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标题: 【求助】谁能帮我验证下这两个引物都合格吗？ [打印本页]

作者: IAM007 时间: 2015-9-4 15:58 标题: 【求助】谁能帮我验证下这两个引物都合格吗？

相关疾病：
先天性卵巢发育不全综合征

我的目的基因：Mus musculus peroxiredoxin 6 (Prdx6)
ncbi搜索的序列号： NM_007453.3
设计了两个，如下：
PRIMER1 引物起始位置扩增长度
F: 5`-CTGTGCCTTCGCCAGCAT 919 bp
r:5`-TGTCACCGCCCGTCTTTT 1349 bp 431 bp
PRIMER2
F: 5`-TGTGGCTCATAACCTCTT 1669 bp
R: 5`-CACCTAGAAATAAACATCCC 2004 bp 336 bp
blast了下，但是不能定夺哪个更好些？PRIMER1 我要的目的基因peroxiredoxin 6最高总得分没有PRIMER2里的高，但是PRIMER1 上下游引物的匹配比PRIMER2要好？此外有个问题就是：这两个引物的E-value值都很高，不知道有没有问题，希望战友能够帮我分析下，我选哪个引物更合理，谢谢！

作者: ALALA 时间: 2015-9-4 15:58

cuturl('http://biocompute.bmi.ac.cn/CZlab/MFEprimer-2.0/')

作者: IAM007 时间: 2015-9-4 16:39

相关疾病：
先天性卵巢发育不全综合征

谢谢楼上，我把我的两对引物放进MFEprimer-2.0 Report检测了下，但是还是有点问题想向您咨询一下，希望得到您的解答和帮助。以下是我的两个引物检测出来的信息。

图片附件: 71419841.snap.jpg (2015-9-4 16:39, 25.17 KB) / 该附件被下载次数 14
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=36977

作者: IAM007 时间: 2015-9-4 16:39

我要的目的基因就是第一个NM-007453.3，图A和图B就是我的两队引物检测的信息，从图中看出，A和B的GC含量都不在引物设计原则推荐的范围内？我不知道这个问题大不大？
总图A中，可以看出我的目的基因编号1的ppc分值和编号2,编号3的ppc的分值都是100，并且正反义链的Tm值都是一样的，此外，FP△G和RP△G以及FP3'△G和RP3'△G的值也都是一样的，由此判断，若使用这对引物的话，很容易会扩增出这些非特异性的条带；
而图B中，我目的基因ppc的分值虽然是92.6，但是其他的同源序列基因的ppc、Tm值、FP△G和RP△G、FP3'△G和RP3'△G与我的目的基因的分值相差甚远，由此，我认为，这对引物比较合适。
希望wisdom_love帮我看下我的判断对吗？还有FP△G和RP△G与FP3'△G和RP3'△G，是什么意思，能说明什么问题？谢谢！

图片附件: 86987858.snap.jpg (2015-9-4 16:39, 26.6 KB) / 该附件被下载次数 8
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=36978

作者: panda王 时间: 2015-9-4 16:40

你分析的很到位，就是你这样的判断过程。
△G是引物与目标结合的自由能，3'指的是引物3‘段最后五个碱基与目标结合的自由能，FP(forward primer)和RP(reverse primer)值得是上下游引物。
不过需要提醒两点：
1. 对于A，这种情况下编号2和编号3的能对你的目的基因造成很大的干扰，但是一般情况下需要继续仔细看一下编号2和3所扩增的基因，如果是一个基因的两个变体，那么情况将不同。你的情况是，他们一个是预测的基因，另外一个是非编码RNA，预测的基因不好说，但这个非编码RNA可能会造成干扰，所以你的判断是对的。
2. 对于B，如果仅从特异性上讲，非常好，但是缺点就是GC含量偏低，造成引物的Tm值只有50°C左右，这样实际实验时你的退火温度就很低，低的退火温度容易造成意想不到的非特异扩增。
综合考虑，建议你重新设计引物，找一个特异又Tm值比较高的引物。

作者: panda王 时间: 2015-9-4 16:40

另外，引物设计可以试试下面的软件，也是我们实验室最近开发的，有任何问题欢迎随时联系。
cuturl('http://biocompute.bmi.ac.cn/CZlab/VizPrimer/')

作者: IAM007 时间: 2015-9-4 16:40

之所以又拿来请教大家帮我检测下设计的这两对引物合不合理，因为自己检测时就发现这两对引物都有自己的缺点之处，都不算好，现在决定按wisdom_love提的建议，重新设计。

作者: bs4665 时间: 2015-9-4 16:41

另外，引物设计可以试试下面的软件，也是我们实验室最近开发的，有任何问题欢迎随时联系。
cuturl('http://biocompute.bmi.ac.cn/CZlab/VizPrimer/')

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你好！请教一下看看我设计的引物怎么样？我不会分析啊！谢谢！

图片附件: 36371731.snap.jpg (2015-9-4 16:42, 37.07 KB) / 该附件被下载次数 15
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=36979

作者: vcve 时间: 2015-9-4 16:47

cuturl('http://code.google.com/p/mfeprimer/wiki/HowTo')
如果还有问题，请随时联系。

作者: am10 时间: 2015-9-4 16:47

QUOTE:

原帖由 vcve 于 2015-9-4 16:47 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

cuturl('http://code.google.com/p/mfeprimer/wiki/HowTo')
如果还有问题，请随时联系。

这个我看了！但是没看明白！请您帮我分析一下我设计的这个引物怎么样！！谢谢！！

作者: vcve 时间: 2015-9-4 16:48

QUOTE:

原帖由 am10 于 2015-9-4 16:47 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

这个我看了！但是没看明白！请您帮我分析一下我设计的这个引物怎么样！！谢谢！！

引物序列？物种？

作者: IAM007 时间: 2015-9-4 16:48

QUOTE:

原帖由 vcve 于 2015-9-4 16:48 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

引物序列？物种？

F 5-ACCAGAGGCAGTAACCAT-3
R 5-GCAGTGTGACTCAAGAGAA-3
物种是：human 基因是 CDKN2A（P16INK4a）
CDKN2A有好几个变异体，主要包括变异体1和4，变异体1的产物是P16INK4a 变异体4的产物是P14ARF 我需要的是变异体1。
我们让宝生物的人给我们设计这个引物，他们说没有好的引物，设计不出来，所以很郁闷，我自己用primer6.0设计的这个引物，不知道怎么样！您帮我看一下！！谢谢！

作者: IAM007 时间: 2015-9-4 16:49

上图~~~~~~~~~~~~~

图片附件: 58725995.snap.jpg (2015-9-4 16:49, 51.92 KB) / 该附件被下载次数 9
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=36980

图片附件: 54639289.snap.jpg (2015-9-4 16:49, 39.41 KB) / 该附件被下载次数 8
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=36981

作者: IAM007 时间: 2015-9-4 16:50

NM_000077.4是我们要的变异体1

作者: vcve 时间: 2015-9-4 16:50

QUOTE:

原帖由 IAM007 于 2015-9-4 16:49 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
上图~~~~~~~~~~~~~

从你给的截图中，前三个扩增物拥有和你目标产物（第四个）相同的退火温度，也就是说它们都有可能在实际的反应中出现，而其余扩增产物的退火温度都比较低，所以一般认为它们不会在实际的反应中出现。
而第一个扩增产物的长度和其余三个不一样，所以它能在电泳条带中区别开来（即使它能扩增），而其余两个非目的条带则和你的（第四个）拥有相同的退火温度和长度，它们无法在电泳中区分。
所以，你如果想要仅仅扩增第四个条带而不是其他的，就必须找到第四个基因和其他（2和3号）基因在序列上的区别，找到第四个基因上独特的区域来设计引物。

作者: vcve 时间: 2015-9-4 16:51

QUOTE:

原帖由 IAM007 于 2015-9-4 16:50 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

NM_000077.4是我们要的变异体1

从上图可以发现你的目的基因和其他变体的区别其实很小，就在5‘端一个很小的UTR区域，所以，你的引物必须有一个在这里，才能至少区别NM_058197.4这个变体。
截图来自该网站：cuturl('http://biocompute.bmi.ac.cn/CZlab/VizPrimer/index.html')

图片附件: 72911725.png (2015-9-4 16:51, 35.11 KB) / 该附件被下载次数 9
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=36983

作者: IAM007 时间: 2015-9-4 16:51

QUOTE:

原帖由 vcve 于 2015-9-4 16:51 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

从上图可以发现你的目的基因和其他变体的区别其实很小，就在5‘端一个很小的UTR区域，所以，你的引物必须有一个在这里，才能至少区别NM_058197.4这个变体。
截图来自该网站：cuturl('http://biocompute.bmi.ac.cn/CZlab/VizPrimer/ind') ...

非常感谢您！！前面去做实验了！刚吃饭回来！不好意思！！
谢谢！！你的解释很清楚，我明白了！！呵呵！！再次感谢您！
请问怎么才能让我的引物在5‘端的UTR区域？

作者: vcve 时间: 2015-9-4 16:51

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原帖由 IAM007 于 2015-9-4 16:51 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

非常感谢您！！前面去做实验了！刚吃饭回来！不好意思！！
谢谢！！你的解释很清楚，我明白了！！呵呵！！再次感谢您！
请问怎么才能让我的引物在5‘端的UTR区域？ ...

那就把引物设计在5‘端，不太清楚你使用的引物软件是否可以这样设置。我估计可以。
VizPrimer可以做。

作者: IAM007 时间: 2015-9-4 16:52

QUOTE:

原帖由 vcve 于 2015-9-4 16:51 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

那就把引物设计在5‘端，不太清楚你使用的引物软件是否可以这样设置。我估计可以。
VizPrimer可以做。

呵呵！！我是初学者，那个软件昨天才装上用的，不太会用那个软件，您能否帮我设计一下这个引物呢？

作者: IAM007 时间: 2015-9-4 16:52

你好，我又重新设计了一堆引物，把引物输入后检查的结果你帮我看一下这对引物怎么样？谢谢！！

图片附件: 16546981.snap.jpg (2015-9-4 16:52, 36.17 KB) / 该附件被下载次数 6
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=36984

作者: IAM007 时间: 2015-9-4 16:55

那就把引物设计在5‘端，不太清楚你使用的引物软件是否可以这样设置。我估计可以。
VizPrimer可以做。

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你好！这个是我新设计的引物，我刚才检验了一下，现在把截图给您，您帮我看看这个引物怎么样？
非常感谢！！

图片附件: 86541249.snap.jpg (2015-9-4 16:55, 36.17 KB) / 该附件被下载次数 6
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=36985

作者: vcve 时间: 2015-9-4 16:56

QUOTE:

原帖由 IAM007 于 2015-9-4 16:55 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
那就把引物设计在5‘端，不太清楚你使用的引物软件是否可以这样设置。我估计可以。
VizPrimer可以做。

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你好！这个是我新设计的引 ...

建议参照我前面的分析自己先分析。

作者: cj_mondy 时间: 2015-9-4 16:57

你好，使用了你的软件，我自己设计的是大鼠的β-catenin β连环蛋白，先是在pubmed上搜的rattus norvegicus beta-catenin mRNA，complete cds，然后用primer premier 5设计的引物

图片附件: 95142638.png (2015-9-4 16:57, 50.74 KB) / 该附件被下载次数 7
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=36986

作者: cj_mondy 时间: 2015-9-4 16:58

看了你的介绍，我的引物第二个是我要的，第一个相似性好高，是不是特异性就不好？需要重新设计

作者: cj_mondy 时间: 2015-9-4 16:59

另外红色标记是代表什么？

作者: vcve 时间: 2015-9-4 16:59

QUOTE:

原帖由 cj_mondy 于 2015-9-4 16:59 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

另外红色标记是代表什么？

红色标记的为极有可能被扩增的产物。
前面两个可能是一个东西，只不过一个是基因组，一个是转录本，基因组的含有一个内含子。

作者: cj_mondy 时间: 2015-9-4 17:00

QUOTE:

原帖由 vcve 于 2015-9-4 16:59 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

红色标记的为极有可能被扩增的产物。
前面两个可能是一个东西，只不过一个是基因组，一个是转录本，基因组的含有一个内含子。

嗯，谢谢！！这个都是我自己设计的，感觉你的软件很容易上手，分析的指标我也能看得懂，万分感谢！！！！

作者: shkudo 时间: 2015-9-4 17:00

相关疾病：
46XX性发育睾丸疾病
你用MFEdrimer-2.0 Report比对你的目的基因Mus musculus peroxiredoxin 6 (Prdx6)时，选择的是哪个数据库？我比对没有出现你那样的结果，期待你的详细解答，谢谢！
bbcodeurl('file:///C:\Documents and Settings\Administrator\Application Data\Tencent\Users\463206561\QQ\WinTemp\RichOle\SXX{YM3PCNGX{ALC_%C6UQW.jpg', '%s')
bbcodeurl('file:///C:\Documents and Settings\Administrator\Application Data\Tencent\Users\463206561\QQ\WinTemp\RichOle\SXX{YM3PCNGX{ALC_%C6UQW.jpg', '%s')

作者: caihong 时间: 2015-9-4 17:00

VizPrimer

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这个我怎么用不了啊！

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