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标题: 【求助】为什么老是有引物二聚体出现给怎么办? [打印本页]

作者: bs4665 时间: 2015-8-31 17:32 标题: 【求助】为什么老是有引物二聚体出现给怎么办?

我PCR扩增人基因组DNA的时候,老是有引物二聚体出现.我试着降低引物浓度到0.1(20μM),还是有出现,而且引物二聚体的位置好象还在100-200bp之间，不知道这到底是不是二聚体啊，还是四聚体啊？

作者: dior 时间: 2015-8-31 17:32

你这100-200bp的片段不一定是引物二聚体，可能是非特异扩增的小片段条带。你可以引物浓度不变，降低一下褪火温度。

作者: bs4665 时间: 2015-8-31 17:42

你这100-200bp的片段不一定是引物二聚体，可能是非特异扩增的小片段条带。你可以引物浓度不变，降低一下褪火温度。

作者: bs4665 时间: 2015-8-31 17:58

降低退火温度了，那非特异条带不是会更多的，嘛
而且我也试过。结果没有什么改变啊

作者: dhpbj 时间: 2015-8-31 17:58

降低退火温度了，那非特异条带不是会更多的，嘛
而且我也试过。结果没有什么改变啊

作者: zbboom 时间: 2015-8-31 17:59

除了做引物浓度梯度，可以降低一下Mg离子浓度，或者干脆做一个镁离子浓度梯度，降低退火温度肯定是非特异产物更多的

作者: S6044 时间: 2015-8-31 18:00

是不是引物设计的有问题呢？设计好引物后还要对靶基因中潜在的引物进行分析，这些位点应该不会形成同源多聚体结构，也没有明显的形成二能结构的趋势，不会自身互补，与基因组中的其他序列无显著的同源性。你应该先考虑引物自身的问题。如果确认没有问题，再考虑其他原因。

作者: youyou99 时间: 2015-8-31 18:00

引物二聚体的出现是相对的，并不是单纯因为你的条件而导致二聚体的出现，事实上如果引物更倾向于和目的片断结合，正常pcr扩增的话，那引物二聚体就基本不会出现了，换句话说，如果你能扩增出目的条带，那么同样的条件，撤去模板，进行pcr循环就有可能出现引物二聚体。引物二聚体的出现并不可怕，只是说明你的引物不是最佳，但不直接决定能否扩增出来，通常只要引物和目的片断有一定的配对区，摸索合适的pcr条件，应该是能扩增出来的。
拿我的实验为例，我的目的片断GC含量较高，在未加DMSO之前，怎么优化条件，总是扩不出目的片断，而电泳前端的引物二聚体倒是常常光顾，且亮度挺高，当向体系中加入1.5μl的DMSO后，终于扩出了目的片断，而且二聚体也不攻自破了

作者: dhpbj 时间: 2015-8-31 18:00

原因之一：
引物二聚体的出现太多，说明你的扩增效率不高，也就是说很多引物没有被用来参与PCR的扩增，尤其是目的片段少的情况下，更能用此解释。你可以检查一下你的扩增产物是不是很多。
单纯依靠降低退火温度，不能解决这一问题，反而会增加非特异扩增的机会。
建议你先摸索一下退火温度，提高退火温度常可解决问题。
从你的条带位置看，不像是二聚体，到像是非特异扩增的条带，很可能引物设计的不好，还有另一位置扩增效率更高，因为条带短，更容易扩增出来。
另外，你用的引物浓度也太高了。正常情况下，终浓度0.1-1uM。

作者: zhezhe 时间: 2015-8-31 18:01

建议延长一下退火时间

作者: eor 时间: 2015-8-31 18:01

100-200bp应该是非特异的扩增条带
可以提高退火温度以及降低Mg2+浓度试试
你没有说除了100－200bp的条带还有没有你要扩增的目的条带？
比例是多少？
如果有你要的扩增条带，量还可以
那没关系呀，把你要的条带切胶继续往后做克隆
如果没有你要的扩增条带，建议你重新设计引物好了
有时候你反复摸PCR条件还不如你重新设计合成引物来的快

作者: remenb 时间: 2015-8-31 18:02

我也正郁闷着，扩增了一个多月，老是只有100~200BP的带，不知道为何物？我的目标片断在2500BP。正烦着呢！请问楼上是否现在一切顺利！！

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