-9-14 14:51

我提出的RNA OD比值1.79，反转录出的cDNA可以扩出βacting，但是怎么不能扩出目的片断！引物的Tm值为56.6和57，另一组为57和61.5，用55退火没有特异条带，只有弥漫影。今天用52退火，还是这样，怎么办啊？
请帮忙分析一下吧！谢谢！
作者: 小困    时间: 2011-9-14 14:51

我的电泳图按亮度28s.18s 有，是离加样孔的第二·三条带，但是跑在靠近加样孔的条带是什么呀？不可能是5s.
作者: HOT兔    时间: 2011-9-14 14:52

我的电泳图按亮度28s.18s 有，是离加样孔的第二·三条带，但是跑在靠近加样孔的条带是什么呀？不可能是5s.

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离加样孔最近的带是基因组DNA，你可以用灭活RNA酶的DNA酶消化。  
作者: 大猫    时间: 2011-9-14 14:52

本人在作RT-PCR时遇到一情况，第一次作时就把两种目的基因作出，但按同样操作同样试剂重作，结果只跑出引物二聚体，我想不出原因，我没作过RNA定量，每次按2UL加。请大家帮忙，给我解答此问题。谢谢！也给我一个RNA电泳图吧？
作者: 胖小妮子    时间: 2011-9-14 14:54

我用trizol提取RNA然后做RT-PCR,但是只能p出500bp的产物，大于700bp的产物从来没有p出来过，我用的是华美的Taq酶，请教用什么方法能扩增出长片段的产物？
作者: 喵咪    时间: 2011-9-14 14:55

本人在作RT-PCR时遇到一情况，第一次作时就把两种目的基因作出，但按同样操作同样试剂重作，结果只跑出引物二聚体，我想不出原因，我没作过RNA定量，每次按2UL加。请大家帮忙，给我解答此问题。谢谢！也给我一个RNA电泳图吧？

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RNA的保存比较困难，我们放在-80冰箱中，PCR时一次不如一次产量高，时间长了就p不出来了
作者: 喵咪    时间: 2011-9-14 14:55

我提出的RNA OD比值1.79，反转录出的cDNA可以扩出βacting，但是怎么不能扩出目的片断！引物的Tm值为56.6和57，另一组为57和61.5，用55退火没有特异条带，只有弥漫影。今天用52退火，还是这样，怎么办啊？
请帮忙分析一下吧！谢谢！

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你的产物是多少bp?大于600不容易出来。我做的时候一般400 以下每次都可以出来
作者: 韩梅梅    时间: 2011-9-14 14:56

我提出的RNA OD比值1.79，反转录出的cDNA可以扩出βacting，但是怎么不能扩出目的片断！引物的Tm值为56.6和57，另一组为57和61.5，用55退火没有特异条带，只有弥漫影。今天用52退火，还是这样，怎么办啊？
请帮忙分析一下吧！谢谢！
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你的产物是多少bp?大于600不容易出来。我做的时候一般400 以下每次都可以出来。
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啊？真不幸，我扩的是820和700左右的，用的是MBI的反转录试剂盒合成第一链，再做PCR，不过PCR的taq酶是鼎国的，要不要换？打算买takara的试一下，再有就是引物的问题，上游引物错配比较高，3'端有连续7、8个碱基与其他部位互补，重要么？现在找不到原因，好着急啊
作者: 明天的明天    时间: 2011-9-14 14:56

以我做RT-PCR的经验，如果RNA提取没问题（三条带带型清楚），一般问题出在Taq酶和引物上面，鼎国的酶最好别用，如果买TaKaRa的酶，最好买那种Ex Taq，扩增1000bp以内应该没问题；再有就是你的引物，一般引物的3端最好不要有超过5连续个碱基有错配的，你可适当增长你的引物（35bp）以内都没问题  
作者: 小米虫子    时间: 2011-9-14 14:57

本人在作RT-PCR时遇到一情况，第一次作时就把两种目的基因作出，但按同样操作同样试剂重作，结果只跑出引物二聚体，我想不出原因，我没作过RNA定量，每次按2UL加。请大家帮忙，给我解答此问题。谢谢！也给我一个RNA电泳图吧？
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咱俩现遇到的境况一样，我想模板问题不大，因为我第二天重复结果就做不出来了，你现在想出对策了吗？请多交流。
作者: 椰子叶子    时间: 2011-9-14 15:03

啊？真不幸，我扩的是820和700左右的，用的是MBI的反转录试剂盒合成第一链，再做PCR，不过PCR的taq酶是鼎国的，要不要换？打算买takara的试一下，再有就是引物的问题，上游引物错配比较高，3'端有连续7、8个碱基与其他部位互补，重要么？现在找不到原因，好着急啊

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我认为是RNA的提取有问题，不是Taq的问题。一般的Taq扩增1000bp的片段是没有问题的。
作者: 花裙子    时间: 2011-9-14 15:04

离加样孔最近的带是基因组DNA，你可以用灭活RNA酶的DNA酶消化，另外RNA电泳图园子里有，仔细看看以前的帖子吧。

请问各位高手:灭活RNA酶的DNA酶如何得到？怎么消化？能说具体些吗？
作者: 丸子妹    时间: 2011-9-14 15:04

请教一个问题
50到100毫克组织每次大概能提出多少量的RNA？
作者: 丸子妹    时间: 2011-9-14 15:04

有没有那位师兄师姐用过Takara的DRR019A试剂盒,能谈谈对他反应体系的看法和体会马?
还有一个问题,我每做一次反转录要进行18次PCR,就是说我用同样的cDNA模板,要扩18个基因,所以,觉得这个盒子不是很理想!大家能给点意见吗??谢谢!
作者: 丸子妹    时间: 2011-9-14 15:05

ＲＮＡ酶活性的控制
　　为了获得高质量的真核细胞mＲＮＡ， 必须使用ＲＮＡ酶的抑制剂或采用下述的破碎细胞和灭活ＲＮＡ酶同步进行的方法，最大限度地降低细胞破碎过程中所释放的ＲＮＡ酶的活性。同时，避免偶然引入实验室内其他潜在的痕量ＲＮＡ酶也很重要。下面列举避免ＲＮＡ酶法染问题的一些注意事项。大多数有经验的研究者并不拘泥于这些注意事项，只是在遇到问题时可能采用其中的一种或几种方法加以解决。
　　如不谨慎操作，外源性ＲＮＡ酶可以通过下述途径污染ＲＮＡ制品：
（１）玻璃制品、塑料制品和电泳槽 灭菌的一次性使用的塑料制品基本上无ＲＮＡ酶，可以不经预处理直接用于制备和贮存ＲＮＡ。实验室用的普通玻璃器皿和塑料制品经常有ＲＮＡ酶法染，使用前必须于180 ℃干烤８小时或更长时间（玻璃器皿）或用氯仿冲洗（塑料制品）。另一种方法是用0.1 ％焦碳酸二乙酯（ＤＥＰＣ）的水溶液浸泡用于制备ＲＮＡ的烧杯，试管和其他用品。ＤＥＰＣ是ＲＮＡ酶的强烈抑制剂，但其作用并不是绝对的（Ｆedorcsak和Ehrenberg,1966）。灌满ＤＥＰＣ的玻璃或塑料器皿在37℃放置２小时，然后用灭菌水淋洗数次， 并于100℃干烤15分钟（Ｋumar和Ｌindberg,1972)。在15 lbf/in2(1.034x105Pa)高压蒸氯灭菌15分钟。上述处理可以除去器甲上痕量的ＤＥＰＣ，以防ＤＥＰＣ通过羧甲基化作用对ＲＮＡ的嘌呤碱基进行修饰。
　　羧甲基化的ＲＮＡ在无细胞体系中翻译效率很低，然而，除非其中大部分嘌呤碱基均被修饰，否则其形成ＤＮＡ：ＲＮＡ或ＲＮＡ：ＲＮＡ杂交休的能力并不明显降低。用于ＲＮＡ电泳的电泳槽应用去污剂洗干净，再用水冲洗，用乙醇干燥，然后灌满３％的Ｈ２Ｏ２溶液，于室温放置10分钟，然后用0.1 ％ＤＥＰＣ（见下文）处理过的水彻底冲洗电泳槽。最好能留出一些玻璃器皿、塑料制品和电泳槽作上特殊标记，存放在指定地点，为ＲＮＡ实验专用。
（２）研究人员造成的污染 ＲＮＡ酶最主要的潜在污染源是研究人员的手。因此，在准备分离的和分析ＲＮＡ的材料和溶液时，主有涉及ＲＮＡ的一切操作过程中，都应戴一次性手套，接触“胖的”玻璃器皿和其他物品以后，手套就可能沾染上ＲＮＡ酶，因此进行ＲＮＡ实验时应勤换手套。
（３）污染的溶液 用高压灭菌的水和ＲＮＡ研究专用的化学试剂配制溶液，用干烤过的药匙称取试剂，将溶液装入无ＲＮＡ酶的玻璃器皿。可能的话溶液均应用0.1％ＤＥＰＣ于37℃至少处理12小时，然后于100℃加热15分钟或在15lbf/in2(1.034x105Pa)的高压下蒸气灭菌15分钟。注：ＤＥＰＣ可与胺类迅速发生化学反应，因些不能用来处理含有Ｔris 一类的缓冲液。可存几瓶新的未开封的Ｔris晶体以制备无ＲＮＡ酶的溶液。
作者: 阿福    时间: 2011-9-14 15:06

请看看：
引物1:
up 5'CGAGGTGACCTGGGCACCATCCATCAC
lower 3'ctgctccaccttgggcttgcgacccac
引物2:
up 5'aaccctaaggccaaccgtgaaaag
lower 3'tcatgaggtagtctgtcaggt
引物设计是否合理。多谢！
作者: 阿福    时间: 2011-9-14 15:06

对了，我还想问问他们的Tm值？他们大于20bp
作者: finger    时间: 2011-9-14 15:07

兄弟们，我在设计引物时，两对引物的Tm值相差8度
请问在做RT-PCR时会有什么影响，如何处理？
谢谢!  
作者: guagua    时间: 2011-9-14 15:08

鼠肝取材可以取小块肝组织，用ＤＥＰＣ处理后的pbs冲洗后在２００目的纱布上制成细胞悬液，抽提mRNA
作者: 阿拉蕾    时间: 2011-9-14 15:08

弟们，我在设计引物时，两对引物的Tm值相差8度
请问在做RT-PCR时会有什么影响，如何处理？
谢谢!
很急！

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按低的减5度就可以了，我感觉RT-pcr对温度的要求不是很苛刻，我一般先用94-50-72，基本都是一条带，也可以用94-68两个温度，效果比前一个还好。
作者: finger    时间: 2011-9-14 15:09

谢谢这位仁兄!
按低的减5度是什么意思？
我的引物Tm值低的是51度，减5度是吗？
你用的是什么试剂盒?一步法还是两步法？
作者: finger    时间: 2011-9-14 15:09

按低的减5度就可以了，我感觉RT-pcr对温度的要求不是很苛刻，我一般先用94-50-72，基本都是一条带，也可以用94-68两个温度，效果比前一个还好。

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谢谢这位仁兄!
按低的减5度是什么意思？
我的引物Tm值低的是51度，减5度是吗？
你用的是什么试剂盒?一步法还是两步法？
：）
作者: finger    时间: 2011-9-14 15:09

各位战友：小弟有一个问题
我在做RT-PCR的时候，在同样的条件下，产生了两个结果，一个是特异性条带，而另一个除了有特异性条带外，还有一条非特异性条带。

图片附件: 87932952.jpg (2011-9-14 15:10, 14.48 KB) / 该附件被下载次数 17
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=8565

作者: 喵咪    时间: 2011-9-14 15:10

离加样孔最近的带是基因组DNA，你可以用灭活RNA酶的DNA酶消化，另外RNA电泳图园子里有，仔细看看以前的帖子吧。
请问各位高手:灭活RNA酶的DNA酶如何得到？怎么消化？能说具体些吗？

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到公司去买，我问的GENE公司15000单位卖1300元，我觉得太贵了，你再打听一下是否有便宜一点的，别望了发贴通知我。
作者: 喵咪    时间: 2011-9-14 15:11

各位战友：小弟有一个问题
我在做RT-PCR的时候，在同样的条件下，产生了两个结果，一个是特异性条带，而另一个除了有特异性条带外，还有一条非特异性条带。

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加样孔右边的是什么？最前面的带应该是引物二聚体吧。少加点引物试试？加样时也可能存在误差。
作者: jude    时间: 2011-9-14 15:12

各位高手好！我是刚开始做rt-pcr的,问题提的较幼稚.我是做组织的.请问各位的经验:是液氮提组织RNA好还是TRAIL好哪?
作者: 海鸥crazy    时间: 2011-9-14 15:14

大家好，我是新手，请大家多多照顾哦！

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我最近打算用RT－PCR的方法扩增HSP70,HSP27（热休克蛋白），不知道有人做过这个没有？请问在什么组织里面表达最高，有没有这方面比较成功的引物和实验方法技巧？万分感谢！
作者: 阿拉蕾    时间: 2011-9-14 15:15

请看看：
引物1:
up 5'CGAGGTGACCTGGGCACCATCCATCAC
lower 3'ctgctccaccttgggcttgcgacccac
引物2:
up 5'aaccctaaggccaaccgtgaaaag
lower 3'tcatgaggtagtctgtcaggt
引物设计是否合理。多谢！！！。

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建议使用primer 5 分析自己的引物
作者: loli    时间: 2011-9-14 15:16

有几个小问题请教：
1.我的几个引物均从不同文献查的，内参GADPH要哪个的好？
2.我做的样本少，试剂盒买哪个公司的合算？
谢谢！
作者: 麻瓜    时间: 2011-9-14 15:16

哪位高手帮帮忙啊！
我已开始做RT-PCR用的是一步法的试剂盒，做得还不错，可是五一回来后，就再也做不出来了，我以为是引物重新稀释的问题，可是，我将引物条回到原来的浓度，还是做不出来，我就用我的试剂盒，做了另外一个同学的样本（而且我同时也用了我的RNA) ，结果就出来带了，还很好，同时，我的同学用了他的两步法的试剂盒作了我的样本，也跑出了很好的带，这就说明我的RNA,我的试剂盒都没有问题，可是，我再做我的样本，还是不出带，到底问题出在哪呢？各位高手帮帮忙吧！好苦恼啊！
作者: 柠檬籽    时间: 2011-9-14 15:17

请教：我是PCR新新新新手，有时我觉得没做错什么，可是电泳后却没有丝毫的结果，包括阳性对照也没有条带，什么原因啊？赐教赐教！
作者: 糊涂虫    时间: 2011-9-14 15:17

我现在作R-PCR有几个问题，请专家帮忙解决一下
1）总RNA抽提出来的白色絮状物很难用DEPC5水溶解，一直呈团快状，请问是什么原因能，能用65度水浴吗
2）作PCR时，主要需要摸哪些条件，比如模板量，引物量，还有？模板量，引物量，还有pcr的条件怎么摸那
3）我在抽提时取肺组织50mg，请问是否需要很精确就得是50mg，如果取的不准确，会不会对以后的结果产生影响呢，比如RNA定量等
作者: 嗨皮    时间: 2011-9-14 15:18

大家好,我是刚开始做RT-PCR，作了一次没有任何结果。我做的是用重铬酸钾染毒人胚肺细胞，然后检测细胞中P53的变化。请问大家有人做这方面的
东西吗？如果有的话，请问你们做得电泳图如何？谢谢大家。  
作者: @木木@    时间: 2011-9-14 15:19

我现在作R-PCR有几个问题，请专家帮忙解决一下
1）总RNA抽提出来的白色絮状物很难用DEPC5水溶解，一直呈团快状，请问是什么原因能，能用65度水浴吗
2）作PCR时，主要需要摸哪些条件，比如模板量，引物量，还有？模板量，引物量，还有pcr的条件怎么摸那
3）我在抽提时取肺组织50mg，请问是否需要很精确就得是50mg，如果取的不准确，会不会对以后的结果产生影响呢，比如RNA定量等

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你好
1）一般是白色的团块，可以用65度的水浴，不过如果还不溶解或是胶冻状，那可能有蛋白污染，但主要是乙醇没有空干（我也是遇到好多次，经验总结），如果溶解了，需要测一下260/280的比值，如果是>1.8，还好应该是有DNA，<1.8，就是有蛋白！
2）摸条件主要是：TM值，一般都是试剂盒，它提供的条件应该是最优的。不过可以调节引物的浓度！
3)不会的，因为最后加的是总RNA的溶液，只要模扳量一样，就可以作定量！
作者: free    时间: 2011-9-14 15:19

如果，相同条件下，作了两次PCR ，可是没有任何PCR产物，只有引物二聚体。条件是按试剂盒说明来的，是否能说明模板中没有目的mRNA的表达，tm值已经是摸出来的啦！
同样PCR产物，第一次和第二次电泳条带不一样，第一次只有目的条带，而第二次除了有目的产物还有引物二聚体，这是为什么？
作者: 韩梅梅    时间: 2011-9-14 15:20

mxbdna2003，我已经用了inner control.我就是用housekeeping-gene来做inner control的，因为我有很多个样品，不同发育阶段的，所以我想先用housekeeping gene做PCR来调每个样品的起始模板量，等到每个样品用housekeeping gene primer扩出的产物经电泳后，每一条带的亮度一致以后，我再用同样的模板量以特异引物PCR。这样得到的结果我就当作是半定量的结果。可我调了2个多月了，还是调不一致，CDAN模板也降解了。所以现在我又要从头做起。头疼！
能否具体地告诉我该怎么做？万分感激！


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嗨，楼上的...
我给支一招完美的：

先用已经定量的RNA(假设为1ug/ul)1ul做模板，放入20ul体系进行逆转录，这样所得的cDNA可以认为与原始的RNA一致，所以cDNA浓度约为50ng/ul。

下一步，用GAPDH调节cDNA模板量：
1、将每管cDNA模板取5ul稀释至10ng/ul（若目的基因mRNA丰度太低可略去这一步）；
2、不管3721，每一样品均以10ng／1ul cDNA模板进行扩增（此处用25ul反应体系，注意循环数不可过多，最多30次，以确保PCR还在线性区），跑胶看看亮度；
3、不用说，GAPDH扩增的量是参差不齐的。不要紧，你有Quantity One软件你怕谁，用“Volume”功能将每一个GAPDH带都给定下量（具体数值）；
4、最后，根据上述定量值调整cDNA模板量，按比例换算就行了。

下面就不用说了，用重新计算、调整的cDNA模板来重做一次PCR(条件同前)，来验证上述工作的效果，看吧，扩出来的GAPDH绝对的均匀一致，误差不会超过10％的。

试试吧，能完美时，为什么不完美......
作者: 大仙    时间: 2011-9-14 15:20

离加样孔最近的带是基因组DNA，你可以用灭活RNA酶的DNA酶消化，另外RNA电泳图园子里有，仔细看看以前的帖子吧。

请问各位高手:灭活RNA酶的DNA酶如何得到？怎么消化？能说具体些吗？

到公司去买，我问的GENE公司15000单位卖1300元，我觉得太贵了，你再打听一下是否有便宜一点的，别望了发贴通知我。

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请问，既然电泳跑出18s 、28s条带，说明RNA已抽出，基因组DNA的存在会不会影响做RT-PCR的结果呢？如果不影响，也没必要进行消化了呀。
作者: finger    时间: 2011-9-14 15:21

如果，相同条件下，作了两次PCR ，可是没有任何PCR产物，只有引物二聚体。条件是按试剂盒说明来的，是否能说明模板中没有目的mRNA的表达，tm值已经是摸出来的啦！
同样PCR产物，第一次和第二次电泳条带不一样，第一次只有目的条带，而第二次除了有目的产物还有引物二聚体，这是为什么？
作者: finger    时间: 2011-9-14 15:21

你好
1）一般是白色的团块，可以用65度的水浴，不过如果还不溶解或是胶冻状，那可能有蛋白污染，但主要是乙醇没有空干（我也是遇到好多次，经验总结），如果溶解了，需要测一下260/280的比值，如果是>1.8，还好应该是有DNA，<1.8，就是有蛋白！
2）摸条件主要是：TM值，一般都是试剂盒，它提供的条件应该是最优的。不过可以调节引物的浓度！
3)不会的，因为最后加的是总RNA的溶液，只要模扳量一样，就可以作定量！
作者: finger    时间: 2011-9-14 15:22

如果，相同条件下，作了两次PCR ，可是没有任何PCR产物，只有引物二聚体。条件是按试剂盒说明来的，是否能说明模板中没有目的mRNA的表达，tm值已经是摸出来的啦！
同样PCR产物，第一次和第二次电泳条带不一样，第一次只有目的条带，而第二次除了有目的产物还有引物二聚体，这是为什么？
很急！
作者: 冰激凌小姐    时间: 2011-9-14 15:23

我想请问一下：移液器的怎么消毒呢，我做的结果现实A260/A280大于2.3怀疑是由于降解造成的，原因可能出在了移液器上，怎么处理呢  
作者: 哇啦    时间: 2011-9-14 15:23

大家好：
我在做RT后地PCR后，扩出了内含子？请问有造成这种情况有哪些原因？
谢谢！
作者: finger    时间: 2011-9-14 15:25

大家好：
我在做RT后地PCR后，扩出了内含子？请问有造成这种情况有哪些原因？
谢谢！

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应该是基因组DNA污染了你的模板
作者: finger    时间: 2011-9-14 15:26

我想请问一下：移液器的怎么消毒呢，我做的结果现实A260/A280大于2.3怀疑是由于降解造成的，原因可能出在了移液器上，怎么处理呢

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移液器怎么会有污染？
那肯定是不小心！
大于2.3不是降解造成的。因为核酸蛋白检测仪只是检测核苷酸的吸光光度值，即使降解也不会出现大于2的情况
作者: 荷塘青蛙！    时间: 2011-9-14 15:26

我做的rt-pcr引物27bp
252bp为阳性对照右侧
左侧是目的基因，什么都没有>!怎么回事〉？
出现的是什么东西？引物二聚体么？
谢谢！！！
作者: 荷塘青蛙！    时间: 2011-9-14 15:27

我的目的基因405bp
从缺口顺序为：别人的引物（403bp），我的引物，我的引物(DNA模板）（405bp），marker,我的引物.其他为RNA模板
作者: 荷塘青蛙！    时间: 2011-9-14 15:27

这是RNA情况，OD纯度没有问题，那问什么出现那条明亮的小于100bp的带？是什么呢？怎么改正/

作者: 蝴蝶结子    时间: 2011-9-14 15:30

这是RNA情况，OD纯度没有问题，那问什么出现那条明亮的小于100bp的带？是什么呢？怎么改正/

作者: 蝴蝶结子    时间: 2011-9-14 15:30

这是RNA情况，OD纯度没有问题，那问什么出现那条明亮的小于100bp的带？是什么呢？怎么改正/

作者: finger    时间: 2011-9-14 15:59

RT-PCR检测基因表达的问题讨论

　　关于RT-PCR技术方法的描述参见PCR技术应用进展， 在此主要讨论它在应用中的 问题。理论上1μL细胞质总RNA对稀有mRNA扩增是足够了（每个细胞有1个或几个拷 贝）。1μL差不多相当于50－100，000个典型哺乳动物细胞的细胞质中所含RNA的数 量，靶分子的数量通常大于50，000，因此扩增是很容易的。该方法所能检测的最低 靶分子的数量可能与通常的DNAPCR相同；例如它能检测出单个RNA分子。当已知量的 转录RNA（用T7RNA聚合酶体外合成）经一系列稀释，实验结果表明通过PCR的方法可 检测出10个分子或低于10个分子，这是反映其灵敏度的一个实例。用此技术现已从不 到1个philadelphia染色体阳性细胞株K562中检测到了白血病特异的MRNA的转录子。 因此没必要分离polyA+RNA，RNA/PCR法有足够的灵敏度来满足绝大多数实验条件的需 要。

　　将PCR缓冲液同时用于反转录酶反应和PCR反应，可简化实验步骤。我们发现整个 反应过程皆用PCR缓冲液的结果相当于或优于先用反转录缓冲液合成CDNA，然后PCR缓 冲液进行PCR扩增循环。当然，值得注意的是PCR缓冲液并不最适合第一条DNA链的合 成。我们对不同的缓冲液用于大片段DNA合成是否成功还没有进行过严格的研究。

　　反转录酶的选择似乎对实验方法成功与否并不十分重要。BRL和BOEHRINGERMANN HEIM的MULV反转录酶进行全面的研究，但没有理由认为来源可靠的反转录酶不能适用 于该方法。在研究中，我们仅使用了PERKINELMER/CETUS公司生产的TAQ聚合酶。

　　cDNA第一条链的合成可用不规则六聚体、寡聚(dT)或PCR下游引物来启动反应。 如果用寡聚(dT)，一般每次反应加0.1μL就够了。如果用下游寡核苷酸作为第一条链 的起始引物，10-50pmol最为理想。反转录反应以后，加入适量的上游和下游引物进 行PCR反应与用不规则六聚体方法一样。三种启动方法中无论用那一种最后得到的扩 增产物都同样理想。而加入不规则六聚体似乎更容易得到前后一致的结果，且靶序列 的合成量通常最多(E.S.K.)加入不规则六聚体方法一样。三种启动方法中无论用那一 种最后得到的扩增产物都同样理想。而加入不规则六聚体似站更容易得到事一致的结 果，且靶序列的合成量通常最多(E.S.K.未发表)。第一条链合成完毕，不必加碱或 RNA酶以除去RNA模板。95℃热处理使反转录酶失活，同时也使RNA-DNA杂合子变性。 不必加碱或RNA酶以除去RNA模板。95℃热处理使反转录酶失活，同时也使RNA-DNA杂 合子变性。残留的RNA模板似乎对PCR反应无干扰。
作者: finger    时间: 2011-9-14 16:01

RT-PCR检测基因表达的问题讨论

　　关于RT-PCR技术方法的描述参见PCR技术应用进展， 在此主要讨论它在应用中的 问题。理论上1μL细胞质总RNA对稀有mRNA扩增是足够了（每个细胞有1个或几个拷 贝）。1μL差不多相当于50－100，000个典型哺乳动物细胞的细胞质中所含RNA的数 量，靶分子的数量通常大于50，000，因此扩增是很容易的。该方法所能检测的最低 靶分子的数量可能与通常的DNAPCR相同；例如它能检测出单个RNA分子。当已知量的 转录RNA（用T7RNA聚合酶体外合成）经一系列稀释，实验结果表明通过PCR的方法可 检测出10个分子或低于10个分子，这是反映其灵敏度的一个实例。用此技术现已从不 到1个philadelphia染色体阳性细胞株K562中检测到了白血病特异的MRNA的转录子。 因此没必要分离polyA+RNA，RNA/PCR法有足够的灵敏度来满足绝大多数实验条件的需 要。

　　将PCR缓冲液同时用于反转录酶反应和PCR反应，可简化实验步骤。我们发现整个 反应过程皆用PCR缓冲液的结果相当于或优于先用反转录缓冲液合成CDNA，然后PCR缓 冲液进行PCR扩增循环。当然，值得注意的是PCR缓冲液并不最适合第一条DNA链的合 成。我们对不同的缓冲液用于大片段DNA合成是否成功还没有进行过严格的研究。

　　反转录酶的选择似乎对实验方法成功与否并不十分重要。BRL和BOEHRINGERMANN HEIM的MULV反转录酶进行全面的研究，但没有理由认为来源可靠的反转录酶不能适用 于该方法。在研究中，我们仅使用了PERKINELMER/CETUS公司生产的TAQ聚合酶。

　　cDNA第一条链的合成可用不规则六聚体、寡聚(dT)或PCR下游引物来启动反应。 如果用寡聚(dT)，一般每次反应加0.1μL就够了。如果用下游寡核苷酸作为第一条链 的起始引物，10-50pmol最为理想。反转录反应以后，加入适量的上游和下游引物进 行PCR反应与用不规则六聚体方法一样。三种启动方法中无论用那一种最后得到的扩 增产物都同样理想。而加入不规则六聚体似乎更容易得到前后一致的结果，且靶序列 的合成量通常最多(E.S.K.)加入不规则六聚体方法一样。三种启动方法中无论用那一 种最后得到的扩增产物都同样理想。而加入不规则六聚体似站更容易得到事一致的结 果，且靶序列的合成量通常最多(E.S.K.未发表)。第一条链合成完毕，不必加碱或 RNA酶以除去RNA模板。95℃热处理使反转录酶失活，同时也使RNA-DNA杂合子变性。 不必加碱或RNA酶以除去RNA模板。95℃热处理使反转录酶失活，同时也使RNA-DNA杂 合子变性。残留的RNA模板似乎对PCR反应无干扰。
作者: finger    时间: 2011-9-14 16:02

寻找使PCR反应产生良好扩增结果的最低浓度的寡核苷酸引物是十分重要的。我 们发现过量的引物通常会产生许多妨碍随后分析的额外扩增产物。浓度为5pmol的引 物可得到非常清晰及有效的扩增产物。当然，最好是找到你要扩增的每个序列的最佳 引物量。没有必要用全部的cDNA反应产物进行PCR扩增。可取等分量cDNA样品用几组 不同的引物作PCR分析;例如:一份cDNA反应物可用于研究几种不同类型的RNA。cDNA反 应物通常用PCR缓冲液衡释5倍。将cDNA的浓度隆低至0.2mM，此浓度更适于Taq聚合 酶。dNTP浓度不应超过0.2mM，因为较高浓度的dDTP使Taq聚合酶的错误掺入或突变率 增高。对于扩增来说，即使dNTP的浓度低到0.05mM也不会出现问题。

　　镁离子浓度对反应十分重要，因此应注意将镁的摩尔浓度保持恒定。有时核酸溶 于含1mMEDTA的缓冲液中，EDTA可歼螯合大多数镁离子。通常，PCR反应中游离镁离子 浓度应保持在2mM。

　　将PCRA循环次数减少，不可避免地产生许多非特异性的扩增产物。很容易将长度 不同的DNA的扩增。即使基因组序列得到扩增，当引物与大小不同的外显子结合时， 很容易将长度不同的MRNA与基因组的产物区别一来。如果不了解基因组的结构，选用 与5'编码基因间隔300-400bp的引物，脊椎动物的外显子很少大于300-400bp，因此很 容易从不同的外显子中导出引物。如果所研究的基因无内含子、或者研究完整原病毒 RNA转录，为了获得有关PCR的结果有必要用DNA酶彻底处理RNA。只要有很少量的基因 组DNA污染，用此方法分析就会出现假阳性结果。
作者: 橘子水儿    时间: 2011-9-14 16:03

该不是酶切位点的问题。关键是你的引物除了酶切位点之外的部分与你的目的基因的同源性好不好的问题。所谓的酶切位点不好使说克隆的时候会不好连接，也有可能连接上了，但酶切不了，不能进行酶切检测重组子。

=====================================================================================================

其实酶切结果和克隆的结果不一致，只要存在相当的酶切位点就可以得到相应的片段，但并不说明你的克隆完全正确，只好测序了
作者: 蓝蜗牛    时间: 2011-9-14 16:04

大鼠心脏中提取总mRNA后，检测MMP-2、-9和TIMP-1的表达量
其中MMP-2、-9的引物是参照外文文献上所提供的，摸了很多退火温度，但老也做不出来。不过内照还可以。
在 pubmed上对该引物评分后发现分数不理想，分别为40.1、38.6和40.1、36.2分。我是不是该换引物了。请高手多多指教。本人在此不甚感激。
作者: 丁香@@    时间: 2011-9-14 16:05

我听说SYBR的稳定性很差，有两周就降解了，是真的吗
作者: 喵咪    时间: 2011-9-14 16:06

到公司去买，我问的GENE公司15000单位卖1300元，我觉得太贵了，你再打听一下是否有便宜一点的，别望了发贴通知我。

=============================================================

我知道增健公司有卖的，150元，小包装的。
请问此酶如何进行消化呢？增健公司没有提供操作步骤。请您尽快法帖通知我，谢谢！
作者: 8黑眼圈8    时间: 2011-9-14 16:09

我要分离类风湿性关节炎关节腔积液的T 淋巴细胞用来作RT-PCR，不知道如何得到此淋巴细胞，请教各位！谢谢
作者: 丸子妹    时间: 2011-9-14 16:10

我要分离类风湿性关节炎关节腔积液的T 淋巴细胞用来作RT-PCR，不知道如何得到此淋巴细胞，请教各位！谢谢！
作者: 丸子妹    时间: 2011-9-14 16:11

请教!
我做SD大鼠肺组织的RT-PCR,需EGF引物,我在文献上查得下面几个:
sense primer 5-GTGGCGTGTGCATGTATGTT-3 (3357-3376)
antisense primer 5-CTCACGTTGCTGCTTGACTC-3 (3614-3633)
另外一个
forward primer 5-AGCAATTGGTGGTGGATG-3
reverse primer 5-ACTCTTTGCAAAAGTTGTC-3
鼠得全序列如下,如何验证?
LOCUS NM_012842 4801 bp mRNA linear ROD 24-DEC-2003
DEFINITION Rattus norvegicus epidermal growth factor (Egf), mRNA.
ACCESSION NM_012842
VERSION NM_012842.1 GI:6978796
KEYWORDS .
SOURCE Rattus norvegicus (Norway rat)
ORGANISM Rattus norvegicus
Eukaryota; Metazoa; Chordata; Craniata; Vertebrata; Euteleostomi;
Mammalia; Eutheria; Rodentia; Sciurognathi; Muridae; Murinae;
Rattus.
REFERENCE 1 (bases 1 to 4801)
AUTHORS Kawamata,T., Yamaguchi,T., Shin-ya,K. and Hori,T.
TITLE Divergence in signaling pathways involved in promotion of cell
viability mediated by bFGF, NGF, and EGF in PC12 cells
JOURNAL Neurochem. Res. 28 , 1221-1225 (2003)
PUBMED 12834262
REMARK GeneRIF: role in divergence in signaling pathways involved in
promotion of cell viability
REFERENCE 2 (bases 1 to 4801)
AUTHORS Limesand,K.H., Barzen,K.A., Quissell,D.O. and Anderson,S.M.
TITLE Synergistic suppression of apoptosis in salivary acinar cells by
IGF1 and EGF
JOURNAL Cell Death Differ. 10 (3), 345-355 (2003)
PUBMED 12700634
作者: 丸子妹    时间: 2011-9-14 16:11

REMARK GeneRIF: IGF1 and EGF synergistically suppress apoptosis in
salivary acinar cells
REFERENCE 3 (bases 1 to 4801)
AUTHORS Martinez,R. and Gomes,F.C.
TITLE Neuritogenesis induced by thyroid hormone-treated astrocytes is
mediated by epidermal growth factor/mitogen-activated protein
kinase-phosphatidylinositol 3-kinase pathways and involves
modulation of extracellular matrix proteins
JOURNAL J. Biol. Chem. 277 (51), 49311-49318 (2002)
PUBMED 12356760
REMARK GeneRIF: EGF plays a role in T3-induced cerebellar development in
astrocytes
REFERENCE 4 (bases 1 to 4801)
AUTHORS Pickett,C.A., Manning,N., Akita,Y. and Gutierrez-Hartmann,A.
TITLE Role of specific protein kinase C isozymes in mediating epidermal
growth factor, thyrotropin-releasing hormone, and phorbol ester
regulation of the rat prolactin promoter in GH4/GH4C1 pituitary
cells
JOURNAL Mol. Endocrinol. 16 (12), 2840-2852 (2002)
PUBMED 12456804
REMARK GeneRIF: both epidermal growth factor and thyrotropin releasing
hormone stimulated prolactin gene transcription appear to require
protein kinase C delta, whereas protein kinase C eta may also be
able to transmit the epidermal growth factor response
REFERENCE 5 (bases 1 to 4801)
AUTHORS Hallak,H., Moehren,G., Tang,J., Kaou,M., Addas,M., Hoek,J.B. and
Rubin,R.
TITLE Epidermal growth factor-induced activation of the insulin-like
growth factor I receptor in rat hepatocytes
JOURNAL Hepatology 36 , 1509-1518 (2002)
PUBMED 12447877
REMARK GeneRIF: EGF- and Src-mediated transactivation pathway for IGF-IR
activation in hepatocytes, and indicate a role for the IGF-IR in
hepatocyte intracellular signaling.
REFERENCE 6 (bases 1 to 4801)
作者: 丸子妹    时间: 2011-9-14 16:11

AUTHORS Fukamachi,K., Matsuoka,Y., Ohno,H., Hamaguchi,T. and Tsuda,H.
TITLE Neuronal leucine-rich repeat protein-3 amplifies MAPK activation by
epidermal growth factor through a carboxyl-terminal region
containing endocytosis motifs
JOURNAL J. Biol. Chem. 277 (46), 43549-43552 (2002)
PUBMED 12297494
REMARK GeneRIF: EGF is internalized into clathrin-coated vesicles by
NLRR-3, resulting in Ras-MAPK signaling
REFERENCE 7 (bases 1 to 4801)
AUTHORS LeBedis,C., Chen,K., Fallavollita,L., Boutros,T. and Brodt,P.
TITLE Peripheral lymph node stromal cells can promote growth and
tumorigenicity of breast carcinoma cells through the release of
IGF-I and EGF
JOURNAL Int. J. Cancer 100 (1), 2-8 (2002)
PUBMED 12115579
REMARK GeneRIF: lymph node stromal cell lines expressed mRNA transcripts
for IGF-I and EGF as major mitogenic factors which may contribute
actively to the process of cancer cell dissemination
REFERENCE 8 (bases 1 to 4801)
AUTHORS Thulesen,J., Bor,M.V., Thulesen,S., Nexo,E., Poulsen,S.S. and
Jorgensen,P.E.
TITLE Altered secretion and processing of epidermal growth factor in
adrenergic-induced growth of the rat submandibular gland
JOURNAL Regul. Pept. 106 (1-3), 105-114 (2002)
PUBMED 12047917
REMARK GeneRIF: isoproterenol treatment leads to a hyperstimulatory state
of granular convoluted tubule cells, which then causes depletion of
cellular stores of mature EGF, and most likely due to a shortened
posttranslational transit, incomplete peptide processing
REFERENCE 9 (bases 1 to 4801)
AUTHORS DiCamillo,S.J., Carreras,I., Panchenko,M.V., Stone,P.J.,
Nugent,M.A., Foster,J.A. and Panchenko,M.P.
TITLE Elastase-released epidermal growth factor recruits epidermal growth
factor receptor and extracellular signal-regulated kinases to
down-regulate tropoelastin mRNA in lung fibroblasts
JOURNAL J. Biol. Chem. 277 (21), 18938-18946 (2002)
PUBMED 11889128
REMARK GeneRIF: stimulation of recruits epidermal growth factor receptor
and extracellular signal-regulated kinases to down-regulate
tropoelastin mRNA in lung fibroblasts
REFERENCE 10 (bases 1 to 4801)
AUTHORS Yang,L.T., Alexandropoulos,K. and Sap,J.
TITLE c-SRC mediates neurite outgrowth through recruitment of Crk to the
scaffolding protein Sin/Efs without altering the kinetics of ERK
activation
JOURNAL J. Biol. Chem. 277 (20), 17406-17414 (2002)
PUBMED 11867627
作者: 丸子妹    时间: 2011-9-14 16:12

REMARK GeneRIF: epidermal growth factor (EGF) can be converted from a
non-neuritogenic into a neuritogenic factor through moderate
activation of endogenous SRC by receptor-protein-tyrosine
phosphatase alpha (a physiological SRC activator)
REFERENCE 11 (bases 1 to 4801)
AUTHORS Saggi,S.J., Safirstein,R. and Price,P.M.
TITLE Cloning and sequencing of the rat preproepidermal growth factor
cDNA: comparison with mouse and human sequences
JOURNAL DNA Cell Biol. 11 , 481-487 (1992)
PUBMED 1524680
COMMENT PROVISIONAL REFSEQ: This record has not yet been subject to final
NCBI review. The reference sequence was derived from U04842.1.
FEATURES Location/Qualifiers
source 1..4801
/organism="Rattus norvegicus"
/mol_type="mRNA"
/db_xref="taxon:10116"
/chromosome="2"
/map="2q42-q43"
gene 1..4801
/gene="Egf"
/db_xref="GeneID:25313"
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CDS 389..3790
/gene="Egf"
/note="go_component: membrane fraction [goid 0005624]
[evidence IEA];
go_component: membrane [goid 0016020] [evidence IEA];
go_component: integral to membrane [goid 0016021]
[evidence IEA];
go_component: extracellular space [goid 0005615] [evidence
IEA];
go_function: calcium ion binding [goid 0005509] [evidence
IEA];
作者: 丸子妹    时间: 2011-9-14 16:12

go_function: growth factor activity [goid 0008083]
[evidence IEA]"
/codon_start=1
/product="epidermal growth factor"
/protein_id="NP_036974.1"
/db_xref="GI:6978797"
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/db_xref="LocusID:25313"
/db_xref="RATMAP:41197"
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/translation="MLFSLTFLSVFLKITVLSVTAQQTRNCQSGPLERSGTTTYAAAG
PPRFLIFLQGNSIFRINTDGTNHQQLVVDAGVSVVMDFHYKEERLYWVDLERQLLQRV
FFNGSGQETVCKVDKNVSGLAINWIDGEILRTDRWKGVITVTDMNGNNSRVLLSSLKR
PANILVDPTERLIFWSSVVTGNLHRADLGGMDVKTLLEAPERISVLILDILDKRLFWA
QDGREGSHGYIHSCDYNGGSIHHIRHQARHDLLTMAIFGDKILYSALKEKAIWIADKH
TGKNVVRVNLDPASVPPRELRVVHLHAQPGTENRAQASDSERCKQRRGQCLYSLSERD
PNSDSSACAEGYTLSRDRKYCEDVNECALQNHGCTLGCENIPGSYYCTCPTGFVLLPD
GKRCHELVACPGNRSECSHDCILTSDGPLCICPAGSVLGKDGKTCTGCSFSDNGGCSQ
ICLPLSLASWECDCFPGYDLQLDRKSCAASMGPQPFLLFANSQDIRHMHFDGTDYKTL
LSRQMGMVFALDYDPVESKIYFAQTALKWIERANLDGSQRERRITEGVDTPEGLAVDW
IGRRIYWTDSGKSVIEGSDLSGKHHQIIIKESISRPRGIAVHPKARRLFWTDTGMSPR
IESSSLQGSDRTLIASSNLLEPSGIAIDYLTDTLYWCDTKLSVIEMADLDGSKRRRLT
QNDVGHPFSLAVFEDHVWFSDWAIPSVIRVNKRTGQNRVRLRGSMLKPSSLVVVHPLA
KPGADPCLHRNGGCEHICQESLGTAQCLCREGFVKAPDGKMCLTRKDDQILAGDNADL
SKEVASLDNSPKAYVPDDDRTESSTLVAEIMVSGLNYEDDCGPGGCGSHAHCISEGEA
AVCQCLKGFAGDGNLCSDIDECELGSSDCPPTSSRCINTEGGYVCQCSEGYEGDGIYC
LDVDECQQGSHGCSENATCTNTEGGYNCTCAGCPSAPGLPCPDSTSPSLLGKDGCHWV
RNSNTGCPPSYDGYCLNGGVCMYVESVDRYVCNCVIGYIGERCQHRDLRWWKLRHADY
GQRHDITVVSVCVVALALLLLLGMWGTYYYRTRKQLSESSKKPSEESSSNVSSNGPDS
SGAGVSSGPQPWFVVLEEHQQPKNGRLPAAGTNGAVVEAGLSSSL"
misc_feature <467..2080
/gene="Egf"
/note="KOG1215; Region: Low-density lipoprotein receptors
containing Ca2+-binding EGF-like domains [Signal
transduction mechanisms]"
/db_xref="CDD:19004"
misc_feature <1271..3199
/gene="Egf"
/note="KOG1215; Region: Low-density lipoprotein receptors
containing Ca2+-binding EGF-like domains [Signal
transduction mechanisms]"
/db_xref="CDD:19004"
misc_feature 1457..1576
作者: 丸子妹    时间: 2011-9-14 16:12

/gene="Egf"
/note="EGF_CA; Region: Calcium-binding EGF-like domain,
present in a large number of membrane-bound and
extracellular (mostly animal) proteins"
/db_xref="CDD:14791"
misc_feature 1904..2032
/gene="Egf"
/note="LY; Region: Low-density lipoprotein-receptor YWTD
domain"
/db_xref="CDD:22689"
misc_feature 2042..2161
/gene="Egf"
/note="LY; Region: Low-density lipoprotein-receptor YWTD
domain"
/db_xref="CDD:22689"
misc_feature 2162..2293
/gene="Egf"
/note="LY; Region: Low-density lipoprotein-receptor YWTD
domain"
/db_xref="CDD:22689"
misc_feature 2300..2422
/gene="Egf"
/note="LY; Region: Low-density lipoprotein-receptor YWTD
domain"
/db_xref="CDD:22689"
misc_feature <2888..>3445
/gene="Egf"
/note="KOG1217; Region: Fibrillins and related proteins
containing Ca2+-binding EGF-like domains [Signal
transduction mechanisms]"
/db_xref="CDD:19006"
misc_feature <3020..>3427
/gene="Egf"
/note="KOG1214; Region: Nidogen and related basement
membrane protein proteins [Cell wall/membrane/envelope
biogenesis, Extracellular structures]"
/db_xref="CDD:19003"
mat_peptide 3308..3466
作者: 丸子妹    时间: 2011-9-14 16:13

/gene="Egf"
/product="epidermal growth factor"
variation 2971..2979
/gene="Egf"
/note="Deleted in allele"
/replace=""
variation 3250..3252
/gene="Egf"
/note="Different sequence in allele"
/replace="ggt"
variation 3324..3326
/gene="Egf"
/note="Deleted in allele"
/replace=""
polyA_signal 4784..4789
/gene="Egf"
polyA_site 4801
/gene="Egf"
ORIGIN
1 caaaaggaga agccatcagg gaaggaatcc tatctgcata tttcgtcttt agccccatcc
61 ctcattcccg gtggggtttg gaactttcca tcaattcttt ccctgtctca tttctctttg
121 agcctttgcc tagctgtgcc tgtcacagcg agaaatcagt caccctccgc cttccagcac
181 tcttaggctc tgagaaattt ggcatacggg tgtcaggtat taaaacagct aaataaaaga
241 tgccctgggg ctgaaggcca gcgtggctgg aagttctggg ggtcagaagc ctgactccgc
301 ctgctccaag ctctagcaat ttaagtcacc cgggggtttt ttgttttggt ttggtttggt
361 ttttcttgac cttagaacca ccgagaccat gctgttctcg ctcaccttcc tgtcggtgtt
421 tttaaagatt actgtactca gtgtcacagc acagcagacc aggaactgtc agtcaggtcc
481 tctcgagaga agcgggacta ccacgtatgc cgccgccggt cctcccaggt tcctgatttt
541 cttacaagga aacagcatct ttcggattaa cacagatgga acaaatcacc agcaattggt
601 ggtggatgcc ggcgtctcag tggtcatgga ttttcattac aaggaagaga gactctattg
661 ggtggattta gaaagacaac ttttgcaaag agttttcttt aatgggtcag gacaagagac
721 agtgtgcaag gtggataaga atgtgtctgg gctggccata aactggatag atggggagat
781 tctccggacg gaccgatgga agggagtcat cacagtaaca gatatgaacg ggaacaattc
841 ccgtgttctt ctgagttcct taaaacgtcc tgcaaatata ttagtggatc caacagagag
901 gttgatattt tggtcttcag tggtgactgg caaccttcac agagcagatc tcgggggtat
961 ggatgtaaaa acactgctgg aggcaccaga gaggatatca gtgctgattc tggatatcct
1021 ggacaaaagg ctcttctggg ctcaggacgg tagagaagga agccacggtt acattcactc
1081 ctgtgactat aacggtggct ccatccatca tatcagacat caagcacggc acgatttgct
1141 tactatggcc attttcggtg acaagatctt atactcagca ctgaaagaga aggcgatttg
1201 gatagccgac aaacacactg ggaagaatgt ggttcgagtt aacctcgatc cagcctctgt
1261 gccgccaaga gaactgagag tcgtgcacct acatgcacag cccgggacag agaaccgtgc
1321 tcaggcctct gactccgaac gatgcaaaca gagaagagga cagtgtctct acagtctctc
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1441 ccggaagtac tgcgaagatg tcaatgagtg tgccttgcag aatcacggct gtactcttgg
1501 gtgtgaaaac atccctggat cctattactg cacatgccct acaggctttg ttctgcttcc
1561 tgatgggaaa cgatgtcacg aacttgttgc ctgtccaggc aacagatcag agtgtagcca
作者: 丸子妹    时间: 2011-9-14 16:13

1621 tgattgcatc ctgacatcag atggtcctct gtgcatctgt ccagcaggtt cagtgctcgg
1681 aaaagatggg aagacatgca ctggttgttc cttctccgat aatggtggat gcagccagat
1741 ctgccttcct ctcagcctag catcctggga atgtgattgc tttcctgggt acgacctaca
1801 attggaccga aagagctgtg cagcttccat gggaccgcag ccatttttac tgtttgcaaa
1861 ttcccaggac atacgacaca tgcattttga tggaacagac tacaaaactc tgctcagccg
1921 gcagatggga atggtttttg ccttggatta tgaccccgtg gaaagcaaga tatattttgc
1981 acagacagcc ctgaagtgga tagagagggc taatctggat ggctcccagc gagaaagacg
2041 gatcacggaa ggagtagaca cgccagaagg tcttgccgtg gactggattg gccggagaat
2101 ctactggacg gacagtggga agtctgtcat tgaagggagt gatttgagcg ggaagcatca
2161 tcaaataatc atcaaagaga gcatctcaag gccacgagga atagctgtgc atccaaaggc
2221 caggagacta ttctggacgg acacggggat gtctccgcgg attgaaagct cttcccttca
2281 aggttctgac cggacgctga tagccagctc taatctactg gaacccagtg gaatcgcgat
2341 tgactactta acagacactt tgtactggtg tgacaccaag ctgtctgtga ttgaaatggc
2401 cgatctagat ggttccaaac gccgcagact tacccagaac gatgtaggtc acccattctc
2461 tctagctgtg tttgaggatc acgtgtggtt ctcggattgg gctatcccat cggtaataag
2521 ggtgaacaag aggactggtc aaaacagggt acgtctccga ggcagcatgc tgaagccctc
2581 gtcactggtt gtggtccacc cattggcaaa accaggtgca gacccctgct tacacaggaa
2641 tggaggctgt gaacacatct gccaagagag cctgggcacg gctcagtgtc tgtgtcggga
2701 aggattcgtg aaggccccag atgggaaaat gtgtctcact cggaaggatg atcagatact
2761 ggccggtgac aatgctgatc ttagtaaaga ggtggcatcg ttggacaact cccctaaggc
2821 ttatgtacca gacgatgata ggacagagtc ctccacacta gtggctgaga tcatggtgtc
2881 agggctgaac tatgaagatg actgcggccc tggtgggtgt ggcagccatg cccactgtat
2941 ttcagaggga gaggcagctg tgtgtcagtg tttgaaagga tttgctggcg atggaaacct
3001 gtgttctgat atagacgaat gtgagctggg tagctcagac tgtcctccca cctcgtccag
3061 gtgcatcaac accgaaggtg gctatgtctg ccaatgctca gaaggctacg agggagatgg
3121 gatctactgt ctcgacgttg atgagtgcca gcaggggtcg cacggctgca gcgagaatgc
3181 cacctgcacc aacacggagg gaggctacaa ctgcacctgt gcaggctgcc catcagcacc
3241 tggactgcct tgccctgact ctacctcacc ctctctcctt ggaaaagatg gctgccactg
3301 ggtccgaaac agtaacacag gatgcccgcc gtcgtacgat gggtactgcc tcaatggtgg
3361 cgtgtgcatg tatgttgaat ccgtggaccg ctacgtgtgc aactgtgtca ttggctatat
3421 tggagaacga tgtcagcacc gagacttacg ttggtggaag ctgcgccatg ctgactacgg
3481 gcagaggcac gacatcactg tggtgtctgt ctgtgtggtg gcgctggccc tgctgctcct
3541 cttagggatg tgggggactt actactacag gactcggaag cagctatcag agagctcaaa
3601 gaagccttcc gaagagtcaa gcagcaacgt gagcagtaac gggcctgaca gcagcggggc
3661 tggggtgtct tctggtcccc aaccttggtt tgtggtccta gaggaacacc aacagcccaa
3721 gaatgggcgt ctgcctgccg ctggcacgaa cggcgcagta gtagaggctg gcctgtcttc
3781 ctccctgtaa ctcgggccag tgcacctgac ttcctggaga cagaagcccc gaatatatga
3841 gatgggcaca gagcaaagct gctggattcc accatcaaat gacaaaggac cccaggaaat
3901 ggaggggaac ccccacttac cctcctacag ggaatggcct ctagctgtgt gggctgagaa
3961 gaagctgcat tctctccagt cagctaatgg atcgagtcaa caaagggcct cagacctgcc
4021 ccagcaaaca gagccagttc tgtagaaact gggagcagac agaaggtacc gaaagtgaaa
4081 tagcaaacca ggctgaaggg tggtagagcg gcagatctgg tactcctgtc tccacggcta
4141 atcactgctc agggtcctga agataactgc atagctgcat agctgatagc cgcgacttct
4201 gcttcttgct tcaagcagtc ccgttgaaga cgatcaaaag agaagtggag aaaaatcatc
4261 agaaaccgaa gtcaagacgg ttcacgtgtg taagctgtgt ccttcctacc cctggactgt
4321 tgggctcttt tccttgttgt ctcagaagaa atgggttaaa gcaggcgatc acatgctttg
4381 ttgattgcac agtagatgat atgatctaca tagatcttag ctcactctca cggaaaggct
4441 ggaacattat agatgctgca agatacactg caagtgtggc ccctgctcat aattttgcct
4501 tctgaattgt gattagtgaa aataattgta acttagagtc cgatttattc agaatcagag
4561 cattattttt atactatgaa aatctttgaa tgaagatatt taactttaaa aacatttcct
4621 aagagacaac agtgtttctt aatcattgtc ttttcttctt gcagtctttc ccagtgaaaa
4681 cggtaaattc tgctgtttgc atagaatctt taacttattt ttaagatatg agattgtaaa
4741 caaattgctt gatttatttc aatcaattta ttctaattat ttaaataaaa tcacccctaa
4801 g
//
作者: finger    时间: 2011-9-14 16:15

大鼠心脏中提取总mRNA后，检测MMP-2、-9和TIMP-1的表达量
其中MMP-2、-9的引物是参照外文文献上所提供的，摸了很多退火温度，但老也做不出来。不过内照还可以。
在 pubmed上对该引物评分后发现分数不理想，分别为40.1、38.6和40.1、36.2分。我是不是该换引物了。请高手多多指教。

==============================================================================

可能是引物的问题，不要轻易相信别人的引物，尤其是国内的，自己设计一下，用软件，不麻烦！
作者: finger    时间: 2011-9-14 16:15

我做的rt-pcr引物27bp
252bp为阳性对照右侧
左侧是目的基因，什么都没有>!怎么回事〉？
出现的是什么东西？引物二聚体么？
谢谢！！！

===============================================

像是引物二聚体，可是，你用多大的电压，胶的浓度是多少？
作者: finger    时间: 2011-9-14 16:16

这个没加marker,
为什么会这样，请帮帮我！！！多谢！！！

==============

你的问题很模糊！？
作者: finger    时间: 2011-9-14 16:17

请教!
我做SD大鼠肺组织的RT-PCR,需EGF引物,我在文献上查得下面几个:
sense primer 5-GTGGCGTGTGCATGTATGTT-3 (3357-3376)
antisense primer 5-CTCACGTTGCTGCTTGACTC-3 (3614-3633)
另外一个
forward primer 5-AGCAATTGGTGGTGGATG-3
reverse primer 5-ACTCTTTGCAAAAGTTGTC-3
鼠得全序列如下,如何验证?
LOCUS NM_012842 4801 bp mRNA linear ROD 24-DEC-2003
DEFINITION Rattus norvegicus epidermal growth factor (Egf), mRNA.
ACCESSION NM_012842
VERSION NM_012842.1 GI:6978796
KEYWORDS .
SOURCE Rattus norvegicus (Norway rat)
ORGANISM Rattus norvegicus
Eukaryota; Metazoa; Chordata; Craniata; Vertebrata; Euteleostomi;
Mammalia; Eutheria; Rodentia; Sciurognathi; Muridae; Murinae;
Rattus.
REFERENCE 1 (bases 1 to 4801)
AUTHORS Kawamata,T., Yamaguchi,T., Shin-ya,K. and Hori,T.
TITLE Divergence in signaling pathways involved in promotion of cell
viability mediated by bFGF, NGF, and EGF in PC12 cells
JOURNAL Neurochem. Res. 28 , 1221-1225 (2003)
PUBMED 12834262
REMARK GeneRIF: role in divergence in signaling pathways involved in
promotion of cell viability
REFERENCE 2 (bases 1 to 4801)
AUTHORS Limesand,K.H., Barzen,K.A., Quissell,D.O. and Anderson,S.M.
......

===================================================

用PRIMER PRIMER5 软件，把引物序列输进去，看看匹配度！  
作者: 飞天小鹿    时间: 2011-9-14 16:26

请问那位老兄知道提取小量细胞(<10000)RNA的方法？请告知详情？
作者: finger    时间: 2011-9-14 16:33

请问那位老兄知道提取小量细胞(<10000)RNA的方法？请告知详情？
一位初学者。

==================

可以用TRIZOL来提
见说明书就行！
作者: finger    时间: 2011-9-14 16:34

下面是我RT-PCR 扩增条带，在目的条带上面有一些条带，不知道是什么，求助！
（左边两条泳道）

图片附件: 54637279.jpg (2011-9-14 16:34, 8.91 KB) / 该附件被下载次数 8
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=8566

作者: 章鱼小丸子    时间: 2011-9-14 16:35

向版主和各位高手求救:我做的rt-pcr两步法,怎么调节条件都是弥散性条带,自上而下逐渐变浅,连成一片,刚换的新引物,但引物铀来时在常温放了一天多,会不会有问题呀.
请赐教!
作者: 格格巫    时间: 2011-9-14 16:35

请问:谁有primer 5.0软件,我下不到呀,请帮忙发给我一个,谢谢了.
作者: 阿拉蕾    时间: 2011-9-14 16:36

向版主和各位高手求救:我做的rt-pcr两步法,怎么调节条件都是弥散性条带,自上而下逐渐变浅,连成一片,刚换的新引物,但引物铀来时在常温放了一天多,会不会有问题呀.
请赐教!

===============================

不会的，来的时候都是常温！
但溶解后，就要放在冰箱里了！是-20度里
作者: 我是一片云    时间: 2011-9-14 16:38

向版主和各位高手求救:我做的rt-pcr两步法,怎么调节条件都是弥散性条带,自上而下逐渐变浅,连成一片,刚换的新引物,但引物铀来时在常温放了一天多,会不会有问题呀.
请赐教!
作者: 荷塘青蛙！    时间: 2011-9-14 16:41

谢谢! 感谢赐教,如果不是引物问题那是我的试验条件问题了?我用cDAN 6微升,MMLV酶3个单位,镁浓度1MOL/L,退火56度,循环30次,仍是弥散性条带,不知该改那些条件,请各位给予建议.不胜感激
作者: 微笑的海豚    时间: 2011-9-14 16:42

一、RT-PCR
1. cDNA产量的很低
可能的原因：
*RNA模板质量低
*对mRNA浓度估计过高
*反应体系中存在反转录酶抑制剂或反转录酶量不足
*同位素磷32过期
*反应体积过大，不应超过50μl


2. 扩增产物在电泳分析时没有条带或条带很浅
*最常见的原因在于您的反应体系是PCR的反应体系而不是RT-PCR的反应体系
*与反应起始时RNA的总量及纯度有关
*建议在试验中加入对照RNA
*第一链的反应产物在进行PCR扩增时，在总的反应体系中的含量不要超过1/10
*建议用Oligo(dT)或随机引物代替基因特异性引物（GSP）用于第一链合成。由于RNA模板存在二级结构，如环状结果，有可能导致GSP无法与模板退火；或SSⅡ反转录酶无法从此引物进行有效延伸。
*目的mRNA中含有强的转录中止位点，可以试用以下方法解决：
a. 将第一链的反应温度提高至50℃。
b. 使用随机六聚体代替Oligo(dT)进行第一链反应。
作者: 微笑的海豚    时间: 2011-9-14 16:43

3. 产生非特异性条带
*用RT阴性对照检测是否被基因组DNA污染。如果RT阴性对照的PCR结果也显示同样条带，则需要用DNase I重新处理样品。
*在PCR反应中，非特异的起始扩增将导致产生非特异性结果。在低于引物Tm 2至5℃的温度下进行退火，降低镁离子或是目的DNA的量将减少非特异性结果的产生。
*由于mRNA剪切方式的不同，根据选择引物的不同将导致产生不同的RT-PCR结果。


4. 产生弥散（smear）条带
*在PCR反应体系中第一链产物的含量过高
*减少引物的用量
*优化PCR反应条件/减少PCR的循环次数
*在用DNase处理被DNA污染的RNA样品时，其产生的寡核苷酸片段会产生非特异性扩增，一般会显示为弥散背景。


5. 产生大分子量的弥散条带
*大多数情况下是由于退火温度过低而导致的非特异性的起始及延伸产生的
*对于长片段的PCR，建议将反应体系中cDNA的浓度稀释至1:10（或1:100-1:200）


6. 在无反转录酶的情况下，对照RNA获得扩增结果
*通常是由于对照RNA中含有痕量DNA而导致的。由于进行体外转录时不可能将所有的DNA模板消除。建议可将第一链cDNA稀释1:10、1:100、1:1000倍以消除DNA污染所造成的影响。
*有可能是引物二聚体的条带


7. 扩增产物滞留在加样孔中
*有可能是由于模板量过高而导致PCR结果产生了高分子量的DNA胶状物。建议将第一链结果至少稀释100倍再进行二次扩增。
*另外，在二次PCR时使用的退火温度如果比引物的Tm值低5℃，可以将退火温度适当增高或进行热启动以提高特异性。


8. SSⅢ与SSⅡ有何不同？
*具有更高的热稳定性（达50℃）
*具有更长的半衰期（达220分钟）
*对PCR无抑制
*干冰运输
*Tdt活性更低
SuperScriptⅢ反转录酶

9. 为什么有人更喜欢用SSⅢ而不是ThermoScript？
ThermoScript如果保存不当会引起活性很快降低，SSⅢ则更稳定。


10. 为什么使用基因特异性引物（GSP）？
GSP在扩增低丰度的转录本时是最好的。OligodT引物建议用于高质量RNA及全长转录本的逆转录；随机引物用于mRNA片段的逆转录。


11. 什么情况下需要使用RNase H？
在第一轮PCR中RNA/DNA杂合体不能正常变性时
作者: 微笑的海豚    时间: 2011-9-14 16:44

12. 根据不同的目的选择不同的系统：
目的 建议
RT与PCR使用不同的引物
或需要灵活选择PCR DNA聚合酶 两步法RT-PCR系统
高灵敏度 一步法或两步法RT-PCR系统
高特异性 含有适当的DNA聚合酶的两步法RT-PCR系统
或具有高保真Platinum Taq酶的一步法RT-PCR系统
高保真度 含有Pfx Taq酶的两步法RT-PCR系统
长的反转录结果 通常使用两步法RT-PCR系统可达到最佳结果
含Elongase酶的一步法RT-PCR系统
二、Generacer
1. 如何针对Generacer试剂盒设计基因特异性引物（GSP）？
使用5’或3’RACE试剂都需要至少一条基因特异性引物，您在设计引物时需要注意以下几点要求：
*50-70％的GC含量，以提高引物熔点（Tm）
*23-28个碱基长度，以提高引物特异性
*降低3’端GC含量，将引物非特异性结合的可能性降至最低


2. 为什么得不到RACE产物？
*加入Hela对照
*低质量的RNA模板
*逆转录失败，SSII和SSIII非常适用于长模板cDNA的合成
*目的基因丰度太低，可以通过提高PCR的循环次数来解决，建议使用巢式PCR
*目的基因没有表达，可以通过使用两条GSPs来分析cDNA中是否含有目的基因
*目的基因太长而不适合进行反转录，建议使用GeneRacer试剂盒中的Oligo dT来得到全长cDNA，使用随机引物或与模板的5’端尽可能近的GSP进行PCR。
*cDNA模板属于困难模板，可以通过以下方法解决：优化PCR反应参数及反应体系；降低退火温度；使用5-10％的DMSO帮助通过高GC含量区；使用高保真度和高延伸能力的酶进行PCR反应。


3. RACE的PCR结果有杂带
RACE PCR杂带或非特异性PCR条带可能是由于以下原因：
*GSP与其他cDNA的非特异性结合会导致在扩增目的产物时得到无关产物。
*GeneRacer引物和cDNA的非特异性结合会导致产生一端带有GeneRacer引物序列的PCR产物。
*RNA降解。
*PCR管或试剂污染。
注意：杂带一般是因为没有优化PCR条件，可以加入阴性对照来确定。
作者: 微笑的海豚    时间: 2011-9-14 16:46

4. 得不到全长的5’RACE PCR产物
*CIP反应后的RNA降解产生了新的带有5’磷酸的断裂模板，可以同GeneRacer RNA Oligo连接。一定要小心操作，保证RNA无降解。
*CIP脱磷酸不完全，可以增加反应中CIP的量或减少RNA的量。
*PCR产生了杂带，并不是真正的连接产物，可以使用上述建议优化PCR。

三、PCR

在进行PCR时：
*请确保您没有使用过量的起始DNA或者过高浓度的引物，也没有加入过量的Mg++
*请确保您使用了恰当的退火温度
*请确保您没有使用过量的DNA聚合酶

四、引物
1. 应该选择哪种纯化方法？
取决于实验目的和引物的长度


2. 为什么我订购了50nmol，但是收到却只有40nmol？
50nmol是起始量


3. 怎样制备100μM的储液？
体积（μl）=质检报告上的nmol数目×10


4. 怎样设计引物？
*一般长度20-30bp；
*至少50%的GC含量；
*避免引物二聚体和二级结构；
*引物对的Tm值应该接近。


5. 引物序列有插入或缺失？
*使用上游和下游引物多测几个克隆。
*请选择正确的纯化方法。


6. PCR无结果？
*请检查引物设计是否正确；
*请检测OD读数是否正确；
*做一个阳性对照和一个阴性对照。
作者: 七彩星星    时间: 2011-9-14 16:47

本人在作RT-PCR时遇到一情况，第一次作时就把两种目的基因作出，但按同样操作同样试剂重作，结果只跑出引物二聚体，我想不出原因，我没作过RNA定量，每次按2UL加。请大家帮忙，给我解答此问题。谢谢！也给我一个RNA电泳图吧？

RT-PCR的重复性不好，你要有思想准备，RNA要定量，否则你在rt时就没有依据，不知道改加多少模板量，而且后面条件的摸索都要求你先有一个确定的模板量
作者: 饭团团    时间: 2011-9-14 16:47

我从文献查的引物，发现样本的引物和内参的引物TM温度差别很大，内参是66度，而样本是58度，我又想同管扩增，不知道我该怎么处理呢？
作者: 饭团团    时间: 2011-9-14 16:48

我抽提的总RNA后，用DEPC水溶解后有时出现成凝胶状，用移液器也取不出来，怎么会有这种情况呢？
作者: 饭团团    时间: 2011-9-14 16:48

又谁能给我讲讲PCR这步摸条件到底什么是最重要的呢，是模板量，还是循环次数，还是引物加样量？该是怎么个顺序呢？
作者: HOT兔    时间: 2011-9-14 16:48

pcr扩增时，同管扩和分管扩哪种方法好呢，有什么区别呢？
作者: Darcy    时间: 2011-9-14 16:49

（我用cDAN 6微升,MMLV酶3个单位,镁浓度1MOL/L,退火56度,循环30次,仍是弥散性条带）有一点我不明白,就是有弥散性条带,我扩增的片断部分应该有加深呀,为什么一点比其他条带浓重的显示都没有呀  
作者: 蒲公英    时间: 2011-9-14 16:50

请问各位高手:primer软件中,我得机器码是97,激活密码应该是多少?
拜托了!
作者: 胖小妮子    时间: 2011-9-14 16:50

请教高手：我想用primer5.0验证引物,机器码和激活码都输进去后显示无效密码,但我得密码是算号器产生得呀,怎么办,如何才能完全激活?使用?
作者: 开心蔬菜帮    时间: 2011-9-14 16:51

我今天用cDAN 6微升,MMLV酶2个单位,镁浓度1MOL/L,退火61度,循环30次,仍是弥散性条带,怎么搞的,我要活不下去了,救救我呀!请问会不会与引物量多有关?,我用的引物终浓度0.2μmol/l,也不高呀.cDNA(20微升体系)我用6微升,会不会多了,按说弥散性条带的产生与此无关呀?我不知道了,各位神仙救命呀!!  
作者: 米米    时间: 2011-9-14 16:52

我今天用cDAN 6微升,MMLV酶2个单位,镁浓度1MOL/L,退火61度,循环30次,仍是弥散性条带,怎么搞的,我要活不下去了,救救我呀!请问会不会与引物量多有关?,我用的引物终浓度0.2μmol/l,也不高呀.cDNA(20微升体系)我用6微升,会不会多了,按说弥散性条带的产生与此无关呀?我不知道了,各位神仙救命呀!!

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奇怪，你是做得RT,还是PCR?怎么用的是cDNA,酶却用MMLV酶，搞不明白，是写错了，还是加错了？
作者: 韩梅梅    时间: 2011-9-14 16:53

请问各位高手:primer软件中,我得机器码是97,激活密码应该是多少?
拜托了!

=============

7945
作者: 椰子叶子    时间: 2011-9-14 16:54

请教高手：我想用primer5.0验证引物,机器码和激活码都输进去后显示无效密码,但我得密码是算号器产生得呀,怎么办,如何才能完全激活?使用?

========================================

如果还不行，可能是下载的版本不对，重下载一个
作者: 开心蔬菜帮    时间: 2011-9-14 16:54

我今天用cDAN 6微升,taq酶2个单位,镁浓度1MOL/L,退火61度,循环30次,仍是弥散性条带,怎么搞的,我要活不下去了,救救我呀!请问会不会与引物量多有关?,我用的引物终浓度0.2μmol/l,也不高呀.cDNA(20微升体系)我用6微升,会不会多了,按说弥散性条带的产生与此无关呀?我不知道了,各位神仙救命呀!!
上一次是写错了,是taq酶,我今天发现个奇怪的现象,我的琼脂糖电泳跑的样品比marker跑的慢,明显的样品的溴酚兰滞后,不知如何解释,我今天稀释了cDAN 1:10,和1:100,加1微升稀释的cDAN,可惜仍是弥散条带,只是稀释过的似乎跑的电泳滞后性小一些,不知有没有人遇到过这种现象,请指教一二
作者: 阿拉蕾    时间: 2011-9-14 16:55

我提出的RNA OD比值1.79，反转录出的cDNA可以扩出βacting，但是怎么不能扩出目的片断！引物的Tm值为56.6和57，另一组为57和61.5，用55退火没有特异条带，只有弥漫影。今天用52退火，还是这样，怎么办啊？
请帮忙分析一下吧！谢谢！

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可以再把温度降低一点啊，比如说50度啊，你用的是试剂盒吗？如果不是的话还可以调整Mg2+的浓度，加入优化剂如DMSO等增加taq酶的特异性试试看。或者可以做个降落pcr试试看有没有你要的目的片断，如果还是没有的话那就可能不是退火温度的问题了，还是不行的话就考虑换个引物看看了。：（
作者: dior    时间: 2011-9-14 16:57

急!!!救命呀!!!
我得primer5.0不能用,机器码和激活码都输进去还是不行(我得机器码是97,激活码应该是7945没错吧?)如果是版本得问题,那在哪里可下到确实好用的?或者哪位好心的大侠帮我,给我发一个过来,多谢了!!
我的系统是win2000
作者: 七彩星星    时间: 2011-9-14 16:59

我听说 在BSA对PCR有促进作用，可消除抑制因素。可我加进去后怎么发现BSA都变性成白色的了。我用的浓度为0.5%终浓度。
上火！
作者: finger    时间: 2011-9-14 16:59

有谁知道touchdown PCR或落降PCR的原理和操作过程吗?
作者: 章鱼小丸子    时间: 2011-9-14 17:00

请哪位大虾指教LOH（杂合性缺失）检测的方法学问题，目前常规的方法有那些，能否和RT－pcr同时做？谢谢先  
作者: +田田+    时间: 2011-9-14 17:00

有谁知道touchdown PCR或落降PCR的原理和操作过程吗?

降落pcr是设定一系列退火温度越来越低的循环，退火温度的范围应该跨越15度左右，从高于估计Tm值至少几度到低于它10度左右。例如，如果一队没有简并的引物－模板的计算Tm值为62度，可设定pcr仪的退火温度从65度降到50度，（每两个循环降低一度），再在50度退火温度下做15个循环。
主要原理是：由于开始时的退火温度选择为高于估计的Tm值，随着循环的进行，退火温度逐渐降低到Tm值，并最终低于这个水平，这个策略有利于确保第一个引物－模板杂交事件发生在最互补的反应物之间，即那些产生目的扩增产物的反应物之间。尽管退火温度最终会降到非特异性杂交的Tm值，但此时目的扩增产物已经开始几何扩增，在剩下的循环中处于超过任何滞后（非特异性）pcr产物的地位。  
作者: free    时间: 2011-9-14 17:01

有谁知道touchdown PCR或落降PCR的原理和操作过程吗?

===============================================================================================================

降落pcr是设定一系列退火温度越来越低的循环，退火温度的范围应该跨越15度左右，从高于估计Tm值至少几度到低于它10度左右。例如，如果一队没有简并的引物－模板的计算Tm值为62度，可设定pcr仪的退火温度从65度降到50度，（每两个循环降低一度），再在50度退火温度下做15个循环。
主要原理是：由于开始时的退火温度选择为高于估计的Tm值，随着循环的进行，退火温度逐渐降低到Tm值，并最终低于这个水平，这个策略有利于确保第一个引物－模板杂交事件发生在最互补的反应物之间，即那些产生目的扩增产物的反应物之间。尽管退火温度最终会降到非特异性杂交的Tm值，但此时目的扩增产物已经开始几何扩增，在剩下的循环中处于超过任何滞后（非特异性）pcr产物的地位。

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谢谢，如何用touchdown PCR 确定最佳反应条件？有关于这方面的文章吗？
作者: finger    时间: 2011-9-14 17:01

如何用touchdown PCR 确定最佳反应条件？
请提供给我相关的文章，谢谢！
作者: 大仙    时间: 2011-9-14 17:02

降落pcr只是一种在不知道最佳退火温度的时候比较适用，他只是一种潜在的一步法找到最佳扩增条件的方法，有人发现一些本来扩增满意的单一扩增产物当采用降落pcr时变得更好了即产生更多的产物了。
但是就我个人理解，并不能通过降落pcr确定你最佳的退火温度，只是当你在不知道最佳退火温度，也不知道你的引物和你的模板是不是合适，是否能成功的进行pcr的时候使用，前提还包括你的pcr的其他条件都已经调整的比较合适的时候，认为只是退火温度不满意的时候才有比较高的价值。只是一种优化pcr的方法，并不是确定最佳退火温度的方法。不知道我的理解对不对。
作者: 蒲公英    时间: 2011-9-14 17:02

请教各位大侠：
我将处理好的样品（细胞）拿到北京做实验，然后要提取RNA做差显，请问用什么试剂来保存细胞便于运输而不影响后续实验。
比较及，请各位大侠多多帮忙！
作者: 天蓝蓝    时间: 2011-9-14 17:03

我用AMV做RT，查了很多20微升的体系，都不一样，我不知道哪种体系好，请大家给我一个体系。另外，这些试剂加入的顺序如何，加入后温度怎样，麻烦告诉我具体的操作过程和注意事项，谢谢。
作者: 天蓝蓝    时间: 2011-9-14 17:03

说错了，是差显体系。
作者: 何去何从    时间: 2011-9-14 17:04

请问：我想利用RT-PCR检测一个大鼠基因的表达，而此基因被我转到人的细胞中去，并且这个基因与人中的相应基因具有很高的同源性，所以我利用引物去批的时候就不能反应出表达的差异了，请问各位能人志士怎么办？  
作者: 假小子    时间: 2011-9-14 17:05

我提出的RNA OD比值1.79，反转录出的cDNA可以扩出βacting，但是怎么不能扩出目的片断！引物的Tm值为56.6和57，另一组为57和61.5，用55退火没有特异条带，只有弥漫影。今天用52退火，还是这样，怎么办啊？
请帮忙分析一下吧！谢谢！

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你的产物是多少bp?大于600不容易出来。我做的时候一般400 以下每次都可以出来。

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我也是啊，我扩得目的条带是805bp的，不容易出来，450以下的很容易，这和什么有关呢，应该怎么解决这个问题呢?
那位高手解答一下啦
作者: 假小子    时间: 2011-9-14 17:05

我用trizol提取RNA然后做RT-PCR,但是只能p出500bp的产物，大于700bp的产物从来没有p出来过，我用的是华美的Taq酶，请教用什么方法能扩增出长片段的产物？

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我也是啊，我扩得目的条带是805bp的，不容易出来，450以下的很容易，这和什么有关呢，应该怎么解决这个问题呢?我用的taq酶是promega的
那位高手解答一下啦
作者: 微笑的海豚    时间: 2011-9-14 17:05

首先要确保引物设计合理，如果引物设计没有问题，还要注意
保证模板质量
保证RNA的质量，除了比值、没有降解，不混有DNA也很重要。可以用DNaseI处理一下。
反转录时可以采用较高的温度，或者加入甲酰氨以消除二级结构的影响，必要时可以掺入同位素以确定反转录是否完全。
PCR时可以采用热启动。
一般注意以上几点，扩增1Kb左右的片断应该问题不大。
我试验中RNA比值一般在1.7~1.8就可以进行下面反应了，反转录引物为oligodT18。
作者: 清风风铃    时间: 2011-9-14 17:06

小妹有几个菜鸟问题想请问各位高手：作RT-PCR时，如何决定选择随机引物还是Oligo（dT）呢。
作者: jude    时间: 2011-9-14 17:06

那位高手帮忙设计一下引物：人B7-H1基因，谢谢！！！
LOCUS NM_014143 1553 bp mRNA linear PRI 21-DEC-2003
DEFINITION Homo sapiens programmed cell death 1 ligand 1 (PDCD1LG1), mRNA.
ACCESSION NM_014143
VERSION NM_014143.2 GI:20070268
KEYWORDS .
SOURCE Homo sapiens (human)
ORGANISM Homo sapiens
Eukaryota; Metazoa; Chordata; Craniata; Vertebrata; Euteleostomi;
Mammalia; Eutheria; Primates; Catarrhini; Hominidae; Homo.
REFERENCE 1 (bases 1 to 1553)
AUTHORS Wiendl,H., Mitsdoerffer,M., Schneider,D., Chen,L., Lochmuller,H.,
Melms,A. and Weller,M.
TITLE Human muscle cells express a B7-related molecule, B7-H1, with
strong negative immune
作者: jude    时间: 2011-9-14 17:06

那位高手帮忙设计一下引物：人B7-H1基因，谢谢！！！
LOCUS NM_014143 1553 bp mRNA linear PRI 21-DEC-2003
DEFINITION Homo sapiens programmed cell death 1 ligand 1 (PDCD1LG1), mRNA.
ACCESSION NM_014143
VERSION NM_014143.2 GI:20070268
KEYWORDS .
SOURCE Homo sapiens (human)
ORGANISM Homo sapiens
Eukaryota; Metazoa; Chordata; Craniata; Vertebrata; Euteleostomi;
Mammalia; Eutheria; Primates; Catarrhini; Hominidae; Homo.
REFERENCE 1 (bases 1 to 1553)
AUTHORS Wiendl,H., Mitsdoerffer,M., Schneider,D., Chen,L., Lochmuller,H.,
Melms,A. and Weller,M.
TITLE Human muscle cells express a B7-related molecule, B7-H1, with
strong negative immune regulatory potential: a novel mechanism of
counterbalancing the immune attack in idiopathic inflammatory
myopathies
JOURNAL FASEB J. 17 (13), 1892-1894 (2003)
PUBMED 12923066
REMARK GeneRIF: B7-H1 is expressed in muscle cells and may have a negative
immune regulatory function in idiopathic inflammatory myopathies.
REFERENCE 2 (bases 1 to 1553)
AUTHORS Youngnak,P., Kozono,Y., Kozono,H., Iwai,H., Otsuki,N., Jin,H.,
Omura,K., Yagita,H., Pardoll,D.M., Chen,L. and Azuma,M.
TITLE Differential binding properties of B7-H1 and B7-DC to programmed
death-1
JOURNAL Biochem. Biophys. Res. Commun. 307 (3), 672-677 (2003)
PUBMED 12893276
REMARK GeneRIF: binding properties of B7-H1 to programmed death-1.
REFERENCE 3 (bases 1 to 1553)
AUTHORS Chen,X.L., Cao,X.D., Kang,A.J., Wang,K.M., Su,B.S. and Wang,Y.L.
TITLE In situ expression and significance of B7 costimulatory molecules
within tissues of human gastric carcinoma
JOURNAL World J. Gastroenterol. 9 , 1370-1373 (2003)
作者: jude    时间: 2011-9-14 17:07

PUBMED 12800259
REMARK GeneRIF: ICOS-B7H costimulatory pathway may be involved in the
negative regulation of cell-mediated immune responses.
REFERENCE 4 (bases 1 to 1553)
AUTHORS Selenko-Gebauer,N., Majdic,O., Szekeres,A., Hofler,G., Guthann,E.,
Korthauer,U., Zlabinger,G., Steinberger,P., Pickl,W.F.,
Stockinger,H., Knapp,W. and Stockl,J.
TITLE B7-H1 (programmed death-1 ligand) on dendritic cells is involved in
the induction and maintenance of T cell anergy
JOURNAL J. Immunol. 170 (7), 3637-3644 (2003)
PUBMED 12646628
REMARK GeneRIF: Monoclonal antibody DF272-defined surface molecule B7-H1
represents a unique receptor structure on dendritic cells that may
play a role in the induction and maintenance of T cell anergy.
REFERENCE 5 (bases 1 to 1553)
AUTHORS Trabattoni,D., Saresella,M., Biasin,M., Boasso,A., Piacentini,L.,
Ferrante,P., Dong,H., Maserati,R., Shearer,G.M., Chen,L. and
Clerici,M.
TITLE B7-H1 is up-regulated in HIV infection and is a novel surrogate
marker of disease progression
JOURNAL Blood 101 (7), 2514-2520 (2003)
PUBMED 12468426
REMARK GeneRIF: up-regulation in HIV infection, relation to disease
progression, and possible role in AIDS progression
REFERENCE 6 (bases 1 to 1553)
AUTHORS Brown,J.A., Dorfman,D.M., Ma,F.R., Sullivan,E.L., Munoz,O.,
Wood,C.R., Greenfield,E.A. and Freeman,G.J.
TITLE Blockade of programmed death-1 ligands on dendritic cells enhances
T cell activation and cytokine production
JOURNAL J. Immunol. 170 (3), 1257-1266 (2003)
PUBMED 12538684
REMARK GeneRIF: Blockade of PD-L1 during T cell responses initiated by
allogenic dendritic cells increases T cell proliferation and
cytokine production, showing that PD-L1 functions to inhibit T cell
activation.
作者: jude    时间: 2011-9-14 17:08

REFERENCE 7 (bases 1 to 1553)
AUTHORS Mazanet,M.M. and Hughes,C.C.
TITLE B7-H1 is expressed by human endothelial cells and suppresses T cell
cytokine synthesis
JOURNAL J. Immunol. 169 (7), 3581-3588 (2002)
PUBMED 12244148
REMARK GeneRIF: B7-H1 is inducible on human endothelial cells by IFN-gamma
both in vitro and in vivo; blocking its interaction with its
receptor (PD-1) on T cells augments T cell cytokine synthesis.
REFERENCE 8 (bases 1 to 1553)
AUTHORS Dong,H., Strome,S.E., Salomao,D.R., Tamura,H., Hirano,F.,
Flies,D.B., Roche,P.C., Lu,J., Zhu,G., Tamada,K., Lennon,V.A.,
Celis,E. and Chen,L.
TITLE Tumor-associated B7-H1 promotes T-cell apoptosis: a potential
mechanism of immune evasion
JOURNAL Nat. Med. 8 , 793-800 (2002)
PUBMED 12091876
REMARK GeneRIF: Cancer cell-associated B7-H1 increases apoptosis of
antigen-specific human T-cell clones in vitro
REFERENCE 9 (bases 1 to 1553)
AUTHORS Freeman,G.J., Long,A.J., Iwai,Y., Bourque,K., Chernova,T.,
Nishimura,H., Fitz,L.J., Malenkovich,N., Okazaki,T., Byrne,M.C.,
Horton,H.F., Fouser,L., Carter,L., Ling,V., Bowman,M.R.,
Carreno,B.M., Collins,M., Wood,C.R. and Honjo,T.
TITLE Engagement of the PD-1 immunoinhibitory receptor by a novel B7
family member leads to negative regulation of lymphocyte activation
JOURNAL J. Exp. Med. 192 (7), 1027-1034 (2000)
PUBMED 11015443
REFERENCE 10 (bases 1 to 1553)
AUTHORS Dong,H., Zhu,G., Tamada,K. and Chen,L.
TITLE B7-H1, a third member of the B7 family, co-stimulates T-cell
proliferation and interleukin-10 secretion
JOURNAL Nat. Med. 5 (12), 1365-1369 (1999)
PUBMED 10581077
COMMENT PROVISIONAL REFSEQ: This record has not yet been subject to final
NCBI review. The reference sequence was derived from AF233516.1.
On Apr 8, 2002 this sequence version replaced gi:7661533.
FEATURES Location/Qualifiers
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CDS 53..925
作者: jude    时间: 2011-9-14 17:09

/gene="PDCD1LG1"
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transduction [goid 0007166] [evidence TAS] [pmid
10581077];
go_process: signal transduction [goid 0007165] [evidence
P] [pmid 10581077];
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[pmid 10581077];
go_process: cell proliferation [goid 0008283] [evidence
TAS] [pmid 10581077]"
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PKAEVIWTSSDHQVLSGKTTTTNSKREEKLFNVTSTLRINTTTNEIFYCTFRRLDPEE
NHTAELVIPELPLAHPPNERTHLVILGAILLCLGVALTFIFRLRKGRMMDVKKCGIQD
TNSKKQSDTHLEET"
sig_peptide 53..106
/gene="PDCD1LG1"
mat_peptide 107..922
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/note="KOG3513; Region: Neural cell adhesion molecule L1
[Signal transduction mechanisms]"
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misc_feature 488..727
/gene="PDCD1LG1"
/note="IGcam; Region: Immunoglobulin domain cell adhesion
molecule (cam) subfamily"
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ORIGIN
1 cgaggctccg caccagccgc gcttctgtcc gcctgcaggg cattccagaa agatgaggat
61 atttgctgtc tttatattca tgacctactg gcatttgctg aacgcattta ctgtcacggt
121 tcccaaggac ctatatgtgg tagagtatgg tagcaatatg acaattgaat gcaaattccc
181 agtagaaaaa caattagacc tggctgcact aattgtctat tgggaaatgg aggataagaa
241 cattattcaa tttgtgcatg gagaggaaga cctgaaggtt cagcatagta gctacagaca
301 gagggcccgg ctgttgaagg accagctctc cctgggaaat gctgcacttc agatcacaga
361 tgtgaaattg caggatgcag gggtgtaccg ctgcatgatc agctatggtg gtgccgacta
421 caagcgaatt actgtgaaag tcaatgcccc atacaacaaa atcaaccaaa gaattttggt
481 tgtggatcca gtcacctctg aacatgaact gacatgtcag gctgagggct accccaaggc
541 cgaagtcatc tggacaagca gtgaccatca agtcctgagt ggtaagacca ccaccaccaa
601 ttccaagaga gaggagaagc ttttcaatgt gaccagcaca ctgagaatca acacaacaac
661 taatgagatt ttctactgca cttttaggag attagatcct gaggaaaacc atacagctga
721 attggtcatc ccagaactac ctctggcaca tcctccaaat gaaaggactc acttggtaat
781 tctgggagcc atcttattat gccttggtgt agcactgaca ttcatcttcc gtttaagaaa
841 agggagaatg atggatgtga aaaaatgtgg catccaagat acaaactcaa agaagcaaag
901 tgatacacat ttggaggaga cgtaatccag cattggaact tctgatcttc aagcagggat
961 tctcaacctg tggtttaggg gttcatcggg gctgagcgtg acaagaggaa ggaatgggcc
1021 cgtgggatgc aggcaatgtg ggacttaaaa ggcccaagca ctgaaaatgg aacctggcga
1081 aagcagagga ggagaatgaa gaaagatgga gtcaaacagg gagcctggag ggagaccttg
1141 atactttcaa atgcctgagg ggctcatcga cgcctgtgac agggagaaag gatacttctg
1201 aacaaggagc ctccaagcaa atcatccatt gctcatccta ggaagacggg ttgagaatcc
1261 ctaatttgag ggtcagttcc tgcagaagtg ccctttgcct ccactcaatg cctcaatttg
1321 ttttctgcat gactgagagt ctcagtgttg gaacgggaca gtatttatgt atgagttttt
1381 cctatttatt ttgagtctgt gaggtcttct tgtcatgtga gtgtggttgt gaatgatttc
1441 ttttgaagat atattgtagt agatgttaca attttgtcgc caaactaaac ttgctgctta
1501 atgatttgct cacatctagt aaaacatgga gtatttgtaa aaaaaaaaaa aaa
作者: jude    时间: 2011-9-14 17:09

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molecule (cam) subfamily"
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ORIGIN
1 cgaggctccg caccagccgc gcttctgtcc gcctgcaggg cattccagaa agatgaggat
61 atttgctgtc tttatattca tgacctactg gcatttgctg aacgcattta ctgtcacggt
121 tcccaaggac ctatatgtgg tagagtatgg tagcaatatg acaattgaat gcaaattccc
181 agtagaaaaa caattagacc tggctgcact aattgtctat tgggaaatgg aggataagaa
241 cattattcaa tttgtgcatg gagaggaaga cctgaaggtt cagcatagta gctacagaca
301 gagggcccgg ctgttgaagg accagctctc cctgggaaat gctgcacttc agatcacaga
361 tgtgaaattg caggatgcag gggtgtaccg ctgcatgatc agctatggtg gtgccgacta
421 caagcgaatt actgtgaaag tcaatgcccc atacaacaaa atcaaccaaa gaattttggt
481 tgtggatcca gtcacctctg aacatgaact gacatgtcag gctgagggct accccaaggc
541 cgaagtcatc tggacaagca gtgaccatca agtcctgagt ggtaagacca ccaccaccaa
601 ttccaagaga gaggagaagc ttttcaatgt gaccagcaca ctgagaatca acacaacaac
661 taatgagatt ttctactgca cttttaggag attagatcct gaggaaaacc atacagctga
721 attggtcatc ccagaactac ctctggcaca tcctccaaat gaaaggactc acttggtaat
781 tctgggagcc atcttattat gccttggtgt agcactgaca ttcatcttcc gtttaagaaa
841 agggagaatg atggatgtga aaaaatgtgg catccaagat acaaactcaa agaagcaaag
901 tgatacacat ttggaggaga cgtaatccag cattggaact tctgatcttc aagcagggat
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1021 cgtgggatgc aggcaatgtg ggacttaaaa ggcccaagca ctgaaaatgg aacctggcga
1081 aagcagagga ggagaatgaa gaaagatgga gtcaaacagg gagcctggag ggagaccttg
1141 atactttcaa atgcctgagg ggctcatcga cgcctgtgac agggagaaag gatacttctg
1201 aacaaggagc ctccaagcaa atcatccatt gctcatccta ggaagacggg ttgagaatcc
1261 ctaatttgag ggtcagttcc tgcagaagtg ccctttgcct ccactcaatg cctcaatttg
1321 ttttctgcat gactgagagt ctcagtgttg gaacgggaca gtatttatgt atgagttttt
1381 cctatttatt ttgagtctgt gaggtcttct tgtcatgtga gtgtggttgt gaatgatttc
1441 ttttgaagat atattgtagt agatgttaca attttgtcgc caaactaaac ttgctgctta
1501 atgatttgct cacatctagt aaaacatgga gtatttgtaa aaaaaaaaaa aaa
作者: fangxiang    时间: 2011-9-14 17:10

请教专家：我抽提总rna，用华舜的试剂盒（system 1），但是得到的rna跑电泳是一片，没有出现理想的三条条带，难道还是降解了吗，我用的是进口的无酶tip，提取的是肺组织。哪位能给我讲讲，急急急！
作者: 速冻虾米    时间: 2011-9-14 17:11

最近在做RT-PCR，也是很奇怪！我用同样的试剂盒、同样的方法、同样的条件做，以前能做出来非常清晰漂亮的条带，现在就怎么都做不出来！连内参也出不来，不知道是什么问题。
我用的是TAKARA公司所一步法试剂盒，引物设计也没什么问题，现在有个可能的变化就是我用了新的试剂盒来做，以前用剩下的试剂盒做预实验，非常理想！于是买了新的，结果就做不出来了！其实确切的来说应该说结果不稳定，偶尔会出来一两个条带，也不理想！所以现在几乎实验停滞下来了，那个好心人分析分析到底是怎么回事呢？
作者: 韩梅梅    时间: 2011-9-14 17:12

请教专家：我抽提总rna，用华舜的试剂盒（system 1），但是得到的rna跑电泳是一片，没有出现理想的三条条带，难道还是降解了吗，我用的是进口的无酶tip，提取的是肺组织。哪位能给我讲讲，急急急！！！

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我前段时间也用了华舜的产品，觉得质量一般，因为提出来的RNA全部都蛋白质污染，如果说操作不当，不可能每次每个样品都操作不好啊！测RNA 的OD值只有1.3、1.2，更有甚者竟然是负数！！所以，你先要肯定提出的RNA的质量是好的，再是上样量是否太多？或者电泳电压太大？电泳时间过长，RNA也会降解？还有，你RNA 的电泳是用普通的电泳还是变性电泳？可能一般的电泳结果就不如变性电泳好，但是具体的内容你得查查资料，我不是很清楚，不好意思！
作者: 椰子叶子    时间: 2011-9-14 17:12

首先我觉得国产的RNA抽提试剂真的很差劲，我在这个地方吃了N多亏，原因就是老板说我肯定是技术不过关，我不服气就一直用国产试剂，可就是抽不出来，最后偷偷用Trizol试剂试了一下，马上就有很漂亮的条带，所以我觉得Gibico的TriZol还是很经典的。如果抽出的RNA电泳图谱可以，即使260/280低也没有很大的关系，因为比值可能和溶解体系的离子浓度，PH值有关。
作者: 兔纸    时间: 2011-9-14 17:12

不知道有没有用TAKARA的反转录实际和的。DDR0119A两步法那种。
10微升的体系。说明书上说以RT产物为模板进行PCR时Mg与dNTP都不用加了，那么Mg的浓度怎么控制？
有用过的战友请给点意见！
作者: 如影随形    时间: 2011-9-14 17:13

各位好，请问PCR产物直接测序与克隆测序哪种好？
作者: 麻瓜    时间: 2011-9-14 17:14

请问现在还能提供吗？谢谢！

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我也想要，不知道XP能不能用。
以前别人给我一套，但是到了XP上就不能用，郁闷！
作者: 8黑眼圈8    时间: 2011-9-14 17:15

我重合引物再做，但是非特异带很多，209bp（所要）,350bp,380bp,500bp,等，见附件。通过增加
退火温度，降低引物浓度，增加模板量，仍无法驱除。不知该引物特异性好不好/?请问有无好
的方法？多谢！希望高手费心看看！！！

tidu1 右1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
c4 c7 d3 d5 引物 引物 无 57.4 59.1 61.4 64
57.4du 7.5pM 5pM 无 引物10pM,taq1u (8 9 10 11)

27cycles
tidu2 左
1 2 3 4 5 6
50.1 52.2 54.5 taq0.5u marker
27cycles
引物减为5pM
tidu1 , tidu2 模板量4ul
57du 右--左 1 2 3 4
调整模板量，6 8 10 12 ul
去不了非特异带，大家看看有什么好办法么？谢谢了
作者: 菠萝菠萝蜜    时间: 2011-9-14 17:15

我准备做RT－PCR，设计了一对引物，请大家帮我看看怎么样？
CDS序列：1 atgagccacg ggaagagaac cgacatgctc ccggagatcg ccgccgccgt aggtttcctc
61 accagtctcc tgaggactcg gggctgcgtg agcgagcaga gactcaaggt tttcagtagg
121 gcgctccagg acgcactgac cgatcattac aaacaccact ggtttccaga aaagccatcc
181 aagggctccg gctatcgctg tatccgcatc aaccacaaga tggaccccat catcagcaag
241 gtggccagcc agatcggact cagccagccc cagctgcacc agctcctgcc cagcgagctg
301 accctgtggg tcgatcccta cgaagtgtcc taccgcatcg gggaagatgg atccatctgc
361 gtgctgtatg aggaggcgcc ggtggccacc tcctacgggc tcctcacctg caagaaccag
421 atgatgctgg gcaggagcag tccatcgaag aactacgtga tgactgtctc cagctag
引物：5‘TATCCGCATCAACCACAAG3'
3'CACGACATACTCCTCCGC5'
作者: 阿拉蕾    时间: 2011-9-14 17:16

不知道有没有用TAKARA的反转录实际和的。DDR0119A两步法那种。
10微升的体系。说明书上说以RT产物为模板进行PCR时Mg与dNTP都不用加了，那么Mg的浓度怎么控制？
有用过的战友请给点意见！

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我现在用的就是这个两步法的试剂盒，这种是V3.0的试剂盒，我曾经问过TAKARA公司，他们说这种V3.0的试剂盒用的是TaKaRa Ex Taq HS,和以前的版本相比，Buffer和PCR酶都有所改进，酶的量也用的很少，按照说明书操作即可，不用另加Mg2+。我们有很多同学多用这个试剂盒，按照说明书就做得挺好的拉！我想如果你做的效果不好的话，可以试试加点少量Mg2+，不过dNTP肯定是不用加的了。
作者: 丸子妹    时间: 2011-9-14 17:16

不知道有没有用TAKARA的反转录实际和的。DDR0119A两步法那种。
10微升的体系。说明书上说以RT产物为模板进行PCR时Mg与dNTP都不用加了，那么Mg的浓度怎么控制？
有用过的战友请给点意见！
作者: 兔纸    时间: 2011-9-14 17:17

情况是这样的，我想将在进行PCR时加少量的RT产物，3——4微升，PCR体系设为25，这样还可以节省RT产物，否则那不就相当于一步法了吗？
作者: free    时间: 2011-9-14 17:17

我正在做RT,遇到写问题,向各位高手赐教!
1 相同的体系,相同的Tm和CDNA,以前目标产物和内参都跑出来了,现在只能跑出来内参,无产物,何缘故?
2 将内参和目标引物分开放在两个体系里跑是否更好?更容易出结果?
作者: free    时间: 2011-9-14 17:18

我是GREEN HAND,向高手请教:
1 相同的CDNA,相同的体系和TM,以前内参和目标产物都P出来过,现在就只有内参P出来,无产物,何缘故?
2 将内参和目标引物分别放在两个管里跑是否更容易出结果?更好?
3内参P出来是否说明CDNA没有问题?
作者: 果冻也酸    时间: 2011-9-14 17:18

情况是这样的，我想将在进行PCR时加少量的RT产物，3——4微升，PCR体系设为25，这样还可以节省RT产物，否则那不就相当于一步法了吗？

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应该是可以的吧，我每次做25微升体系的时候都是用4微升，这样还有时候有很亮的拖尾，我想用3微升也是可以的，只要你的目的基因的表达比较高就行了。
作者: 兔纸    时间: 2011-9-14 17:19

1 PCR时目标产物和内参都跑出来了,但拖尾严重,是什么原因?如何处理?
2 引物应如何稀释?我的引物是20个碱基,分子量6000多,2OD,我稀释到200uL,在25Ul反应体系中加入0.5-0.8uL,是否终浓度太高?
谢谢各位高手!!!
作者: 阿福    时间: 2011-9-14 17:19

试着回答一下问题
1 相同的体系,相同的Tm和CDNA,以前目标产物和内参都跑出来了,现在只能跑出来内参,无产物,何缘故?
2 将内参和目标引物分开放在两个体系里跑是否更好?更容易出结果?

第一个问题：原因很多，可以参考院中的一些帖子，再作几次可能会好的。
第二个问题：答案应该是肯定的。
作者: 绿茶公子    时间: 2011-9-14 17:20

关于RNA 的几个问题:
1.RNA中DNAse I 消化问题 时 用的酚/氯仿/异戊醇及醋酸钠用市面上买的国产的 分析纯级的产品是否可以?还是必须用昂贵的进口货?
2. RNA 电泳所用的电泳液必须是DEPC 处理过的液体配置的吗?可否用跑DNA 的来跑?
作者: 冰激凌小姐    时间: 2011-9-14 17:20

我做rtpcr，如果把内参和目的条带在一个体系里扩增，只能扩出内参，目的条带很弱，但是如果分开扩的话能扩出，这是为什么呢
还有，我扩出的目的条带竟然有2条，这是什么原因呢，我只加了一对引物的？
作者: 爱哭鬼    时间: 2011-9-14 17:20

各位大侠，在下做禽流感和猪瘟病毒rt-pcr（从组织中抽提总RNA,用特异性引物反转录，nt-pcr)
1。用invitorgen公司的rna抽提试剂盒
2。抽提的rna全部用于反转录（按TAKARA 的 AMV XL 20微升体系反转录，5倍buffer4微升，Dntp 8微升，PRI/HPRI 0.5微升，AMV XL 1微升，引物（25uM) 1 微升，DEPC水 5.5微升）
3。用takara 试剂做NT-pcr(2uLCDNA/25体系)
以上条件对有些样品能做，有些不能；更恼人的是以前能做的样品现做不来，主要问题在前两步，最近对CDNA浓度测定（按dsDNA 50ug/ml 标准）OD260/OD280=1.7-1.8,OD260/230=1.33-1.68(该比值为何东东？？A230值是测什么的？？？）
因RNA病毒的核酸RNA量的关系，抽提的核酸全部用于反转录，不知该反转录体系对RNA核酸量有上限要求吗？
抽提的总RNA跑电泳？（跑DNA电泳槽用ＤＥＰＣ水清洗便可吗？？
谢谢你的关注与指教！！
作者: 兔纸    时间: 2011-9-14 17:21

我做rtpcr，如果把内参和目的条带在一个体系里扩增，只能扩出内参，目的条带很弱，但是如果分开扩的话能扩出，这是为什么呢
还有，我扩出的目的条带竟然有2条，这是什么原因呢，我只加了一对引物的？？？？？？？？？

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同管扩增存在抑制，所以目的带弱。
是扩出两条目的带吗？应该是一条目的带，一条杂带吧！
作者: 春雨    时间: 2011-9-14 17:21

请教：我的目的基因和内参基因同样条件下单独PCR时，扩增良好，但放在一起扩增，目的基因出来，但内参基因一点都没有。想知道两者在什么条件下互相抑制，扩增条件该如何一步步调整呢？关键是该如何具体解决呢？？
作者: 喵咪    时间: 2011-9-14 17:22

本人做RT-PCR有一定的经验。细胞和动物组织的RT-PCR都做过，经过曲折的探索，我现在基本上都不失败，多长的基因，都能扩出来，希望能给迷茫的同学带来光明。
作者: 喵咪    时间: 2011-9-14 17:22

回复：你的情况较简单，是因为你的目的基因和内参照的引物序列有互补配对区，在退火时出现杂交现象，所以不能扩出来。建议你改换内参照序列后，应该出来。
作者: 小妖儿    时间: 2011-9-14 17:23

用MLV-RTase可以逆转录多长的cDNA片断？单链的cDNA可以在4度放多久不降解？希望RT高手指教！！
作者: 小妖儿    时间: 2011-9-14 17:23

用MLV-RTase可以逆转录多长的cDNA片断？单链的cDNA可以在4度放多久不降解？希望RT高手指教！！
作者: 喵咪    时间: 2011-9-14 17:23

引物稀释应该有一个公式：2OD=66ug 66/6000=11nmol 11nmol/110ul=100uM,在稀释5倍，到20uM, 因此你应该用55ul TE或水来稀释。
作者: 喵咪    时间: 2011-9-14 17:24

回复：逆转录多长的cDNA fragment ,需要根据你的实验要求。单链cDNA放在4度很快就降解，－20大概能保存3－4天，最好放在－80，可以保存半年。
作者: 蓝蜗牛    时间: 2011-9-14 17:24

请问兔纸：我如何控制条件才能
作者: 蓝蜗牛    时间: 2011-9-14 17:24

请问兔纸：我如何控制条件才能减少杂带的产生呢？
作者: 喵咪    时间: 2011-9-14 17:25

高手能不能在这里讲讲RT-PCR的经验？
比如如何避免RNA降解？制胶的方法，注意事项？
我在实验时，有时RNA提不出，方法没区别，但找不到原因。跑出来的胶总是不够直。虽然图像分析能弥补一点，但总觉得不够好，也不知应如何处理。

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RNA很容易降解，要有充分的实验准备。建议：操作一定要带手套和口罩，不能讲话，能在无菌台上操作更好。要有专门的一套工具，高压时间要常一些。电泳装置应该用DEPC水浸泡。只要实验注意，应该没问题。
作者: 喵咪    时间: 2011-9-14 17:25

请教：我的目的基因和内参基因同样条件下单独PCR时，扩增良好，但放在一起扩增，目的基因出来，但内参基因一点都没有。想知道两者在什么条件下互相抑制，扩增条件该如何一步步调整呢？关键是该如何具体解决呢？？

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你的情况较简单，是因为你的目的基因和内参照的引物序列有互补配对区，在退火时出现杂交现象，所以不能扩出来。建议你改换内参照序列后，应该出来
作者: 喵咪    时间: 2011-9-14 17:26

各位大侠，在下做禽流感和猪瘟病毒rt-pcr（从组织中抽提总RNA,用特异性引物反转录，nt-pcr)
1。用invitorgen公司的rna抽提试剂盒
2。抽提的rna全部用于反转录（按TAKARA 的 AMV XL 20微升体系反转录，5倍buffer4微升，Dntp 8微升，PRI/HPRI 0.5微升，AMV XL 1微升，引物（25uM) 1 微升，DEPC水 5.5微升）
3。用takara 试剂做NT-pcr(2uLCDNA/25体系)
以上条件对有些样品能做，有些不能；更恼人的是以前能做的样品现做不来，主要问题在前两步，最近对CDNA浓度测定（按dsDNA 50ug/ml 标准）OD260/OD280=1.7-1.8,OD260/230=1.33-1.68(该比值为何东东？？A230值是测什么的？？？）
因RNA病毒的核酸RNA量的关系，抽提的核酸全部用于反转录，不知该反转录体系对RNA核酸量有上限要求吗？
抽提的总RNA跑电泳？（跑DNA电泳槽用ＤＥＰＣ水清洗便可吗？？
谢谢你的关注与指教！！

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建议：对RNA进行定量，然后再根据实验要求加入适量RNA,你把所有的RNA都用于RT，浓度过高。260/280代表核酸的纯度。260/230也是纯度，230代表的是有机溶剂的吸光值。电泳装置要用DEPC水处理。
作者: jude    时间: 2011-9-14 17:26

在贴子上看到，PCR体系有别于RT-PCR体系，区别到底在哪？
作者: 兔纸    时间: 2011-9-14 17:30

请问兔纸：我如何控制条件才能减少杂带的产生呢？？？？

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主要是通过调整退火温度来完成的。另外可以试一下Mg的浓度。
但是前提必须是引物设计合理。
作者: 麻瓜    时间: 2011-9-14 17:30

兔纸 兄，我查看了文献决定先提高一下温度看看条带的情况，我的两条引物TM分别是54和58度，我打算选56度做做，不知可否

另外如何判断引物的合理性呢，有什么方法？
作者: 小荷尖尖    时间: 2011-9-14 17:31

3个月前做PCR，目的基因和内参（ACTIN）都很亮。但是现在却两者都出不来（新抽提的RNA）。有趣的是，从每一份cDNA样品中吸取一定连量进行混合，可以P出东东，但是很模糊。另外同样的样品我同学的目的基因和内参（GAPDH）现在可以P出来。
请教各位大虾，帮忙分析是什么原因？
作者: 葡萄籽    时间: 2011-9-14 17:31

我用的是保生物的一步法试剂盒做rt-pcr.五月份做出来了,可现在又做不出来了.我用的是trizol提的rna,260/280一般在1.9-2.0,跑电泳三条带都差不多亮,我觉得应能进行rt-pcr,可是没出带.我怀疑可能是试剂盒被污染了,就用其自带的control做了一次没问题,现在我感觉可能是引物的问题,(可我用的是原来的引物).试剂盒挺贵的我都不敢试了.怎么办那?
作者: 兔纸    时间: 2011-9-14 17:32

兔纸 兄，我查看了文献决定先提高一下温度看看条带的情况，我的两条引物TM分别是54和58度，我打算选56度做做，不知可否

另外如何判断引物的合理性呢，有什么方法？

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（转）引物的另一个重要参数是熔解温度（Tm）。这是当50％的引物和互补序列表现为双链DNA分子时的温度。Tm对于设定PCR退火温度是必需的。在理想状态下，退火温度足够低，以保证引物同目的序列有效退火，同时还要足够高，以减少非特异性结合。合理的退火温度从55℃到70℃。退火温度一般设定比引物的Tm低5℃。
引物序列的不同，Tm会差异很大。所有退火温度只是一个起始点。可以通过分析几个逐步提高退火温度的反应以提高特异性。开始低于估算的Tm5℃，以2℃为增量，逐步提高退火温度。较高的退火温度会减少引物二聚体和非特异性产物的形成。为获得最佳结果，两个引物应具有近似的Tm值。引物对的Tm差异如果超过5℃，就会引物在循环中使用较低的退火温度而表现出明显的错误起始。如果两个引物Tm不同，将退火温度设定为比最低的Tm低5℃。或者为了提高特异性，可以在根据较高Tm设计的退火温度先进行5个循环，然后在根据较低Tm设计的退火温度进行剩余的循环。这使得在较为严紧的条件下可以获得目的模板的部分拷贝。
作者: 兔纸    时间: 2011-9-14 17:32

不知道你是自己设计的引物还是参考文献的。
如果通过软件设计的话，应该没有太大问题，但最好去BLAST一下。
作者: 小困    时间: 2011-9-14 17:33

各位大虾：
小弟用trizol提的小鼠肾脏和脾脏的RNA,但无论怎样改进方法测得的RNAOD260/OD280比值恒在1.4左右，我用PH试纸测得溶解RNA的溶液确实为酸性，但是实验室的其他兄弟提的RNA虽然用的也是相同的水，但是测得的比值相当满意（是不是这个原因我不是很确定）。但是现在我用我得到的膜板cDNA作pcr，总是得到弥漫性的条带，请教各位仁兄帮我找找原因，不甚感激！
作者: 不懂    时间: 2011-9-14 17:33

请问喵咪：
　我想证明某个基因在某种细胞内不表达，用RT-PCR的方法是不是说服力不强？
我选该基因表达的那些细胞作阳性对照，如果阳性细胞能跑出目的条带，而我的细胞跑不出目的条带，这样能否说明？有没有别的方法？
　我是分子生物学的新手，盼望回复。
作者: 大猫    时间: 2011-9-14 17:34

请问兔纸：
引物的TM值使用公式=4（G+C）+2(A+T)计算还是参考引物合成单上给的TM值，在oligo上也给了TM值，依据哪一个呢？
谢谢  
作者: 兔纸    时间: 2011-9-14 17:34

理论上,这些TM值应该是一样的.实际中也不应该差太多吧
我没有比较过.  
作者: @木木@    时间: 2011-9-14 17:34

我也是用PCR扩人糖皮质激素受体基因全长编码序列(约2000多个bp).

用过人淋巴细胞RT反转的cDNA及 人脑cDNA文库做模板,试过从50-62的退火温度(引物Tm为60),均一片空白,(除了几条约4000bp的杂带)
郁闷!
作者: 嗨皮    时间: 2011-9-14 17:35

请问RT-PCR与荧光定量RT-PCR反应体系是否相同？
作者: 嗨皮    时间: 2011-9-14 17:35

请问RT-PCR与荧光定量RT-PCR反应体系是否相同？
作者: 童童    时间: 2011-9-14 17:35

大家好,我要做IL-16的免疫组化和RT-PCR,请各位前辈指导我该怎么做啊!
作者: 回眸    时间: 2011-9-14 17:37

请问各位高手：
我用一步法做RT-PCR扩增350BP片断第一次用：94度，30秒；54度，20秒；72度，30秒扩增出来了，但隐约可见非特异性带。改为55度后就只能扩出内参而扩不出目的基因了，请问我下一步该如何来去掉非特异性带啊？谢谢
作者: 回眸    时间: 2011-9-14 17:37

请问各位高手：
我用一步法做RT-PCR扩增350BP片断第一次用：94度，30秒；54度，20秒；72度，30秒扩增出来了，但隐约可见非特异性带。改为55度后就只能扩出内参而扩不出目的基因了，请问我下一步该如何来去掉非特异性带啊？谢谢
作者: 清风风铃    时间: 2011-9-14 17:38

同管做PCR,内参可出来,无目的条带,二聚体明显,脱尾严重,是何故?谢谢!  
作者: free    时间: 2011-9-14 17:38

谢谢斑竹的鼓励！
请问，我的两条引物的TM 值都比较高，上游是68 ，下游是76 那我用多少退火温度比较合适呢？  
作者: 麻瓜    时间: 2011-9-14 17:39

我是新手,希望各位老手多提供些有价值的关于RT-PCR技术方面的网站
作者: 小蜜蜂    时间: 2011-9-14 17:39

OLIG（DT）长短是否有区别？即olig15 与olig18怎样选择？
作者: 米米    时间: 2011-9-14 17:39

遇到一个麻烦，PCR扩增出来的片段和我的目的产物不一样，前者有700bp而我的目的产物应该是600bp。测序后，我在NCBI中核对了一下，发现目的产物被分为两个分离的部分出现在测序结果的两端，中间有一些无意义的序列，也就是说测序结果提示产物两端与模板相一致，但中间无意义。这是事么原因，百思不得其解。各位高人请指点迷津。多谢！
作者: 兔纸    时间: 2011-9-14 17:40

我正在做RT-PCR，遇到一个麻烦，PCR扩增出来的片段和我的目的产物不一样，前者有700bp而我的目的产物应该是600bp。测序后，我在NCBI中核对了一下，发现目的产物被分为两个分离的部分出现在测序结果的两端，中间有一些无意义的序列，也就是说测序结果提示产物两端与模板相一致，但中间无意义。这是事么原因，百思不得其解。各位高人请指点迷津。多谢！

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按照你说的情况中间多的100bp应该是该基因的内含子序列。
就是说你提的RNA不纯，混有基因组DNA了。
作者: 麻瓜    时间: 2011-9-14 17:40

多谢兔纸兄您快捷的回信。如果真的是您说的这种情况，我已经提出的RNA是否就没有用处了，还是可以在纯化一次呢？如果可以，方法是怎样的阿？
作者: 小鼹鼠    时间: 2011-9-14 17:41

各位老师，请问怎么做半定量的rt-pcr?
作者: 邓布利多    时间: 2011-9-14 17:41

我要做iNOS的RT-PCR,引物设计搞得我很不爽，最近我下载了一个引物设计的程序，但我找不到它要的基因库，不知哪位高手能告诉我怎么找，谢谢！
作者: 兔纸    时间: 2011-9-14 17:43

多谢兔纸兄您快捷的回信。如果真的是您说的这种情况，我已经提出的RNA是否就没有用处了，还是可以在纯化一次呢？如果可以，方法是怎样的阿？

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说实话，我没有做过，不过我感觉是可以纯化的。
作者: 花裙子    时间: 2011-9-14 17:44

我检测一种病毒 做RT-PCR 结果只括增出一次 以后就再也重复不出来了
我想请教一下 是否出来一次就可以证明是此种病毒
作者: 邓布利多    时间: 2011-9-14 17:44

各位大虾：
小弟用trizol提的小鼠肾脏和脾脏的RNA,但无论怎样改进方法测得的RNAOD260/OD280比值恒在1.4左右，我用PH试纸测得溶解RNA的溶液确实为酸性，但是实验室的其他兄弟提的RNA虽然用的也是相同的水，但是测得的比值相当满意（是不是这个原因我不是很确定）。但是现在我用我得到的膜板cDNA作pcr，总是得到弥漫性的条带，请教各位仁兄帮我找找原因，不甚感激！

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我怀疑你的RNA混有DNA污染，不懂你是用什么抽提的？试剂盒？Trizol？？
作者: 阿拉蕾    时间: 2011-9-14 17:45

用Trizol提RNA方法,RNAOD260/OD280比值是比较低,
用QIAEGN,TAKARA,V-GENE等试剂盒就比较好,都在2.0以上,
根据我的经验,比值低影响PCR结果并不明显,可能还是其他原因.
作者: 白鸟之翼    时间: 2011-9-14 17:45

我在做RT-PCR,需要使用DNA酶去除所提mRNA中污染的DNA.购买了takara的DNase I,看了说明书还是有点弄不懂具体如何使用.反应体系是什么?我用的是Trizol提取mRNA 的方法,目前做到加70%的酒精这一步,离心弃掉上清后再该怎么办,加多少DNase I?
哪位站友用使用 DNaseI的经验请详细告知,不胜感激!
作者: 糊涂虫    时间: 2011-9-14 17:46

我是RT-PCR 新手，想请教一下，用氯仿抽提RNA 剩下的中下层液体中富含DNA 以及蛋白质，请问要想再利用这些物质应该如何保存，能保存多久？
请各位大侠指教！！！
作者: 糊涂虫    时间: 2011-9-14 17:46

我是RT-PCR 新手，想请教一下，用氯仿抽提RNA 剩下的中下层液体中富含DNA 以及蛋白质，请问要想再利用这些物质应该如何保存，能保存多久？
请各位大侠指教！！！
作者: 韩梅梅    时间: 2011-9-14 17:46

我想问一下，RNA变性电泳的具体步骤和所加试剂的体积。谢谢！我以前用trizol抽提，但是做的是普通的电泳，未变性处理，结果只有一个标本条带好，其余的总是无明显的条带，不知是否电泳过程有降解。请高手指点！
作者: HOT兔    时间: 2011-9-14 17:46

请教 喵咪 高手：我做人组织RT-PCR ，基因的gc含量较高，都三个月了还做不出来。我做的是巢式，抽了十几个标本的RNA，目前只有一个标本作出了，且很好，但其他的标本这只有杂带，无主带，且内引物杂带在同一个位置，怎么改变条件都不行。曾经用内引物做外引物直接做RT-PCR ，用的是TAKARA ONE STEP RNA KIT，只做了两个标本，有目的带，但是在同样位置也出现了杂带，且杂带较主带亮，升高退火温度也没用。所抽RNA用的是GIBCOL trizol，没有去DNA污染，RNA电泳没有变性，大多无明显条带。

曾经怀疑内引物不好，改定资料上所用引物，还是扩不出来，但是曾经作出的标本扩出来了。不知为何，很着急，希望指点指点。多谢，多谢！
作者: 椰子叶子    时间: 2011-9-14 17:47

做RT-PCR后用分光光度剂测量RNA量的时候，用什么方法处理装提取物的玻璃管？多谢！！

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自来水冲洗干净，双蒸水洗两遍，然后加溶解RNA的水调零，再测就可以了。
作者: 清风风铃    时间: 2011-9-14 17:48

我用的是保生物的一步法试剂盒做rt-pcr.五月份做出来了,可现在又做不出来了.我用的是trizol提的rna,260/280一般在1.9-2.0,跑电泳三条带都差不多亮,我觉得应能进行rt-pcr,可是没出带.我怀疑可能是试剂盒被污染了,就用其自带的control做了一次没问题,现在我感觉可能是引物的问题,(可我用的是原来的引物).试剂盒挺贵的我都不敢试了.怎么办那?

我又拿一步法的试剂盒做了两步法，重提的rna，260/280为1.9。跑胶可以。可是做rt后，用cdna做pcr没有目的条带，啥也没有。苦闷死我了。我做的是大鼠骨骼肌的UCP3的表达。各位前辈下一步我该怎么做呀  
作者: 清风风铃    时间: 2011-9-14 17:48

有一点还得说明，我用的是trizol提的rna，用的是b－actin的引物，也没出结果连杂带也没有。目的条带ucp3是300多，actin是200多。
用一步法时的条件是 50 度25min，85度30s，60度30s，72度1.2min 25 个cycl
用2步法时的条件是rt 30度10min，50度25min，5度5min 1cycl
pcr 85度30s 60度30s 72度1.5min 25 cycl
不知是哪出了问题，怎么办呀
作者: 阿拉蕾    时间: 2011-9-14 17:49

一步法:50度30分,94度2分,(94度30秒,55度正负5度先做个梯度,72度45秒),35个循环,试试.你的目的条带片断并不长,72度1~1.5min 好像长了
作者: 阿拉蕾    时间: 2011-9-14 17:50

本人在做RT-PCR遇到一怪现象，即本人对同一动物不同组织扩增同一段基因，结果从一种组织中可以扩出我的目的基因，条带非常的好，而另一组织在同样的条件下却得到许多非特异性的条带，尝试其他条件同样无法得到满意的结果，百思不得其解！（注：已肯定该基因在两种组织中都表达，且内参照在两种组织都可扩增出来）
从这两种组织中提取的RNA的量是不一样的，我测过吸光度，差异还很大，会不会和这有关呢？ 请高手指教！

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是不是引物的特异性的问题,不同的组织里的非特异干扰也不一样
作者: 阿拉蕾    时间: 2011-9-14 17:50

我提取RNA用的是QIAGEN 公司的RNeasy MINI KIT
效果还好。而且样本间的均一性也可以呀。OD260/280总能在1.6-1.98之间
后来我又用trizol提取，却总是得不到满意结果。比值一直到不了1.4 我用酚氯仿抽提了两次还是不成。而且，每次都会有些RNA损失。真奇怪。大家得OD比值是多少呢？

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对,用QIAGEN 的试剂盒提取的效果要比trizol的好,
作者: 阿拉蕾    时间: 2011-9-14 17:51

我的RT-PCR有多条band,不知原因，请各位 帮忙。

在RT时，引物设计Random Primers 和Oligo dT-Adaptor Primer那个更好，我用的是Random Primers ；AMV RT 与MMLV RT 那个更好，我用的是AMV RT。

PCR时，我全选gene, 后用Primer 3.0 选primer 100bp~200bp. 同学说还是先选Gene的前1000bp,用此1000的前两行选一个primer，用此1000的后两行选另一个primer.更专一性一点，又可与primer dimer 区别。想问的是这一方法是否更好，是否更难批出产物，primer dimer 是否难以避免，因我看到有些公司的mannual的pcr图中都有primer dimer bands。我的primer Tm 为60度是否太低。

我的pcr 条件：

94oC, 2min
94oC, 30S
55oC,60S
72OC,45S
30cycles
72oC, 7min

另外pcr 时，这样减少蒸发，用加热的盖?

非常感谢各位化时间看我的贴。

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逆转录酶的选择要根据你扩增目的片段的长短以及是否需要完整的核酸末端而定,长的最好选superscript II,而短的可以选择其他两种,但是还要看是否具有RNase H活性.即便是同一种酶也不一样的
作者: 米米    时间: 2011-9-14 17:51

麻烦向各位大虾请教问题,我正在做RT_PCR,我从肿瘤组织中提RNA,质量还可以,可PCR了几次都是没有目的基因但内参条带很亮,为了排除模板的问题,我用肿瘤细胞提RNA,PCR后出现了目的条带,为什么呢?是我组织标本跟细胞相比相对不新鲜造成的吗?
另外我跑胶了发现我让上海申能博彩合成的上游引物(26bp)浓度明显低于下游引物(bp23),上游引物100pM1微升上样只隐约可见,而下游引物却非常亮,我两条引物都合成了2OD,为什么浓度相差这么大,是不是他们上游合成的不够2OD呀?急盼回复!谢谢!
作者: HOT兔    时间: 2011-9-14 17:52

一步法:50度30分,94度2分,(94度30秒,55度正负5度先做个梯度,72度45秒),35个循环,试试.你的目的条带片断并不长,72度1~1.5min 好像长了

谢谢前辈,我再试试吧你也是用的这个试剂盒吗
作者: 喵咪    时间: 2011-9-14 17:52

我作的是巢式ＲＴ－ＰＣＲ，用于抽提ＲＮＡ的试剂盒是QIAGEN 公司的RNeasy MINI KIT ，前半年效果很好，但是从上个月开始突然出现问题，内参总也跑不出来，但是目的产物却很清晰，就算新抽提的ＲＮＡ也是这样，而且加样孔里很亮，感觉跑不出来。　我取了一次ＰＣＲ后的产物跑胶，加样孔里没有东西，但是二次ＰＣＲ后的产物从上个月以来加样孔里总是很亮，内参跑不出来，这是什么原因呢？大家帮我分析分析阿，谢谢了！
我两次扩增的条件是一样的，目的产物有外引物，内引物两对，内参照只有一对引物，我用的试剂盒是ｔａｋａｌａ的ＭＲＮＡ selected PCR kit ,
作者: 喵咪    时间: 2011-9-14 17:53

巢式ＲＴ－ＰＣＲ中，我第一次加了外引物和内参照的引物，第二次加了内引物和内参照的引物，内参照的引物没有变，但是从我以前的实验结果来看，目的产物的增加很明显，但是内参照却不是这样，有的时候很模糊，有的时候比较清晰，不知道这是否和引物有关？我的目的产物长度是282bp,内参照长度是838ｂｐ，是不是这种现象也和扩增产物的长度有关呢？谢谢大家帮我分析分析，
作者: 小米虫子    时间: 2011-9-14 17:53

我正准备测定小鼠肺组织中某一基因的表达，在网上查了它的序列，来源是mouse(house mouse)，有时写的strain是BABL/c，而我用的是C57BL/6，我不知道这两种品系的小鼠基因序列是否应该相同呢？
我是一名新手，请指教！
作者: 魔法师A    时间: 2011-9-14 17:54

各位大虾，我是新人，已经做了两个月RT PCR了，死活作不出来：（
从培养细胞中取RNA，每次细胞在10的6次方到7次方，基因全长2.3kb，Promega的MMLV。400bp的b-actin曾经p出来过，1200bp的没有。盼高人指点！
作者: 魔法师A    时间: 2011-9-14 17:54

各位大虾，我是新人，已经做了两个月RT PCR了，死活作不出来：（
从培养细胞中取RNA，每次细胞在10的6次方到7次方，基因全长2.3kb，Promega的MMLV。400bp的b-actin曾经p出来过，1200bp的没有。盼高人指点！
作者: 绿茶公子    时间: 2011-9-14 17:54

我的课题是要构建一个真核表达载体，第一步就是通过RT-PCR扩增目的基因，非常不幸的是我已经奋战了一个多月，未果，内对照设的b-actin条带很亮，就是没有目的条带（768bp),我已对体系进行过优化，也无明显效果，引物序列已找多人核对，不知是什么原因，急死我了，那位好心大虾帮帮我！

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我和你一样啊，我的目的基因2.3kb，400bp的b-actin很亮。你是怎么解决的？
作者: 绿茶公子    时间: 2011-9-14 17:54

我的课题是要构建一个真核表达载体，第一步就是通过RT-PCR扩增目的基因，非常不幸的是我已经奋战了一个多月，未果，内对照设的b-actin条带很亮，就是没有目的条带（768bp),我已对体系进行过优化，也无明显效果，引物序列已找多人核对，不知是什么原因，急死我了，那位好心大虾帮帮我！

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我和你一样啊，我的目的基因2.3kb，400bp的b-actin很亮。你是怎么解决的？
作者: 冰激凌小姐    时间: 2011-9-14 17:55

我现在在做RT-PCR，已经P了近一个月了，可是每次做出来都得不到清晰的目的条带，总是云雾状的一片，也找不出原因，真是急死了！请有经验的高手帮忙看一下吧！

图片附件: 90407926.jpg (2011-9-14 17:55, 29.54 KB) / 该附件被下载次数 12
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=8567

作者: 冰激凌小姐    时间: 2011-9-14 17:55

从右边起依次是MARKER；以四种组织RT出来的CDNA为摸板P出的产物；怀疑摸板降解，新稀释CDNA做模板P出的产物；最左边的是actin内参！
请大家帮我分析一下，到底问题出在哪儿呀！
作者: 冰激凌小姐    时间: 2011-9-14 17:56

下面是我RT-PCR 扩增条带，在目的条带上面有一些条带，不知道是什么，求助！
（左边两条泳道）

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会不会是引物二聚体？？
作者: 冰激凌小姐    时间: 2011-9-14 17:57

请教各位大侠：
我将处理好的样品（细胞）拿到北京做实验，然后要提取RNA做差显，请问用什么试剂来保存细胞便于运输而不影响后续实验。
比较及，请各位大侠多多帮忙！
谢谢！

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听细胞组的老师讲，他们是把培养液加满带的！
一两天是没问题的，不过要小心污染！
作者: 大猫    时间: 2011-9-14 18:01

菜鸟问题：
请问rt-pcr时候用的参照物除了B-actin还有用什么呢？
作者: dior    时间: 2011-9-14 18:01

还有GADPH作内参！
作者: dior    时间: 2011-9-14 18:02

我们是将提取好后的总RNA放干冰运输！
作者: =菓子=    时间: 2011-9-14 18:03

做RT-PCR后用分光光度剂测量RNA量的时候，用什么方法处理装提取物的玻璃管？多谢！！
我们实验室采用DEPC水冲洗两遍，吸取1微升RNA溶解和99微升DEPC水就行。  
作者: 阿拉蕾    时间: 2011-9-14 19:24

一步法:50度30分,94度2分,(94度30秒,55度正负5度先做个梯度,72度45秒),35个循环,试试.你的目的条带片断并不长,72度1~1.5min 好像长了
作者: 我是一片云    时间: 2011-9-15 11:21

做RT-PCR后用分光光度剂测量RNA量的时候，用什么方法处理装提取物的玻璃管？多谢！！
我们实验室采用DEPC水冲洗两遍，吸取1微升RNA溶解和99微升DEPC水就行。

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浓度如果太低,OD值太小,准确性差,就要缩小稀释倍数,2ul+98ul,依此类推.
作者: 喵咪    时间: 2011-9-15 11:23

菜鸟问题：
请问rt-pcr时候用的参照物除了B-actin还有用什么呢？

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GADPH也可以的
作者: 哇啦    时间: 2011-9-15 11:24

1。我想请教一下，RT的引物如果同PCR的AS引物的话，会产生不良后果吗？
2。不同的目的RNA作RT时，体系相同吗？
3。RT的产物长度由反应的 时间决定吗？
敬请各位前辈指教，谢谢！
作者: 柠檬籽    时间: 2011-9-15 11:25

请教有哪位高手曾做过大鼠组织hsp90a的RT-PCR的，本人原未做过，不知如何设计引物，恳请帮忙！
作者: 柠檬籽    时间: 2011-9-15 11:26

我的引物序列是primer1:5'－ttttaagcttATGCCAGCTCTCCAGCTGCTGTTTCTGGC－3'
primer2:3'－GAAGTTGTACCAGTGGATcttaagccc－5'(其中小写的是酶切位点），而所要扩增的目的片断序列是cggtcc caagatgcca
gctctccagc tgctgtttct ggcctgcctg gtatggggaa tgggggccag gacagcacag
ttccgaaagg ccaacgatcg gagtggtcga tgccagtaca ccttcactgt ggccagcccc
agtgaatcta gctgcccaag ggaggaccag gccatgtcag ccatccagga ccttcagaga
gatagcagca tccagcatgc agacctagag tccaccaagg cccgggtcag atccctggag
agtctcctcc accagatgac ctcaggcgga gttactggga cccaggaggt ccaggagggg
ctacaaggcc agctgggtgc cctgaggaga gagcgggacc agctggagac ccaaaccagg
gatctggagg tagcctataa caatctcctg agagacaaat cagctttgga ggaagagaag
aggcagctgg aacaagagaa taaagatttg gccaggaggc tagaaggcag cagccaggag
gtagcaaggc tgaggagagg ccagtgtccc tcaacccacc acccctctca ggacatgttg
ccaggctcca gggaagtctc tcagtggaat ttggacacgt tggctttcca ggaactgaag
tcagaactaa cagaggttcc tgcttcccaa atcttgaaga atcaatctgg tcatcccagg
agcaaagagg gagacaaagg atgtggagtg ctaatgtggg taggagagcc agtcaccctg
aggacagctg agacaatcac tggaaagtat ggagtatgga tgagagaccc caagcccact
cacccctaca cccaggagac cacttggagg attgacacgg ttggcacagg catccgccag
gtgtttgagt acagtcagat aagccagttc gagcagggct atccttcaaa ggtccatgtg
ctcccccagg cactggaaag cacaggtgct gtggtgtatg cagggagcct gtatttccag
ggtgctgagt ccagaactgt gctcaggtat gaactgaaca cagaaacagt gaaggcagag
aaggaaattc ctggagctgg ctaccatgga cagttcccat acgcatgggg tggctacaca
gacatcgact tagctgtgga tgagagcggc ctctgggtca tctatagcac agaggaaacc
agaggagcca tagtcctctc caaattgaac ccagagaacc tggaacttga gagtacctgg
gagaccaaca tccgtaagca gtctgtggct aatgcctttg ttatctgtgg catcttgtac
acggtgagca gctactcttc agtccatgca accatcaact ttgcctatga cactaacact
gggatcagca agaccctgac catcccattc aagaatcgct acaaatacag cagcatggtc
gactacaacc ccctggagag gaaactcttt gcctgggaca acttcaacat ggtcacctat
gatatcaagc tctcagagat gtgaggagcc tctatcccta ccagagaagg cagaaaaagg
gggaagttcc aggctcccag gtga
请问我的引物设计的是不是有问题？因为我常常会出现一条与我的目的带相当近的大片断杂带。
那位前辈可以帮忙看一下吗？先行谢谢了！
作者: 桔囿    时间: 2011-9-15 11:27

各位前辈大家好，我有个问题请教，做RT-PCR也有一段时间啦，所有的目的条带都跑出来了，可唯独内参跑的不理想（我是分开跑的），我的内参用的是b-actin,不知道是怎么回事，请问各位前辈怎么解释这个事情，是不是内参引物设计或合成有问题啊，不过这个引物序列是文献查出来的，不知道各位前辈可否帮我出出注意，盼答复，急＋郁闷！谢谢
作者: 桔囿    时间: 2011-9-15 11:27

各位前辈大家好，我有个问题请教，做RT-PCR也有一段时间啦，所有的目的条带都跑出来了，可唯独内参跑的不理想（我是分开跑的），我的内参用的是b-actin,不知道是怎么回事，请问各位前辈怎么解释这个事情，是不是内参引物设计或合成有问题啊，不过这个引物序列是文献查出来的，不知道各位前辈可否帮我出出注意，盼答复，急＋郁闷！谢谢
作者: 微笑的海豚    时间: 2011-9-15 11:29

各位前辈大家好，我有个问题请教，做RT-PCR也有一段时间啦，所有的目的条带都跑出来了，可唯独内参跑的不理想（我是分开跑的），我的内参用的是b-actin,不知道是怎么回事，请问各位前辈怎么解释这个事情，是不是内参引物设计或合成有问题啊，不过这个引物序列是文献查出来的，不知道各位前辈可否帮我出出注意，盼答复，急＋郁闷！谢谢

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你好！
我提供一对我亲自用过、确实好用的b-actin引物序列：

Sense primer： 5' CACCAACTGGGACGACAT 3'
Anti-sense primer：5' CATACTCCTGCTTGCTGATC 3'

PP5分析结果：

图片附件: 85029882.png (2011-9-15 11:30, 14.83 KB) / 该附件被下载次数 10
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=8573

作者: 微笑的海豚    时间: 2011-9-15 11:30

而且，它除了可以扩增人的b-actin之外，还可以用于小鼠和大鼠。
下面附的图是采用Clustal X1.83比对的结果（蓝框部分即为上、下游引物所在位置）。

但愿对你有所帮助，祝顺利！

图片附件: 14830774.png (2011-9-15 11:31, 37.47 KB) / 该附件被下载次数 10
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=8574

作者: 庄梦蝶    时间: 2011-9-15 11:31

我想要可激活的primer express，谁有？
作者: 邓布利多    时间: 2011-9-15 11:34

请教各位大虾，我用Trizol提细胞的总RNA，老是提不出来，请问你们具体是怎么提的，一般时间是多长？还有就是引物的Tm值及引物的长度是指加上酶切位点还是不加？急盼回复，谢谢。
作者: 海鸥crazy    时间: 2011-9-15 11:35

一周前我摸条件,内参和目标产物都出来了,但产物丰度低,这几天用同样的模板怎么也跑不出产物,有时内参也跑不出,体系和模板没有问题,问了些高手,有的建议我换引物,有的建议我做巢式PCR,我向各位高手请教:巢式PCR如何作?内引物如何设计?对于低丰度的产物巢式PCR出结果的可能性有多大?我快被PCR折磨疯了!救救我吧!先谢谢了各位高手了!
作者: 桔囿    时间: 2011-9-15 11:35

非常感谢您的帮助，相信在您的帮助下我可以尽快跑出好看的b－actin！谢谢你啊！
作者: 喵咪    时间: 2011-9-15 11:36

请教各位大虾，我用Trizol提细胞的总RNA，老是提不出来，请问你们具体是怎么提的，一般时间是多长？还有就是引物的Tm值及引物的长度是指加上酶切位点还是不加？急盼回复，谢谢。

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具体怎么回事？怎么叫没有提出来？你跑胶了？
Tm值一般不加。
作者: 喵咪    时间: 2011-9-15 11:36

位前辈大家好，我有个问题请教，做RT-PCR也有一段时间啦，所有的目的条带都跑出来了，可唯独内参跑的不理想（我是分开跑的），我的内参用的是b-actin,不知道是怎么回事，请问各位前辈怎么解释这个事情，是不是内参引物设计或合成有问题啊，不过这个引物序列是文献查出来的，不知道各位前辈可否帮我出出注意，盼答复，急＋郁闷！谢谢

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内参一般来说有一个很广的温度范围都可以P出来，如果内参老出不来，而目的带有的话，考虑内参引物的问题－－降解可能性比较大，还有就是，种属没搞错吧？
作者: queen    时间: 2011-9-15 11:46

我刚来到这个讨论区，准备做RT-PCR,但还有很多不明白的，有几个问题请各位前辈答复：
１　我的蛋白有５０多ＫＤ，其mRNA也不短啊，能用一般的方法吗？
２　事先提取的总ＲＮＡ如何保存？
３　最后怎么对原样品中的目的ＲＮＡ定量？
作者: 回眸    时间: 2011-9-15 11:46

两个月前我模条件出了结果,但之后近2个月怎么也没结果,我重新做了模版,换了TAQ酶,dntp,换引物,试了近100次,天天P!结果今天才发现是BUFFER和DDwater出了问题!这是最不可能出问题的呀!!!可能是污染了!今天结果出来了非常漂亮!我从自己的经验教训中领悟到,实验的任何环节都可能出问题,只是相对难易.不能忽视小的地方,往往会造成实验的彻底失败!希望我的教训对大家有点帮助!祝你们幸运!
作者: 麻瓜    时间: 2011-9-15 11:47

我是分子生物学的超级新手,谁能给我一张RNA的电泳图吗?非常感谢.
作者: 大猫    时间: 2011-9-15 11:47

各位RT-PCR高手：
我接触RT-PCR刚3个月，提取总RNA，经0.8％琼脂糖电泳后，效果很是不错，把经验总结如下，有不足的地方请高手们严厉指出。
1、贴璧细胞按要求收集后，注意用生理盐水洗2次；
2、1ML Trizol最多能用于10^6个细胞数，多了也是浪费资源；
3、整个操作过程按要求戴口罩、帽子和手套，不要怕麻烦呀，这样总比反复重来要省事吧；
4、所有的Tips、EP管，用0.1%DEPC水处理，并高温灭菌；
5、全过程不应超过1小时，要知道RAN是很容易降解的；
6、用75％酒精洗RNA时，千万不要吝啬，除了保证2边外，离心速度和时间都可以相对延长；要让RNA乖乖的贴在管底；
其它的按照说明书就好了，推荐用SIGAMA 公司提供的TRIZOL。
不知道这些经验有用吗？做实验是不允许偷懒的。
有没有在细胞上测过TF的凝血时间？
作者: fangxiang    时间: 2011-9-15 11:48

泣血***求！
谁用过Promega的SV Total RNA Isolation kit抽提过血液细胞的总RNA？
小弟今年研2，用SV Total RNA Isolation kit结合SV Red Blood Cell lysis Solution在全血中提取总RNA，刚开始一两次效果帅呆了，现已有近一月再也提不出来了，极度郁闷中！！！！！！
老板不停的吵，压力太大！！！救我。
那位前辈做过，大家交流交流。
QQ:7353739
E-MAIL:volcano8000@sohu.com
在线等也行！你给个电话我打过去!!

主要问题是红细胞裂解不完全，操作手册说要裂解3次，我老是操作完了，下面还有好多红细胞沉淀，现在我把裂解液4度保存（相当于冰浴），加入后再静置5分钟（说明书上不用静置），操作4次，耗时1个半小时，红细胞倒是裂解好了，上柱后再耗时1个多小时，电泳RNA再也看不到了。请教技术支持，说是RNA降解了。怎么办？
作者: +田田+    时间: 2011-9-15 11:49

麻烦请问一下：为什么设计RT-PCR引物时根据文献给的Gene Bank 号和文献上的引物对不上号呢？设计引物有什么要点吗？本人目前想找到所要的序列自己设计一段引物，可是不知是哪个序列，因为对不上号所以不知是哪个序列。谢谢各位
作者: 冰激凌小姐    时间: 2011-9-15 11:49

在做RT-PCR的时候，我的目地片断没有内含子。
我是根据它的基因序列合成引物来做RT的，RNA我是用DNAase处理后用酚氯仿抽提。
但是这样能排除基因组DNA的污染么?
要怎么样设置对照实验啊？
作者: 王六六    时间: 2011-9-15 11:50

希望高手指教！我最近又作了预实验，发现杂带是由于DNA污染导致的，不知到除去污染后能否得到更强的主带，或者原本主带受抑制的能重新表达。
另外：希望高手指点用GIBCOL TRIZOL抽提RNA的注意事项。我用的试剂好像过了24个月，不知能否用，一直放在低温冰箱内。但是用他抽提新鲜组织都不能得到好的条带，操作应该没问题，不知是哪里出问题了，我们没有低温离心机，不知有无影响。我的RNA电泳用的是百分之二的琼脂糖，电泳液也没特殊处理，没做变性电泳。不知有无影响。
希望高手能给一个变性电泳的操作步骤，本人将万分感激！
作者: 喵咪    时间: 2011-9-15 11:50

primer primer 5.0软件网上有下载
算号器也贴出来了
你搜索一下
作者: 小米虫子    时间: 2011-9-15 11:51

我想问一下，提取rna的时候是不是所有的操作都该在超净台上，比如说电泳啊测浓度啊什么的，那些枪头都是用DEPC处理过的么？
作者: 椰子叶子    时间: 2011-9-15 11:51

个人认为5‘RACE难在加尾反应这一步

一般我们反转录之后的cDNA第一链量都不是很大

很难达到加尾酶的反应要求

以至于加尾效率不高

建议用好的加尾酶并在反应之前预变性以及适当延长反应时间
作者: guagua    时间: 2011-9-15 11:52

最近做实验一直不顺利，所以把问题拿出来请大家出出主意。
首先，我用的是Invitrogen公司的Trizol提取S-D大鼠心脏的总RNA，效果也很好，比值一般都在2.0左右，RNA电泳图也比较好；
而后，我使用了Invitrogen公司的SSⅡ反转录KIT进行反转录，使用的是oligo（dT）12-18，取1ul电泳，无条带
最后，使用Taq酶做内参的PCR，系统如下
10×PCR buffer 5ul
25mM MgCl2 3ul
dNTP 1ul
3‘，5’ primers 各1ul
cDNA 2ul
Taq酶 0.3ul
加dH2O至 50ul
反应条件是 94℃5‘，（94℃ 1’，55℃ 1‘， 70’ 1‘ ），70’ 5‘，4℃∞
25－30 cycles
其中引物为GAPDH，种属相同
电泳结果无！
作者: 年轮    时间: 2011-9-15 11:52

请教Tripure 提取细胞中总RNA的操作方法,越详细越好!
作者: 阿福    时间: 2011-9-15 11:53

我认为只有做同管扩增，才可能做半定量，这样各种条件可以一样。我想请教，两张用同样条件跑出来的电泳图，当其非内参照条带相对光密度增加程度不一样、且其所代表的基因能竟争抑制某种活性物质，请问此时能否将这两张电泳图中两组非内参照条带与内参照条带的相对比进行半定量比较，即是否具可比性。请高手指点。
作者: 阿拉蕾    时间: 2011-9-15 11:53

请教各位大虾，我用Trizol提细胞的总RNA，老是提不出来，请问你们具体是怎么提的，一般时间是多长？还有就是引物的Tm值及引物的长度是指加上酶切位点还是不加？急盼回复，谢谢。

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异丙醇沉淀的时候，混匀，放在-20度过夜再离心。我遇到过这样的情况。一般过夜可以解决。祝你好运
作者: 魔法师A    时间: 2011-9-15 11:54

各位同事大家好：
我因进行RT-PCR试验急需核酸序列分析软件包goldkey，可不知如何得到，敬请各位大虾指导。非常感谢！
作者: 阿拉蕾    时间: 2011-9-15 11:54

没着呀,只要烤的时候不打开烘箱就可以了

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正确，而且比锡箔好，不容易存水
作者: 不懂    时间: 2011-9-15 11:55

１.请问 用TaKaRa RNA PCR Kit (AMV) Ver. 3.0做RT-PCR,在RT时,样本总RNA是否可以超过1ug，我要Ｐ的目的基因在组织表达的ＭＲＮＡ的丰度不高，可不可以样本总ＲＮＡ超过１ug达到１－５ug．ＲＴ步骤参考试剂盒说明．
２．要Ｐ１５００ＢＰ的目的基因，用两步发ＲＴ－ＰＣＲ是否容易Ｐ出来？
３．我的引物ＴＭ值很底，ＦＯＲ－５６.４度　ＲＥＶ－５５.０度．初次
　　Ｐ用的退火温度是５０．０是不是有点底了？
　　ＰＣＲ：９４．０　５min
94.0 1min
50.0 45sec
72.0 4min
*35 cycle
72.0 5min
４．我的结果没有出来
求解？
作者: 葡萄籽    时间: 2011-9-15 11:55

请教各位高手，如何确定我的逆转录这一步做出来了呢。
做了近两个月的RT-PCR，还是没见到任何产物，恨不得跳楼！
我用分光光度计测过cDNA，结果78.3ug/ml, 当时很高兴，但后来人家告诉我很可能都是RT时加进去的dNTP，而且做PCR也做不出来啊！
作者: 喵咪    时间: 2011-9-15 11:56

１.请问 用TaKaRa RNA PCR Kit (AMV) Ver. 3.0做RT-PCR,在RT时,样本总RNA是否可以超过1ug，我要Ｐ的目的基因在组织表达的ＭＲＮＡ的丰度不高，可不可以样本总ＲＮＡ超过１ug达到１－５ug．ＲＴ步骤参考试剂盒说明．
２．要Ｐ１５００ＢＰ的目的基因，用两步发ＲＴ－ＰＣＲ是否容易Ｐ出来？
３．我的引物ＴＭ值很底，ＦＯＲ－５６.４度　ＲＥＶ－５５.０度．初次
　　Ｐ用的退火温度是５０．０是不是有点底了？
　　ＰＣＲ：９４．０　５min
94.0 1min
50.0 45sec
72.0 4min
*35 cycle
72.0 5min
４．我的结果没有出来
求解？

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1. 最好按照说明书的操作来进行试验，这个盒子效果一般，样本量最好不要超过1ug，如果超过对你的pcr体系会有影响，因为它的酶有一定要求。
2.你要P 1500bp 最好用高保真的酶，这个盒子恐怕不能满足你的要求。如果不用高保真的酶，那很可能出现错配。你的目的产物下一步是用来干什么的？如果是要表达，那一定要用高保真的酶；如果只是作半定量，那还可以勉强。不过最好p完后测一下序。建议用高保真的酶。
3.你的引物温度相差不是很大，我一般从温度较低的一个开始，如：ＦＯＲ－５６.４度　ＲＥＶ－５５.０度 那么我就用55度。其他地按照说明书即可。
4.结果没出来，很大原因RT那步的产物有问题。还可能是操作过程中的问题，如忘记加试剂等。本人以为TAKARA的这个盒子虽然很便宜，但不是很好用，相对来说一步法盒子好一些。而且这个盒子的量不足。最好能用invetrogen的盒子，但可能贵一些。
作者: 喵咪    时间: 2011-9-15 11:57

请教各位高手，如何确定我的逆转录这一步做出来了呢。
做了近两个月的RT-PCR，还是没见到任何产物，恨不得跳楼！
我用分光光度计测过cDNA，结果78.3ug/ml, 当时很高兴，但后来人家告诉我很可能都是RT时加进去的dNTP，而且做PCR也做不出来啊！

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那你做RT的时候用的什么引物？一般跑电泳就可以的。如果是随机引物，电泳结果是弥散的片状条带；如果是寡T或特异引物，那么应该是特意的条带。但从浓度反面很难判断，因为测的基本是核苷酸的浓度，间接反映DNA和RNA浓度。
作者: 不懂    时间: 2011-9-15 11:58

1. 最好按照说明书的操作来进行试验，这个盒子效果一般，样本量最好不要超过1ug，如果超过对你的pcr体系会有影响，因为它的酶有一定要求。
2.你要P 1500bp 最好用高保真的酶，这个盒子恐怕不能满足你的要求。如果不用高保真的酶，那很可能出现错配。你的目的产物下一步是用来干什么的？如果是要表达，那一定要用高保真的酶；如果只是作半定量，那还可以勉强。不过最好p完后测一下序。建议用高保真的酶。
3.你的引物温度相差不是很大，我一般从温度较低的一个开始，如：ＦＯＲ－５６.４度　ＲＥＶ－５５.０度 那么我就用55度。其他地按照说明书即可。
4.结果没出来，很大原因RT那步的产物有问题。还可能是操作过程中的问题，如忘记加试剂等。本人以为TAKARA的这个盒子虽然很便宜，但不是很好用，相对来说一步法盒子好一些。而且这个盒子的量不足。最好能用invetrogen的盒子，但可能贵一些。


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说的有道理,我的一个师姐用此盒子就出现了错配,
我的师姐告诉我他们RT用的总RNA达到1-5UG.结果出来了. 如用高保真的酶,问题是此酶,有没有3'到5'的外切酶活性,我想用T载体连接.怕没有 了AA末端.
作者: 不懂    时间: 2011-9-15 11:58

你可以查一下或向代理询问一下。应该有没有3---5 外切酶活性的高保真酶。你连接后要干什么？
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表达
作者: 喵咪    时间: 2011-9-15 11:58

表达

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如果是表达，那你一定的用高保真的酶了，如果不用，那表达出的蛋白就不是你想要得蛋白。看看invetrogen有没有你要的酶，他的酶是最好的，但是很贵！还有就是没有不具备3-5外切酶活性的高保真酶，之所以叫高保真，就是因为它有这种活性。
我给你一个方法可能管用，不是我做过是我同学这么做过，效果还行，你借鉴一下吧。首先先用高保真的酶P出目的基因，然后再用普通的酶在适宜的条件下温育即可加上AAAAAAAA的尾巴，可以和T载体相连。
不妨试一试，祝好运！
作者: 庄梦蝶    时间: 2011-9-15 11:59

我也想求助一下RT-PCR.我要从脾淋巴细胞中扩一个禽细胞因子.用的是上海华舜的RNA提取试剂盒.我需要的长度是700BP左右,扩了几次出来,但拿出去测序结果都不对.不然就扩不出来.用总RNA在普通的琼脂糖上跑电泳你10分钟时,能看到两条清晰的条带.19分钟只能看到一条清晰的条带,在点样孔较近的条带出出现类似RNA分解样的东西.请各位高手给我分析一下原因好吗.都做两个多月了都还是错的.我都快急死了.
作者: 微笑的海豚    时间: 2011-9-15 11:59

请问用TRIZOL从血清中提取丙肝RNA没有看到沉淀,结果也没有做出来是不是提取的问题啊,还有去除上清仍有少量可不可以烤一烤,温度是多少啊

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去除试管底的少量液体时，不必烤，可以再拿去离心一下，再用10或100 ul的枪小心吸取液体（注意不要让枪头接触管壁 ），然后直接以DEPC 水溶即可
作者: 微笑的海豚    时间: 2011-9-15 12:00

听细胞组的老师讲，他们是把培养液加满带的！
一两天是没问题的，不过要小心污染！

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回答基本正确，详见《体外培养的原理与技术》绿皮，精装，作者记不住了
作者: 嘉年华    时间: 2011-9-15 12:00

请教关于RT-PCR的技术
作者: 喵咪    时间: 2011-9-15 12:01

我也想求助一下RT-PCR.我要从脾淋巴细胞中扩一个禽细胞因子.用的是上海华舜的RNA提取试剂盒.我需要的长度是700BP左右,扩了几次出来,但拿出去测序结果都不对.不然就扩不出来.用总RNA在普通的琼脂糖上跑电泳你10分钟时,能看到两条清晰的条带.19分钟只能看到一条清晰的条带,在点样孔较近的条带出出现类似RNA分解样的东西.请各位高手给我分析一下原因好吗.都做两个多月了都还是错的.我都快急死了.

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原因可能有以下几点：
1）华舜的RNA 试剂盒不是太好用， 提的RNA不是很纯。你所提到的总RNA电泳有图吗？一般正常应该有三条带，28s，18s，5s。但如果RNA质量很高，5s是看不到的，28s应该是18s亮度的两倍。加样孔附近出现的不一定是RNA降解的产物，很大可能是DNA！
2）扩出的不是你想要的目的片段，很大程度说明你的引物有问题，可能有错配！仔细到NCBI上去比对一下，如果是马上重新设计引物！
作者: 黄永    时间: 2014-4-23 14:45

rt-pcr 时，RN A  和CDNA 都需要测浓度吗



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