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标题: 【求助】PCR产物电泳条带为什么被“劈开”了？ [打印本页]

作者: 爱老虎游tt 时间: 2015-9-1 18:00 标题: 【求助】PCR产物电泳条带为什么被“劈开”了？

向各位老师请教：PCR产物跑琼脂糖凝胶电泳的结果如图。电泳条件：100mV，30min
marker大小分别是100，200，…600bp
预期的PCR产物条带大小是488bp，不知道为什么出现了两条距离很接近的条带，个人感觉不像是引物二聚体。请各位老师帮忙分析分析原因，谢谢！

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作者: 爱老虎游tt 时间: 2015-9-1 18:02

奇怪的是，当把这种PCR产物进行酶切，再电泳时，却没有出现这种现象，条带都很清晰而完整。见下图

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http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=36951

作者: 969 时间: 2015-9-1 18:02

这种情况我在扩增actin的时候遇到过，当时我做半定量，但是内参和目的循环数不同，所以我在25个循环是拿出actin管子，跑胶就出现了和你类似的情况，我当时分析是因为没有进行后续的72度8min这一步，导致有些扩增产物没在尾端加上一些polyT，从而小了几十个bp，但是显然不适用你这种情况，有别的同志也遇到过这种奇怪的现象吗？都提出来探讨下，说说可能性吧。

作者: 爱老虎游tt 时间: 2015-9-1 18:03

嗯，我们没有省略延伸的步骤。
但是分离的DNA似乎放的有点久了，会不会跟这个有关系呢？

作者: 爱老虎游tt 时间: 2015-9-1 18:03

我在小木虫发的帖子有站友说是胶做的有问题，上下浓度不一致，所以出现了两条带。如果是这样的话，为什么酶切产物看不出问题呢？两者用的是同一批凝胶。
另外我个人猜想这种情况下（表层和底层之间出现了密度梯度）条带是不是应该拉的比较长，而不是分为两条？

作者: 爱老虎游tt 时间: 2015-9-1 18:03

我也觉得不应该是胶滴问题，DNA放久似乎也不可能。
问下，你扩增的是cDNA产物吗？如果是，有可能你的cDNA体系里面混有痕量的基因组DNA，这样会导致扩增出两条带的情况。比如，这两者中间刚好就隔了个20-30bp的内含子么。

作者: 爱老虎游tt 时间: 2015-9-1 18:04

我们的模板不是cDNA.今天查了查，这种现象好像叫做“ghost band”，在western blot和微卫星序列的PCR中比较常见，不过机制可能与我们这个不同。我们的实验是做单核苷酸多态性SNP的。
还有个师姐说可能是扩增产物自己形成了环。在网上说的，说的不是很清楚。有机会再问问她。

作者: 969 时间: 2015-9-1 18:04

扩增产物自己形成了环
这个有点意思哦，难不成是扩增产物自身形成了某种稳定的2级结构吗？产物还是一样的产物，但是由于有空间构象的不同，从而导致跑胶时出现这样几十个bp的微小差异，这样倒是有可能解释你说的这种现象哦！有达人能给出科学点的解释吗？

作者: dior 时间: 2015-9-1 18:05

这种现像很像是用不对称对引物扩增导致,跑得快一些的是单链,后面的是双链,当酶切时,双链切断,单链仍在

作者: baidukk 时间: 2015-9-1 18:05

这种情况我在扩增actin的时候遇到过，当时我做半定量，但是内参和目的循环数不同，所以我在25个循环是拿出actin管子，跑胶就出现了和你类似的情况，我当时分析是因为没有进行后续的72度8min这一步，导致有些扩增产物没在尾端加上一些polyT，从而小了几十个bp，但是显然不适用你这种情况，有别的同志也遇到过这种奇怪的现象吗？都提出来探讨下，说说可能性吧。

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72度停留5－10分钟，竟然可以延伸出polyT，而且还有几十个之多，我以前没有见过相关的资料，不知如何得到的这样的结论的？
一般的资料显示，停留这步主要还是保证产物的完整性，另外还会加A（TA克隆的依据）。环化的可能也不大，没有结构的基础！！楼上的解释可能更接近事实！
另楼主是否可以将详细的实验细节说明下，比如用的什么模板，引物，PCR的步骤等！

作者: 爱老虎游tt 时间: 2015-9-1 18:06

我们并非采用不对称PCR方法，而是经典方法，体系配制错误造成不对称PCR的可能性比较小(多次重复的结果)。之前未能提供实验细节，对不起各位。我将尽快发上具体实验条件（师姐的实验，我是助手）。
不过即使是不对称PCR，酶切结果似乎也不改如图2那样。因为它基本符合我们的预期结果，没有多余的条带。
另外还想请教，单链是否能被酶切？

作者: 爱老虎游tt 时间: 2015-9-1 18:07

相关疾病：
先天性卵巢发育不全综合征
实验目的：检测目的基因单核苷酸多态性S/X
体系配制：10×PCR Buffer 2.50
10mM dNTPs 0.40
Taq DNA聚合酶（2U/ ） 0.40
正向引物（25uM） 0.4
反向引物（25u M） 0.4
ddH2O 19.60
模板（100ng/ ） 2.00
总体积 25.00
PCR条件
94 C 变性 5min；
94 C 60s，60 C 30s，72 C 45s 共35个循环；
72 C 延伸 2min；
预期PCR产物为488bp
酶切反应
经MnlI限制性内切酶消化后,SS基因型在胶图中有两个片断（285bp和203bp），SX基因型有三个片断（285bp、248bp和203bp），XX基因型有两个片断（248bp和203bp）
电泳条件
3%琼脂糖凝胶，110V，1小时20分钟，大的水平电泳槽，正负电极间距离有24cm

作者: chengjie79 时间: 2015-9-1 18:07

我就是那位师姐。谢谢各位的热情帮助。希望这个问题能早日解决。
另外，我发现国外发表的一篇论文（也是做这个基因的同一位点的多态性）的PCR产物电泳结果和我是一样的，也有条很靠近的条带，而酶切结果也是不出现此条带。

作者: feiya 时间: 2015-9-1 18:07

个人意见：
战友可以考虑提供该国外论文的原文，给各位战友参考
也可以考虑直接email 给该论文作者，询问论文作者对这个问题的解释。
欢迎大家集思广益，继续讨论～

作者: 969 时间: 2015-9-1 18:08

72度停留5－10分钟，竟然可以延伸出polyT，而且还有几十个之多，我以前没有见过相关的资料，不知如何得到的这样的结论的？
一般的资料显示，停留这步主要还是保证产物的完整性，另外还会加A（TA克隆的依据）。
yes，我搞错了，72度8min的目的是为了加上polyA吧，我随手写成了polyT，但是这个现象确实是我遇到过，而且不止一次，在PCR完成后不进行72度这一步，确实会出现2条带，大小相隔很近。

作者: shkudo 时间: 2015-9-1 18:09

不是polyA，一般只能加一个，加两个的概率要低好几个数量级！
另外，同意版主的意见，把原文传上来，大家一起分析，毕竟很多人没有遇到过这样的情况！

作者: 969 时间: 2015-9-1 18:09

长见识了，看来我对我实验出现双带的理解一直是错误的，72度处理8min原来一般只能加上1到2个碱基A，之前一直想当然了，呵呵！3q。

作者: am10 时间: 2015-9-1 18:09

我做PCR实验时也会经常遇到这种情况，我认为这是引物的不特异，也就是说该引物可以扩增出除目的带以外的其他带，但是，你的酶切位点只存在于目的带上，所以酶切后是正常的。

作者: jude 时间: 2015-9-1 18:10

会不会是有多个拷贝？拷贝之间差异很小，酶切结果一致？

作者: 爱老虎游tt 时间: 2015-9-1 18:10

……那么非特异性扩增产物哪去了？为什么酶切后的电泳见不到它们？

作者: toy 时间: 2015-9-1 18:11

这是国外论文的原文地址：cuturl('http://circ.ahajournals.org/cgi/content/full/95/12/2628')，在 Figure 1 上。
我也会尽快和作者联系一下的。

作者: toy 时间: 2015-9-1 18:11

该篇论文的责任作者所留的信箱好像已经作废了，发邮件老是被拒收，怎么回事？

作者: chengjie79 时间: 2015-9-1 18:12

试试问问第一作者～
第一作者：Groenemeijer BE
1997、1999年发文章之后，2008年才发另外一篇，真可谓十年磨一剑
cuturl('http://www.pubmedcentral.nih.gov/articlerender.fcgi?tool=pubmed&pubmedid=18711614')
Correspondence to: B.E. Groenemeijer Department of Cardiology, Gelre Hospitals, PO Box 9014, 7300 DS Apeldoorn, the Netherlands Email: E-mail: b.groenemeijer@gelre.nl

作者: fox_79 时间: 2015-9-1 18:12

怎么一会480kb一会480bp 么看懂啊
引物特异性差这个基因内部也存在互补位点所以出现两条带(其实是一条带只不过有个长有个短而已)
所以二者中间都含有酶切位点酶切完之后都是一样的所以出现上述结果?
有可能吗? 我猜的

作者: fox_79 时间: 2015-9-1 18:13

如果实在较真的话你完全可以测个序啊花不了多少money

作者: 爱老虎游tt 时间: 2015-9-1 18:13

kb是我笔误，抱歉！应该是488bp，已改正
如果引物特异性的原因，造成长短不同的两种链，那么它们酶切以后的片断怎么会长度一样呢？我想这种情况只能出现在x/x基因型的结果中，这种基因型酶切以后会有一个几十bp的小片断，电泳的时候可能从胶里跑出去了观察不到。如果引物特异性造成的长度差异就发生在这个小片断内，那么酶切的时候被切掉，可以得到和正常PCR产物酶切后一样的结果。但是这种情况并不适用于另两种基因型。

作者: redbutterfly 时间: 2015-9-1 18:13

那位外文的第一作者一直没给回信。
如果我要测序的话，在北京找什么公司比较好？

作者: minran_1980 时间: 2015-9-1 18:14

是不是因为你的产物部分变性，有单链和双链，电泳时所以有两条带，酶切前又复性了，所以酶切结果是正常的。

作者: minran_1980 时间: 2015-9-1 18:14

分别送去测序就明白了,不用去猜什么

作者: ero11 时间: 2015-9-1 18:15

大家要积极讨论啊~
DNA的硫修饰就是因为跑胶时的拖带而发现的哦~

作者: 爱老虎游tt 时间: 2015-9-1 18:15

今天听到一种新的解释：很接近的两条带可能是DNA的不同螺旋状态，分子量一样，但是由于螺旋的状态不同，泳动速度不同。
松弛DNA在拓扑异构酶或者溴乙锭的作用下可以变为正超螺旋，而超螺旋结构在电泳过程中涌动速度快于线形DNA（也就是松弛DNA）
一同学说PCR时碰到过同样的现象，其师姐说属于正常现象。
越看越觉得有道理，呵呵

作者: junhun 时间: 2015-9-1 18:15

相关疾病：
盲
不会本身引物特异性不好，批了同源序列吧。。。螺旋状态。。那是瞎扯淡。。你又没环化。。何来螺旋。。当然除了双螺旋结构。。同学和师姐。。都是瞎扯淡。。。

作者: veiwu 时间: 2015-9-1 18:16

以前参加讨论的一个关于STR的帖子也有这个问题，最后也没搞清楚是啥，还为了当事人不求甚解而叹气。难得这两位师姐弟这么有求知欲，都准备去测序了，先赞一个，搞科研就应该这样精益求精！
个人意见：每对带的亮度比似乎较稳定，说明两者很可能是同一片段衍生出来的不同形式，而且这种变化不是百分之百，而是按比例的。这里有几十bp的长度差，首先排除末端加A；成环和不同螺旋状态倒是有可能，但按一定比例发生这样的变化而不是全部变，似乎需要更多热力学上的证据；变性不完全和同源序列也有可能，但似乎错误低级了点，不太容易犯。
嘿嘿，说了半天，我没啥新idea。还是等你们测序结果吧。一定要会来通报啊。
Btw，北京很多地方有测序服务，不过你的量肯定少，不知道有没人愿意做。我有朋友也做这个，我可以帮你问一下，需要的话给我email。

作者: redbutterfly 时间: 2015-9-1 18:16

那我提个问题：很接近的两条带可能是DNA的不同螺旋状态，分子量一样，但是由于螺旋的状态不同，泳动速度不同。
松弛DNA在拓扑异构酶或者溴乙锭的作用下可以变为正超螺旋，而超螺旋结构在电泳过程中涌动速度快于线形DNA（也就是松弛DNA）
一同学说PCR时碰到过同样的现象
如果是如此解释，为什么平时PCR很少发现这种现象，而你们这种PCR发生的几率这么大？

作者: dog002 时间: 2015-9-1 18:17

我有过相似经历，我来尝试解答！
根据图片，大带应为期望的488bp产物带；小带（看起来好像小了20-30bp左右）可能是由于核酸的二级结构造成的。
前提是该基因在基因组内可能是多拷贝的。有的拷贝可能存在1个或几个小片段的缺失。在PCR过程中就会形成如示意图中的产物（有两个小片段缺失）。该种结构在琼脂糖上会形成如楼主图中的小带。当然，由于酶切后，片断变小，这种影响就小了，自然就看不到双带的现象了。
根据我的经验，楼主可以将同样的PCR产物在聚丙烯酰胺胶上跑一下。如果我猜得没有错的话，其结果很可能就是小带消失了，取而代之的是一条比真实产物还要大很多的带。这主要是由于形成二级结构的产物在聚丙烯酰胺胶上前进更为困难所致（胶孔比琼脂糖小很多）。
可能有人会问，为什么有缺失的拷贝的自身的PCR产物没有形成额外的带。答案就是，缺失的碱基数很少且琼脂糖的分辨率有限，所以无缺失的和有缺失的PCR产物都在那条大带里，而只有形成如示意图所示的二级结构的产物时，由于其泳动能力特殊，所以才会出现小带现象。

作者: 爱老虎游tt 时间: 2015-9-1 18:17

我想可能跟我们的片段长度比较长有关系吧，将近500bp，而酶切以后不再出现是因为片段长度短了，当然这只是我的猜想。
我特意问过那位见过类似结果的同学，她说当时P的片段也比较长。不过她的实验似乎不做酶切。

作者: redbutterfly 时间: 2015-9-1 18:18

楼上师兄，我问一下，有一次，我做RT-PCR时，用actin调整模板浓度，每隔3个循环拿出来检测一下，25个循环拿出来检测时有两条带，28个循环再检测时就剩一条带了，这怎么解释呢？

作者: baidukk 时间: 2015-9-1 18:18

今天听到一种新的解释：很接近的两条带可能是DNA的不同螺旋状态，分子量一样，但是由于螺旋的状态不同，泳动速度不同。
松弛DNA在拓扑异构酶或者溴乙锭的作用下可以变为正超螺旋，而超螺旋结构在电泳过程中涌动速度快于线形DNA（也就是松弛DNA）
一同学说PCR时碰到过同样的现象，其师姐说属于正常现象。
越看越觉得有道理，呵呵
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这种情况只在质粒提取后跑胶遇到过，超螺旋、螺旋和线性会有不同的带，但是在PCR后跑胶也出现不同形态没有遇到过。

作者: xyw5 时间: 2015-9-1 18:19

蛮有道理，不知是否做过验证？

作者: 爱老虎游tt 时间: 2015-9-1 18:19

这种情况只在质粒提取后跑胶遇到过，超螺旋、螺旋和线性会有不同的带，但是在PCR后跑胶也出现不同形态没有遇到过。

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想起来了，那个同学就是做的质粒

作者: feiya 时间: 2015-9-1 18:19

我做的SSR，其中一对引物扩增出的产物和楼主情况相似，也曾按照楼上说的做过变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，但结果是一样的，出现上下两对一模一样的条带，还有一个师姐，她做的乌贼，也出现了这种情况，不知大家有什么好的见解？

作者: 爱老虎游tt 时间: 2015-9-1 18:20

简单重复序列出现“影子带”的问题似乎很常见啊。我碰到问题之后看过一些关于简单重复序列出现影子带的文献，机制不是特别清楚，但“滑动”理论似乎比较受到认同。也有一些解决办法，似乎都不是很彻底。
看看这篇文献？《二核苷酸微卫星PCR扩增的影子带及其来源》

作者: JK.jon 时间: 2015-9-1 18:20

我来出示一些实验证据：
首先是琼脂糖图片，我扩增的是ITS片段，该片段在基因组内是高度重复的。仔细观察图片，可以看到除9，10号个体外，其他个体的PCR产物都有前托尾现象，其原因如上所述。9，10号个体未见前托尾现象的原因是这两个个体是纯合子，即所有拷贝的序列是一致的（经过测序验证）。之所以是前托尾而不是形成如楼主的图片中的条带是因为个体基因组内ITS片段杂合度（这里的杂合度是针对碱基缺失而言）较高，不同的拷贝间会在PCR扩增过程中形成多种多样的二级结构产物。

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http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=36952

作者: JK.jon 时间: 2015-9-1 18:20

聚丙烯酰胺图片：
A,B,C为ITS片段克隆后单菌落PCR结果，符合真实产物片断大小。
D: A与B的PCR产物的混合物，经过变形复性后，上样（单带）
E,F,G: A与C的PCR产物的混合物，经过变形复性后，上样（双带）
测序结果证实，A与B序列完全一致，A与C仅差3个左右的碱基，却造成了如图中比正常产物大许多的条带。

图片附件: 86587286.jpg (2015-9-1 18:20, 8.4 KB) / 该附件被下载次数 7
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=36953

作者: JK.jon 时间: 2015-9-1 18:21

尽管我不能确定我在实验中发现的现象就一定是楼主问题的解答，但是我觉得已经很接近了。
至于为什么形成二级结构的片段在琼脂糖上的泳动能力要快一些，我的猜测是：
1，和正常产物比，形成二级结构的片段分子量要小些
2，形成二级结构的片段结合的EB比正常产物要少，因而跑得快些
至于说到SSR中的双带现象，这几乎是做过的人都遇到的事情，有比较权威的解释，这里就不展开谈了。

作者: JK.jon 时间: 2015-9-1 18:25

楼上师兄，我问一下，有一次，我做RT-PCR时，用actin调整模板浓度，每隔3个循环拿出来检测一下，25个循环拿出来检测时有两条带，28个循环再检测时就剩一条带了，这怎么解释呢？

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这个。。。。很难回答。
实验上遇到奇怪的现象会很多，关键是有没有重复性。
如果你每次做，都是这个结果，那么倒是可以探讨一下。

作者: abc816 时间: 2015-9-1 18:26

感觉部分PCR产物形成二级结构的可能性比较大。
以前提质粒的经验：提质粒的时候跑电泳，一般会出现三条带，提的好的时候，超螺旋（跑的最快的，在最前面）比较亮。中间是线性化的分子，质粒的分子量依靠这条带来判断，跑的最慢的是开环的分子。
也就是说，虽然楼主电泳有两条带，但序列可能是相同的，不知道什么原因造成有部分pcr产物二级结构的变化，从而电泳显示两条带。
期待楼主分别回收两条带，测序的结果。

作者: vcve 时间: 2015-9-1 18:26

简单重复序列出现“影子带”的问题似乎很常见啊。我碰到问题之后看过一些关于简单重复序列出现影子带的文献，机制不是特别清楚，但“滑动”理论似乎比较受到认同。也有一些解决办法，似乎都不是很彻底。
看看这篇文献？《二核苷酸微卫星PCR扩增的影子带及其来源》

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感觉这篇文章对特异与非特异错配的异源双链的判断也没讲清楚，证据不是很足。板胶的分辨率太低，我觉得应该做做毛细管电泳看看。我分析过相当多毛细管的峰图数据，从没有见到过异源双链峰，当然，不排除毛细管里不会发生异源双链的情况的可能，但我认为原理上需要解释，并且应该做实验验证。

作者: vcve 时间: 2015-9-1 18:27

补充一下，我认为楼上的混合PAGE实验对这篇文章是个很好的补充。Good job！

作者: dior 时间: 2015-9-1 18:27

可能是引物二聚体或者提高退火温度试试

作者: eric930 时间: 2015-9-1 18:27

是不是以DNA为模板经常会发生这样的问题啊，图片中所有的泳道都是以DNA为模板，以相同的引物跑的PCR但是结果貌似不太一样，而且有三个明显出现了两条相近的目的条带。
这种情况除了各位老师分析的会有一些螺旋结构的产生导致泳动速度发生变化以外，会不会是由于存在不同的拷贝导致的呢？
期待大家的解答。

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