分析测试百科

标题: 【求助】抗凝血DNA的提取 [打印本页]

作者: memory 时间: 2015-8-31 18:15 标题: 【求助】抗凝血DNA的提取

本人要做抗凝血DNA的提取（EDTA抗凝），但是我想问一下可以库存后再做么？可以在-20度放多久？需要特殊处理么？有无实验步骤发来？谢谢！

作者: H2O 时间: 2015-8-31 18:15

可以库存的。最好在－80度。
一般不需要特殊步骤，冻溶之后按照正常提取DNA的步骤来做就可以了
我是做PCR的，应该没问题

作者: H2O 时间: 2015-8-31 18:15

千万不要用肝素抗凝，那样PCR做不出来的

作者: remonte 时间: 2015-8-31 18:16

谢谢！那么我们没有-80度冰箱，只有-20度的怎么办？

作者: memory 时间: 2015-8-31 18:16

谢谢！那么我们没有-80度冰箱，只有-20度的怎么办？

作者: 阿k 时间: 2015-8-31 18:17

我们这儿的科室做HLA分型时，正是用EDTA抗凝的全血提取DNA。我们一般先将标本分装成2～4个EP管，冻存于零下20度冰箱中，存放时间很长，半年没问题，只要不是反复冻溶全血标本就可以了。

作者: gmjghh 时间: 2015-8-31 18:17

DNA非常稳定的，特别是只需要它做PCR的时候，因为这时对DNA的完整性要求不高（有人为了提高PCR效率，特别将基因组DNA打断或酶切一下）
DNA酶在－20℃没有活性的，放心好了。
我曾经有几管EDTA抗凝血，在4°C放了一个多月，PCR非常好。

作者: gmjghh 时间: 2015-8-31 18:17

QUOTE:

原帖由 H2O 于 2015-8-31 18:15 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

千万不要用肝素抗凝，那样PCR做不出来的

我觉得不一定，我们用的抗凝剂都是肝素，但PCR效果也不错的。

作者: veiwu 时间: 2015-8-31 18:18

可以库存. 如短期内提取，可以存放在-20冰箱。但如果近期不提，最好存放在
-80度冰箱，保险些。

作者: H2O 时间: 2015-8-31 18:18

我用肝素抗凝的做过，平均只有20％出结果，其余都没有结果！
用EDTA抗凝的，全有结果

作者: dhpbj 时间: 2015-8-31 18:18

各位大侠，能否传个Protocal上来呀？我们老师非让用自己配的试剂提取，不让用试剂盒，用不用提取前对血进行WBC的分离处理？小妹在等！！

作者: yes4 时间: 2015-8-31 18:19

Protocal
1. 分离外周血白细胞
(1)取患者肘静脉血5ml，EDTA抗凝，2500rpm离心10 min。
(2)小心吸取上层血浆，分装到3个0.5ml离心管中。
(3)在血细胞中加入3倍体积的溶血液，摇匀，冰浴15 min。
(4)2500rpm离心10 min，弃上清。
(5)加入10ml溶血液，摇匀，冰浴15 min。
Devil3000rpm离心10 min，弃上清。
(7)倒置离心管，去掉残液。
Musical Note得白细胞，－80ºC冻存。
2. 从白细胞中提取基因组DNA
(1)取白细胞，加4.5ml SE，使劲吹打，混匀。
(2)沿管壁加入0.5ml的10％SDS。
(3)加蛋白酶E 50μl／管。
(4)首尾轻摇10 min，混匀。
(5)37ºC水浴过夜。
Devil第二天取出，沿管壁加3 ml饱和NaCL，迅速手摇15秒，使蛋白变性析出。
(7)4000rpm离心10 min。
Musical Note取出上清，放于另一管中，加入等体积的三氯甲烷，混匀15 min。
(9)2500rpm离心10 min。
(10)取出上清，加入等体积的三氯甲烷，混匀10 min。
(11)2500rpm离心10 min。
(12)取上清，转入50ml管中，加3倍体积无水乙醇。
(13)首尾轻摇，见DNA絮状沉淀析出。
(14)将DNA挑至管壁，75％乙醇洗涤2遍。
(15)将DNA挑至0.5ml管中，冻干。
(16)加TE 300μl，使DNA溶解，4ºC保存。

作者: yes4 时间: 2015-8-31 18:19

1. DNA提取用试剂
灭菌双蒸水(ddH2O)
0.1M HCL: 10M HCL1ml加99mlddH2O。
0.1M Tris: 1.21gTris加ddH2O溶解定容至100ml。
0.1M Tris- HCL(pH8.0): 0.1M HCL58.4ml加0.11M Tris碱100ml。
0.5M EDTA(pH8.0)：称取186.1g Na2EDTA.2H2O, 用700mlddH2O溶解,用10M NaOH调校至pH8.0(50 ml)。
低渗溶血液：氯化铵7.01g,碳酸氢钾0.07g,加ddH2O定容至1000ml。
SE: 醋酸钠1.36g,氯化钠4.38g, 用400mlddH2O溶解, 冰醋酸调pH至5.6, 定容至500ml。
蛋白酶E: 10 mg/ml
TE: 1M Tris- HCL(pH8.0)1ml, 0.5M EDTA(pH8.0)0.02 ml, 加ddH2O至100ml。

作者: yes4 时间: 2015-8-31 18:19

上面方法简单、省钱

作者: seagate 时间: 2015-8-31 18:19

我看很多书上说用ACD抗凝更好，不知道是不是这样呢？

作者: seagate 时间: 2015-8-31 18:20

还有问个比较菜的问题，EDTA抗凝用的是干粉吗？和血液的体积之间需要什么比值关系吗？

作者: kewanqi2011 时间: 2015-8-31 18:20

还有问个比较菜的问题，EDTA抗凝用的是干粉吗？和血液的体积之间需要什么比值关系吗？
当然不是用干粉，配成0.5MOL/L的浓度，一般我抽5ml血，加65ul的EDTA，但要混匀，个别还是有凝血，但EDTA又不能加的太多，否则影响DNA的提取

作者: iii_ii 时间: 2015-8-31 18:21

EDTA抗凝用2.5%的溶液，与血液之间体积比一般是1:10

作者: wawa 时间: 2015-8-31 18:21

如果用陈血用试剂盒提取DNA，第一步请一定用三蒸水裂解红细胞两到三次，新鲜血不用，后面的就可以按照步骤做，这样效果会好一点。

作者: hustwb 时间: 2015-8-31 18:21

DNA的提取和纯化
1 DNA提取
⑴ 新鲜外周静脉血3~5ml，以ACD（柠檬酸纳缓冲液）1/7体积抗凝；
⑵ 3500rpm 15分钟离心，吸除上层血浆；
⑶ 加5倍体积蒸馏水（灭菌），摇匀，静置5~10分钟，3500rpm15分钟离心，去上清，（若沉淀不够，可重复1~2次）；
⑷ 吸取沉淀（少许液体）放入1.5ml离心管，STE 清洗2次；12000rpm 7~8分钟离心；
⑸ 去上清后加0.5mlSTE，10%SDS 25~30ml，蛋白酶-K 5μl（100μg/ml）37℃消化过夜，直至沉淀物溶解为止；
⑹ 等体积饱和酚，倒转摇匀10分钟。12000rpm 5分钟，离心，吸上层入另一1.5ml离心管；勿吸入蛋白层；
⑺ 上清液加等体积酚：氯仿：异戊醇（25：24：10），倒转混匀10分钟。12000rpm 5分钟，离心，吸上层入另一1.5ml离心管；
⑻ 上清液加等体积氯仿：异戊醇（24：1），倒转混匀10分钟，12000rpm5分钟，取上清入另一管；
⑼ 加1/12体积3M 醋酸钠，混匀后再加3倍体积的4℃无水乙醇，轻柔振摇；应出现白色絮状物（DNA）；于-20℃放置20~30分钟，12000rpm 低温（4℃）离心10分钟，沉淀DNA，去上清；
⑽ 加1ml 70%乙醇洗涤，12000rpm 低温（4℃）离心10分钟，去上清，重复1次；
⑾ 自然干燥后，用pH8.0TE溶解，保存在-20℃备用。
2 DNA浓度的测定取15ul DNA 标本加1485μl 双蒸水，充分混匀后，用紫外分光光度计测定波长分别为260nm、280nm、330nm时的OD值，计为OD260、OD280、OD330，计算浓度和比值，判断DNA的浓度和纯度。
DNA浓度（μg/ml）=（OD260-OD330）×50μg/ml×稀释倍数（100）
DNA纯度=（OD260-OD330）/（OD280-OD330）
若DAN纯度<1.6, 表明有残存酚或蛋白含量太高，用氯仿抽提纯化。
3 DNA的纯化
⑴ 加等体积氯仿；异戊醇，轻轻振摇5分钟，12000rpm低温离心5分钟，吸取上层水相至另一EP管；重复一次；
⑵ 加入1/12体积的3M NaAC，混匀，再加入2.5倍体积无水乙醇沉淀DNA；12000rpm低温离心5分钟，去除上清；
⑶ 加1ml 70%乙醇洗涤，12000rpm 低温离心10分钟，去上清；重复1次；
⑷ 真空干燥，加适量TE溶解，置4℃备用。

作者: baidukk 时间: 2015-8-31 18:22

EDTA抗凝可直接买EDTA抗凝真空抽血管，好处是方便，并且抽血体积固定，并且EDTA抗凝液在管臂混合均匀。

作者: purrr 时间: 2015-8-31 18:22

我们用的是ACD一般抗凝剂，效果不错
但我最近做了一批标本，手工操作（不是用kit），结果样本之间的OD260/OD280比值差异很大，最好的在1.85左右，最差的只有1.2左右，且比值差的浓度一般也较低。
请问大家可能有什么原因呢？
我是刚来的，请多关照！

作者: memory 时间: 2015-8-31 18:22

1，我用EDTA抗凝用你提供的方法可以么？
2，STE是什么？如何配置？
3，第5步加SDS多少？25-30ml?,不是吧？
谢谢诸位！

作者: vcve 时间: 2015-8-31 18:22

EDTA抗凝用2.5%的溶液，与血液之间体积比一般是1:10

=============================================================================================================

以前我们实验室一直用肝素抗凝，PCR效果也不错。但考虑目前反对用肝素抗凝的呼声越来越高，我们也考虑用EDTA抗凝。老板让找这方面的资料。不知你所说的有无出处，能告诉一下吗？老板是个治学严谨之人，讲究有根有据。还请你帮个忙。

作者: vcve 时间: 2015-8-31 18:23

前两天，试着用两种方法，提取库存冻血的DNA。冻血标本DNA提取前，一定要室温水浴溶解，然后加磷酸盐缓冲液，离心，弃上清。往沉淀中加入提取缓冲液，再温育1小时。以后的步骤同新鲜血液的DNA提取步骤。

作者: jude 时间: 2015-8-31 18:23

EDTA抗凝可直接买EDTA抗凝真空抽血管，好处是方便，并且抽血体积固定，并且EDTA抗凝液在管臂混合均匀。

===================================

能否告知那里有卖？价钱多少？非常感谢！

作者: jude 时间: 2015-8-31 18:24

准备用EDTA抗凝真空管抽血用于提取DNA，哪位老师知道哪里有卖，请告知。多谢！

作者: H2O 时间: 2015-8-31 18:24

EDTA抗凝真空管在大医院的化验科或材料科有卖的，一些医药用品专销店也有，天津医科大学总医院是这样。

作者: xyw5 时间: 2015-8-31 18:24

EDTA抗凝用的是2%的溶液，一般0.2ml可加1ml全血。

作者: jude 时间: 2015-8-31 18:25

QUOTE:

原帖由 xyw5 于 2015-8-31 18:24 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

EDTA抗凝用的是2%的溶液，一般0.2ml可加1ml全血。

谢谢！能否给出：那本书上写的？老板非要看到书才行。有劳了。

作者: xyw5 时间: 2015-8-31 18:25

姜泊等主编分子生物学常用实验方法人民军医出版社1996，p108，原文：（从白细胞中制备DNA）取全血5ml,用3.8%柠檬酸钠或2%的EDTA（以NaOH调PH至7.4)，1/10体积抗凝，1500r/min离心5min。
我就是这样用的EDTA，我加了0.2mlEDTA，因为有本书是协和医科大学出的，主编惠汝太，书不厚，名字记不清了，也是这样。

作者: kswl870 时间: 2015-8-31 18:25

1. 通常可用EDTA-、柠檬酸-、ACD等抗凝全血，并提取基因组DNA，最好不要用肝素抗凝。我们常用柠檬酸或ACD抗凝。直接用采血室里的采血袋就好，袋子上通常都标明了抗凝剂的使用比例。
2. 抗凝全血在2-8度可保存达两个月，但随保存时间的增加，DNA的得率和完整性会受影响。
3. 冷冻全血当然是在-80C最好。-80C x 4年，-20C x 1年的冷冻全血我们都提过，得率在未冻全血的60~80%。有些经多次冻融的就有些惨了，只有30%多。 Sad
4. 对冷冻全血需重复细胞裂解步骤，以保证将红细胞完全裂解，但会减少纯化所得DNA的量。

作者: gogo 时间: 2015-8-31 18:25

采用改良Miller法抽提人白细胞DNA
１．试剂配制
•  1M Tris-HCl （pH8.0） 500ml
60.55g Tris 碱溶于400ml蒸馏水中，用浓HCl 调 pH8.0 (用浓HCl加量约21ml)，定容到500ml, 高压灭菌。
•  0.5 M EDTA （pH8.0） 500ml
在400ml蒸馏水中加入93.05gEDTA-Na盐，在磁力搅拌器上剧烈搅拌，用NaOH调节pH至8.0 （约需10g NaOH颗粒），然后定容到 500ml，高压灭菌。
•  10% Triton-X 100 500ml
•  10% SDS 200ml
20gSDS溶于160ml蒸馏水中，加热至68℃助容，加水定容至200ml，备用。
•  蛋白酶K 10mg/ml 溶于水，分装于小离心管中，-20℃保存。
2、　DNA提取步骤
•  去柠檬酸钠或EDTANa2抗凝全血5ml（尽量不用肝素抗凝），置于50ml有盖离心管中。
•  加入5-8倍体积（约40ml，将离心管加满即可）冷蒸馏水，反复颠倒混匀，冰中放置5min，4×3750rpm，离心20min。
•  缓慢倾倒上清，再沉淀中加入预冷的0.1% Triton-X 100 （体积同上），轻柔混匀沉淀，如有离心，弃上清。
•  沉淀中加入2ml裂解液，彻底打碎沉淀，然后加入10%SDS 100 μl（至终浓度为0.5%），混匀。
•  加入10mh/ml蛋白酶K 40 μl（至终浓度为200 μg/ml），混匀，55℃， 3小时；或37℃，过夜消化（以过夜为佳）。
•  加入6.0M NaCl 0.7ml，剧烈振荡20秒。
•  3750 rpm 离心40min，将上清移至另一有盖离心管中。
•  加入2倍体积（约5.2 ml)无水乙醇或95%乙醇，反复颠倒混匀至出现絮状DNA沉淀，调处DNA之一Eppendorf 管中。
•  75%乙醇洗涤2遍。将DNA保存在75%乙醇中，放置于冰箱中（-20℃）备用。

作者: qhyu 时间: 2015-8-31 18:26

我觉得提取冻存的抗凝血DNA时，裂解红细胞的时间应该缩短，这样提取出的DNA的量会多一点。我们一般是用ACD抗凝。
ACD配方：单结晶水柠檬酸（分子量210.1） 8.0g
柠檬酸三钠（分子量 294.1） 22.0g
单结晶水D-葡萄糖（分子量 198.2）24.5g
顺次溶于蒸馏水中，定容至1000ml，过滤除菌。分装后－20°C保存。

作者: yizhi 时间: 2015-8-31 18:26

请问EDTA加多了对DNA提取影响有多大？5ml的全血(新鲜)加了1ml的EDTA，有机法提出的DNA经过定量只有300ng/ul

作者: is2011 时间: 2015-8-31 18:26

⑺ 上清液加等体积酚：氯仿：异戊醇（25：24：10），
中不是10,而是1吧!!

作者: greenbee 时间: 2015-8-31 18:27

我是用EDTA抗凝的冻存的全血，请问用您的方法可以提取出DNA吗？我操作是需要注意哪些问题呢？期待你的回答。**

作者: ending 时间: 2015-8-31 18:27

Protocal
1. 分离外周血白细胞
(1)取患者肘静脉血5ml，EDTA抗凝，2500rpm离心10 min。
(2)小心吸取上层血浆，分装到3个0.5ml离心管中。
(3)在血细胞中加入3倍体积的溶血液，摇匀，冰浴15 min。
(4)2500rpm离心10 min，弃上清。
(5)加入10ml溶血液，摇匀，冰浴15 min。
Devil3000rpm离心10 min，弃上清。
(7)倒置离心管，去掉残液。
Musical Note得白细胞，－80ºC冻存。
2. 从白细胞中提取基因组DNA
(1)取白细胞，加4.5ml SE，使劲吹打，混匀。
(2)沿管壁加入0.5ml的10％SDS。
(3)加蛋白酶E 50μl／管。
(4)首尾轻摇10 min，混匀。
(5)37ºC水浴过夜。
Devil第二天取出，沿管壁加3 ml饱和NaCL，迅速手摇15秒，使蛋白变性析出。
(7)4000rpm离心10 min。
Musical Note取出上清，放于另一管中，加入等体积的三氯甲烷，混匀15 min。
(9)2500rpm离心10 min。
(10)取出上清，加入等体积的三氯甲烷，混匀10 min。
(11)2500rpm离心10 min。
(12)取上清，转入50ml管中，加3倍体积无水乙醇。
(13)首尾轻摇，见DNA絮状沉淀析出。
(14)将DNA挑至管壁，75％乙醇洗涤2遍。
(15)将DNA挑至0.5ml管中，冻干。
(16)加TE 300μl，使DNA溶解，4ºC保存。
请问douxiangfeng ：您的操作步骤中使用的是蛋白酶E，在其它文献中提到的是蛋白酶K，而我手里也只有蛋白酶K ，请问蛋白酶E和蛋白酶K 有何区别？另外用您的方法提取库存抗凝血可以吗？

作者: veiwu 时间: 2015-8-31 18:27

用ACD 怎么样啊？我的怎么扩不出来了???
肝素是可以使用的啊！

欢迎光临分析测试百科 (http://bbs.antpedia.com/)