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标题: 【求助】细胞免疫荧光 [打印本页]

作者: jude 时间: 2015-8-12 10:23 标题: 【求助】细胞免疫荧光

我目前正在做细胞免疫荧光,因为是第一次做,每一步都是摸索前进.第一次做出来的结果也不理想,希望各位有这方面心得的战友可否说明一下期间应该注意的问题呢?

作者: 箭头儿 时间: 2015-8-12 10:25

免疫荧光第一步的步骤几注意事项
1.首先是玻片的处理:泡酸去污, 冲洗, 晾干, 泡纯酒精脱脂, 蒸馏水洗(此时要用镊子夹着洗), 晾干备用.
2.不知道你做的细胞是贴壁比较好的细胞比如干细胞,还是贴壁不大好的细胞比如神经元
前者的话可以不用多聚赖氨酸包被玻片,后者爬片之前要包被多聚赖氨酸以免洗片时细胞掉片
3. 固定,我用的是预冷纯丙酮固定15分钟(应为丙酮有毒,操作的时候小心些),这步应该注意:丙酮很容易挥发,但又要保证固定期间不能干片,所以要多滴加丙酮,其间用盖子盖住,这一步不要在6孔板内进行,因为丙酮会将其熔化.
4. 不知道你的一抗是在胞浆表达还是在胞核表达
如果在胞浆表达,可以不用0.01%的TRITON X-100渗透(我前几次用了TRITON,结果胞核也表现出很强的荧光), 当然,如果一抗是在胞核内表达要用TRITON 渗透15分钟
5. 5%的正常山羊血清或是5%的BSA封闭,注意这一步不要洗,只是甩掉多余的封闭液.
6. 加一抗,根据你所做抗体的需求稀释,一般是先将稀释液加到EP管里,后加一抗.(一抗在吸出来之前要离心10-20秒),一抗的量要多加些,也是为了避免干片.
7. 孵育抗体:最好是4度冰箱过夜,这个过夜不是简单的过夜,一般要达14-16个小时,此时要将6孔板做成湿盒,目的是妨干片.在孵育期间不要随意搬动,以免抗体流失.
注意,PBS液的PH值要调在7.4左右

作者: 箭头儿 时间: 2015-8-12 10:26

相关疾病：
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免疫荧光第二步的步骤及注意事项
1. 等抗体孵育过后,取出洗片,这是要注意不要把不同抗体的片子混在一块了(比如冲洗玻片的吸头要一对一,冲完一种抗体后要去掉,换另一个再冲)
2. 洗后自然晾干,加荧光二抗(一般这也要摸个浓度,并不能按部就班地照着说明书上稀释),室温孵育45-60分钟,注意要避光,虽说荧光除非再紫外灯下才会淬灭的快,但操作时还是要注意避光
3. PBS洗,洗的时候还是要注意避光
4. 洗后自然晾干,加第二种荧光探针(我做的是一抗在胞浆表达,加第二种荧光谈针是染核,这样便于计数)孵育10-15分钟,避光条件下作用,洗片时也要避光.
5. 自然晾干后,50%缓冲甘油封片.

作者: qhyu 时间: 2015-8-12 10:27

楼上的战友总结挺全面的，下面我结合自己实验心得将特别需要注意的事项再补充一下：
1，接种细胞密度很重要。不要过密或者过稀，这点很重要，直接决定你实验结果的好坏；
2，关于固定问题。楼上战友用预冷纯丙酮，而我使用4%的多聚甲醛，效果还是不错的，固定一般室温，时间10分钟就足够了；
3，清洗是个关键步骤。免疫染色涉及好多清晰的步骤，因此在清洗的时候一定要小心谨慎，防止细胞被冲掉或挤到一起的现象发生；
4，加荧光标记的二抗时一定要注意避光，防止荧光淬灭。而且在荧光显微镜观察的时候也要注意防止光线过强。

作者: 箭头儿 时间: 2015-8-12 10:27

总之,首先,应该注意的是片子有没进行了脱脂处理;其二,注意洗片用PBS的PH植要在7.4左右;其三,固定,孵育一抗不能干片,孵育一抗时间要久;其四,多余的封闭液不能洗掉,只能甩干;其五,要注意避光
说了这么多,嘿嘿,最重要的一点是:你以后阐述问题的时候请具体一点,不要让回答问题的人遍地撒网,好累呀!!!

作者: 箭头儿 时间: 2015-8-12 10:28

楼上的各位都很有经验,佩服!
我也刚刚开始做荧光,做了一次,发现背景的荧光很强,要检测的荧光可以看到,但很弱,激
发一次拍照后几乎就没有,怎么回事儿?请高手指教!谢谢!

作者: qianqin1977 时间: 2015-8-12 10:28

QUOTE:

原帖由 箭头儿 于 2015-8-12 10:28 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

楼上的各位都很有经验,佩服!
我也刚刚开始做荧光,做了一次,发现背景的荧光很强,要检测的荧光可以看到,但很弱,激
发一次拍照后几乎就没有,怎么回事儿?请高手指教!谢谢! ...

背景强，有可能 1玻片是否处理得当；2洗片没洗干净；3洗片用的PBS很脏；4抗体用前没有稍离心，离心过后取上清进行稀释；5用的荧光二抗浓度太高，并不是说坑体浓度高就会增强荧光，相反，会增加背景染色。还有就是二抗得质量问题。
抗体淬灭得太快有可能 1操作过程中未避光（可能性不是很大），2二抗稀释不当（太稀了），3 二抗质量存在问题，我第一次做得时候是用中山分装得进口FITC，结果也是荧光很弱，我同学做也一样，后来甚至用了很高得浓度都不行，没办法，换二抗，换了SIGMA公司（博士得公司分装)的Cy3，荧光很强，我们实验室的老师一看就感叹：“漂亮”。
你不妨试试，祝好运！

作者: mimili_901 时间: 2015-8-12 10:28

请问操作的时候怎么避光啊,没有光我怎么操作啊!!!

作者: dior 时间: 2015-8-12 10:29

提到的加一抗时要离心，是多少温度，多大转速离心十几秒？
还有抗体稀释液从哪里可以买得到？主要成分是什么？有没有含破膜剂？可不可以用含破膜剂的PBS代替？
还有，串色了，应该从哪些方面克服？
谢谢！
charles97 ：
关上门，拉上窗帘（最好是透一点光，不然不好操作的），我们是这样避光的。

作者: 箭头儿 时间: 2015-8-12 10:30

谢谢你的指导。
还有个问题想咨询。就是一抗用之前为什么必须得离心呢？

作者: 箭头儿 时间: 2015-8-12 10:30

QUOTE:

原帖由 mimili_901 于 2015-8-12 10:28 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

请问操作的时候怎么避光啊,没有光我怎么操作啊!!!

在操作过程中避光只是个相对的概念,比如不要对着光,洗片和孵育时用不透光的锡箔纸或是黑色的塑料纸包好.其实只要你的荧光二抗质量够好,荧光也没那么快淬灭,一般来说,避光是避免紫外光.
祝好运!!

作者: 箭头儿 时间: 2015-8-12 10:31

提到的加一抗时要离心，是多少温度，多大转速离心十几秒？
还有抗体稀释液从哪里可以买得到？主要成分是什么？有没有含破膜剂？可不可以用含破膜剂的PBS代替？
还有，串色了，应该从哪些方面克服？
谢谢！
charles97 ：
关上门，拉上窗帘（最好是透一点光，不然不好操作的），我们是这样避光的。
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1.离心是为了怕抗体有沉渣(当然这个不一定,进口的质量好的就不存在,但也要预防分装公司在分装过程中出现什么问题)而影响结果; 2.因为抗体会挥发到盖子上,而这些抗体都比较珍贵,所以建议离心. 因为离心只是以上两点主要作用,所以不要求温度和转速,只要把离心机打开5秒左右后就关上
我都是用PBS稀释的,当然,很多代理公司都可买到稀释液,不过我还没买过,嘿嘿,替老板节省嘛,就连便宜的要死的PBS都全是自各配的. 我上面说过,如果你的一抗是在胞浆表达,就不用破膜剂,除非在胞核表达,你可以用0.01-0.1%的TRITON-X-100进行渗透.
我不明白着窜色是什么意思,是不是,该在胞浆显色的二抗结果在胞核表达很强的荧光?这个是我刚开始做的时候也是这样,就是用了所谓的破膜剂TRITON,有一次因为边做边吃饭而用的时间也长了,结果几乎都在胞核里出现,胞浆反而弱,所以我后来干脆就不用TRITON 渗透了,效果好了! 还有你所谓的窜色是不是该在胞核表达的荧光在胞浆也可看到淡淡的一层呢?这个正常,照片照出来后你只要调一下背景,把背景调黑,这不仅看不到你所说的窜色,而且照片也漂亮 ,很简单的,这个只需要你对荧光显微镜多了解一点就行了.
不知道我说清楚了没,祝好运!!!

作者: 箭头儿 时间: 2015-8-12 10:32

谢谢你的指导。
还有个问题想咨询。就是一抗用之前为什么必须得离心呢？

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嘿嘿,不用太客气,谈不上什么知道,我也只是把自己做实验时自己的一点体会说出来而已
关于为什么要离心,你参考一下我回答上位战友的帖就行了.
祝好运!

作者: ns5fan 时间: 2015-8-12 10:32

准备做内皮细胞的免疫荧光，有几个问题请教一下高手
1. 内皮细胞为贴壁细胞，载玻片是否还需要用明胶包被？
2. 固定液有丙酮、甲醛、多聚甲醛等，哪种效果好？各自的浓度及固定时间是多少？
3. 抗原为细胞膜表面表达，荧光抗体为直接标记，这种抗体结合要作用多长时间？温度？
4. 有两种荧光标记物，分别为PE和FITC，请问各自的激发光波长和滤光片波长为多少？
请这方面有经验的战友不吝赐教。谢谢！！！

作者: 箭头儿 时间: 2015-8-12 10:33

内皮细胞为贴壁细胞，载玻片是否还需要用明胶包被？

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用不用明胶，看你的细胞贴壁状况如何？细胞爬片后是不是容易脱落。如果不脱落，就不用包被了。

作者: 箭头儿 时间: 2015-8-12 10:34

固定液有丙酮、甲醛、多聚甲醛等，哪种效果好？各自的浓度及固定时间是多少？

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我们检测的是蛋白，我想你用100%的丙酮4度固定10-15min应该可以。附图1可参考

图片附件: 86831068.snap.jpg (2015-8-12 10:34, 57.98 KB) / 该附件被下载次数 17
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=36232

作者: 箭头儿 时间: 2015-8-12 10:34

有两种荧光标记物，分别为PE和FITC，请问各自的激发光波长和滤光片波长为多少？

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上图可参考

作者: zzzz 时间: 2015-8-12 10:35

我最近也做免疫荧光，用的是红色的染料CY3，发现一个问题，这个荧光2抗非特异性太强了，染出来的照片是很漂亮，但是一看只加CY3的二抗对照，也是有很强的染色，几乎没什么差别，这个问题怎么解决啊？通过降低稀释度或多次清洗能减弱或避免非特异性着色吗？

作者: caihong 时间: 2015-8-12 10:35

楼上的朋友们说的太好了，真是受益匪浅，谢谢你们的帮助。我决定不用tritonx-100了，细胞核里面的光太强。谢谢。祝你们实验顺利。呵呵

作者: am10 时间: 2015-8-12 10:36

我最近也做免疫荧光，用的是红色的染料CY3，发现一个问题，这个荧光2抗非特异性太强了，染出来的照片是很漂亮，但是一看只加CY3的二抗对照，也是有很强的染色，几乎没什么差别，这个问题怎么解决啊？通过降低稀释度或多次清洗能减弱或避免非特异性着色吗？

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我也准备用CY3，不知到你的稀释度是多少？我准备用1：50，不知道行吗？二抗也有荧光你要注意有没有过程干片子的可能，或者你PBS洗时没换枪头

作者: zhy平平 时间: 2015-8-12 10:37

我也准备用CY3，不知到你的稀释度是多少？我准备用1：50，不知道行吗？二抗也有荧光你要注意有没有过程干片子的可能，或者你PBS洗时没换枪头

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不知道你的红色荧光解决的怎么样了？我前一阵子也在做组织的免疫荧光，但是背景色非常严重，当时用了1:200的二抗。

作者: zhy平平 时间: 2015-8-12 10:37

我最近也做免疫荧光，用的是红色的染料CY3，发现一个问题，这个荧光2抗非特异性太强了，染出来的照片是很漂亮，但是一看只加CY3的二抗对照，也是有很强的染色，几乎没什么差别，这个问题怎么解决啊？通过降低稀释度或多次清洗能减弱或避免非特异性着色吗？

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我也出现了这样的情况就是加了一抗和不加一抗的组织标本片子都出现了局部增强的染色。
请问你的问题解决了吗？可否有什么经验分享？

作者: cj_mondy 时间: 2015-8-12 10:37

谢谢以上战友的经验，在这问楼主一下，我们用的BSA是不是最好现配现用好，我第一次做的结果还行，这次做的是用的十天前配的BSA，最后结果不太好，会不会是和这个有关呢？感觉做的步骤应该没啥错误，谢谢指点！

作者: vcve 时间: 2015-8-12 10:38

谢谢以上战友的经验，在这问楼主一下，我们用的BSA是不是最好现配现用好，我第一次做的结果还行，这次做的是用的十天前配的BSA，最后结果不太好，会不会是和这个有关呢？感觉做的步骤应该没啥错误，谢谢指点！

作者: gogo 时间: 2015-8-12 10:38

不错不错，请问一抗、二抗和各种细胞器染料的稀释比例一般是多少啊？我知道不同抗体的稀释比例不一样，但是大体范围是多少啊？

作者: qhyu 时间: 2015-8-12 10:38

请问把6孔板做成湿盒是何意啊，偶才开始做这个，所以不太理解啊，谢了

作者: ha111 时间: 2015-8-12 10:39

各位战友，如果一抗做免疫印迹效果不好的话，还有必要试试免疫荧光吗？还是再买一个抗体呢？（说明书上写着能做免疫荧光）

作者: xevin 时间: 2015-8-12 10:39

想请教下各位，我在荧光显微镜下观察细胞免疫染色时遇到了串色的问题，应该怎么解决？
细节是这样的我蓝色激发光观察我转染的GFP蛋白，此时理论上只显示绿色荧光，但是这时部分细胞区域和非细胞区域出现了偏黄色和黄色荧光（因为我的目的蛋白标记的是FITC红色荧光），这时的现象解释应该是红+绿=黄；
所以我想问下大家这是什么情况？为何激发产生绿光时，还出现了红色荧光的重叠，是为什么？如何解决？是不是我二抗稀释度太低，而造成背景混杂，而出现的影响？还是什么原因，非常感谢！

作者: october7 时间: 2015-8-12 10:39

QUOTE:

原帖由 xevin 于 2015-8-12 10:39 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

想请教下各位，我在荧光显微镜下观察细胞免疫染色时遇到了串色的问题，应该怎么解决？
细节是这样的我蓝色激发光观察我转染的GFP蛋白，此时理论上只显示绿色荧光，但是这时部分细胞区域和非细胞区域出现了偏黄色和黄色荧光（因 ...

荧光显微镜参数设置不恰当导致激发光不正确所致，我DAPI染色时也遇到过类似问题，把显微镜设置弄明白就好了。

作者: xyw5 时间: 2015-8-12 10:40

难得的好贴，学习了。我想请教一个问题，就是我在拍照的时候发现我的DAPI（紫外光激发）不仅被紫外光激发，而且当我用蓝光和绿光激发的时候，也能在视野里看到相应的荧光，蓝光下显绿色，绿光下是红色，不过绿光下的荧光比较弱，我想问一下是不是DAPI的问题，比如降解了，还是显微镜参数设置的问题？

作者: zzzz 时间: 2015-8-12 10:40

我最近也在做细胞免疫荧光，麻烦问一下我的抗体说明书写了可以做免疫组化，western，流式，不知道这个抗体可不可以做细胞免疫荧光呢？还有就是我的抗原在细胞膜上表达，做的时候要不要通透处理呢？
还有：
我最近也做免疫荧光，用的是红色的染料CY3，发现一个问题，这个荧光2抗非特异性太强了，染出来的照片是很漂亮，但是一看只加CY3的二抗对照，也是有很强的染色，几乎没什么差别，这个问题怎么解决啊？通过降低稀释度或多次清洗能减弱或避免非特异性着色吗？
恳请相关人士帮我解答非常感谢啊！！！

作者: happylife123 时间: 2015-11-17 09:39

免疫荧光具有：特异性强、敏感性高、速度快的特点，在临床上具有越来越重要的作用。全自动化学发光免疫分析仪是通过检测患者血清从而对人体进行免疫分析的医学检验仪器。其工作原理是：将定量的患者血清和辣根过氧化物（HRP）加入到固相包被有抗体的白色不透明微孔板中，血清中的待测分子与辣根过氧化物酶的结合物和固相载体上的抗体特异性结合。分离洗涤未反应的游离成分。然后，加入鲁米诺Luminol发光底液，利用化学反应释放的自由能激发中间体，从基态回到激发态，能量以光子的形式释放。此时，将微孔板置入分析仪内，通过仪器内部的三维传动系统，依次由光子计数器读出各孔的光子数。样品中的待测分子浓度根据标准品建立的数学模型进行定量分析。最后，打印数据报告，以辅助临床诊断。

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