分析测试百科

标题: 【求助】测量蛋白质浓度的方法 [打印本页]

作者: p1900 时间: 2015-8-28 16:22 标题: 【求助】测量蛋白质浓度的方法

最近投了一篇稿子，审稿人置疑了我测量蛋白质浓度的方法。
我实验中用的是牛血清蛋白BSA，用磷酸盐配成的pH7.0缓冲溶液，用紫外吸光280nm测标准曲线，然后去测未知样浓度。
审稿人置疑这种方法和Bradford法或Lowry法，哪个更好？还指出我没有提供有根据的文献，说这种根据氨基酸测量蛋白浓度的方法不可靠。
本人化工的，对蛋白质这块了解不多，BSA只是作为一种模拟物系才用到的，希望高人指点！谢谢！

作者: danzi 时间: 2015-8-28 16:22 标题: 回复

这种直接测280nm吸光值的方法当然不如其他化学反应显色法，灵敏度一般低1-2个数量级。另外非常易受其他杂质的干扰

作者: 青青草 时间: 2015-8-28 16:23 标题: 回复

我用的体系里面只有BSA和磷酸缓冲液两种组分，且磷酸盐组分在各个样品中浓度保持一致，这样相当于只有BSA单一组分，其他组分对测量的影响就几乎可以忽略了吧

作者: 跳跳哈里 时间: 2015-8-28 16:23 标题: 回复

你的目标蛋白也是BSA么？如果不是，不能用280nm来测量，每种蛋白的extinction coefficient不一样的

作者: 小熊妮妮 时间: 2015-8-28 16:24 标题: 回复

我只用到1种蛋白，就是BSA，没有别的蛋白了，这样能测吗？

作者: 蓝色雨梦 时间: 2015-8-28 16:25 标题: 回复

我用的体系里面只有BSA和磷酸缓冲液两种组分，且磷酸盐组分在各个样品中浓度保持一致，这样相当于只有BSA单一组分，其他组分对测量的影响就几乎可以忽略了吧

作者: 美人鱼 时间: 2015-8-28 16:25 标题: 回复

你用的这种方法太粗犷了，准确度比Bradford法低很多。其实如果有条件的话，买个蛋白质定量kit，一切都搞定了......

作者: 大嘴猴 时间: 2015-8-28 16:26 标题: 回复

能测，不过看你的标准曲线了

作者: malong 时间: 2015-8-28 16:26 标题: 回复

我们实验室一般Bradford法测
买个5*的公司试剂，到时候直接加水加蛋白溶液五分钟搞定

作者: n111 时间: 2015-8-28 16:27 标题: 回复

能详细的解释一下么？
灵敏度为什么低呢？

作者: 小熊妮妮 时间: 2015-8-28 16:28 标题: 回复

Commassie法优点是：
1.灵敏度高，据估计比Lowry法约高四倍，其最低蛋白质检测量可达1ug。这是因为蛋白质与染料结合后产生的颜色变化很大，蛋白质－染料复合物有更高的消光系数，因而光吸收值随蛋白质浓度的变化比Lowry法要大的多。
2.测定快速、简便，只需加一种试剂。完成一个样品的测定，只需要5分钟左右。由于染料与蛋白质结合的过程，大约只要2分钟即可完成，其颜色可以在1小时内保持稳定，且在5分钟至20分钟之间，颜色的稳定性最好。
3.干扰物质少。如干扰Lowry法的K+、Na+、Mg2+离子、Tris缓冲液、糖和蔗糖、甘油、巯基乙醇、EDTA等均不干扰此测定法。
此法的缺点是：
1.由于各种蛋白质中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，因此Bradford法用于不同蛋白质测定时有较大的偏差，在制作标准曲线时通常选用g—球蛋白为标准蛋白质，以减少这方面的偏差。
2. 仍有一些物质干扰此法的测定，主要的干扰物质有：去污剂、Triton X-100、十二烷基硫酸钠（SDS）和0.1M的NaOH。（如同0.1M的酸干扰Lowary法一样）。
3. 标准曲线也有轻微的非线性，在0-1000ug/ml浓度范围内有较好线性。因而不能用Beer定律进行计算，而只能用标准曲线来测定未知蛋白质的浓度。
BCA法特点： 1. 灵敏度高，检测浓度下限达到25μg/ml，最小检测蛋白量达到0.5μg，待测样品体积为1-20μl 。 2. 测定蛋白浓度不受绝大部分样品中的去污剂等化学物质的影响，可以兼容样品中高达5%的SDS，5%的Triton X-100，5%的Tween 20，60，80。 3. 在20-2000μg/ml浓度范围内有良好的线性关系。 4. 检测不同蛋白质分子的变异系数远小于考马斯亮蓝法蛋白定量。 5. 受螯合剂和略高浓度的还原剂的影响：EDTA小于10mM。DTT小于1mM巯基乙醇低于1mM
BCA法和Commassie法各有优势，在不知道蛋白样本缓冲液成分的情况下可以两种方法配合使用，以消除定量的误差。

作者: 大大 时间: 2015-8-28 16:28 标题: 回复

如果我的样品里面有4%SDS和25mM DTT，有能测的试剂盒吗？谢谢

作者: 小妖精@ 时间: 2015-8-28 16:29 标题: 回复

如果我的样品里面有4%SDS和25mM DTT，蛋白浓度可能不高，稀释怕小于最低检测限，有什么办法能测吗？谢谢

作者: qinqinai 时间: 2015-8-28 16:30 标题: 回复

样品可以在别的缓冲液里不？可以的话可以超滤置换缓冲液后测定，直接测定可能会有影响。

欢迎光临分析测试百科 (http://bbs.antpedia.com/)